CUADERNO TEÓRICO

UNIDAD TEMÁTICA V

MODO DE OPERACIÓN DE BIORREACTORES

CULTIVO CONTINUO

Cátedras: Biotecnología de los Alimentos (IA) – Biotecnología (IQ) – Ingeniería

Bioquímica (IQ) – Microbiología Industrial (LAQyB)

Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales (UNaM)

- Dra. María Alicia Martos -

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 CULTIVO CONTINUO

Un cultivo continuo es esencialmente un sistema en el que se alimenta en forma

continua el reactor con medio fresco y del cuál se retira en forma continua medio de
cultivo agotado, junto con el (o los) productos de reacción (Fig.1) .

Figura 1: Biorreactor continuo

El cultivo continuo opera con bajas concentraciones de nutriente limitante, es decir en la

zona de cultivos restrictos, zona en la cual la velocidad de crecimiento es proporcional a
la concentración de dicho nutriente.
Para poner en marcha un cultivo continuo, se realiza previamente un cultivo batch y en
un momento dado se comienza a alimentar con medio fresco a un caudal F y por un
rebalse se mantiene el volumen constante. El líquido que sale del biorreactor a un
caudal F, tendrá células y la concentración de nutrientes será menor que en el caudal de
entrada debido a que en parte fueron consumidos por los microorganismos.
Los parámetros de operación característicos en los reactores continuos son:
a) La velocidad de dilución: D; b) El tiempo de retención:. tR.
La velocidad de dilución D, se define como la relación entre el caudal de alimentación,
F y el volumen de cultivo, V (D = F/V).
Siendo:
D: velocidad de dilución (h-1) = nº de volúmenes de medio que pasan a través del
reactor por hora.

2
El tiempo de retención está relacionado con D de la siguiente manera:
1
tR =
D
El valor de D corresponde a las veces que se renueva el volumen del biorreactor por
unidad de tiempo, así un valor de D=0,25 h-1 indica que en una hora se renovó un 25 %
del volumen de cultivo.
En un cultivo continuo se considera que se alcanza el estado estacionario cuando han
pasado por lo menos 4-5 tiempos de retención (tR = 1/D).

1. Balance de materia en el reactor

Para un componente cualquiera del cultivo (Ci), incluida la biomasa) se puede plantear
el siguiente balance de materia en el biorreactor, considerando que el mismo está bien
mezclado y la corriente de producto posee la misma composición que el líquido dentro
del reactor.

 velocidad  Veloc.  Veloc.  Veloc.  Veloc.

  =   −   +   −  
 acumulación   Entrada   Salida   Form.   Cons. 

d (VCi )
= F1  Ci1 − F2  Ci + V  r fi − V  rci (ec. 2.1)
dt

Siendo:
V: volumen del cultivo

3
 F1: caudal de alimentación
F2: caudal de salida
Ci1: concentración del componente i en la alimentación.
Ci: concentración componente i a la salida (hipótesis mezclado perfecto: Ci2=Ci)
rfi: velocidad de formación del componente i
rci: velocidad de consumo del componente i

A partir de la ecuación general (ec. 2.1), se harán balances para biomasa, sustrato y
producto.

1.1. Balance de biomasa

Aplicando la ec. 2.1 a la biomasa y considerando que ingresa medio fresco sin células y
no hay consumo de células en el reactor, se obtiene:

d(X )
V = 0 − F  X + V  rx − 0 (ec. 2.2)
dt

Siendo:
X: biomasa ([Link]/l)
rx: velocidad de crecimiento microbiano (g/l.h)
F: caudal de alimentación = caudal de salida

Cuando se alcanza el estado estacionario, las concentraciones dentro del biorreactor

permanecerán constantes en el tiempo, lo que significa igualar a cero la ecuación
anterior y dividiendo por V resulta:
F
−  X + rx = 0
V
Teniendo en cuenta que rx = µ.x, se obtiene:

  X = D X
Por lo tanto:
=D (ec. 2.3)

4
Es decir que la velocidad específica de crecimiento microbiano tiene que ser igual a la
velocidad de dilución. La ec. 2.3, expresa que la velocidad específica de crecimiento se
puede controlar ajustando la velocidad de dilución (D) o sea variando el caudal F.

1.2. Balance de Sustrato

Aplicando la ec. 2.1 a cualquier componente que ingrese, se obtiene:

dS
V = FS R − FS + 0 − Vrs
dt

Dividiendo por V (volumen de medio) e igualando a 0 la ecuación anterior (estado

estacionario) se obtiene:
rs = D  (S R − S ) (ec. 2.4)

Donde:
SR : concentración del sust. limitante en la alimentación (reservorio).
S : concentración de sust. limitante en el reactor, en estado estacionario.

A partir de esta ecuación se puede medir la velocidad de consumo de cualquier nutriente

del medio de cultivo.

Determinación de la concentración de biomasa en el reactor

Considerando que S es la FCE y no hay formación de producto o este está asociado al

proceso de producción de energía, rs vendrá dado por la ecuación de Pirt:
rX
rS = + ms  X
YX / S

Reemplazando rs en la ec. 2.4, se obtiene:

D  (S R − S ) =
rx ~
+ ms  X
YX / S

X
D  (S R − S ) =
~
+ ms  X
YX / S

Además en estado estacionario μ = D

5
 
D X
D  (S R − S ) =
~
+ ms  X
Y X / S

Despejando X :

X = Yx/ s 
(
D  SR − S

) (ec. 2.5)
D + ms  Yx/ s

Y´x/s : rendimiento verdadero = constante

La ec. 2.5 nos dice como va a variar la concentración de células dentro del reactor en
función de D. El tiempo desaparece como variable porque se está en estado
estacionario.
Si el mantenimiento fuese despreciable (ms=0), la ec. 2.5 se transforma en:


( 
X = Yx / s  S R − S ) (ec. 2.6)

Si S es el sustrato limitante, estará relacionado con µ por la ec. de Monod:

S
 = D = m 
ks + S
Reemplazando en la ec. 2.6 se obtiene una expresión para la concentración de células
en estado estacionario en términos de D y de los parámetros cinéticos:

  D  ks 
X = Yx / s   S R −  (ec. 2.7)
  m − D 

Esta ecuación es válida cuando no es necesario el mantenimiento y no existe síntesis de

producto o este está directamente asociado al metabolismo energético.

La concentración de biomasa en el reactor (ec.2.7), en estado estacionario, dependerá de

D y de SR, si SR aumenta, la concentración de biomasa en el reactor aumentará.

Determinación de la concentración del sustrato limitante en el reactor

Si S es el sustrato limitante, esta relacionado con  a través de la ecuación de Monod y

en estado estacionario será:

6
 
m  S
= =D
ks + S

Porque es una imposición del sistema que  sea siempre igual a D en estado
estacionario.
~
Despejando S :
 D  ks
S= (ec. 2.8)
m − D

Esta ecuación expresa la concentración de sustrato limitante en el reactor en estado

estacionario. Es decir que la concentración del sustrato limitante en el reactor varía en
función de D, pero no depende de la concentración de sustrato a la entrada (SR).
De manera que tanto la concentración de sustrato y la concentración de células dentro
del reactor en estado estacionario, quedan expresados en función de la velocidad de
dilución (D).

Gráfico de X y S en función de D
Para saber que ocurre en un cultivo continuo, se debe hacer una gráfica de la
concentración celular y el sustrato limitante en función de D, que es la única variable
que se tiene y se puede modificar a voluntad (Fig. 2).

Figura 2: Efecto de la velocidad de flujo sobre la concentración de sustrato (S), la

concentración de células (X), tiempo de duplicación (td) y productividad (D.X).

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Como se observa en la Figura 2, a medida que D aumenta, S aumenta al principio
lentamente y mas rápido después y la concentración de biomasa dentro del reactor
disminuye.
Cuando las velocidades de dilución son altas, el organismo no puede crecer lo
suficientemente rápido como para compensar la velocidad con la que son arrastradas por
la corriente de salida y se produce el “lavado” del cultivo. La concentración del sustrato
en el reactor aumenta, hasta alcanzar el valor que tiene en a la entrada (S R) por eso el

gráfico de la FCE termina bruscamente en SR y X se hace cero en el reactor. El valor de
D al cual ocurre el “lavado” o “wash out” se conoce como velocidad de dilución crítica
(Dc).

Es decir que a la velocidad de dilución crítica (Dc) ocurren dos cosas:


1. La concentración de células en el reactor ( X ) se hace cero.

2. La concentración de sustrato en el reactor (S ) es igual al de la alimentación (SR)
 ~
Durante el lavado (Dc) será: X = 0 y por lo tanto S = SR , esto es así porque a Dc, no
habrán células en el reactor y por lo tanto no se consumirá sustrato.
De la ecuación de Monod el valor de Dc será:

SR
DC =  .m 
KS + SR

Como generalmente Ks << SR, se puede hacer la siguiente aproximación: DC   m

Es decir que el D debe ser menor al m para que no ocurra el lavado.

Si se trabaja a un D > m las células serán arrastradas por la corriente de salida a una
velocidad mayor de la que son capaces de multiplicarse, produciéndose el lavado.
Por lo tanto se toma como criterio de trabajo: D < m

Explicación de la primera parte de la curva

Para valores de μ bajos, comparables a ms, la curva X vs D, puede presentar diferentes

formas (bajar, permanecer constante o aumentar), en base al tipo de sustrato limitante
utilizado (Fig. 3).

8
 Zona de µ comparable
con ms

~
X
3

2
1

~
Figura 3: Grafico de X vs D a valores de D bajos.

Curva 1
En un cultivo continuo, cuando el sustrato limitante es la FCE, a medida que el
microorganismo crece mas lento (bajos valores de μ), la concentración de biomasa en
estado estacionario disminuye. La curva de X~ vs D (Fig. 3) disminuye según la ec. 2.5,
vista anteriormente:

X = Yx/ s 
(
D  SR − S

) (ec. 2.5)
D + ms  Yx/ s


De la ec. 2.5 se observa que cuando D → 0  X → 0 . Para explicar este hecho Pirt
introdujo el concepto de mantenimiento celular explicado anteriormente.
Recordando la ec. de Pirt:

rx
rs = + ms  X
Yx/ s
Dividiendo por X se obtiene la velocidad específica de consumo de sustrato (qs):

qs = + ms
Yx/ s

Expresando la ec. de Pirt en función de los rendimientos:

9
 1 1 m
= + s
Yx / s Yx/ s 
A partir de las ecuaciones anteriores, se puede observar que cuando los
microorganismos crecen a valores de μ (D) muy bajos, comienza a pesar el término de
mantenimiento (ms). Es decir que la poca cantidad de sustrato (FCE) se consume
principalmente para mantenimiento (que representa un gasto energético para mantener
la viabilidad de las células) y no está disponible para la biosíntesis y crecimiento celular
y por lo tanto la población se va lavando. El rendimiento experimental (Yx/s) disminuye,
se aleja del rendimiento máximo teórico.

Curva 2
Si el cultivo no está limitado por la FCE, pero está limitado en otro compuesto como
nitrógeno, como el nitrógeno no está asociado al mantenimiento celular el valor de X
vendrá dado por la ec. 2.6 (sin mantenimiento):


( 
X = Yx / N  S R − S ) (ec. 2.6)

A velocidades de alimentación bajas, es decir D 0, en estado estacionario se

consume casi todo el sustrato, por lo que de la ec. 2.6 para biomasa resulta:

X = Yx / N  S R
~
Es decir que cuando D tiende a cero, X no tiende a cero, sino que adquiere un valor
igual a Yx/s. SR, y por lo tanto X será independiente del valor de D.

Curva 3
Cuando el microorganismo crece a muy baja velocidad de dilución y no está limitado
por la FCE, puede acumular polisacáridos y por lo tanto la curva sube.
Si el cultivo está por ejemplo limitado en nitrógeno, habrá en el medio un exceso de la
FCE y si este es un azúcar (glucosa, fructosa, etc.) la célula puede tender a acumular
polisacáridos y por lo tanto el peso de cada célula aumentará y dará un rendimiento
mayor.

10
  ~
Variación de S y X con SR
A partir de la ecuación de Monod se obtuvo una expresión para determinar la
concentración de sustrato limitante dentro del reactor (ec. 2.8):
 D  ks
S= (ec. 2.8)
m − D

Esta ecuación implica que la concentración del sustrato limitante en el reactor varía en
función de D, pero no depende de la concentración de sustrato a la entrada (SR).
Si se duplicara la concentración de sustrato limitante en la alimentación (SR), el valor
~
de S seguirá siendo el mismo. Una vez que se fija el valor de D, queda fijo el valor
~
de S (Fig. 2.4).

De las ecuaciones 2.5 y 2.6:


X = Yx/ s 
(
D  SR − S

) (ec. 2.5)
D + ms  Yx/ s


( 
X = Yx / s  S R − S ) (ec. 2.6)

La densidad celular en el reactor se controla por la cantidad de nutriente limitante. Si la

concentración de éste (SR) en el reservorio aumenta, dejando constante la velocidad de
dilución, la densidad celular aumentaría aunque la velocidad de crecimiento seguiría
siendo la misma (Fig. 4).
~ ~
Por lo tanto: si D se mantiene constante y varia SR, variará X pero S se mantendrá
constante.

Figura 4: Grafico de biomasa, sustrato en función de la velocidad de dilución a

diferentes concentraciones de sustrato limitante en el reservorio.

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1.3. Balance de producto
A partir del balance general en el reactor (ec. 2.1) se plantea el balance para un
determinado producto:

dP
V = − F .P + V  rp
dt

Siendo:
P: concentración del producto (g/l)
rp: velocidad de formación de producto

En estado estacionario se obtendrá:


rP = D  P

Despejando P , se obtiene una expresión para la concentración de producto en estado

estacionario en función de la concentración de biomasa:

qp  X
P= (ec. 2.9)
D

La expresión de qp depende del tipo de producto formado. Si qp es conocido, la

concentración de producto en el reactor puede calcularse a partir de la ec. 2.9.
Recordando las ecuaciones cinéticas para productos asociados al crecimiento:

qp = Yp/x . µ

Reemplazando en la ecuación 2.9 se obtiene:

P = Yp  x
x

Para productos finales del metabolismo energético, P y X en estado estacionario tendrán

la misma curva.

12
2. Determinación de las constantes cinéticas (ks, ms) y rendimiento
2.1. Medición de ks y μm
Puesto que los valores de ks en un cultivo celular son generalmente muy bajos, la
determinación precisa de este parámetro a partir de datos de un reactor discontinuo
(batch) es bastante difícil. Una mejor estimación de ks puede realizarse utilizando un
cultivo continuo.
En un cultivo continuo, en estado estacionario se tenía que µ = D. Si el crecimiento se
puede modelar utilizando la cinética de Monod, se tendrá:

m  S
D= (ec. 2.11)
Ks + S
Siendo
S : concentración de sustrato limitante en el reactor en estado estacionario (g/l).
Ks: constante de saturación (g/l),
μm. la velocidad específica máxima de crecimiento (tiempo-1).

A partir de datos experimentales de S a distintos valores de D, obtenidos en el reactor

en estado estacionario, se pueden calcular los parámetros ks y μm de la siguiente
manera:

Haciendo la inversa de la ecuación 2.11 se obtiene la ecuación linealizada de

Lineweaver-Burk.
1 Ks 1 1
=  + (ec. 2.12)
D m S m

De la representación gráfica de 1/D en función de 1/S, se pueden calcular los valores de

μm y Ks a partir de la pendiente y ordenada al origen.

2. 2. Medición del coeficiente de mantenimiento (ms ) y rendimiento verdadero

Los cultivos continuos son también útiles para la determinación de rendimientos y
coeficientes de mantenimiento en cultivos celulares.

13
De la ec. de Pirt
X
rS = + ms  X
YX / S

En estado estacionario: μ = D, por lo tanto:

D X
rS = + ms  X
YX / S
Dividiendo por X:
D
qS = + ms (ec. 2.13)
Y X / S

Del balance de sustrato en cultivo continuo (ec. 2.4):

rs = D  (S R − S )

Se obtiene:
rS D  (S R − S )
qs = = (ec. 2.14)
X X

Procedimiento de cálculo:
~
1. Por cada valor de D y SR fijos, se determinan S y X y se calcula qs por la ec. 2.14.
2. Se realiza la siguiente tabla:

D qS
D1 qS1
D2 qS2
D3 qS3

3. Se traza la recta qS = f (D) (ec. 2.14). De la pendiente y ordenada al origen se calcula

Y`x/s y qS respectivamente.

3. Rendimiento experimental en cultivo continuo

En un cultivo continuo con alimentación estéril, el rendimiento de biomasa a partir de
sustrato (Yx/s), se obtiene de la siguiente manera:

14
 X
Yx / s = (ec. 2.15)
SR − S

Yx/s depende de la concentración de sustrato y de la velocidad de crecimiento, no es

exactamente igual para cualquier S0.

4. Productividad en cultivo continuo

En el cultivo continuo, la productividad de biomasa Pc (g/l.h) (en estado estacionario)
se obtiene del producto del factor de dilución por la concentración de células

X  D (g/l.h).
Recordando que el valor de X, está dado por la ec. 2.7 (cuando no hay formación de
productos o este está asociado al metabolismo energético y las necesidades de
mantenimiento son despreciables), por lo tanto:

~  K D 
Pc = XD = YX / S  D   S R − s  (ec. 2.16)
  m − D 

Graficando Pc en función de la velocidad de dilución, D, se obtiene una curva como se

muestra en la Figura 2.2, la que presenta una productividad máxima a una determinada
velocidad de dilución (Dopt).
Derivando D.X (ec.2.16) con respecto a D e igualando a cero se obtiene una expresión
para calcular el valor de Dopt que proporciona la máxima productividad:

 ks 
Dopt. =  m  1 −  (ec. 2.17)
 ks + S R 

Por ser KS << SR; Dopt. < µm (pero muy próximo a µm).
Es decir que operando el biorreactor a Dopt, se tendrá la máxima productividad (pero
Dopt está muy próximo a D critico). Es muy difícil lograr una operación estable para D
cercano a µm . Generalmente se usa un valor de D algo menor que Dop como solución
de compromiso para mejorar la estabilidad con buena productividad.
Reemplazando la expresión de Dopt en la ec. 2.7.

15
   D  ks 
X = Yx / s   S R −  (ec. 2.7)
  m − D 

Se obtiene la concentración de biomasa a la màxima productividad:


X opt = Yx / s  (S R + k S ) − (k S  (S R + k S ))
1/ 2
 (ec. 2.18)

A partir de las ec. 2.17 y 2.18 y considerando que SR >> ks , se obtiene la ec. para la
productividad máxima:

Pc m = Dopt  X opt   m  Yx / s  S R (ec. 2.19)

Es decir que la productividad volumétrica máxima es función de la µm del

microorganismo, de Yx/s y de SR.
La productividad de los productos relacionados con el crecimiento se puede describir de
la siguiente manera:
Pr = D  P

Siendo P la concentración de producto en estado estacionario (g/l).

5. Comparación productividad en cultivo batch vs continuo

La productividad en cultivo continuo está dado por:

Pc m = (D  X )opt =  m  Yx / s  S R

En el estado estacionario, si el quimiosato opera al o cerca del Dopt, la productividad

permanecerá a un valor constante y máximo durante la totalidad de la fermentación.
La productividad de un cultivo batch (en términos de biomasa formada), se puede
expresar mediante la siguiente ecuación definida anteriormente:

16
 Yx / s  S R   m
Pb =
xf
ln +  m  t npt
x0
La relación entre la productividad en cultivo continuo y batch será:

Pc Xf
= ln +  m  t npt
Pb X0

Xf
Suponiendo tnpt = 0, y considerando que en la práctica  10
X0
La productividad en continuo será > 2,3 en batch:

Pc  2,3Pb
En la práctica el tiempo no productivo total (tnpt) es de horas, lo que hace aún mayor la
diferencia señalada.

6. Ventajas y desventajas del cultivo continuo

Ventajas
Los sistemas de cultivo continuo ofrecen las siguientes ventajas respecto a los cultivos
en batch:
▪ Permite seleccionar a voluntad la velocidad específica de crecimiento y mantener
a la población bacteriana creciendo a una dada velocidad en forma indefinida y
constante.
▪ Permite examinar el efecto de cambios en los parámetros físicos o químicos sobre
el crecimiento y la formación del producto a una tasa de crecimiento constante.
▪ Permite la determinación de las constantes cinéticas, energía de mantenimiento y
rendimientos.
▪ Resulta mas productivo que el cultivo batch.
▪ Se lo puede operar en forma automática para obtener una producción de calidad
constante.

Desventajas
▪ La mayor complejidad y costo de los equipos.

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 ▪ Como el tiempo que demanda la operación de los equipos de cultvio continuo es
mayor que el de los cultivos en batch, existe un mayor riesgo de contaminación y
de que se produzcan mutaciones en las cepas bacterianas en estudio.
▪ El crecimiento de organismos filamentosos es difícil debido a la viscosidad y
naturaleza heterogénea del cultivo que evita el crecimiento en régimen
permanente.

El control de la contaminación es un problema que atañe al diseño del fermentador, a su

construcción y operación.

7. Diferencias entre cultivo discontinuo y continuo

▪ El cultivo continuo opera bajo condiciones de estado de equilibrio (las
concentraciones de todos los componentes del cultivo son constantes).
▪ El cultivo continuo opera bajo condiciones limitantes de sustratos mientras que el
cultivo batch, en la fase exponencial, funciona en presencia de exceso de sustrato.
▪ La velocidad de crecimiento en el cultivo continuo está controlada por la
velocidad de dilución (y por ello bajo el control del operador) y su valor es
siempre menor que μm.. Por el contrario, la velocidad específica de crecimiento en
la fase exponencial de un cultivo batch, alcanzará el μm correspondiente a las
condiciones que prevalezcan en el cultivo.

8. Algunas aplicaciones del cultivo continuo

▪ Producción de algunas proteínas.
▪ Tratamiento de efluentes, en particular cuando se emplean microorganismos o
enzimas inmovilizadas.
▪ Producción de etanol.
▪ Producción de productos asociados al crecimiento, especialmente en gran escala
(por ejemplo, ácido láctico).

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4. BIBLIOGRAFÍA

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segunda edición, 1986.

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Capítulo 6.
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