MANUAL DE PRÁCTICAS

DE MICROBIOLOGÍA
TÉCNICO SUPERIOR UNIVERSITARIO
QUÍMICA ÁREA BIOTECNOLOGÍA

Docente:

Dr. Juan Manuel Carmen Cristóbal

MAY- AGO 2024

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DEL VALLE DE TOLUCA
UNIDAD ACADÉMICA DE CAPULHUAC
 PRÁCTICA 1

USO Y MANEJO DEL EQUIPO DE MICROBIOLOGÍA (EL MICROSCOPIO)

FECHA DE EMISIÓN: ELABORÓ: M. en CARN. Juan Manuel Carmen Cristóbal

FECHA DE REALIZACIÓN: REVISÓ:

ASIGNATURA: Microbiología APROBÓ:

UNIDAD TEMÁTICA Introducción a la microbiología

TEMA: Diversidad Microbiológica y Uso del microscopio CUATRIMESTRE: TERCERO

NÚMERO DE PARTICIPANTES RECOMENDABLE: 4 DURACIÓN: Tres Horas

LUGAR: Laboratorio de Microbiología Profesor: M. en CARN. Juan Manuel Carmen Cristóbal

REQUISITOS TEÓRICOS DE LA PRÁCTICA:

• Equipos más comunes del laboratorio de microbiología

• Uso y manejo del microscopio
• Características de los microorganismos

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Objetivo general

Describir el equipamiento del laboratorio de microbiología y su uso.

Objetivos específicos

• Describir el equipamiento y material del laboratorio de microbiología.

• Identificar los elementos que componen un microscopio compuesto.

• Manejar adecuadamente el microscopio óptico aplicando una correcta técnica

de enfoque.

• Mencionar los cuidados de los equipos de laboratorio.

• Conocer la diversidad microbiológica haciendo uso del microscopio.

 MATERIAL: REACTIVOS: EQUIPO:

Caja Petri Aceite de inmersión Microscopio óptico

Pipeta Pasteur Incubadora bacteriológica

Portaobjetos Autoclave

Cubreobjetos Contador de colonias

Muestras de agua negras Cámara de flujo laminar

Muestra de agua
estancada

Pan con moho

ANTECEDENTES

Los microorganismos son tan pequeños que resulta imposible observarlos individualmente a
simple vista, por lo que se hace necesario disponer de un instrumento que permita
visualizarlos para distinguirlos y estudiarlos, dicho instrumento es el microscopio, el cual se
define como un sistema óptico formado por una combinación de lentes para conseguir
imágenes aumentadas de tamaño que hacen visibles al ojo humano.

La palabra se deriva del antiguo griego MICROS que significa pequeño y SKOPEIN, observar.
El primer microscopista fue Anthony Van Leewenhoek, quien observó por primera vez la
vida microscópica en el agua de lluvia, agua de mar, sarro dentario y muchos otros
materiales.

Las partes de un microscopio están constituidas por la parte mecánica: base o pie, brazo,
tornillo micrométrico, tornillo micrométrico, tubo, platina, subplatina, carro y revolver o
portaobjetivos; y la parte óptica está constituida por una fuente de luz, condensador,
objetivos y ocular.

Microscopios ópticos especiales

Microscopio de Luz ultravioleta

Microscopio de campo obscuro

Microscopio de contraste de fase

Microscopio electrónico
Por otra parte, los microorganismos son los seres más numerosos que existen en la tierra; son
organismos ancestrales que han colonizado exitosamente cada nicho ecológico posible.
Los microorganismos se encuentran prácticamente en todas las regiones del planeta,
desde los polos, en ambientes bajo el punto de congelación y muy secos, hasta los trópicos
con temperaturas altas y con elevada precipitación pluvial. Su presencia y actividad es
esencial para la salud y funcionamiento adecuado de todos los ecosistemas. Podemos
encontrar: bacterias, virus, algas, hongos y protozoarios principalmente.

PROCEDIMIENTO

• Se dará a conocer el equipamiento del laboratorio de microbiología y su uso.

• Cada equipo dispondrá de un microscopio, con la finalidad de Identificar cada una

de sus partes y sus funciones.

• Cada estudiante revisará una preparación con cada una de las muestras

• Para la toma de muestra, con la ayuda de una pipeta Pasteur se coloca una gota
sobre el portaobjetos e inmediatamente se coloca encima el cubreobjetos

• Se observa en el microscopio a 4X, 10X y 40X

• Cuando se tiene identificado un microorganismo, colocar una gota de inmersión sobre

el cubreobjetos y observar a 100X

• Repetir con todas las preparaciones

• Observar las preparaciones proporcionadas por el docente

• El alumno identificará las diferentes formas de los microorganismos

• Dibujar todas las observaciones y realizar sus respectivas anotaciones

• Limpiar el equipo y lavar el material.

• Dejar el espacio limpio y recogido

Conocimiento del microscopio.

Para su estudio, se pueden distinguir tres partes: una mecánica, óptica y de iluminación.

1.- Parte mecánica: Constituye el soporte de la parte óptica y consta de:

 • El estativo: formado por el pie o base del microscopio y el brazo o asa, ambos
constituyendo un solo cuerpo.

• La platina: placa cuadrada o circular en la que se apoya la preparación a

observar.

• Dispone de unas pinzas que permiten sujetar la preparación. La platina se halla

perforada en el centro para dejar paso a los rayos luminosos procedentes de la fuente de
luz.

• El tubo: pieza cilíndrica y hueca en cuya parte superior se sitúa una lente (el ocular)
y en la inferior se encuentra una pieza giratoria llamada revólver que lleva enroscadas otras
lentes (los objetivos) que, en este caso, son tres, aunque en otros modelos de microscopio
pueden ser más.

• Tornillos: de enfoque, que permiten el desplazamiento del tubo mediante una

cremallera dentada, de modo que, al acercar o alejar el tubo de la preparación se
consigue el enfoque de la misma. Son el tornillo macrométrico que hace un desplazamiento
rápido y el tornillo micrométrico que hace un avance fino.

2.- Parte óptica: Comprende los sistemas de lentes que consta de las siguientes piezas:

• El ocular: llamado así por ser la lente sobre la que se aplica el ojo del observador. Tiene
como misión aumentar la imagen producida por el objetivo. Su aumento viene señalado
por una cifra y el signo X (5X, 10X, 20X, etc.)

• El objetivo: es la lente que se encuentra sobre el objeto (preparación) a observar. Es el

elemento óptico más importante, puesto que es el que produce la imagen aumentada del
objeto, esta imagen, además, la observamos invertida (el objetivo funciona como una
cámara fotográfica) de ahí que, lo que observamos a la derecha de la preparación se
encuentre realmente a la izquierda y viceversa. Los aumentos de los objetivos vienen
indicados sobre los mismos y son, para este microscopio, 4X, 10X y 40X. El aumento total del
microscopio se obtiene multiplicando los aumentos del ocular por los del objetivo con el
que se está realizando la observación.
3.-Iluminación: está formado por una lámpara que ilumina directamente el objetivo. Existe
también un diafragma que se puede abrir o cerrar mediante una palanquita regulando así
la intensidad luminosa.

Cuidado del microscopio

1.- Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición
de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde
de la misma y dejarlo cubierto con su funda.

2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda
para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar deforma prolongada, se
debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.

3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente
con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.

4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio.

5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el
objetivo con pañuelos especiales para, óptica o con papel de filtro (menos
recomendable). En cualquier caso, se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con
suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con
una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza,
porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.

6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico,

platina, revolver y condensador).

7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la

preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de
objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través
del ocular. -

8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido,
secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.
9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al
acabar el curso, encargar un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.

CONCLUSIÓN

El microscopio es un instrumento de laboratorio que se utiliza como herramienta que le

permite al estudiante, describir las características y función de distintos organismos
unicelulares y pluricelulares, es fundamental que el estudiante identifique las partes ópticas
y mecánicas, que le sirve de conocimiento previo en las subsecuentes prácticas de
Microbiología.

BIBLIOGRAFIA

Méndez, ME., Hernández, ME., Padilla, S., González, L., Vera, O., Rocha, J. 2014 Book Mart.
México.

Gama, MA. 2010. Biología, competencias, aprendizaje, vida. Pearson. México.

De Erice, E. 2012. Biología la ciencia de la vida. Mc Graw Hill.

PEDRAZA FLORES, EDUARDO; VELAZCO TEJADA ELIZABETH. Manual de prácticas de

biología I. Universidad de colima
 PRÁCTICA 2.

ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN

FECHA DE EMISIÓN: ELABORÓ: DR. Juan Manuel Carmen Cristóbal

FECHA DE REALIZACIÓN: REVISÓ:

ASIGNATURA: Microbiología APROBÓ:

UNIDAD TEMÁTICA: Esterilización y Desinfección
TEMA: Autoclave CUATRIMESTRE: Tercero

NÚMERO DE PARTICIPANTES RECOMENDABLE: 5 DURACIÓN: Dos horas y media

LUGAR: Laboratorio de Microbiología Profesor: Dr. Juan Manuel Carmen Cristóbal

REQUISITOS TEÓRICOS DE LA PRÁCTICA:

Tipos de esterilización

Tipos de desinfectantes

Uso y manejo de la autoclave

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Que el alumno conozca los principios generales de las técnicas de esterilización de

materiales de vidrio y medios de cultivo de uso común en Microbiología.
 MATERIAL: REACTIVOS: EQUIPO:

Cajas Petri Alcohol 96% Autoclave

Matraz Erlenmeyer 250 mL con Agua destilada

tapa

Pipetas 1-3 mL

Pipeta 10 mL

Probeta graduada

Tubos con tapón

Papel estraza

Algodón

Gasas

Cinta masking tape

Hilo

ANTECEDENTES

Los microorganismos como otros seres vivos son susceptibles a los cambios de condiciones
ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han
distribuido en una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre
todo de tipo físico químico.

Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para

limitar su presencia o eliminarlos. La esterilización es un método de eliminación total de todo
tipo de organismo y que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras
que la desinfección es un proceso que solamente elimina formas vegetativas de los
microorganismos.

La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de mayor utilización en
Microbiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por
oxidación, por ejemplo, al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en un horno
a 150º-180ºC durante 2 horas. Estos métodos se aplican principalmente en la esterilización
de asas de inoculación y todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.

Los procesos de con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones,
cultivos bacterianos que se desechan, el más recomendable es la autoclave en el que se
utiliza vapor de agua a presión para alcanzar temperaturas de 121º C. El material se deja a
esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destrucción de endosporas,
que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor.
Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como soluciones de
vitaminas, aminoácidos, etc. se esterilizan por filtración en membranas estériles de 0.2 micras
de diámetro y para el caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gases como
óxido de etileno o con radiaciones gama. Las superficies generalmente se desinfectan con
radiaciones UV o compuestos químicos en forma líquida como: los fenoles, compuestos
cuaternarios de amonio, formaldehído, alcoholes, halógenos y detergentes.

Cada uno de estos procedimientos tienen ventajas y desventajas de uso, los sistemas de
filtración son muy eficientes y rápidos para la esterilización, pero sólo se aplican en
pequeños volúmenes. Los fenoles y compuestos cuaternarios de amonio son muy efectivos
para la desinfección de superficies, pero son muy corrosivos. Los detergentes y los alcoholes
tienen actividad limitada contra esporas bacterianas y algunos virus por lo que sólo son
desinfectantes.

PROCEDIMIENTO

Preparación del material de vidrio

1. Lavar perfectamente las cajas Petri y pipetas con escobillón y detergentes. Enjuagar
con abundante agua corriente.
2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una piseta,
por las paredes. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe
secar el material por otro medio.
3. Una vez seco el material se procederá a envolver las cajas Petri y pipetas con papel
estraza. Para los tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y gasa,
procurando que ajusten con holgura, sobre los que finalmente se les colocará un
capuchón de papel.

Esterilización de materiales

1. Todo el material se esteriliza en autoclave (excepto el material de plástico) de acuerdo

a las siguientes instrucciones:
a. Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador. En
caso necesario añadir agua destilada.
b. Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto.
Acomodar los medios y materiales en la canasta de la autoclave y colocarla
dentro.
c. Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y
esperar a que salga el vapor de agua por el orificio de purgado. Después cerrar
este orificio con la válvula de seguridad.
d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121º C o 15 lbs de presión
revisando continuamente la escala del manómetro. Una vez alcanzada esta
temperatura deberá bajarse el nivel de calentamiento moviendo la perilla de
control a nivel medio o bajo.
e. Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos.
f. Apagar la autoclave y dejar que baje la presión al vapor de “0”. Quitar la válvula
de seguridad y con la ayuda de guantes de asbesto o una jerga húmeda abrir
cuidadosamente la puerta, de adelante hacia atrás para evitar quemaduras
por la salida de vapor.
2. Guardar todo el material esterilizado en la caja hermética etiquetando su material.
 BIBLIOGRAFÍA

Aquiahuatl Ramos María de los Ángeles y Pérez Chabela María de Lourdes. (2004). Manual de prácticas
del laboratorio de Microbiología General. Departamento de Biotecnología, UAM, Iztapalapa pp. 12-16
 PRÁCTICA 3

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

FECHA DE EMISIÓN: ELABORÓ: Dr. Juan Manuel Carmen Cristóbal

FECHA DE REALIZACIÓN: REVISÓ:

ASIGNATURA: Microbiología APROBÓ:

UNIDAD TEMÁTICA: BACTERIAS
TEMA: MEDIOS DE CULTIVO CUATRIMESTRE: TERCERO

NÚMERO DE PARTICIPANTES RECOMENDABLE: 5 DURACIÓN: Tres Horas

LUGAR: Laboratorio de Microbiología Profesor: Dr. Juan Manuel Carmen Cristóbal
REQUISITOS TEÓRICOS DE LA PRÁCTICA:

Conocer uso y clasificación de los medios de cultivo

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Diferenciar y preparar los medios de cultivo de acuerdo con su función y consistencia

para el crecimiento microbiano.

MATERIAL: REACTIVOS: EQUIPO:

Cajas Petri esterilizadas

Matraz Erlenmeyer 250 mL Caldo nutritivo Refrigerador

Pipetas 1-3 mL Agar nutritivo Autoclave

Tubos con tapón Agua destilada Balanza analítica

Espátula Alcohol 70% Incubadora

Mechero

Agitador magnético

Perilla

Probeta graduada 250 mL

Papel Parafilm

Algodón

Gasas

Cinta masking tape

ANTECEDENTES
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar
su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de
oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de
cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante.

Tipos de medios de cultivo Por su estado:

a. Medios líquidos: llevan disueltos los nutrientes principales

b. Medios sólidos: llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacárido acídico

producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45° C. Se usa a una
concentración del 1,5%.

c. Medios semisólidos: agar a una concentración del 0,7%.

Por su composición:

a. Medios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono, fuente de

nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca...), otros elementos como son
estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a
concentraciones conocidas.

b. Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevan ingredientes

como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. que
contienen nutrientes en abundancia, pero sin saber con exactitud la composición
cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.

Por su función

a. Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos

adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos
(particularmente heterótrofos exigentes). Ejemplo: adición de sangre, suero o extractos de
tejidos de animales y plantas.

b. Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento

específico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de gran
utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana
mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos; adicionando
cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram (+); utilizando maltosa como única fuente
de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.

c. Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de

microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en
dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkey
diferencia lactosa (+) de lactosa (-).
d. Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que
el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Ejemplo: al
añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio
por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento.

PROCEDIMIENTO

1. Pesar el medio de cultivo a en los matraces de 250 ml de acuerdo con las

instrucciones de la etiqueta (100 ml de cada uno), agregar la cantidad de agua
requerida y disolver parcialmente.

2. Colocar en autoclave los medios para esterilizar (revisar indicaciones en etiqueta de

cada medio de cultivo)

3. Cumplido el ciclo de esterilización, esperar a que baje la presión antes de abrir nunca
agregar agua para enfriar rápidamente.

4. Vaciar el medio a 4 cajas Petri, aproximadamente 20 ml por caja, esperar a que

solidifique antes de invertir para incubar.

a. Trabajar el procedimiento frente a la llama del Mechero Bunsen y sin hablar.

b. Quitar con mucho cuidado el empaque exterior de cada una de las cajas de
Petri, sin destapar directamente la caja.

c. Cada estudiante deberá apilar las cajas a la izquierda del mechero, dejando
hacia arriba la tapadera de mayor tamaño.

d. Colocar los Erlenmeyer conteniendo el agar nutritivo frente a la llama del

mechero. (Asegúrese de que el medio de cultivo esté totalmente líquido, para
verterlo)
e. Retirar el tapón de gasa, y flamear con cuidado la boca del Erlenmeyer.

f. Tomar una caja con la mano izquierda, colocarla frente al mechero y

destaparla parcialmente.

g. Verter aproximadamente 20 ml del medio en la primera caja de Petri con la

mano derecha.

h. Tapar inmediatamente la caja de Petri.

i. Trasladar la caja debidamente tapada, a la derecha del mechero con la

mano izquierda, evitando agitar el contenido de la caja. (No la aleje más de
50 cm. de distancia de la llama del mechero)

j. Flamear de nuevo la boca del Erlenmeyer.

k. Repetir el mismo procedimiento con las restantes cajas de Petri.

l. Con la mano izquierda, destapar parcialmente la caja de Petri, sin soltar la

tapadera superior.

m. Con la mano derecha, tomar el mechero y pasar muy suavemente la llama

sobre la superficie del medio, hasta eliminar toda burbuja que hubiera
quedado en la superficie del medio.

n. Tapar inmediatamente la caja de Petri con mucho cuidado.

o. Dejar solidificar el medio por término de 30 minutos.

5. Realizar la prueba de esterilidad a una o dos cajas de cada medio preparado,
incubando a 37 °C por 24 hrs.

a. Anotar observaciones

6. Sellar las cajas Petri con Parafilm y llevarlas al refrigerador

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Meths. 4th. Ed. Boston:

Butterwortths.
• Prescott, L. M., Harley, J. P. y Klein, D. A. 1999. “Microbiología “. 4a ed. Edit.
McGraw-Hill-Interamericana. España, Pp. 729-733.
 PRÁCTICA 4

SIEMBRA Y CRECIMIENTO MICROBIANO

FECHA DE EMISIÓN: ELABORÓ: Dr. Juan Manuel Carmen Cristóbal

FECHA DE REALIZACIÓN: REVISÓ:

ASIGNATURA: Microbiología APROBÓ:

UNIDAD TEMÁTICA: Crecimiento bacteriano
TEMA: Cultivo de microorganismo CUATRIMESTRE: Tercero

NÚMERO DE PARTICIPANTES RECOMENDABLE: 5 DURACIÓN: Tres Horas

LUGAR: Laboratorio de Microbiología Profesor: Dr. Juan Manuel Carmen Cristóbal
REQUISITOS TEÓRICOS DE LA PRÁCTICA:

Conocer técnicas de toma de muestra y siembra en los medios de cultivo

Estría y Picadura

Morfología macroscópica

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Que el alumno conozca las diferentes técnicas de toma de muestra y siembra en los
medios de cultivo para poder conocer la morfología de las sepas bacterianas.

Específicos:

a. Compruebe la presencia de microorganismos en diferentes superficies.

b. Adquiera habilidad en el manejo de medios de cultivo para determinar la presencia
de ciertos microorganismos.
c. Explique la importancia de trabajar con asepsia en un laboratorio de microbiología.

MATERIAL: REACTIVOS: EQUIPO:

10 Cajas Petri con agar nutritivo Alcohol 70% Refrigerador

2 Pipetas 1-3 mL Incubadora
10 Tubos con caldo nutritivo
Balanza analítica
1 Mechero

1 Perilla

2 Asas bacteriológicas

2 abatelenguas
 5 hisopos estériles

Un trozo de lechuga o alguna otra

verdura

Cinta masking tape

ANTECEDENTES

En Microbiología se entiende como siembra el proceso mediante el cual se lleva una porción de una
población de microorganismos, denominada entonces inóculo, de un cultivo crecido a un medio nutritivo
para su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente
esterilizados y siguiendo las instrucciones de los monitores de prácticas. La principal advertencia consiste en
trabajar siempre próximos a la llama del mechero que, debido a las corrientes de convección verticales
que genera, es capaz de crear un ambiente estéril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la
llama.

Como instrumento porta inóculos más frecuentes se utiliza el asa de siembra, con el que se puede tomar
inóculo a partir de colonias o de medio líquido, debido a que mantiene un pequeño volumen de agua por
tensión superficial. Para depositar el inóculo en líquido basta con introducir el extremo en el medio y agitar
ligeramente. Sobre sólido hay que hacer un recorrido largo sobre la superficie salvo en el caso del medio TSI,
en el que también hay que inocular picando en profundidad para observar reacciones metabólicas en
anaerobiosis. A veces se utilizan pipetas para transportar volúmenes grandes de inóculos como en la
práctica de crecimiento bacteriano.

PROCEDIMIENTO

Toma de muestras.

Muestra representativa del ambiente.

• Rotular la caja con un trozo de masking-tape indicando el tipo de muestra y la fecha.

• Quitar la tapa superior de la caja y déjela expuesta al aire del laboratorio durante 15 minutos
• Cubrirla de nuevo e incubar a 37o C por 48 horas.
Muestra de superficies.

o Rotular la caja indicando el tipo de muestra y la fecha.

o Remover el forro de un hisopo estéril y frotar la superficie de la verdura
o Con la mano izquierda, tomar la parte inferior de la caja que contiene el medio de cultivo.
o Con la mano derecha, tomar el hisopo e inocular la muestra en uno de los lados de la muestra.
o Remover el forro de un hisopo estéril y frotar una superficie de la mesa de trabajo que no haya sido
desinfectada.
o Con la mano izquierda, tomar la parte inferior de la caja que contiene el medio de cultivo.
o Con la mano derecha, tomar el hisopo e inocular la muestra en el otro lado de la caja.
o Identificar con el marcador la parte posterior del lado de la caja donde se inoculó.
o Tapar la caja y colocarla en la incubadora a 37 ºC durante 48 horas.
o Remover el forro de un hisopo estéril y frotar con la saliva de un compañero
o Con la mano izquierda, tomar la parte inferior de la caja que contiene el medio de cultivo.
o Con la mano derecha, tomar el hisopo e inocular la muestra en el otro lado de la caja.
o Tapar la caja y colocarla en la incubadora a 37 ºC durante 48 horas.
Muestra de mano

• Con el marcador trazar una línea divisoria a la mitad del fondo exterior de la caja.
• Levantar la tapa de la caja y tocar el lado derecho de la superficie del agar con la yema de los dedos,
tapar inmediatamente la caja.
• Lavarse las manos con abundante agua y jabón y frotar fuertemente los dedos.
• Secar la yema de los dedos de una mano, con gasa estéril y repetir el mismo procedimiento, en el
otro lado de la caja.
• Tapar e incubar a 37º C por 48 horas.

Hacer observaciones a 24 y 48 horas

 RESULTADOS

Observación macroscópica.

El tamaño de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin embargo, las colonias
que forman sobre medios sólidos sí son visibles, y en ellas se puede estudiar una serie de
características que nos ayudan a su identificación. A nivel morfológico, podemos estudiar
la forma de las colonias, su tamaño, aspecto del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado,
etc.), presencia de brillo, color, etc. Incluso sobre medio líquido las bacterias producen
modificaciones de interés para su clasificación y que tienen que ver esencialmente con las
características de su metabolismo. Así se observa si la turbidez es uniforme, si crecen en el
fondo, si lo hacen en la zona superficial, si producen pigmentos, etc.

TÉRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGÍA DE COLONIAS EN LA SUPERFICIE DE UN

MEDIO SÓLIDO
 SUPERFICIE

Lisa

Rugosa

Plegada

CONSISTENCIA (probarla con el asa)

Cremosa

Membranosa

COLOR
Se usan términos comunes para definirlo y se especifica si el pigmento producido difusible
o no.

CARACTERÍSTICAS ÓPTICAS

LUZ TRANSMITIDA (observar a través de la colonia)

Opaca: no permite el paso de luz

Traslúcida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los objetos observados a
través de la colonia.

Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramente los objetos observados a
través de la colonia.

LUZ REFLEJADA (observar la superficie de la colonia)

Opaca

Brillante

CULTIVO EN CALDO

Al igual que en los medios sólidos, en los medios líquidos las características de la bacteria
sembrada se reflejan en las características que presenta el caldo inoculado como son:

Turbidez: Opacidad más o menos densa, signo de crecimiento.

Película: Crecimiento casi continuo sobre el líquido

Sedimento: Depósito de células en el fondo del tubo que se resuspende al agitar.

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS
 Anote las características coloniales de cada cepa en la tabla, basándose en el texto, las
figuras:

AGAR EN SUPERFICIE

Bacteria

Forma

Borde

Elevación

Superficie

Consistencia

Color

Luz transmitida

Luz reflejada

CALDO

Película

Turbidez

Sedimento

BIBLIOGRAFÍA

• Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Meths. 4th. Ed. Boston:

Butterwortths.

• Prescott, L. M., Harley, J. P. y Klein, D. A. 1999. “Microbiología “. 4a ed. Edit.

McGraw-Hill-Interamericana. España, Pp. 729-733.

PRÁCTICA 5

AISLAMIENTO MICROBIANO
FECHA DE EMISIÓN: ELABORÓ: Dr. Juan Manuel Carmen
Cristóbal

FECHA DE REALIZACIÓN: REVISÓ:

ASIGNATURA: Microbiología APROBÓ:

UNIDAD TEMÁTICA: Bacterias
TEMA: Aislamiento microbiano CUATRIMESTRE: Tercero

NÚMERO DE PARTICIPANTES RECOMENDABLE: DURACIÓN: Tres Horas

5
LUGAR: Laboratorio de Microbiología Profesor: Dr. Juan Manuel Carmen
Cristóbal

REQUISITOS TEÓRICOS DE LA PRÁCTICA:

Medios de cultivo específicos

Agar sangre ¿Cómo se prepara?

Agar Mackonhy

Agar verde brillante

Agar para método estándar

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Conocer las técnicas de aislamiento microbiano para evaluar la forma de la medición

bacteriana

Seleccionar técnicas específicas para aislar un microorganismo puro.

MATERIAL: REACTIVOS: EQUIPO:

12 Cajas Petri esteriles Alcohol 96% Refrigerador

Pipetas 1-3 mL Agar MacKonky Incubadora

2 Mecheros Agar Sangre Autoclave

1 Perilla Agar para

método Estandar
1 Matraz Erlenmeyer
 2 asas bacteriológicas Agar Verde
Brillante
Cultivos de
microorganismos 10 mL de Sangre

Papel Parafilm

2 Tubos para sangre o

jeringas estériles

ANTECEDENTES

Un cultivo puro o axénico es aquel formado por células provenientes de una sola colonia inicial y por tanto
perteneciente a la misma especie y cepa. Es una situación artificial ya que en la naturaleza los
microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas y heterogéneas. Es un artificio obligado para
estudiar cada especie y cepa de microorganismo en particular.

PROCEDIMIENTO

1.- Cada equipo preparará una un medio cultivo para 12 cajas Petri, siguiendo las
recomendaciones en las prácticas anteriores.

Métodos para aislar cultivos puros Técnica de siembra por estrías en placa.
 a) Tomar una asada de la muestra original y descargar el asa en una de las orillas de
las placas de los medios de cultivo preparados.

b) Esterilizar el asa al rojo de la flama del mechero.

c) Enfriar el asa y hacer otra serie de estrías

d) Esterilizar nuevamente el asa y dejarla enfriar

e) Realizar la misma técnica realizado de 4 series de estrías

f) Incubar las placas a 37° C/ 24 hrs.

RESULTADOS

Anote las características coloniales de cada cepa en la tabla

AGAR EN SUPERFICIE

Cepa Cepa Cepa 3 Cepa 4 Cepa 5 Cepa 6 Cepa 7

1 2

Tamaño

Borde

Elevación

Superficie
 Consistencia

Color

Luz transmitida

Luz reflejada

Con base a las características macroscópicas, ¿qué bacterias podrían ser las que se
encuentran en los medios de cultivo?

BIBLIOGRAFÍA

• Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Meths. 4th. Ed. Boston:

Butterwortths.

• Prescott, L. M., Harley, J. P. y Klein, D. A. 1999. “Microbiología“. 4a ed. Edit. McGraw-

Hill-Inter
 PRÁCTICA 6

TÉCNICAS DE TINCIÓN BACTERIANA

FECHA DE EMISIÓN: ELABORÓ: Dr. Juan Manuel Carmen Cristóbal

FECHA DE REALIZACIÓN: REVISÓ:

ASIGNATURA: Microbiología APROBÓ:

UNIDAD TEMÁTICA Bacterias
TEMA: Tinción de Gram CUATRIMESTRE: Tercero

NÚMERO DE PARTICIPANTES RECOMENDABLE: 5 DURACIÓN: Tres Horas

LUGAR: Laboratorio de Microbiología Profesor: Dr. Juan Manuel Carmen Cristóbal

REQUISITOS TEÓRICOS DE LA PRÁCTICA:

Conocer técnicas de tinción, tinción simple, inversa o negativa y tinción de Gram

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

El alumno aprenderá y aplicará las técnicas básicas de tinción más frecuentes.

MATERIAL: REACTIVOS: EQUIPO:

10 portaobjetos Aceite de inmersión Microscopio óptico

10 cubreobjetos Azul de metileno

2 asas bacteriológicas Nigrosina o tinta china

2 Mechero Bunsen Cristal violeta

Puente de tinción Yodo de Gram

Vaso de precipitado Etanol al 95%

Safranina

Metanol
 ANTECEDENTES

La coloración es el proceso de teñir artificialmente los microorganismos con colorantes o reactivos

para facilitar su estudio microscópico forma, agrupación y estructuras)

Un colorante es un compuesto orgánico que consta de anillos bencénicos y grupos cromóforos

(agrupación de átomos que da color a ciertos compuestos) y auxocromos (sustituyentes como el grupo
oxidrilo o el amino que mejoran las características de absorción del cromóforo).

En el laboratorio de microbiología se pueden usar los colorantes de varias formas como:

a) Para teñir bacterias y hacerlas visibles al microscopio

b) Para mostrar estructuras del organismo estudiado.
c) Para la identificación de microorganismos en base a sus características de tinción, por ejemplo, si
son o no alcohol-ácido resistentes, si son Gram positivas o Gram negativas.
d) En los medios de cultivo para inhibir el desarrollo de algunas bacterias y así poder estudiar
selectivamente a los microorganismos que si crecen.
TINCIÓN DE BACTERIAS

La célula bacteriana intacta se tiñe fácilmente con colorantes básicos como el cristal, azul de
metileno y fucsina básica, pero relativamente mal con colorantes ácidos como la eosina.

Un colorante básico es aquel constituido por un agrupamiento de átomos orgánicos con carga
positiva que será la parte activa del colorante ya que tendrá afinidad por los ácidos nucleicos. Un colorante
ácido es aquel que se encuentra constituido por átomos orgánicos con carga neta negativa por lo cual
tiene afinidad por el citoplasma.

TIPOS DE TINCIÓN

1. Tinción simple. Conocida con ese nombre ya que solo nos sirve para hacer más fácilmente visibles
a las bacterias sin resaltar ninguna característica en especial. Una tinción simple se lleva a cabo
cubriendo con colorante básico un frotis seco y fijado al calor. El frotis se deja reaccionar con las
células por un minuto y se lava suavemente con agua. El frotis se puede dejar secar o usar papel
secante para que quede listo para observarse.
2. Tinción negativa. Este método de tinción utiliza colorantes neutros o ácidos ya que tienen poca
afinidad por la célula bacteriana por lo tanto como no se absorben se colorea el fondo en el que
están las bacterias pero la célula queda incolora y transparente, así pues las bacterias aparecen
como pequeñas áreas iluminadas en un fondo oscuro. La tinción acídica con nigrosina, o neutral
( con tinta china) son las más usadas.
3. Tinción diferencial. Las bacterias se diferencian unas de otras tanto física como químicamente, por
lo cual su reacción ante algunos colorantes también será diferente dando lugar así a grupos
tintoreales característicos. Entre estos grupos están los que se originan por la tinción descubierta por
Hans Christian Gram, esta tinción divide a las bacterias en Gram positivas o Gram negativas lo cual
no solo sirve para diferenciarlas sino aún para elegir la terapia adecuada en algunos casos. Existen
otras tinciones diferenciales de utilidad en microbiología clínica como la de Ziehl- Neelsen.
4. Tinción estructural. Existen diferentes tipos de colorantes que de acuerdo a su afinidad se utilizan
para teñir y detectar ciertas estructuras de la célula bacteriana como son las esporas, los flagelos y
las cápsulas.

PROCEDIMIENTO

Tinción simple
 1. Preparar un frotis de las bacterias de acuerdo a las indicaciones de la figura 1 y
fijarlo al calor.
2. Cubrir el frotis con azul de metileno y dejar en reposo por un minuto.
3. Lavar con agua corriente suavemente y dejar secar.
4. Observar con el objetivo de inmersión.

Tinción negativa

1. Esterelizar el asa y enfriarla

2. Colocar una pequeña gota de agua en el extremo de un portaobjetos
desengrasado
3. Esterilizar nuevamente el asa y enfriarla
4. Tomar una pequeña cantidad de cultivo, con ayuda de el asa hacer una
extensión sobre el portaobjetos y enseguida colocar una gota de tinta china
(mezclar cuidadosamente).
5. Distiburi la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto
perpendicular en un ángulo de 45º sobre la muestra
6. Desplazar poco a poco el segundo portaobjeto a lo largo del primero para hacer
una capa fina de mezcla.
7. Dejar secar al aire.
8. Con el frotis hacia arriba, pasar 2-3 veces sobre la flama (con esto se fijarán las
bacterias).
9. Observar al microscopio.

Tinción de Gram

1. En un portaobejtos limpio colocar una gota de cultivo o muestra y realizar el frotis.

2. Dejar secar y fijar al calor como se indica.
3. Teñir con cristal violeta y dejar actuar durante 3 minutos
4. Enjuagar con agua corriente suavemente y escurrir.
5. Cubrir el frotis con Lugol (Yodo) y dejar actuar durante un minuto.
6. Enjuagar con agua corriente y escurrir
7. Decolorar con alcohol acetona. Para esto, incline el portaobjetos sobre la charola
de tinción y añada goteando el alcohol acetona, dejando que corra por todo el
frotis. Para un frotis delgado es suficiente con 10 a 20 segundos.
8. Detener la acción decolorante lavando con agua.
9. Contrastar con safranina de 30 a 60 segundos, enjuagar y dejar secar el frotis.
10. Examinar con el objetivo de inmersión.
 FIGURA 1

PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO

RESULTADOS

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS

1. Dibuje y coloree sus observaciones, indicando en cada caso:

a) Tipo de tinción
b) Nombre de la bacteria
c) Característica observada
Reportar las observaciones de forma, agrupación y tamaño relativo de cada uno de los
microorganismos en el cuadro de resultados.
Comparar sus observaciones con las reportadas en la literatura.
Agrupamiento de células (solas, pares, cadenas)

ANÁLISIS DE RESULTADOS

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

• Arronte Claudia y Castillo Ana Rosa. 2011. Manual de Prácticas de Microbiología

General. Universidad Veracruzana, Facultad de Odontología. Pp. 11-16.

• Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Meths. 4th. Ed. Boston:

Butterwortths.

• Prescott, L. M., Harley, J. P. y Klein, D. A. 1999. “Microbiología “. 4a ed. Edit.

McGraw-Hill-Interamericana. España. Pp. 729-733.
 PRÁCTICA 7

PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA ENTEROBACTERIAS

FECHA DE EMISIÓN: ELABORÓ: Dr. Juan Manuel Carmen

Cristóbal

FECHA DE REALIZACIÓN: REVISÓ:

ASIGNATURA: Microbiología APROBÓ:

UNIDAD TEMÁTICA: Crecimiento bacteriano Y Pruebas Bioquímicas
TEMA: Identificación bacteriana CUATRIMESTRE: Tercero

NÚMERO DE PARTICIPANTES DURACIÓN: Tres Horas

RECOMENDABLE: 4
LUGAR: Laboratorio de Microbiología Profesor: Dr. Juan Manuel Carmen Cristóbal

REQUISITOS TEÓRICOS DE LA PRÁCTICA:

Conocer reacciones químicas de las bacterias en los medios de cultivo

Pruebas bioquímicas para enterobacterias

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

El alumno observará algunas reacciones bioquímicas relacionadas con la fisiología

bacteriana, a la vez aprenderá su utilización para la identificación de enterobacterias

MATERIAL: REACTIVOS: EQUIPO:

Aguja bacteriológica Medios de cultivo Autoclave

(4 tubos cada uno)
Mechero de Bunsen Incubadora
Agar de hierro y
Gradilla Balanza analítica
triple azúcar (TSI)
Tubos de ensaye
Agar de hierro y
Probeta graduada lisina (LIA)

Vaso de precipitado Agar Citrato de

Simmons
Matraz Erlenmeyer (5)
Agar Urea según
Parrilla Christensen
espátula Medio de MIO
 Vidrio de reloj

Algodón y gasas para

hacer tapones

ANTECEDENTES

El estudio bioquímico que se lleva a cabo como complemento de otros estudios bacteriológicos es posible
gracias a las reacciones fisiológicas y químicas que llevan a cabo los microorganismos. Para esto se
emplean medios de cultivo enriquecidos con productos útiles para el metabolismo celular, los cuales
además contienen algún indicador que hace cambiar el color del medio al efectuar dichos
microorganismos sus funciones.

Los organismos varían en su capacidad para utilizar diferentes compuestos (por ejemplo: carbohidratos,
urea, citrato, etc.) para algunos microorganismos que se usan en su identificación en el laboratorio. De
acuerdo a los productos de su actividad química, las bacterias se pueden clasificar como:

1. Zimógenas: las que fermentan los carbohidratos, desdoblándolos en alcohol, ácido láctico o acético.

2. Aerógenas: las que producen gas como hidrógeno y dióxido de carbono como resultado de su
actividad metabólica.

3. Anaerógenas: las que no producen cantidades visibles de gas durante su actividad metabólica.

4. Cromógenas: las que producen pigmentos solubles o insolubles.

5. Fotógenas: las que causan putrefacción y producen una débil fosforescencia (algunas bacterias
marinas)

Entre las pruebas bioquímicas más comunes tenemos:

Caldos de carbohidratos con indicador de pH, rojo de fenol: Al fermentar algunos carbohidratos, muchas
bacterias producirán ácido, y con un medio con pH original alrededor de 7.4 al bajar éste a 6.8 por el ácido
que produce un cambio de color gracias a la incorporación de un indicador de pH como es el rojo de
fenol.

Agar de hierro y triple azúcar (TSI)

El agar TSI es uno de los más usados para ver la fermentación de carbohidratos en la familia
Enterobacteriaceae. Se pueden tener varias posibilidades de fermentación de acuerdo a las
características metabólicas del microorganismo como son: Utilización de glucosa sola. Los microorganismos
que fermentan solo la glucosa provocan en este medio una reacción alcalina en la superficie ( roja) sobre
un fondo ácido (amarillo, k/a) debido a que realizan una degradación aeróbica de la glucosa en la
superficie, convirtiendo el piruvato en agua y dióxido de carbono. Después de 18 a 24 horas de incubación
como la concentración de glucosa es baja (0.1%), los microorganismos empiezan a utilizar las peptonas que
se encuentran en el medio, causando la liberación de amoniaco y produciendo un pH alcalino ( rojo)
gracias al rojo de fenol que tiene el medio como indicador de pH. En el fondo, como no hay oxígeno, se
realiza una degradación anaeróbica y el piruvato se convierte en lactato con lo cual el pH disminuye
quedando el pH ácido (amarillo).

Utilización de lactosa y/o sacarosa. Algunos microorganismos tienen la facultad de fermentar la glucosa y
la lactosa resultando una reacción ácida en la superficie (amarilla) y ácida en el fondo (amarilla, a/a). En
este caso después de 18 a 24 hrs como la concentración de lactosa es alta (1.0%), o sea 10 veces más que
la de la glucosa presente, no se ha utilizado completamente y la acidez persiste tanto en el fondo como en
la superficie. En el caso de usar sacarosa la reacción sería la misma.

Sin utilización de ninguna de las anteriores. En el caso de no utilizar ninguno de los carbohidratos presentes
(glucosa, lactosa y sacarosa), lo que se usaría serían las peptonas, ya sea aeróbica o anaeróbicamente.
Sólo utilizándolas aeróbicamente daría una superficie alcalina (roja, k) sobre un fondo sin cambio (sc) o sea
k/sc). Si las usara aeróbicamente daría una superficie alcalina (rojo) sobre fondo alcalino (rojo) o sea k/k.

En este medio también es posible detectar la producción de gas por la formación de burbujas dentro del
medio, y la producción de ácido sulfhídrico, el cual reaccionará con un indicador con base de fierro dando
un color negro debido al sulfuro de hierro formado.

Agar de hierro y lisina (LIA)

Algunos microorganismos son capaces de provocar la descarboxilación de los aminoácidos por inducción
de enzimas específicas, el resultado de esta descarboxilación es la producción de una amina (o diamina)
y dióxido de carbono. Tal es el caso de la producción de la enzima lisina descarboxilasa la cual al actuar
sobre la lisina produce una diamina llamada cadaverina.

En el medio LIA se puede detectar la producción de la lisina descarboxilasa ya que se produce una
reacción coloreada por un cambio en el pH del medio, que contiene como indicador púrpura de
bromocresol. Un cambio del color original del medio (morado) hacia amarillo en el fondo indica una
reacción ácida por la fermentación de una pequeña cantidad de glucosa en el medio. Si el
microorganismo produce lisina descarboxilasa, la acción de esta enzima sobre la lisina dará lugar a la
cadaverina, la cual provocará un cambio de pH hacia la alcalinidad dando un color morado que
sobrepasa la acidez debida a la glucosa. Así pues, un fondo amarillo indica que no se produce lisina
descarboxilasa y un color morado que si es producida.

Prueba del citrato de Simmons

Ciertas bacterias tienen la capacidad de utilizar el citrato como única fuente de carbono en una serie de
reacciones como sigue:

CITRATO OXALACETATO + ACETATO

OXALACETATO PIRUVATO + CO

2 PIRUVATO ACETATO + LACTATO + CO

Los ácidos orgánicos son posteriormente utilizados dando como producto final carbonatos y bicarbonatos
alcalinos. El pH alcalino así logrado hace que el indicador de pH en el medio, el azul de bromotimol vire de
su color verde original a un azul intenso.

Prueba de la ureasa
La hidrólisis de la urea es catalizada en algunos microorganismos por una enzima específica, la ureasa,
dando lugar a dos moléculas de amonio, agua y dióxido de carbono.

Todo esto da lugar a un cambio en el pH, lo que causa que cambie el color original del medio (amarillo) a
un color rojo bugambilia por el indicador rojo de fenol. De acuerdo a la degradación de la urea el color
será más o menos intenso.

(NH2)2C=O + 2H2O---> CO2+2NH3+H2O (NH4)2CO3

Medio MIO (Movilidad, Indol y Ornitina)

Este medio como su nombre lo indica sirve para observar la movilidad, la produccíon de indol y
descarboxilación de la ornitina.

La movilidad se detectará por la presencia de turbidez alrededor del punto de inoculación.

El indol se formará si la bacteria tiene la capacidad de producir la enzima triptofanasa que desdoblará el
aminoácido triptófano en indol, ácido pirúvico y amonio. El indol es incoloro, pero al reaccionar con el
reactivo de Kovacs (p-dimetil-aminobenzaldehido) que se adiciona después de que creció la bacteria,
dará un color rojo violeta.

Por lo que respecta a la descarboxilacíon de la ornitina como el medio tiene púrpura de bromocresol y una
pequeña cantidad de glucosa cuando esta se fermenta se produce un color amarillo en el fondo (ornitina
descarboxilasa negativa), sin embargo, al descarboxilarse la ornitina se produce putresina la cual es alcalina
y sobrepasa la acidez dada por la fermentación de la glucosa resultando en un color morado en el fondo.

PROCEDIMIENTO

1. Marque perfectamente cada uno de sus tubos, usando una serie de TSI, LIA, Urea, Citrato
y MIO

2. Inocule una serie para cada cepa como sigue:

MEDIO FORMA DE INOCULAR

TSI Superficie - picadura

LIA Superficie - picadura

Citrato de Simmons Superficie

Agar Urea Superficie

MIO Picadura

3. Tape los tubos procurando no apretar demasiado los tapones

4. Incube a 35° C por 24 hrs.

5. Lea e interprete los resultados de acuerdo a las tablas de identificación.

 RESULTADOS

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS

1. Anote las observaciones de cada tubo (antes y después de inocular), utilizando los
colores apropiados.

2. Anote los resultados de cada prueba usando las abreviaturas correctas. En caso de no
corresponder a la bacteria que se le dio con el resultado de sus pruebas bioquímicas,
especifique de que bacteria se trata.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

• Arronte Claudia y Castillo Ana Rosa. 2011. Manual de Prácticas de Microbiología

General. Universidad Veracruzana, Facultad de Odontología. Pp. 25-29.

• Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Meths. 4th. Ed. Boston:

Butterwortths.
 ANEXOS

DESCARBOXILASA
UREASA CITRATO DE SIMMONS
( MIO)

Positivo Negativo

SIM LIA

TSI

Positivo Negativo
 PRÁCTICA 8

PRUEBAS BIOQUÍMICAS RÁPIDAS (CATALASA Y OXIDASA)

FECHA DE EMISIÓN: ELABORÓ: Dr. Juan Manuel Carmen

Cristóbal

FECHA DE REALIZACIÓN: REVISÓ:

ASIGNATURA: Microbiología APROBÓ:

UNIDAD TEMÁTICA Pruebas Bioquímicas
TEMA: Identificación bacteriana CUATRIMESTRE: tercero

NÚMERO DE PARTICIPANTES DURACIÓN: Tres Horas

RECOMENDABLE: 4
LUGAR: Laboratorio de Microbiología Profesor: Dr. Juan Manuel Carmen Cristóbal
Alumnos:

REQUISITOS TEÓRICOS DE LA PRÁCTICA:

Conocer reacciones químicas de las bacterias ante la prueba de oxidasa y catalasa

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

El alumno observará algunas reacciones bioquímicas relacionadas con la fisiología

bacteriana para diferenciar Enterobacterias de Pseudomonas

MATERIAL: REACTIVOS: EQUIPO:

Asas bacteriológicas Peróxido de

Hidrógeno al 3%
Mechero de Bunsen Incubadora
Taxo N Oxidasa
Gradilla

Tubos de ensaye

Papel filtro

Portaobjetos

Caja petri

Cultivos bacterianos
 ANTECEDENTES

ACTIVIDAD CATALASA

Se trata de un ensayo muy simple que intenta determinar si la bacteria problema tiene
capacidad para degradar el peróxido de hidrógeno, uno de los agentes oxidantes
producidos como consecuencia de determinadas reacciones metabólicas oxidativas
propias del metabolismo aerobio. La enzima encargada de degradar este producto es
denominada catalasa y aparece en casi todos los microorganismos aerobios obligados
o facultativos. Existen sin embargo organismos anaerobios o microaerófilos que carecen
de dicha actividad, constituyendo esta prueba un importante elemento taxonómico.

El ensayo es muy sencillo, pues basta con añadir una gota de agua oxigenada sobre
una colonia del cultivo y observar si de ésta se empiezan a desprender burbujas de
oxígeno como consecuencia de la actividad enzimática de la catalasa:

2H2O2 ==========> 2H2O + O2

Permite diferenciar géneros:

Strteptococcus (-) de Microccus (+) y/o Staphylococcus (+)
Bacilus (+) de Clostridium (-) y Corynebacterium (+) de Erysipelothrix (-)

PRUEBA DE OXIDASA

El sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos,

de modo que la prueba Oxidasa es importante para identificar aquellos organismos que
carecen de esta enzima (anaerobios obligados).

La reacción de la oxidas se debe a la presencia de un sistema de citocromooxidasa que

activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que
produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa
por lo tanto como aceptor final en la cadena de electrones.

Esta prueba es muy útil para diferenciar Enterobacterias (-) de Pseudomonas (+) o
Neisserias (+).

PROCEDIMIENTO

Prueba de Catalasa

1. Con una asa, transferir parte del centro de una colonia a la superficie de un
portaobjetos
2. Agregar una gota de Peróxido de Hidrogeno al 3% y observar la producción de
burbujas
Prueba de oxidasa

1. El reactivo de oxidasa es bastante tóxico, manejar con precaución. Se altera por la

luz y el oxígeno, por lo que debe ser de preparación extemporánea y protegerse
envolviéndolo con papel negro.
2. Se pone un trozo de papel de filtro sobre una de las tapaderas de una caja Petri.
3. Añadir una gota del reactivo de oxidasa.
4. Depositar sobre el reactivo masa bacteriana
5. La reacción positiva la indica un color azul-violeta intenso antes de 10 segundos.

RESULTADOS

ANÁLISIS DE RESULTADOS

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

• Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Meths. 4th. Ed. Boston:

Butterwortths.
 PRÁCTICA 9

CARACTERÍSTICAS MICROSCOPICAS DE HONGOS

FECHA DE EMISIÓN: ELABORÓ: Dr. Juan Manuel Carmen

Cristóbal

FECHA DE REALIZACIÓN: REVISÓ:

ASIGNATURA: Microbiología APROBÓ:

UNIDAD TEMÁTICA: Hongos
TEMA: Características microscópicas CUATRIMESTRE: tercero

NÚMERO DE PARTICIPANTES DURACIÓN: Tres Horas

RECOMENDABLE: 4
LUGAR: Laboratorio de Microbiología Profesor: Dr. Juan Manuel Carmen Cristóbal

REQUISITOS TEÓRICOS DE LA PRÁCTICA:

Características de los hongos

Estructuras microscópicas (Hifas, micelio, esporangios y esporas)

Utilizar guantes, cubre bocas, cofia y googlees.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA

1. Preparar tinciones simples de hongos a partir de muestras con presencia de

moho
2. Identificar morfología microscópica característica de los diferentes géneros
de hongos filamentosos.
3. Identificar los géneros de hongos filamentosos más comunes.
4. Comparar las características de un moho y de una levadura
MATERIAL: REACTIVOS: EQUIPO:

Asa micológica

Portaobjetos Azul de lactofenol Microscopio

Cubreobjetos

Aguja de disección

Muestras de hongos

Levadura
 ANTECEDENTES

Un hongo es un organismo eucariota, portador de esporas, con una nutrición absortiva y

carente de clorofila; se reproducen asexualmente, sexualmente, o de ambas maneras; y
normalmente posee hifas filamentosas rodeadas de paredes celulares, que habitualmente
contiene quitina.
La clasificación de los hongos se basa principalmente en la anatomía de estos microbios,
especialmente en el aspecto de las hifas, micelios y la naturaleza de las esporas
reproductoras que forman.
Las hifas son células en forma de hilos relativamente rugosos de un grosor de unas 4μ que
forman un micelio.
Micelio: es un conjunto de hifas
Tabicado (septado): las hifas se dividen en paredes transversales (septos), en una serie de
células cilíndricas unidas por sus extremos.

Continuo (cenocitico): Hifas no tabicadas permiten que el citoplasma multicelular fluya sin
interrupción a lo largo del filamento y por lo tanto se dice que es micelio cenocitico, es
decir, el protoplasma es compartido por todo el moho.

La parte del micelio que penetra en el medio para la absorción de alimento se llama
micelio vegetativo. La parte de desarrollo que se proyecta desde la superficie al aire es el
micelio aéreo, esta masa característica da a los mohos su aspecto velloso.
En los hongos saprofitos comunes, algunas de las hifas aéreas se diferencian en estructuras
especiales, características para cada tipo de moho, en cuyas puntas se forman las esporas
reproductoras. El grupo terminal de filamentos sobre esta hifa fecunda en la que se forman
esporas se llama cuerpo fructificante o esporóforo.
En los Zygomycetes la punta de cada hifa fecunda, se alarga dentro de una cabeza
peculiar llamada columela. A su alrededor se desarrolla un saco redondo, el esporangio,
dentro del cual se forman las esporas.
En otros mohos comunes (Aspergillus, Penicilium), la parte terminal de las hifas fecundas, se
ramifica de una manera característica y forma tallos cortos digiformes llamados esterigmas,
o células en forma de botella, llamadas fiálides, en cuyas puntas crecen cadenas de
esporas desnudas.

Penicillium sp Aspergillus niger

Esporas. Cualquier estructura simple redondeada, que cuando se separa del hongo
progenitor, es capaz de germinar y reproducir el organismo completo.

Todos los organismos se reproducen por esporas. En los mohos mas desarrollados, las
esporas reproductoras se forman asexualmente en gran número sobre hifas fecundas,
característicamente muy diferenciadas. En otros hongos se reproducen las esporas
directamente de la parte que se desarrolla (vegetativa) del hongo, sin ninguna estructura
reproductora especial. Todos los hongos a excepción de los hongos imperfectos, pueden
formar esporas sexuales de alguna clase.

Los tipos principales de esporas asexuales:

Blastosporas: yemas formadas por un proceso de germinación a partir de la superficie de

la célula progenitora. Germinación es el método característico por el que se multiplican
las levaduras verdaderas (género Candida, Cryptococcus).
Clamidosporas: parte inclinada y redondeada de una hifa, redondeada por una pared
gruesa y resistente. Es una parte enquistada y permanente del hongo, capaz de resistir
ambientes desfavorables.

Artrospora: segmentos adelgazados o separados directamente de las hifas indiferencias. A

menudo estas células redondas o cilíndricas de pared más gruesa se ven todavía en su
lugar en el filamento segmentado.

Esporangiosporas: esporas formadas dentro de un esporangio, como en el género Mucor

o Rhizopus

Mucor sp. Rhizopus sp .

Formación de esporangio y esporangiosporas

Conidios: formadas en el exterior de una membrana limitante, que nace de hifas

especializadas (conidioforos), o que surgen directamente del micelio vegetativo. Se liberan
de las hifas por abstricción en el punto de unión. Ejemplo: Penicillium, Aspergillus.

d. Microconidios. Son pequeños y unicelulares.

e. Macroconidios. Relativamente grandes, en forma de uso o clava, divididas en dos o

más células por tabiques.
 Morfología microscópica de hongos:

Fusarium sp. Alternaria sp.

Geotrichum candidum Levaduras

Morfología macroscópica:

Placa con una colonia de Penicillium sp. Colonias de levaduras

 PROCEDIMIENTO

Realizar preparaciones en fresco de los hongos a partir de muestras de alimentos.

Preparación en fresco:

Observación entre portaobjeto y cubreobjeto usando azul algodón lactofenol; colonias

gigantes:

a. Colocar un portaobjetos limpio sobre una superficie transparente e iluminada, si esto

no es posible, colocar el portaobjetos sobre una hoja de papel blanco.

b. Colocar una gota pequeña de azul algodón lactofenol en el centro del

portaobjetos.

c. Tomar un fragmento de la colonia del hongo (aprox. 1 o 2 mm dentro de la periferia)

con una asa o aguja de disección, con extremo cuidado manipulando lo menos
posible para no romper la estructura del hongo.

d. Colocarlo sobre la gota de azul de algodón sin frotar y colocar el cubreobjetos

cuidando que no queden burbujas de aire no se debe presionar el cubreobjetos
para evitar que las conidias se desprendan de los conidioforos.

e. Observar al microscopio haciendo uso del lente objetivo 40 X.

RESULTADOS
Dibujos de todas las preparaciones buscando encontrar las diferentes estructuras de los
hongos.
ANÁLISIS DE RESULTADOS
CONCLUSIONES
CUESTIONARIO
1. Explique la diferencia que hay entre una coloración simple y una preparación en
fresco.
2. Describa las diferencias coloniales entre las levaduras y los mohos.
3. Dibuje un micelio septado y uno cenocítico.
4. Cuál es la función del lactofenol
5. Describe las diferencias microscópicas entre bacterias y hongos

BIBLIOGRAFÍA

• Aquiahuatl Ramos M. A. Y Perez Chabela M. L. 2014. Manual de prácticas de

laboratorio de Microbiología General. Universidad Autónoma Metropolitana,
Unidad Iztapalapa. 46-49 pp.

• Rodríguez Morales M., Pavón Romero S. y Santamaría G. 2010. Manual de laboratorio

de Microbiología. Universidad Autónoma del Estado de México. Facultad de
Química.