ESTERILIZACIÓN

OBJETIVOS:
 Reconocer la importancia de la esterilización de materiales en el laboratorio de
microbiología.
 La esterilización es crucial para evitar la contaminación cruzada y el crecimiento
microbiano no deseado.
 Aprender la metodología adecuada para esterilizar diferentes tipos de materiales,
como medios de cultivo, puntas de micro pipeta, entre otros.
 Esto incluye el uso de técnicas como auto clavado, filtración y radiación.
 Preparar medios de cultivo estériles que permitan el crecimiento adecuado de los
microorganismos de interés.
 Los medios deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios.
 Realizar la inoculación de muestras en los medios de cultivo estériles y monitorear
el crecimiento microbiano.
 Esto permite evaluar la efectividad de los procesos de esterilización.
 Desarrollar habilidades prácticas en el manejo aséptico de materiales y técnicas de
siembra en el laboratorio de microbiología.

FUNDAMENTO TEORICO:

La esterilización es el proceso físico o químico que destruye todas las formas viables de
microorganismos, incluyendo esporas y virus. Es un procedimiento esencial en el
laboratorio de microbiología para evitar la contaminación
cruzada y el crecimiento microbiano no deseado. Los medios
de cultivo utilizados en el laboratorio deben estar exentos de
todo microorganismo contaminante, por lo que deben ser
preparados y esterilizados adecuadamente. Esto permite el
crecimiento apropiado de los microorganismos de interés.
Existen diversos métodos de esterilización, como el auto
clavado, la filtración y la radiación, que se seleccionan según
el tipo de material a esterilizar. Cada método tiene sus propias
condiciones de temperatura, presión y tiempo para ser
efectivo. Es crucial controlar el proceso de esterilización
mediante indicadores físicos, químicos y/o biológicos para
asegurar su efectividad. Esto garantiza la eliminación total de
microorganismos. El manejo aséptico de materiales y técnicas
de siembra en el laboratorio de microbiología son
fundamentales para evitar la contaminación de las muestras.
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN EN MICROBIOLOGÍA:

 FISICOS:
o Ebullicion
o Tyndalizacion
CALOR HUMEDO o Pasteurización
o Vapor a presión
(autoclave)

o Flameando
CALOR SECO o Incineración
o Horno Pasteur (aire
caliente)

o Readiaciones Ionizantes
o Rayos Gamma
RADIACIONES
o Rayos X
o Rayos Ultravioleta

MECANICOS o Filtracion
o Sidimentacion

 QUIMICOS

o Óxido de etileno
GASES o Otros
Procedimiento. – en esta práctica nosotros utilizamos 2 métodos de esterilización que son
el vapor a presión (autoclave) y el de flameado.
Los materiales que esterilizamos son:
 Matraz Erlenmeyer.
 Cajas Petri.
 Algodón.
 Asa.
Pasos que seguimos para esterilizar en la autoclave:
1. Lavamos las cajas Petri y los Erlenmeyer
2. Hacemos el secado de los materiales ya mencionados
3. Procedemos a cortar papel madera para envolver las cajas Petri.
4. Una vez cumplido esos pasos procedemos a llevar a la autoclave las cajas Petri y los
Erlenmeyer a 121°C, 1,02 atm durante 15 minutos.
5. Pasado este tiempo tenemos los materiales totalmente esterilizados listos para su
uso.
Sugerencias:
 Planificación detallada: Antes de la práctica, asegúrate de tener un plan detallado
que incluya los materiales necesarios, el procedimiento a seguir y los objetivos
específicos a alcanzar.
 Seguridad: Recuerda seguir todas las normas de seguridad en el laboratorio,
especialmente al trabajar con equipos de esterilización y microorganismos
potencialmente patógenos.
 Control de variables: Mantén un control estricto de las variables en el experimento
para garantizar la validez de los resultados. Esto incluye la estandarización de las
condiciones de esterilización y la manipulación adecuada de las muestras.
 Registro detallado: Lleva un registro detallado de todas las etapas del experimento,
desde la preparación de las muestras hasta los resultados obtenidos, para facilitar el
análisis posterior.
 Análisis crítico: Fomenta la discusión y el análisis crítico de los resultados
obtenidos, animando a los estudiantes a reflexionar sobre las implicaciones de sus
hallazgos y a proponer posibles mejoras en el diseño experimental.
Observaciones:
 Interpretación de resultados: Ayuda a los estudiantes a interpretar correctamente los
resultados obtenidos, destacando la importancia de la reducción microbiana y la
eficacia de los diferentes métodos de esterilización.
 Contextualización: Relaciona la práctica con situaciones reales en la industria
alimentaria, destacando la relevancia de la esterilización para la seguridad y calidad
de los productos.
 Fomento de la curiosidad: Anima a los estudiantes a plantear preguntas y a explorar
nuevas ideas relacionadas con la esterilización de alimentos, fomentando así su
curiosidad científica.
 Feedback constructivo: Proporciona retroalimentación constructiva a los estudiantes
sobre su desempeño en la práctica, destacando tanto los aciertos como las áreas de
mejora.
 Aplicación práctica: Destaca la importancia de los conceptos aprendidos en la
práctica de laboratorio para la vida profesional de los estudiantes, especialmente en
campos como la microbiología de alimentos y la seguridad alimentaria.
Bibliografía:
 Microbiología moderna de los alimentos" de John L. Ingraham.
 "Microbiología del suelo" de Patrick Collard.
 "Principles of Microbiology" de R.M. Atlas.
 "Ciencia y Tecnología de los Alimentos" de A. Madrid, E. Esteire, y J.M. Cenzano.
  "HACCP. Una guía breve para la industria alimentaria" de Sara E. Mortimore y
Carol A. Wallace.
PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO

OBJETIVOS:
 Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de
los microorganismos in vitro.
 Manejar los instrumentos de uso rutinario en el laboratorio de microbiología.
 Realizar un primer acercamiento a la manipulación de microorganismos.
 Adquirir la noción de la importancia del trabajo en condiciones de esterilidad y las
técnicas comunes para llevarlo a cabo.
FUNDAMENTO TEORICO:
Definición de medio de cultivo: Los medios de cultivo constituyen el aporte de nutrientes
indispensables para el crecimiento y desarrollo de los microorganismos in vitro. Su
composición precisa dependerá de las necesidades nutricionales de la especie microbiana
que se quiera cultivar.
Tipos de medios de cultivo:
Medios de cultivo generales: Permiten el crecimiento de un gran número de especies
microbianas (agar nutritivo, caldo ordinario, agar de Sabouraud).
Medios de cultivo selectivos: Permiten el crecimiento de determinados microorganismos e
inhiben el desarrollo de otros.
Medios de cultivo diferenciales: Se desarrollan para el estudio de pruebas fisiológicas o
test bioquímicos (utilización de citratos, acidificación a partir de azúcares, etc.).
Componentes de los medios de cultivo:
Componentes indispensables: agua, nutrientes orgánicos (hidratos de carbono,
aminoácidos, vitaminas, etc.) y nutrientes inorgánicos (P, Fe, N, Mg, S, etc.).
Componentes alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-
agar), tampones, indicador de pH, etc.
Preparación de medios de cultivo:
A partir de componentes individuales o mediante medios deshidratados comerciales.
PROCEDIMIENTO:
• Agar papa-glucosa
Medio para el cultivo y recuento de levaduras y hongos en las mantequillas, otros productos
lácteos,bebidas azucaradas, alimentos congelados, etc. Se compone de:

• Papas peladas, cortadas en cubo 20 g

• Glucosa 4 g
• Agar-agar 4 g
• Agua destilada 200 ml
Disolver en el agua la glucosa, agregar el agar y dejar reposar unos minutos hasta que el
agar se embeba el agua una vez listo llevar al autoclave
como ya mencionamos en el informe de esterilización
a 121°C 1,02 atm durante 15 minutos con el objetivo de
fundir el agar agar una vez transcurrido ese paso
proceder a vaciar en las cajas Petri y dejar un tiempo de
aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente
para que el agar se solidifique.
Sugerencias:
• Planificación detallada: Antes de comenzar la práctica, asegúrate de tener todos los
materiales y equipos necesarios preparados y organizados.
• Seguridad: Recuerda seguir las normas de seguridad en el laboratorio, como el uso
de guantes, bata de laboratorio y gafas de protección.
• Precisión en las mediciones: Es fundamental ser preciso al pesar los ingredientes y
al preparar los medios de cultivo para obtener resultados confiables.
• Control de calidad: Realiza pruebas de esterilidad y verifica el pH de los medios
preparados para garantizar su idoneidad.
• Documentación: Lleva un registro detallado de cada paso realizado, resultados
obtenidos y observaciones relevantes durante la práctica.
Observaciones:
• Esterilización adecuada: Asegúrate de que el proceso de esterilización se realice
correctamente para evitar contaminaciones que puedan afectar los resultados.
• Manipulación aséptica: Practica técnicas de manipulación aséptica para evitar la
contaminación de los medios de cultivo durante su preparación.
• Revisión de resultados: Analiza los resultados obtenidos con atención y discute
cualquier discrepancia o anomalía que pueda surgir durante la práctica.
• Interacción y discusión: Fomenta la interacción entre los participantes para
compartir experiencias y conocimientos, y promueve la discusión sobre la importancia de la
preparación de medios de cultivo en microbiología de alimentos.
• Aprendizaje continuo: Utiliza esta práctica como una oportunidad para aprender y
mejorar tus habilidades en la preparación de medios de cultivo, lo cual es fundamental en el
análisis microbiológico de alimentos.
Bibliografía:
 Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos
Generales (2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela.
 Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos.
 Merck. 2002. Microbiology Manual.
 Ortega, Y; Quevedo F. 1991. Garantía de la Calidad de los Laboratorios de
Microbiología Alimentaria. Organización Panamericana de la Salud. Harla S.A.
México D.F.
 Prof. Sofía Gutiérrez de Gamboa. Prof. Alessandra Garcés Octubre 2001. Prof.
Katiuska Saravia Revisión 2008.
 SIEMBRA

OBJETIVOS:
 Unas prácticas de laboratorio de cultivo de microorganismos incluyen conocer los
diferentes medios de cultivo, observar el crecimiento de microorganismos, y
comprender la importancia de los medios de cultivo en la identificación de
microorganismos.
 Además, se busca verificar la importancia de los medios de cultivo en el
crecimiento de microorganismos, así como comprobar la relevancia de la
observación del crecimiento de microorganismos en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio.
 Estos objetivos se centran en entender cómo el medio de cultivo proporciona los
nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos, y en la
observación del crecimiento de estos organismos en condiciones controladas para su
identificación y estudio.
FUNDAMENTO TEORICO:
Conocer los diferentes medios de cultivo y su importancia en el crecimiento y la
identificación de microorganismos. Esto implica entender cómo los medios de cultivo
proporcionan los nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos.
Observar y estudiar el crecimiento de microorganismos en condiciones controladas de
laboratorio. Esto permite comprender los requerimientos y características de crecimiento de
diferentes tipos de microorganismos.
Aprender técnicas de siembra y aislamiento de microorganismos, como la siembra por
agotamiento en placas de Petri. Esto es fundamental para obtener cultivos puros y poder
identificar y caracterizar los microorganismos.
Familiarizarse con el uso de técnicas de tinción, como la tinción de Gram, para diferenciar
los principales grupos de bacterias. Esto es un paso clave en la identificación y clasificación
de los microorganismos.
Comprender la importancia de mantener condiciones asépticas y de esterilidad en el
laboratorio de microbiología para evitar contaminaciones. Esto es crucial para obtener
resultados confiables.
PROCEDIMIENTO:
• Cuando ya el medio de cultivo se solidifico se procede a la siembra de los
microorganismos, el cual se utilizó bacterias del yogurt bebible, estas bacterias tienen el
nombre de Streptococos thermophilus y Lactobacilus bulgaricus, y la bacteria de la
levadura Saccharomyces Cerevisiae.
• Para la siembra de estas bacterias se procede a desinfectar el ansa, que se realizó
con alcohol por que no se contaba con un mechero Bunsen para su esterilización.
• Cuando ya se desinfecta el ansa se extrae las bacterias y se realiza la siembra de las
bacterias.

• Una vez concluida la siembra de proceder a meter a la incubadora a una temperatura

de 35°C por 7 dias aproximadamente.
• Pasado el tiempo se procede a la observación de las cajas petri

SUGERENCIAS:
 Asegurar la esterilidad
 Asegurar la esterilidad del área de trabajo y los materiales utilizados para evitar la
contaminación de los cultivos.
 Preparación de medios de cultivo
 Seguir un procedimiento estandarizado para la preparación de los medios de cultivo,
incluyendo la esterilización por autoclave.
 Toma de muestras
 Tomar muestras de diferentes superficies y áreas del cuerpo de manera cuidadosa y
aséptica para inocular los medios de cultivo.
 Incubación
 Incubar las placas de Petri a la temperatura adecuada (generalmente 37°C) durante
48 horas para permitir el crecimiento de las colonias.
 Observación de colonias
 Observar cuidadosamente las características morfológicas de las colonias crecidas,
como color, forma y textura, para identificar los diferentes tipos de
microorganismos.
 Análisis microscópico
 Realizar tinciones y observaciones microscópicas de las colonias para determinar la
morfología celular de los microorganismos aislados.
 Pruebas de sensibilidad
 Llevar a cabo pruebas de sensibilidad antimicrobiana (antibiograma) para evaluar la
susceptibilidad de los microorganismos a diferentes antibióticos.
 Registro de procedimientos
 Mantener un registro detallado de los procedimientos, resultados y observaciones
realizadas durante la práctica.
 Importancia de la higiene
 Enfatizar la importancia de la higiene y la prevención de enfermedades a través del
control microbiológico de superficies y áreas del cuerpo.
 Actitud positiva
  Fomentar una actitud positiva hacia la investigación microbiológica y el aprendizaje
práctico de los estudiantes.
OBSERVACIONES:
Contaminación
Estar atento a posibles fuentes de contaminación durante el proceso de cultivo, como la
apertura prolongada de placas de Petri o la exposición a fuentes externas de
microorganismos.

Crecimiento inusual
Observar cualquier crecimiento inusual en las placas de cultivo que pueda indicar la
presencia de contaminantes o la necesidad de investigar más a fondo.
Identificación precisa
Ser meticuloso en la identificación de las colonias, asegurándose de compararlas con
referencias adecuadas y realizar pruebas confirmatorias si es necesario.
Registro detallado
Registrar de manera detallada cualquier observación relevante, incluyendo cambios en las
colonias, resultados de pruebas adicionales y cualquier anomalía en el proceso de cultivo.
Seguridad
Mantener siempre medidas de seguridad adecuadas, como el uso de equipo de protección
personal y la correcta eliminación de desechos biológicos, para prevenir riesgos para la
salud.
Colaboración
Fomentar la colaboración entre los estudiantes para discutir y analizar las observaciones,
promoviendo un ambiente de aprendizaje interactivo y enriquecedor.
Evaluación crítica
Incentivar a los estudiantes a realizar una evaluación crítica de sus observaciones,
cuestionando y analizando los resultados para promover un pensamiento científico
riguroso.
Retroalimentación
Proporcionar retroalimentación constructiva sobre las observaciones realizadas, destacando
aciertos y áreas de mejora para enriquecer la experiencia de aprendizaje.
Creatividad
Estimular la creatividad en la interpretación de las observaciones, alentando a los
estudiantes a proponer hipótesis y soluciones innovadoras basadas en sus hallazgos.
BIBLIOGRAFIA:
 Incluye libros, artículos, páginas web, y cualquier otro tipo de fuente documental
consultada, independientemente del formato.
 Sigue un estilo o norma bibliográfica estandarizada, como APA, MLA, Chicago, etc., que
determina el formato y orden de los elementos de cada referencia.
 Permite respaldar la credibilidad del trabajo al demostrar las fuentes consultadas, y también
puede servir como recomendación de lecturas adicionales.
 Generalmente se ubica al final del documento, después del cuerpo principal del texto.
 Debe ser concisa y precisa, incluyendo solo la información necesaria de cada fuente de
acuerdo al estilo bibliográfico elegido.

TINCION DE GRAM
OBJETIVOS:
 Aprender la técnica de la Tinción de Gram, un método de tinción diferencial
ampliamente utilizado para la clasificación de bacterias.
 Identificar la morfología y la reacción a la Tinción de Gram de diferentes tipos de
bacterias, como cocos y bacilos, grampositivas y gramnegativas.
 Desarrollar habilidades en el manejo del microscopio óptico y la observación de
preparaciones microscópicas de bacterias.
 Comprender los principios básicos de la estructura y composición de la pared
celular bacteriana que determinan la reacción a la Tinción de Gram.
FUNDAMENTO TEORICO:
La Tinción de Gram es una técnica de tinción diferencial desarrollada por el médico danés
Hans Christian Gram en 1884. Se basa en las diferencias en la composición y estructura de
la pared celular de las bacterias, lo que les confiere una reacción característica a la tinción.
Las bacterias se clasifican en dos grandes grupos según su reacción a la Tinción de Gram:
Bacterias grampositivas: Retienen el colorante cristal violeta y se tiñen de color púrpura.
Tienen una pared celular gruesa y rica en peptidoglicano.
Bacterias gramnegativas: Pierden el cristal violeta durante el proceso de decoloración y se
tiñen de color rosado con la colorante safranina. Tienen una pared celular más delgada y
compleja, con una capa externa de lipopolisacáridos.
Esta clasificación es fundamental para la identificación y el diagnóstico de infecciones
bacterianas, ya que las bacterias grampositivas y gramnegativas suelen tener diferentes
requerimientos nutricionales, sensibilidad a antibióticos y patogenicidad.
 La Tinción de Gram también permite observar la morfología celular de las bacterias, como
la forma de cocos, bacilos, espirilos, etc., lo cual es otro criterio importante para su
identificación.
REACTIVOS USDOS EN EL
PROCEDIMIENTO DE LA PRACTICA:

PROCEDIMIENTO:

Lo primero q se hace es
lavar el portaobjetos con
agua destilada.

Luego se toma una pequeña

muestra de nuestro cultivo y se
pone al portaobjetos.

El procedimiento se inicia
fijando a la llama las
bacterias extendidas en un
portaobjetos.
 Las mismas se tiñen con una
solución del colorante básico
cristal violeta.
(Dejar el contacto durante 30
segundos)

Lavar suavemente con agua

destilada (usar gotero).

Cubrir el frontis con lugol

(Dejar en contacto durante 30
segundos)

Lavar suavemente con agua

destilada (usar gotero)
 Decolorar con alcohol de 96
°GL durante 15 a 20 segundos
como máximo (usar gotero)

Lavar suavemente con agua

destilada (usar gotero)

Humedecer (cubrir) el frontis

con safranina
Dejar en contacto entre 30 a
60 segundos.
 Lavar suavemente con agua
destilada (usar gotero)
Quitamos el exceso de agua

Observar en microscopio con

objetivo de inmersión

SUJERENCIAS:
 Asegúrate de contar con todos los materiales y reactivos necesarios antes de
comenzar la práctica.
 Instruye a los estudiantes sobre las medidas de seguridad en el laboratorio,
especialmente al utilizar el mechero Bunsen.
 Fomenta la observación cuidadosa y detallada al microscopio para una correcta
identificación de las bacterias.
 Anima a los estudiantes a registrar sus observaciones de manera organizada y
precisa.
 Promueve la discusión y el análisis de los resultados obtenidos para una
comprensión más profunda del tema.
OBSERVACIONES:
 Supervisa de cerca el proceso de tinción de Gram para garantizar que se sigan los
pasos correctamente.
 Estimula la participación activa de los
estudiantes durante la práctica para mejorar su
comprensión.
 Realiza una revisión de los conceptos teóricos
previos a la práctica para reforzar el aprendizaje.
 Proporciona retroalimentación constructiva a
los estudiantes durante y después de la práctica para
mejorar su desempeño.
  Considera la posibilidad de realizar una sesión de preguntas y respuestas al final de
la práctica para reforzar los conocimientos adquiridos.

BIBLIOGRAFIA:

Prescott, J.L., Harley, J.P. y Klein, D.A. (1999). Introducción a la microbiología. 4a ed.
Madrid: McGraw-Hill-Interamericana.
Roberts, D. (2000). Microbiología práctica de los alimentos. Métodos para el examen de
los microorganismos de los alimentos de interés para la salud pública. Zaragoza:
Editorial Acribia.
Hernández Urzúa, M.A. (2023). Microbiología de los alimentos. Fundamentos y
aplicaciones en Ciencias de la Salud. 2a ed. México: Editorial Médica
Panamericana.
Madrid Vicente, A. (ed.) (2022). Microbiología de los alimentos. Madrid: Editor Antonio
Madrid Vicente.
Castillo, A.M. (2005). Referencias bibliográficas. Biblioteca Central Pedro Zulen,
Universidad Nacional Mayor de San Marcos.