Discusión:

Extracción de ADN
La extracción de ADN es la base para los estudios en biología molecular, pero
para realizar este proceso existen tipos de extracción y métodos de extracción,
para el cual se deben seguir una serie de procedimientos.
Primeramente, se debe realizar la colecta de muestra, la muestra puede ser
cualquier tipo de célula, en la experimentación se recolecto células de epitelio
bucal con el uso de un hisopo estéril. Durante este proceso es importante
realizar una colecta y manejo de ADN integro y sin contaminantes, porque
estos pueden afectar a la reacción de las enzimas durante la reacción de PCR
que se realizara posteriormente.
Extracción de ADN de epitelio bucal
La extracción de ADN es el proceso mediante el cual se aísla y purifica el ADN
de una muestra biológica. Según Rodriguez et al. mencionan que “la
disgregación del tejido y su homogeneización se llevan a cabo en un buffer de
lisis, que contiene sales, un detergente y proteinasa K, que libera el DNA de las
histonas con las que se encuentra empaquetado y proteoliza proteínas
celulares” (p. 223).
En primer lugar, se coloca el hisopo que contiene células de epitelio bucal a un
tubo eppendorf. y luego se añadió la proteinasa K para romper o degradar las
proteínas unidas al ácido desoxirribonucleico, como por ejemplo las histonas.
Posteriormente, se agregó ribonucleasa (RNasa) a la muestra, para que se
rompa el RNA, además cumple la función de limpiar la muestra. Luego se
somete al vortex para facilitar las reacciones de los compuestos añadidos.
En segundo lugar, usamos el buffer lisis que contiene cloruro de sodio que
ayuda a reventar los núcleos de las células, buffer tris base que es un ácido
para evitar que cambie el pH del medio, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)
el cual atrapa iones divalentes de magnesio para que el DNasa no pueda
descomponer al ácido desoxirribonucleico (DNA), también contiene
dodecilsulfato sódico (SDS) este es un detergente que extrae las proteínas de
la membrana y ayuda a romper las hebras del ADN; después la muestra se
somete a vortex, luego la muestra se incuba a 55 °C por 10 minutos para
mantener activa la proteinasa K y RNasa, debido a que son enzimas obtenidas
de bacterias termófilas. Eventualmente, se agregó 100 ul de etanol con el
objetivo de precipitar el ADN para lograr que se agrupen, porque el etanol es
menos polar.

Proceso de purificación
Para este proceso se utilizó un kit comercial, es este proceso se obtendrá ADN
nuclear el cual será utilizado para PCR y electroforesis en gel.
Para la purificación, se tiene que centrifugar el compuesto para sedimentar el
ADN, que es un componente del núcleo. Terminado la centrifugación se filtra el
ADN, la parte acuosa que contiene ADN se introduce en una columna, esta
columna es porosa y contiene sílice los cuales forman enlaces con los fosfatos
del ácido nucleico, ocasionando que estos se peguen a la sílice, por lo tanto,
las moléculas pequeñas logran filtrarse y se quedan las moléculas grandes.
Para filtrar las moléculas grandes que no pudieron por la columna con sílice se
utiliza un buffer de lavado, el cual disuelve a las moléculas grandes y estas
llegan a filtrarse, sin embargo, el ADN no se disuelve porque esta pegada a la
sílice, para conseguir un ADN puro se hizo dos lavados. Después, se utiliza
buffer de elución que contiene sales que se pegan a la columna con sílice
logrando desprender o liberar al ADN que estaba pegado a la sílice, finalmente
el ADN se logra filtrar en el líquido.
 En la experimentación se obtuvo una cantidad de 6,5 ng/uL de ADN,
este resultado indica que el ADN puede ser utilizado para realizar PCR,
porque para realizar PCR se necesita 1 ng/uL.

 La pureza de ácidos nucleicos/proteínas es 1,63 A260/A280 este

resultado indica que el ADN tiene pureza aceptable.

 La pureza de ácidos nucleicos/contaminantes químicos es 0,3

A260/A230, este es un indicador que nuestro ADN esta contaminado con
sales, carbohidratos y fenoles.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción de cadena de polimerasa es una técnica utilizada para hacer
muchas copias de una determinada secuencia de ADN, para empezar solo se
utiliza una pequeña cantidad de ADN. Según Audesirk et al. (2013) mencionan
que “la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por las siglas de
polymerase chain reaction) produce prácticamente cantidades ilimitadas de
DNA. Además, esta reacción puede emplearse para amplificar segmentos
seleccionados de DNA” (p. 255). Mediante esta técnica podremos secuenciar el
ADN por electroforesis en gel, para continuar con el proceso de electroforesis
en gel por lo menos se debe tener un millón de moléculas de ADN, la PCR
consta de los siguientes pasos:

1. Desnaturalización

Las dos cadenas de ADN se encuentran unidos por puentes de

hidrogeno, se programó el termociclador con una temperatura de 98 °C
durante un minuto, este seria nuestro primer ciclo. Tal como Scott (2009)
afirma “la PCR empieza cuando la mezcla de reacción se calienta a 94
 °C. A esta temperatura, el DNA plantilla de doble hebra se desnaturaliza”
(p. 255). Este calor rompe los enlaces de hidrógeno entre las bases
complementarias del ADN de doble cadena, separándolas en dos
cadenas individuales, cuando las hebras de ADN tienen bastantes pares
G-C (Guanina – Citocina) demoran más tiempo en separarse, en cambio
los pares de A-T (Adenina – Timina) se rompe más rápido, este proceso
reemplaza a la helicasa. Esta separación permite que las hebras de ADN
estén listas para el siguiente paso del ciclo de PCR, que es la unión de
los cebadores. La desnaturalización es esencial para que los fragmentos
de ADN puedan ser replicados de manera eficiente en las etapas
siguientes.

2. Hibridación

En esta etapa, se programó el termociclador para calentar las cadenas

de ADN a una temperatura de 98°C por 11 segundos, dando lugar a un
realineamiento de las cadenas originales para formar ADN bicatenario y
después se enfrió el ADN rápidamente hasta los 58° C, para que los
cebadores o iniciadores que se encuentran presentes se alinean al
extremo 3’ de la cadena previamente separada e hibridan con su
secuencia complementaria, evitan el realineamiento de las cadenas
originales por su cantidad en exceso. Así como mencionan Madigan et
al. debido a las altas temperaturas necesarias para desnaturalizar las
copias de doble cadena de DNA in vitro, se utiliza una DNA polimerasa
termoestable aislada de la bacteria termófila de fuentes termales
Thermus (2015, p. 340). Si el diseño de los cebadores o iniciadores es el
correcto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especificidad
del complejo será eficiente. Es decir, en este proceso la temperatura
disminuye, permitiendo el enfriamiento de la reacción para que los
cebadores puedan unirse a sus respectivas secuencias
complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.

3. Elongación

En esta etapa, se sintetiza ADN bicatenario usando como plantilla las

cadenas individuales de los cebadores. Para este proceso se utiliza la
Taq polimerasa para que añada nucleótidos complementarios para crear
las cadenas completas de ADN. La extensión de las cadenas es en
dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. La temperatura
óptima para la reacción es de 72 °C, ya que a esa temperatura la enzima
es funcional. Para este proceso, se programó el termociclador a una
temperatura de 72°C por 45 segundos. Al final del ciclo, se habrán
formado los amplicones con un tamaño dictado por el número total de
pares de bases (pb).
En el proceso de PCR realizado en laboratorio, se realizaron 29 ciclos. El
primero fue para separar las hebras de ADN, después hubo 25 ciclo de
replicación de ADN y finalmente se añadió 3 ciclos para que las hebras que no
terminaron de polimerizarse lo hagan, y de manera indeterminada se deja a
4°C.
La técnica de PCR es necesario para poder visualizar las bandas con mayor
nitidez porque al aumentar el número de copias, las bandas van a ser más
grandes, entonces se va a conseguir una mejor percepción del resultado y se
podrá manipular esa región de ADN con mayor facilidad. Sin embrago, los
factores que pueden afectar la eficiencia del ADN son:

- El diseño de los cebadores o iniciadores, es decir, los cebadores mal

diseñados pueden unirse a secuencias no deseadas, produciendo
amplificaciones inespecíficas.

- Concentración incorrecta de cebadores puede resultar en productos

inespecíficos o en una baja eficiencia de amplificación, una
concentración inadecuada de dNTPs pueden llevar a una síntesis de
ADN incompleta o a errores durante la amplificación y bajas
concentraciones de magnesio inhiben la actividad de la Taq polimerasa.

- Condiciones del ciclo térmico, durante la desnaturalización la

temperatura fue de 98°C, esta es ligeramente elevada y pudo haber
degradado las moléculas de ADN, de la misma manera, durante la
hibridación las temperaturas fueron ligeramente elevadas, los cuales
pueden reducir la especificidad de la unión de los cebadores. Sin
embargo, en la extensión la temperatura y el tiempo fueron
considerables.

Electroforesis
Cada molécula de ADN se diferencia por la cantidad de nucleótidos (tamaño) y
por la cantidad de aminoácidos (carga), en la electroforesis se atrae estas
cargas mediante corrientes eléctricas en una matriz inerte (gel), el ADN tiene
carga negativa (grupo fosfato), por lo tanto, su movimiento será hacia el medio
o polo positivo. Según Iwasa y Marshal (2014) sostienen que “la electroforesis
depende de la capacidad de las moléculas cargadas para migrar cuando se
colocan en un campo eléctrico […] en la que las proteínas son impulsadas por
una corriente aplicada a través de una matriz gelificada” (p. 716). Esta técnica
es utilizada para el diagnóstico de enfermedades, pruebas de paternidad, etc.

El gel utilizado fue agarosa al 2%, significa que se ha disuelto 2 gramos de

agarosa en 100 mililitros de tampón como TBE (Tris-borato-EDTA). Este gel se
prepara utilizando polímeros de agarosa obtenidas de un alga llamada
Gelidium spp., este gel de agarosa al 2% permitirá el paso de moléculas de
ADN con un peso entre 100 a 2500 pb con mayor facilidad porque tiene poros
un poco más grandes, es decir, la concentración de agarosa determina el
tamaño de los poros del gel. Para poder observar las bandas se utilizó el sybr
green porque brinda fluorescencia a las muestras, además es más sensible
que el bromuro de etidio y menos perjudicial para la salud. Según Starr et al.
(2013) sostiene que “los fragmentos de ADN de diferentes tamaños se mueven
a través del gel a distintas velocidades. Los fragmentos más pequeños se
mueven más rápido porque pasan a través de las moléculas del gel más rápido
que los fragmentos más grandes. Todos los fragmentos del mismo tamaño se
mueven a través del gel a la misma velocidad, por lo que se juntan en una sola
banda. Todos los fragmentos en una banda tienen el mismo dideoxinucleótido
al final” (p. 224). En la experimentación se usó corrientes eléctricas de 75
voltios por 55 minutos, se uso una corrida exploratoria, porque nuestro objetivo
es identificar el número de bandas y averiguar si el PCR funciono.
Finalmente se observó el gel con luz ultravioleta en un fotodocumentador, para
poder observar el ADN separado por las corrientes eléctricas, según Iwasa y
Marshall afirman que “la sensibilidad de la electroforesis en gel es tan grande
que las moléculas de DNA que difieren en un solo nucleótido se pueden
separar entre sí, una característica que dio lugar a un método invaluable para
la secuenciación del DNA” (p. 719). En la experimentación se observo que las
muestras se encuentran en el lado negativo(derecho) de la cámara de
electroforesis, tuvo un escaso movimiento del pocillo o pozos hacía el polo
positivo (izquierdo), es decir, que el ADN no se movilizo por los poros del gel de
agarosa.
Los factores que pueden influir negativamente en la obtención de resultados
son:
- Las moléculas de ADN obtenidas en la colección de ADN tenían
contaminantes químicos, la pureza de ácidos nucleicos/contaminantes
químicos fue de 0,3 A260/A230, este es un indicador que nuestro ADN
está contaminado con sales, carbohidratos y fenoles.

- Con respecto a la PCR, pudo ser el diseño de los cebadores o

iniciadores, concentración incorrecta de cebadores, concentración
inadecuada de dNTPs y de magnesio. Así mismo, la temperatura
programada para los ciclos fue de 98°C pero se recomienda usar una
temperatura de 95°C (Allott et al., 2015, p.124). Por lo tanto, la
temperatura programada fue un poco elevada, lo cual pudo haber
ocasionado que se degraden las moléculas de ADN y que los cebadores
no cumplan su función adecuadamente.

- En la electroforesis en gel, por problemas de peso o medida pudo que la

concentración de agarosa haya sido una concentración mayor de 2%,
debido a que es inversamente proporcional al movimiento de moléculas
 de ADN en un campo eléctrico, dicho de otra manera, a mayor
concentración de agarosa menor tamaño de poros, lo que dificulta el
paso del ADN. En síntesis, la concentración de agarosa fue mayor de
2% o bien las moléculas de ADN eran demasiado grandes lo que
dificulto su pronto movimiento en la cámara de electroforesis, sin
embargo, quizá si se hubiese dejado mayor tiempo en el campo eléctrico
se hubiese podido visualizar de mejor manera el movimiento de la
molécula del ADN hacia el polo positivo.

 Allott, A., Mindorf, D. y Azcue, J. (2015). Biología. Reino Unido: Oxford

University Press.
 Audesirk, T., Audesirk, G. y Byers, B. (2013). Biología la vida en la tierra con
fisiología (9na ed.). México: Pearson Educación de México.
 Madigan, M. T., Martinko, J. M., Bender, K. S., Buckley, D. H. y Stahl, D. A.
(2015). Biología de los microorganismos (14va ed.). España: Pearson
Educación, S.A.
 Rodríguez, A., Rizo, A. y Mora, D. (2016). Biología Molecular. Fundamentos
y aplicaciones en las ciencias de la salud (2da ed.). México: McGraw-Hill
Education. https://accessmedicina-mhmedical
com.cientifica.remotexs.co/content.aspx?bookid=1803&sectionid=124155671
 Scott, F. (2009). BIOLOGÍA (3ra ed.). Madrid: Pearson Educación, S. A.
 Iwasa, J. y Marshall, W. (2014). Biología Celular Y Molecular Conceptos Y
Experimentos (8va ed.). México: McGRAW-HILL Interamericana Editores,
S.A. de C.V.
 Starr, C., Evers, C. A. y Starr, L. (2013). Biología, conceptos y aplicaciones
(8va ed.). México: Cengage Learning Editores.