TEMA 2

MICROSCOPÍA
CFGS Laboratorio de Análisis y Control de Calidad
IES Pare Vitoria
Helena Ruiz Cano
 ÍNDICE

1. El microscopio 3. Microscopio de contraste de fases

1.1. Ventajas
4. Microscopio de campo oscuro
1.2. Tipos de microscopios

5. Microscopio UV y de fluorescencia
2. Microscopio de campo luminoso

2.1. Poder de resolución 6. Microscopio electrónico

2.2. Apertura numérica (AN)

2.3. Índice de refracción

 1. EL MICROSCOPIO

Se denomina microscopio al instrumento destinado a la observación de pequeños objetos de los

que se obtiene una imagen muy aumentada mediante un sistema de lentes (ópticas,
electrónicas…)

Como ya sabemos, este instrumento es imprescindible para el estudio de los microorganismos:

bacterias, protozoos, virus...

● El ojo humano presenta un poder de resolución aproximado de 0,2 mm

● El de un buen microscopio óptico se sitúa en torno a 0,2 µm
● El de un microscopio electrónico es de unos 0,2 nm
 1. EL MICROSCOPIO

El poder de resolución es la capacidad de percibir por separado dos puntos pequeños,

adyacentes y cercanos.
El poder resolutivo del microscopio no guarda relación alguna con el aumento del mismo.

El límite de resolución es la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para
que sean distinguidos por separado.

Existe, por lo tanto, una relación inversa entre poder resolutivo y límite de resolución:
cuanto menor sea la distancia que debe separar a dos puntos para que se distingan
por separado, mayor será el poder resolutivo necesario para observarlos.
 1. 1. VENTAJAS DEL USO DE MICROSCOPIOS

Las ventajas del microscopio son:

● Permite ampliar una imagen mediante lentes: los

microscopios utilizan lentes convexas, que funcionan como
un conjunto de prismas. Cuando la luz incide sobre ellas, se
desvía hacia dentro y converge en un punto (punto focal),
y a partir de este punto focal divergen creando una imagen
aumentada e invertida.

● Crea un contraste entre objeto-medio circundante: nos permite observar el objeto con
nitidez.

● Tiene un alto poder de resolución: nos permite percibir diferenciados objetos muy próximos.
 1.2. TIPOS DE MICROSCOPIOS

Microscopio simple o lupa: compuesto por una sola lente de aumento, que produce una imagen
vertical. Su resolución es de unos 10 µm.

Microscopio compuesto: compuesto, al menos, por dos sistemas de lentes (lente objetivo y lente
ocular). Las diferencias entre ellos se deben al sistema de amplificación que usa cada uno:

○ Microscopio óptico o de luz: amplifica mediante un sistema de lentes ópticas.

○ Microscopio electrónico: amplifica mediante un haz de electrones.

El microscopio electrónico
también es compuesto
 1.2. TIPOS DE MICROSCOPIOS

MICROSCOPIOS ÓPTICOS COMPUESTOS:

A. Microscopio de campo claro

○ Es el microscopio que tenemos en el laboratorio.

○ La fuente de iluminación es la luz blanca.

○ Nos permite visualizar muestras teñidas o con pigmentos naturales que resultan
altamente contrastadas.

○ Los componentes de la muestra se visualizan gracias a las diferencias de contraste que

existen entre ellos y el medio que los rodea.
 1.2. TIPOS DE MICROSCOPIOS

MICROSCOPIOS ÓPTICOS COMPUESTOS:

B. Microscopio de campo oscuro

○ Utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un

cono hueco concentrado sobre la muestra.

○ Es una técnica de contraste donde solo la luz difractada

desde el espécimen se usa para formar la imagen. El objeto
se hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás.

○ Se utiliza habitualmente para las muestras no teñidas y para observar microorganismos

con un diámetro pequeño, como las espiroquetas (causantes, por ejemplo, de la sífilis).
1.2. TIPOS DE MICROSCOPIOS
 1.2. TIPOS DE MICROSCOPIOS

MICROSCOPIOS ÓPTICOS COMPUESTOS:

C. Microscopio de contraste de fases

○ Se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las
células sin necesidad de teñirlas.

○ Nos permite observar muestras sin necesidad de teñirlas, por

lo que se pueden observar células, tejidos o microorganismos
vivos.

○ La invención de este microscopio resultó en grandes avances

en el campo de la biología ya que permitió la observación de
procesos biológicos desconocidos hasta el momento.
 1.2. TIPOS DE MICROSCOPIOS

MICROSCOPIOS ÓPTICOS COMPUESTOS:

D. Microscopio de luz UV

○ Iluminan la muestra con luz ultravioleta, que posee una longitud de onda más corta que la luz visible
utilizada en los microscopios ópticos.

○ La ventaja principal de utilizar esta técnica es que puede alcanzarse una resolución mejor que con luz
visible.

○ La muestra debe poseer propiedades emisoras de luz, sean naturales o suministradas.

○ Los microscopios de luz ultravioleta vienen equipados con sensores digitales o cámaras sensibles a la
luz UV; y las partes ópticas no están hechas de vidrio si no de cuarzo o fluorita, ya que el vidrio no
puede transmitir la luz UV.
 1.2. TIPOS DE MICROSCOPIOS

MICROSCOPIOS ÓPTICOS COMPUESTOS:

E. Microscopio de fluorescencia

○ Es un microscopio óptico convencional al que se le añade un

adaptador de fluorescencia, el cual permite realizar la
observación óptica de la muestra de manera tanto convencional
como con contraste con fluorescencia.

○ El microscopio de fluorescencia usa una intensidad de la luz

mucho mayor, la cual excita las especies marcadas con
fluorescencia en la muestra.
 1.2. TIPOS DE MICROSCOPIOS
MICROSCOPIOS ÓPTICOS COMPUESTOS:

F. Microscopio confocal de barrido

○ Su mecanismo se basa en el microscopio de fluorescencia.

○ La diferencia es que permite obtener imágenes de un único plano

confocal.

○ El principio en el que se basa el microscopio confocal es eliminar la

luz procedente de los planos fuera del foco. Sólo la luz que está
dentro de este plano puede ser detectada, de modo que la calidad
de imagen es mucho mejor que las de campo amplio.

○ Como sólo se ilumina un punto cada vez en el microscopio confocal,

se requiere una exploración (scanning) para obtener imágenes bi o
tridimensionales.
 1.2. TIPOS DE MICROSCOPIOS

MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS COMPUESTOS:

Un microscopio electrónico usa electrones en lugar de fotones o luz visible para

formar imágenes de objetos diminutos.

Los microscopios electrónicos permiten alcanzar amplificaciones mayores antes que

los mejores microscopios ópticos, debido a que la longitud de onda de los electrones
es bastante menor que la de los fotones.

Por lo tanto, es necesario disponer de un emisor de electrones. En general se utiliza

un filamento de tungsteno. Este filamento es calentado de modo que la energía de
sus átomos y electrones aumenta. A partir de un cierto nivel energético los
electrones poseen suficiente energía para escapar de sus átomos. Estos electrones
libres son a continuación dirigidos hacia la muestra.
 1.2. TIPOS DE MICROSCOPIOS

MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS COMPUESTOS:

La longitud de onda con la que se mueve un electrón es inversamente proporcional a su velocidad. Esto significa
que si los electrones son acelerados a altas velocidades pueden obtenerse longitudes de onda muy cortas.

Además, en lugar de utilizar lentes de vidrio, los microscopios electrónicos utilizan lentes electromagnéticas.
Estas lentes generan campos eléctricos y magnéticos de modo que su interacción con los electrones hace que
sus trayectorias diverjan o converjan en un punto.

El procedimiento expuesto anteriormente debe llevarse a cabo dentro de una cámara de vacío. De lo contrario,
los electrones interactuarían con las moléculas del aire y no sería posible determinar sus trayectorias
adecuadamente.

La muestra que se observa debe colocarse también dentro de la cámara de vacío. Este es uno de los motivos por
el cual no es posible observar muestras vivas con un microscopio electrónico.
 1.2. TIPOS DE MICROSCOPIOS
MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS COMPUESTOS:

A. Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

o El microscopio electrónico de transmisión (TEM en inglés) emite un haz de electrones dirigido hacia el
objeto cuya imagen se desea aumentar.

o Los electrones son conducidos hacia la muestra mediante las lentes electromagnéZcas. Cuando los
electrones impactan contra la muestra, algunos de ellos consiguen atravesarla y otros son dispersados. Los
electrones que pueden pasar al otro lado de la muestra son capturados por un detector dando lugar así a
una imagen.

o Para uZlizar un microscopio electrónico de transmisión debe cortarse la muestra en capas finas (< 2000 Å).

o Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.
 1.2. TIPOS DE MICROSCOPIOS

MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS COMPUESTOS:

A. Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

ü Esta técnica de microscopía es muy útil para visualizar los detalles internos de una
muestra.

ü La principal limitación que tiene esta técnica es que no permite extraer información de la
superficie de la muestra.
 1.2. TIPOS DE MICROSCOPIOS

MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS COMPUESTOS:

B. Microscopio electrónico de barrido (SEM)

o El microscopio electrónico de barrido (SEM en inglés) es un

tipo de microscopio electrónico capaz de producir imágenes
de alta resolución de la superficie de una muestra utilizando
interacciones electrón-materia.

o Los electrones no iluminan toda la muestra simultáneamente sino que se hace un escaneado
recorriendo los distintos puntos de la muestra.

o Cuando los electrones impactan con la muestra estos pierden parte de su energía debido a distintas
interacciones. Parte de su energía inicial se transforma en calor o en emisiones de rayos, o provoca la
emisión de electrones (electrones secundarios) que se desprenden de la superficie de la muestra.
 1.2. TIPOS DE MICROSCOPIOS
MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS COMPUESTOS:

B. Microscopio electrónico de barrido (SEM)

o El principio de funcionamiento de los microscopios electrónicos de barrido se basa , generalmente, en
medir la cantidad de electrones secundarios que emite la superficie cuando es bombardeada con
electrones.

o La preparación de las muestras para SEM es más sencilla, ya que no es necesario hacer cortes finos. Sin
embargo, la muestra sí debe ser recubierta con una capa de metal delgado , para aumentar los electrones
secundarios que pueden desprenderse cuando se aplica el haz principal de electrones.

o El aumento que alcanzan este tipo de microscopios es menor que el que se puede obtener con un TEM
(200.000 veces vs. 1 millón).

o Sin embargo, la información tridimensional que proporciona esta técnica lo convierte en un instrumento
muy útil para determinados tipos de muestras.
 2. EL MICROSCOPIO DE CAMPO LUMINOSO
El microscopio óptico de campo luminoso, es un microscopio compuesto (lente
objetivo y lente ocular)

En la estructura de un microscopio de campo

luminoso, podemos diferenciar dos partes
fundamentales:

A. SISTEMA ÓPTICO: lentes oculares y lentes

objetivo.

B. SISTEMA DE ILUMINACIÓN: condensador,

diafragma y fuente luminosa.

C. SOPORTE MECÁNICO

Base, brazo, tubo óptico, cabezal, revólver, platina, tornillos de enfoque (macrométrico y micrométrico)…
 2. EL MICROSCOPIO DE CAMPO LUMINOSO
LENTES OCULARES:

• Los microscopios pueden tener un solo ocular (microscopio monocular) o dos

(microscopio binocular). Algunos incorporan un tercer ocular (triocular) que permite
acoplar una cámara fotográfica o de vídeo.

• El aumento viene indicado en cada uno de ellos: 8x, 10x, 15x…

Lentes oculares (10x) Lentes oculares (15x)

 2. EL MICROSCOPIO DE CAMPO LUMINOSO
LENTES OCULARES:
 2. EL MICROSCOPIO DE CAMPO LUMINOSO
LENTES OBJETIVOS:

• Son sistemas de lentes que se clasifican según su distancia focal (distancia entre el
objetivo y la superficie superior del cubre o portaobjetos).

• Los aumentos están indicados en la lente: 4x, 10x, 40x, 100x…

Lentes objetivo (4x, 10x, 40x y 100x)

 2. EL MICROSCOPIO DE CAMPO LUMINOSO
LENTES OBJETIVOS:
 2. EL MICROSCOPIO DE CAMPO LUMINOSO
LENTES OBJETIVOS:

Las lentes objetivo se pueden clasificar atendiendo a diferentes aspectos:

Objetivos secos: entre el objetivo y la muestra solo se interpone el aire

Según su empleo Objetivos de inmersión: necesitan un líquido entre la lente y el objeto.

*El más usado es el aceite de cedro, que posee un índice de refracción de 1,56 (igual al del vidrio).

Objetivos acromáticos: utilizan lentes que eliminan la aberración cromática,

debida a que la luz blanca es separada en sus componentes por las lentes,
creando franjas coloradas en el contorno de las imágenes.
Según el tipo de lente
Objetivos planáticos: utilizan lentes que eliminan la aberración esférica, que
distorsiona la imagen. Esta se produce debido a que la refracción de la luz es
mayor en los bordes de la lente que en el centro.
 2. EL MICROSCOPIO DE CAMPO LUMINOSO

ABERRACIONES

Son errores/distorsiones de visión propios del

diseño.

Existen dos tipos:

• Aberración cromática: debido a ella, todos los

objetos que se visualizan están rodeados de
irisaciones o destellos

• Aberración esférica: se debe a que no es posible

enfocar todo el campo del microscopio al mismo
tiempo, lo que mejor se observa es lo que está
en la parte más central de la lente.
2.1. Poder de resolución en microscopía de campo claro

• La luz tiene una naturaleza ondulatoria, por lo que un objeto muy pequeño se percibe
como un disco rodeado de una serie de anillos luminosos y oscuros.

• Dos objetos muy próximo entre sí sólo podrán percibirse como separados si los anillos
que los rodean NO se superponen entre sí.
2.1. Poder de resolución en microscopía de campo claro

LÍMITE DE RESOLUCIÓN (d): distancia mínima entre dos puntos que se pueden distinguir
entre sí.

𝜆 = longitud de onda de la fuente de luz (nm)

0,61 𝜆
𝑑= 𝑛 = índice de refracción del medio
𝑛 · 𝑠𝑒𝑛 𝛼 𝛼 = mitad del ángulo de la lente del objetivo

• La longitud de onda (𝜆) es muy importante en la resolución, y debe ser siempre inferior a la distancia
entre dos objetos. De lo contrario no se observarán con claridad.

• En un microscopio de campo claro, obtenemos la máxima resolución al emplear la longitud de

onda (𝝀) más corta posible (extremo azul-violeta del espectro visible 400-700 nm)
2.1. Poder de resolución en microscopía de campo claro

LÍMITE DE RESOLUCIÓN (d): distancia mínima entre dos puntos que se pueden distinguir
entre sí.

𝜆 = longitud de onda de la fuente de luz

0,61 𝜆
𝑑= 𝛼 = mitad del ángulo de la lente del objetivo
𝑛 · 𝑠𝑒𝑛 𝛼 𝑛 = índice de refracción del medio

PODER DE RESOLUCIÓN (PR) es inversamente proporcional a la distancia mínima a la cual se

pueden distinguir dos puntos muy cercanos.

!
PR =
"
2.1. Poder de resolución en microscopía de campo claro

LÍMITE DE RESOLUCIÓN (d): distancia mínima entre dos puntos que se pueden distinguir
entre sí.

• El producto n · sen 𝛼 describe las propiedades de la lente del objetivo, y se conoce como apertura
numérica (AN).

• El poder de resolución del microscopio óptico queda definido por los valores de la AN y de la 𝜆.

0,61 𝜆 0,61 𝜆
𝑑= 𝑑=
𝑛 · 𝑠𝑒𝑛 𝛼 𝐴𝑁
Apertura numérica
(AN)
2.2. Apertura numérica (AN)

APERTURA NUMÉRICA (AN): los valores para la AN dependen de:

• La alteración que se pueda conseguir en los objetos del microscopio, que es limitada.

• El medio entre la muestra y el objePvo, que puede ser:

Ø Aire (n = 1)
Ø Otro material, como aceites de inmersión (n > 1)

• En la aplicación prácPca si alteramos los objePvos para conseguir un número máximo en el

valor sen 𝛼, las AN posibles dependen del medio por el que se desplaza la luz:

Ø Si el medio es el aire el valor máximo AN < 1

Ø Si el medio es aceite de inmersión, según el valor n del aceite, obtenemos valores de
AN 1,2 – 1,4
Un cono con ángulo estrecho no separa bien las imágenes de objetos muy
próximos, y la resolución es baja.

Un cono de ángulo abierto separa perfectamente los objetos, dando una

resolución alta.
ÍNDICE DE REFRACCIÓN

La velocidad de la luz depende del medio que atraviesa.

La relación de velocidades de la luz en el vacío y en cualquier sustancia se conoce como índice de

refracción (n).

El índice de refracción es una medida de la intensidad con que una sustancia disminuye la velocidad
de la luz.

Cuando un rayo de luz pasa de un medio a otro se produce refracción. Es decir, el rayo se desvía en
la interfase.

La refracción hace referencia a la inclinación que sufre un rayo cuando pasa de un medio a otro.

La refracción ocurre cuando los índices de refracción de los dos medios son diferentes, y el ángulo
de incidencia no es cero.
ÍNDICE DE REFRACCIÓN

Cuando la luz pasa del aire al vidrio, un medio con n superior, disminuye su velocidad y se desvía
hacia la normal (línea perpendicular a la superficie).

A medida que la luz deja el vidrio para volver al aire con n inferior, acelera su velocidad y se desvía
de la normal.
ÍNDICE DE REFRACCIÓN

ü El índice de refracción del aire es n = 1

ü Sen 90 º = 1

Por lo tanto, la máxima apertura numérica (AN) que podemos tener con un objetivo que funcione en el aire es de 1.

La única forma de aumentar la AN es aumentando el índice de refracción, y para ello se utiliza aceite de inmersión
cuyo índice de refracción es muy similar al del vidrio (naceite = 1,56 y nvidrio = 1,55)

ü El índice de refracción del vidrio es n = 1,56

ü Sen 90º = 1

Por lo tanto, la máxima apertura numérica (AN) que podemos tener con un objetivo de inmersión es de 1,56.
2.3. Límite de resolución (d)

El menor límite de resolución del microscopio o la mínima distancia que puede verse nítida
y diferenciada, se consigue con:

• Una luz visible de longitud de onda (λ) lo más corta posible.

• Un objetivo con AN máxima.

El límite de resolución de un microscopio depende de la AN del condensador y del objetivo:

𝜆
𝑑!"#$%&#%'"% =
𝐴𝑁!"#$%&'! + 𝐴𝑁(!)*$)+,*!-
2.3. Límite de resolución (d)

El límite de resolución (d) se puede calcular así:

• La máxima AN del objetivo (AN = 1,25) y la máxima AN del condensador (AN = 0,9).

• Como la menor λ útil es 0,430 µm (430 nm), tenemos:

0,430 µ𝑚 0,430µ𝑚
𝑑!"#$%&#%'"% = = = 0,2µ𝑚
(1,25 + 0,9) 2,15
2.4. Grado de amplificación y límite eficaz

La mayoría de microscopios ópticos disponen de varios objetivos de

diferentes amplificaciones.

• El grado de amplificación G, del aparato se calcula como el producto del poder de

amplificación del objetivo y del ocular (lo normal es usar ocular de x10)

G=B·M

donde, B es el aumento del objetivo y M el aumento del ocular.

• El límite eficaz de aumento es la AN x 1000, cualquier aumento superior a este no

ofrece una imagen nítida.