INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

LB-FCQ/CL2-1

Práctica 3. ÁCIDOS NUCLEICOS, AISLAMIENTO Y CUANTIFICA-

CIÓN
PARALELO BF4-002, GRUPO 3: Pachacama Melany, Piedra Joselin, Piñera Isabella, Quishpe
David, Sánchez Luis

Facultad de Ciencias Químicas, Carrera de Bioquímica y Farmacia, Cuarto Semestre.

RESUMEN: Como objetivo de la practica numero 3 tenía- procurando obtener un producto lo más puro posible, libre
mos como propósito la extracción de la cadena de ADN y la de contaminantes, para su posterior utilización en estrate-
observación de esta. Para llegar a estos resultados se siguió gias como la secuenciación genética1.
de manera rigurosa los siguientes pasos. En primer lugar,
Para obtener DNA, se puede recolectar de células o virus,
hicimos la extracción de la sangre correspondiente a un
excluyendo aquellos que carecen de núcleo. Las fuentes de
compañero ya que unánimemente se llegó a la decisión de
obtención incluyen sangre, suero, plasma, orina, heces,
elaborar la practica acerca de ADN animal. Posterior a eso
folículo capilar, entre otras2. El proceso de extracción gene-
se puso la sangre en tubos para llevar la misma a centrifu-
ralmente implica la lisis celular, seguida de la separación,
gar y de esa manera obtener dos soluciones, el plasma y el
purificación, precipitación, lavado y disolución del DNA.
suero sanguíneo. Cada uno eligió su objeto de estudio, para
a través de un proceso detallado llegar a observar la cadena
Durante todo el procedimiento, es fundamental mantener
de ADN. Luego de cada uno elegir la solución para el análi-
los reactivos y la muestra a una temperatura baja para ase-
sis. se rompió la célula de manera brusca utilizando un
gurar la integridad del DNA. Para cuantificar la cantidad de
vortex, posterior a eso pusimos en un baño maría, donde
ADN presente en una muestra, se utiliza espectrofotometría,
pasando 2 min las soluciones al unánime durante 10 min
un método que se basa en la capacidad de las soluciones
obteníamos una solución un poco más homogénea. Po lo
con moléculas suspendidas para absorber luz a una longi-
que volvimos a llevar a la centrifuga, para luego trasvasar la
tud de onda específica, generalmente 260 nm. La intensidad
solución resultante y agregando un reactivo volver a llevar a
de la luz absorbida se mide con un fotodetector.
centrifugación. Obtuvimos nuevamente dos soluciones lo
cual retiramos la parte superior con cuidado y una micropi- Para determinar la concentración de ácidos nucleicos, se
peta, añadimos a la parte que solo tenía botón NaCl pusi- emplea la siguiente fórmula:
mos en la centrifuga y luego botamos la parte liquida para
que de esa manera quedara permaneciendo solo la cadena g 50  g ( DNA / mL)
Concentración( DNA) = OD  FD 
de ADN en el tubo a la cual añadimos etanol centrifugamos mL 1unidad (OD )
y por último pusimos agua ultrapura y conservamos en el
congelador. El proceso se llevó a cabo con éxito ya que Esta fórmula incluye la densidad óptica (OD), el factor de
pudimos observar nuestra cadena de ADN, aunque, de dilución (FD) y un valor específico que varía según el tipo de
manera un poco pequeña, pero se logró observar con éxito. ácido nucleico3.
Mediante los cálculos se discutió que nuestra de ADN no
era tan puras, ya que no se cumplió con el valor de pureza ,
siendo este 1.48.
METODOLOGÍA: 1.) Se tomo la muestra de sangre de un
compañero llamado Sebastián Cisneros, quien dono volun-
INTRODUCCIÓN: Los ácidos nucleicos, como el ADN, tariamente su DNA, además, es importante recalcar que el
desempeñan un papel crucial al almacenar la información genoma humano es de 3000 millones pares de bases. 2.)
genética y regular diversos procesos celulares esenciales Está muestra es centrifugada (10 min y 3600 rpm/min) se
para todos los organismos vivos. Sin embargo, para estu- separó en plasma y el botón hemático. 3.) 150 μl de plasma
diarlos adecuadamente, es necesario separarlos de otros
o botón hemático se repartió a los grupos presentes. 4.) Se
componentes celulares como lípidos y proteínas, que son
añadió 300 μl de Buffer de extracción pH=8. 5.) Se utilizo un
más abundantes que los ácidos nucleicos en las células. Este
vortex para ayudar a romper la célula. 6.) Se incubo a baño
proceso de extracción de DNA implica obtener o aislar una
muestra de DNA (ácido desoxirribonucleico) de células u maría con una temperatura entre 65-75 ⁰C y 10 min en el
otros materiales biológicos, asegurando su integridad y termo bloque, mezclar cada 2 min dentro de los 10 min. 7.)
Se centrifuga a 15000 rpm por 5 min. 8.) Lo que se obtuvo
de la centrifuga se trasvasa a un tubo nuevo y se añade 150
μl de PCI (fenol cloroformo isoamílico). 9.) Se centrifuga
15000 rpm por 3 min. 10.) Trasvasar el DNA con la micropi-
peta toda la parte de arriba y no topar la parte de abajo que
es la sustancia orgánica (precipitado). 11.) Añadir 100 μl de
NaCl para precipitar. 12.) Se coloca 180 μl de alcohol iso-
propílico y centrifugamos a 15000 rpm por 5 min. 13.) Se
drena el alcohol isopropílico. 14.) Colocar etanol 200 μl para
lavar. 15.) centrifugamos a 15000 rpm por 5 min. 16.) Se
drena el etanol. 17.) Agregar 30 μl de agua ultrapura. 18.)
Ilustración 3: DNA obtenido del botón hemático
por último llevar a congelar.
Una vez pasado dicho tiempo, se tiene una muestra lista para ser
RESULTADOS: ocupada en la espectrometría, la cual arrojaría los siguientes datos:
Al realizar el vortex se pudo observar en el tubo Eppendorf una
especie de espuma, el cual fue el primer cambio visualmente
llamativo en este procedimiento,

Ilustración 1: Resultados del vortex

Ilustración 4: Resultados de electro-
Posteriormente se procede a llevar a una centrifuga para separar la foresis.
fase acuosa de la muestra

Calculos

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑁𝐴= 0,726 𝜇𝑔/𝑚𝑙

𝐵𝑜𝑡𝑜𝑛 ℎ𝑒𝑚𝑎𝑡𝑖𝑐𝑜 𝑢𝑠𝑎𝑑𝑜 = 150𝜇𝐿 = 0,15 𝑚𝐿

Relación de absorbancias

𝑎𝑏𝑠260 0,066
= = 1,1
𝑎𝑏𝑠280 0,060

𝑎𝑏𝑠280 0,060
= = 1,25
𝑎𝑏𝑠320 0,048

Ilustración 2: Formación de fases de la muestra. Transformación de unidades

Se obtiene la muestra y se la lleva a refrigeración (idealmente a - 𝜇𝑔
80 oC), por alrededor de 48 horas. 0,15 𝑚𝐿 𝐷𝑁𝐴 ∗ 0,726 = 0,1098𝜇𝑔 𝐷𝑁𝐴
𝑚𝐿
0,001 𝑚𝑔 𝑚𝑔
0,1098𝜇𝑔 × = 1,098 × 10−4 𝐷𝑁𝐴
1 𝜇𝑔 𝑚𝐿
• Pureza de la muestra 1.48 como se aprecia en el gráfico, mientras que el valor
aceptado es de 1.8. El valor experimental de 1.1 difiere con
los valores teóricos indicando que el DNA extraído no es
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 − 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙
%𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = | | muy puro por ende tiene presencia de impurezas, esto se
𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 debe a varios factores, como son los materiales y sustancias
empleadas en la extracción del material genético, especial-
1,8 − 1,482 mente la cantidad de sangre utilizada la cual fue una pe-
%𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = | | × 100 queña cantidad,, otro factor es la contaminación de los
1,8
materiales provocando que se creen impurezas, finalmente
%𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = 17,67 % la temperatura influye bastante en la óptima conservación
del DNA la cual requiere una temperatura aproximada de
-20 oC5
DISCUSIÓN:
La extracción de DNA se lo realiza para estudiar el material REFERENCIAS:
genético y para esto es necesario obtener únicamente el
DNA, para lograrlo se emplean diversas técnicas y/o proce-
dimientos tales como: extracción de DNA mediante solven- (1) Cruz-Enríquez, J. A.; Espinosa-Padilla, S. E.; Medina-
tes orgánicos, por el método de precipitación por sales, Torres, E. A. Importancia Del Adecuado Protocolo
absorción de columnas de sílice y finalmente el método de de Extracción de DNA Para Estudios Moleculares.
purificación por unión de microesferas magnéticas4. En esta Alergia, Asma e Inmunología Pediátricas 2021, 30
practica es necesario realizar la lisis de la membrana plas- (2), 50–53. [Link]
mática y luego la membrana del núcleo, para esto se utilizó
una solución buffer de extracción, la centrifugadora y poste- (2) Aplicaciones, F. Y. Biología Molecular Fundamentos y
riormente se usó una solución acuosa de NaCl (cloruro de Aplicaciones.... Carlos Beas.
sodio) esto debido a que las sales aumentan el poder iónico
de la solución y ocasionan la precipitación del ADN5 . Ade-(3) (3) Rojas, A. C. Aprender Es Conocer Extracción de ADN.
más, se empleó etanol y alcohol isopropílico, esto no afecta Conogasi 2020, 1–5.
al DNA debido a que el material genético es insoluble en
alcohol. Posteriormente se midió la absorbancia mediante (4)el (4) National, S.; Network, B. Red Nacional de Biobancos;
espectrómetro y se obtuvo 0.066 en 260 nm y 0.060 en 280 2011. [Link]
nm. [Link].

El cálculo de pureza del DNA se lo realizó mediante el co- (5) Mosquera, R. V. (2005). Marcadores moleculares y la
ciente entre el valor de absorbancia en 260 nm y el valor en extracción de ADN. Biotecnología en el Sector Agropecuario
280 nm, con un resultado de 1.1 de pureza, el espectróme- y Agroindustrial: BSAA, 3(1), 14-18.
tro proporciona el valor de la pureza del ADN siendo del