UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE FARMACIA

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

ESTUDIO DE LA REGULACIÓN DE LA
GUANILATO CICLASA SOLUBLE EN CÉLULAS
NEURALES

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR
Rut Ferrero Bóveda

Bajo la dirección de la doctora

Magdalena Torres Molina

Madrid, 2001

ISBN:84-669-2008-0
 Universidad Complutense de Madrid
Facultad de Farmacia
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Estudio de la regulación de la guanilato

ciclasa soluble en células neurales

TESIS DOCTORAL

Rut Ferrero Bóveda

Madrid, 2001
II

El presente trabajo de investigación se ha

desarrollado en el Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular IV de la
Facultad de Veterinaria de la Universidad
Complutense de Madrid, bajo la dirección
de la Dra. Dª Magdalena Torres.

Vº Bº Directora

Magdalena Torres
 III

INDICE

I. INTRODUCCIÓN

1 GUANILATO CICLASAS
1.1. Guanilato ciclasa soluble 2
1.1.a. Dominios estructurales 2
1.1.a.1. Dominio de unión al grupo hemo 3
1.1.a.2. Dominios catalíticos y de dimerización 5
1.1.b. Isoformas 6
1.1.c. Organización genómica de guanilato ciclasa soluble 8
1.1.d. Regulación de la expresión de las subunidades α y β
de guanilato ciclasa soluble 9
1.1.e. Regulación de la activación de guanilato ciclasa soluble 10
Tolerancia 11
1.2. Herramientas farmacológicas para el estudio de la GCs 13
1.2.a. Los donadores de NO 13
1.2.b. El YC-1, un activador de la guanilato ciclasa soluble
independiente de NO 13
1.2.c. ODQ, inhibidor de la actividad guanilato ciclasa soluble 15
1.3. Formas particuladas de las guanilato ciclasas 16

2. VÍA NO-CG-GMPc
2.1. El óxido nítrico como molécula señalizadora 19
2.2. El óxido nítrico 20
2.2.a. Química y reactividad del NO 20
2.2.a.1. Reacción del NO con oxígeno 20
2.2.a.2. Reacción del NO con superóxido 21
2.2.a.3. Reacciónes de nitrosilación 21
2.2.a.4. Reacción del NO con oxihemoglobina 22
2.3. Biosíntesis de óxido nítrico 23
2.3.a. Estructura de las NOS 24
2.3.a.1. NOS I ó neural 25
2.3.b.2. NOS II o inducible 26
2.3.b.3. NOS III o endotelial 27

3. DONADORES DE NO 27
3.1. Nitroprusiato sódico 28
3.2. Diazeniodiolatos (NONOatos) 29
3.3. Nitrosotioles 30
3.4. Nitratos orgánicos 32

4. SISTEMAS EFECTORES DEL GMPc

4.1. Proteína quinasa dependiente de GMPc 32
4.1.a. Acción sobre el sistema cardiovascular 34
4.1.b. Inhibición de la agregación plaquetaria 35
4.1.c. La PKG en el sistema nervioso 35
4.2 Activación cruzada de PKA/PKG 36
IV

4.3. Proteínas de unión a GTP 37

5. EL GMPc Y LA SEÑALIZACIÓN CELULAR 37

5.1. Fosfodiesterasas reguladas por GMPc 38
5.2. Canales iónicos activados por nucleótidos cíclicos 39

6. APOPTOSIS 41
6.1 Caspasas 43
6.2. Inducción de apoptosis 44
6.2.a. El NO como inductor de apoptosis 45
6.2.b. El NO como supresor de la apoptosis 45
6.2.c. Implicación de la vía del GMPc 46

7. MODELOS CELULARES
46
7.1. Modelos celulares de médula adrenal 46
7.1.a. Rutas de 2os mensajeros 50
7.2. Células endoteliales 51

II. MATERIALES Y MÉTODOS

1. MATERIALES
Productos 53
Instrumental general 55
2. MÉTODOS
Obtención de células adrenomedulares 57
Purificación de células cromafines y endoteliales 59
1. Gradientes discontinuos de urografina 59
Estimación del número de células 60
Mantenimiento en cultivo 61
2. Gradiente continuo de Percoll 64
Pasaje de células endoteliales 64
Determinación de óxido nítrico 65
Preparación de los donadores de NO 65
1. Medida de óxido nítrico con oxihemoglobina 65
2. Determinación de nitritos 68
Determinación de la viabilidad celular 68
Ensayo fluorimétrico de cuantificación del ADN total 69
Extracción del ADN presente en el citosol 70
Ensayo fluorimétrico de cuantificación del ADN citosólico 71
Electroforesis en geles de agarosa 72
Medida de la actividad de caspasas 72
Estudios inmunocitoquímicos 73
Determinación de los niveles intracelulares de GMPc 74
Detección de la GCs mediante inmunotransferencia 76
Inmunoprecipitación de guanilato ciclasa soluble 77
Determinación del estado de fosforilación dela GCs 78
Determinación de catecolaminas en células endoteliales 79
Experimentos de PCR simple y cuantitativa 81
Extracción de ARN 81
 V

Cuantificación de ARN 82
RT-PCR simple 82
RT y PCR- cuantitativa: método de SYBR-green 83
Análisis de datos 84

III. OBJETIVOS 87

IV. RESULTADOS y DISCUSIÓN 89

1. CÉLULAS CROMAFINES BOVINAS 89

2. MOLÉCULAS DONADORAS DE ÓXIDO NÍTRICO 92
2.1. Liberación de NO partir de distintos donadores de NO 92
2.1.a. Determinaciones en ausencia de células 93
2.1.a.1. Determinación de la estequiometría
de los donadores de NO 93
2.1.a.2. Liberación de NO al medio de
incubación a lo largo del tiempo 94
2.1.a.3. Velocidades de liberación de NO 95
2.1.b. Determinación en presencia de células 96
2.1.b.1. Liberación de NO a partir de
donadores en función del tiempo 96
2.1.b.1. Efecto de los donadores de NO
sobre los niveles de GMPc en función del tiempo 96
2.2.Producción de GMPc en respuesta a distintas
dosis de donadores de NO 98

3. ESTIMULACIÓN DE LA GCs POR YC-1 102

4. MODULACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA GCs 105

4.1 Desensibilización de la GCs 105
4.1.a. Implicación de las proteínas fosfatasas
en la inhibición de GCs 108
4.1.b. Cambios en el nivel de fosforilación de la subunidad β
de la GCs en respuesta a distintos tratamientos 111
4.1.c. Efecto de la inhibición de PKG sobre los niveles de
GMPc inducidos por SNP 115
4.1.c.1. Relación de la inhibición de PKG y Ser/Thr
proteínas fosfatasas 117
4.2. Efecto de la toxina pertúsica sobre la acumulación de GMPc 119

5. EFECTO DEL TRATAMIENTO CON AGENTES ESTIMULADORES

DE LA RUTA DURANTE PERIODOS PROLONGADOS 121
5.1. Estudio de la modulación de la actividad de la GCs tras
tratamientos prolongados con NO ó YC-1 122
5.1.a. Importancia del estado reductor de la célula para
la inducción de tolerancia a NO 125
5.2. Expresión de la enzima GCs 127
5.2.a. Vida media de la enzima GCs 128
5.2.b. Mecanismo de regulación de la expresión 130
VI

5.2.c. ARNm de la GCs 132

6. EFECTO DE LA EXPOSICIÓN PROLONGADA A YC-1 134

6.1. Efecto sobre la estructura celular y la capacidad
de adhesión celular 134
6.2. Estudio del citoesqueleto celular 139
6.3. Estudio de la densidad celular de los cultivos 143
6.4. Estudio de la funcionalidad de células cromafines 145
6.5. Estudio de la viabilidad celular 146
6.6. Estudio de la integridad del ADN celular 151
6.7. Estudio de la actividad de caspasas 153

V DISCUSIÓN GENERAL 155

VI. CONCLUSIONES 175

VII. BIBLIOGRAFÍA 177

 Introduccón 1

“A pesar de la amplia distribución de la GCs en la mayoría de las células

animales, su papel y su significado fisiológico ha sido muy pobremente definido
hasta hace relativamente poco tiempo” Adrian Hobbs, 1997.

La actividad guanilato ciclasa, enzima que cataliza la conversión de GTP en GMPc

(GTP-pirofosfato-liasa-ciclasa, EC. 4.6.1.2.), se descubrió por primera vez en el 1969
(Hardman & Sutherland, 1969; Ishikawa et al., 1969; White & Aurbach, 1969).
Desde los primeros momentos, fue evidente que se trataba de una proteína diferente
de la adenilato ciclasa, responsable de la síntesis del AMPc. Mientras que la
adenilato ciclasa (ACs) se encontró solamente en la fracción particulada de
homogenados obtenidos a partir de diferentes tejidos, la actividad de la guanilato
ciclasa se detectó tanto en la fracción soluble como en la particulada, con una
distribución variable dependiendo del tejido (Garbers & Gray, 1974; Kimura &
Murad, 1974; Chrisman et al., 1975).

Aunque descubrimientos recientes sugieren que las dos familias de guanilato

ciclasas, soluble y particulada, comparten características estructurales comunes y
presentan homología en sus secuencias de aminoácidos, difieren en sus mecanismos
de activación y regulación.

A mediados de los años 70, se descubrió que el radical libre NO era un potente
activador de la GCs (GCs), sugiriendo que varios compuestos que contenían
nitrógeno y oxígeno inducían la formación de GMPc mediante un mecanismo que
implicaba la liberación de NO. En esos momentos, se pensaba que la biosíntesis de
NO estaba restringida a las bacterias nitrificantes y desnitrificantes, y el significado
de esa observación en relación con células animales no fue apreciado durante mucho
tiempo. Sin embargo, el descubrimiento del factor relajante del endotelio (EDRF) y
su identificación como NO, no solo puso de manifiesto que las células animales eran
capaces de sintetizar NO, sino que sirvió para identificar a un activador endógeno de
la GCs. En ese momento nació la ruta de señalización NO-GCs-GMPc.

De la misma manera, el mecanismo de activación de la guanilato ciclasa particulada

no se estableció hasta el descubrimiento, en 1978, de la acción de pequeños péptidos
obtenidos a partir de Escherichia Coli (Field et al., 1978). Otros péptidos, aislados a
partir de esperma de equinodermo y de tejido cardiaco de mamífero, fueron capaces
de estimular la guanilato ciclasa particulada tanto en células intactas como en
preparaciones más o menos elaboradas que contenían la fracción de membrana
(Suzuki et al., 1981).
2 Introducción

1.1. Guanilato Ciclasa Soluble

La forma soluble de las enzimas guanilato ciclasas (GCs) está expresada en el

citoplasma de prácticamente todas las células de los mamíferos y participa en un gran
número de procesos fisiológicos, tales como la inhibición de la agregación
plaquetaria, vasodilatación, transmisión de señales neuronales e inmunomodulación
(Collier & Vallance, 1989). La mayoría de las funciones del NO y otros
vasodilatadores están mediadas por la estimulación de las GCs (Palmer et al., 1987;
Chinkers et al., 1989; Becker et al., 1999). Esta enzima es una proteína
heterodimérica compuesta por una subunidad α y una β, siendo necesaria la
expresión de ambas subunidades para la actividad catalítica (Harteneck et al., 1990;
Buechler et al., 1991). Cada subunidad posee un dominio regulador de unión al
grupo postético hemo en el extremo N-terminal, uno catalítico en el extremo C-
terminal que comparte homología de secuencia con los de la forma particulada y
adenilato ciclasa, y un dominio central de dimerización (Schulz et al., 1991; Foster et
al., 1999). La activación de GCs por NO se produce por una interacción de éste con
el grupo hemo. Estudios realizados con GCs purificada han mostrado que se
requieren concentraciones del orden de 0,5 µM de NO para producir la máxima
activación de esta enzima, siendo el valor calculado de EC50 de 0,2 µM (Stone &
Marletta, 1996).

1.1.a. Dominios estructurales

Cada subunidad de GCs puede ser dividida en tres dominios funcionales: de unión al
grupo hemo, de dimerización y catalítico (figura 1).

Extremo amino-terminal

Dominio de unión al grupo hemo

Dominio de dimerización

Dominio catalítico

Extremo carboxi-terminal

Esquema I.1.Tomado de Lucas et al., 2000.

 Introduccón 3

1.1.a.1. Dominio de unión al grupo hemo

El segmento N-terminal de la GCs constituye el dominio de unión del grupo hemo, el
cual confiere a la enzima la sensibilidad al NO (Ignarro et al., 1982; Ohlstein et al.,
1982), siendo la región menos conservada entre las diferentes subunidades (Hobbs,
1997). La oxidación del hierro hemínico al estado férrico conlleva una pérdida de la
actividad enzimática y, a menudo, una pérdida completa del grupo hemo de la
proteína.
Aproximaciones moleculares, como la mutagénesis dirigida, han ayudado a la
identificación de los residuos implicados en la unión del grupo hemo a la GCs. La
delección de 131 residuos de la región N-terminal de la subunidad α y la delección
de 62 aminoácidos de la región N-terminal de la subunidad β dió lugar a una enzima
insensible a NO (Wedel et al., 1994; Fan et al., 1998). Diferentes estudios sugerían
que el grupo hemo se unía a la enzima mediante un enlace de coordinación entre el
Fe2+ y un nitrógeno imidazólico de la histidina que ocupa la posición 105 en la
subunidad β (Wedel et al., 1994). La mutación de este residuo resulta en la
formación de una GCs carente del grupo hemo (Foerster et al., 1996; Zhao &
Marletta, 1997). Además de esta Histidina (105) en la subunidad β1, la mutación de
dos residuos de cisteína altamente conservados en la subunidad β1 (78 y 124), dio
lugar a una enzima con menor afinidad por el grupo hemo e insensible al NO (Friebe
et al., 1997). Sin embargo, la mutación de las cisteínas equivalentes en la subunidad
α1 no afectó a la sensibilidad al NO ni a la afinidad por el grupo hemo, sugiriendo
que el grupo hemo se une fundamentalmente a la región N-terminal de la subunidad
β (Friebe et al., 1997; Zhao & Marletta, 1997). La unión del grupo hemo a otras
proteínas, como el citocromo C, se produce a través de enlaces tioéster a dos residuos
de Cys. Estos datos apoyarían el que las Cys de la subunidad β son fundamentales
para la unión del grupo hemo a la guanilato ciclasa.
En la GCs cada heterodímero contiene un grupo hemo con gran afinidad por el NO
(Gerzer et al., 1981). Este hecho contrasta con el hemo en otras proteínas, como en la
hemoglobina y la mioglobina, que tiene mucha mayor afinidad por el oxígeno
formando especies Fe2+-oxígeno en vez de Fe2+-nitrosil. Para que el NO se una al
grupo hemo y active a la GCs, el hierro debe estar en estado ferroso (Fe2+). Existen
en la actualidad dos hipótesis del mecanismo de activación de la GCs por NO. Una
de ellas postula que el NO se uniría a la sexta posición de coordinación del Fe2+; la
formación de este sexto enlace provocaría la ruptura del enlace entre el Fe2+ y el
nitrógeno de la histidina. Este fenómeno conduciría a que el Fe2+ estuviera de nuevo
pentacoordinado siendo el NO quien ocuparía la quinta posición. La formación del
complejo Fe2+-nitrosil induciría un cambio conformacional en la enzima, dando lugar
a un incremento en su Vmax de 400 veces (Humbert el al., 1990; Stone & Marletta,
1996). La segunda hipótesis sugiere que el NO se uniría al grupo hemo por el lado
proximal, rompiendo el enlace del Fe2+-histidina, y ocupando el NO la quinta
posición de coordinación (Lawson et al., 2000). De la misma forma, el cambio
4 Introducción

conformacional inducido en la enzima sería responsable del incremento de su

actividad.

La importancia del estado del átomo de hierro plantea la posibilidad de modificar la

actividad de la GCs mediante variaciones en el estado reductor de la célula, y explica
porqué agentes como tioles y ascorbato incrementan la activación de la enzima,
presumiblemente manteniendo el hierro de la metaloporfirina en forma ferrosa
sensible a NO (Lucas et al., 2000).

Esquema I.2. Mecanismo de activación de la GCs. Tanto el NO

como el CO interaccionan con el grupo hemo de la enzima,
originando un cambio en su conformación que conduce a la
activación de la misma. Sin embargo, el mecanismo de activación de
la enzima por PPIX no se conoce con exactitud (tomado de Lucas et
al., 2000).

La presencia del grupo hemo no es necesaria para mantener la integridad estructural

de la enzima, pudiendo existir un equilibrio entre las formas de la enzima GCs con el
grupo hemo incorporado a su estructura o sin éste. Esta incorporación reversible
 Introduccón 5

constituye un mecanismo potencial de regulación de la sensibilidad de la enzima a

NO (Foerster et al., 1996).

El CO es capaz de unirse al grupo hemo de la enzima, produciendo una activación de

la misma. Aunque la afinidad del CO por el grupo hemo parece ser muy alta, el
efecto sobre la actividad catalítica de la GCs no es muy significativo, dado que no es
capaz de provocar la ruptura del enlace con la histidina (Deinum et al., 1996). Por
tanto, la unión de CO conlleva la formación de un complejo hexa-coordinado, donde
el CO ocuparía la 6º posición. Recientemente, se ha sugerido un papel modulador del
CO sobre la vía de señalización GCs/GMPc, ya que se ha observado que el CO
incrementa de forma significativa los incrementos del GMPc inducidos en respuesta
a NO. Este hecho podría explicarse por la unión de ambos ligandos gaseosos a lados
opuestos del grupo hemo, formando aductos estables (Reynolds et al., 2000).

1.1.a.2. Dominios catalíticos y de dimerización

Los dominios catalíticos presentes en los extremos C-terminales de las subunidades
α y β, comparten una amplia homología con los dominios catalíticos C1 y C2 de la
adenilato ciclasa y aquellos de las formas particuladas de GC (Thorpe & Garbers,
1989; Chinkers et al., 1989). Aunque cada subunidad, α y β, contiene su propio
dominio catalítico, la actividad ciclasa requiere la expresión de ambas subunidades.
Cada subunidad contribuye con residuos específicos para dar lugar a un único sitio
de unión del sustrato y a un único sitio catalítico. (Liu et al., 1997a).
La dimerización está mediada por una región específica que es homóloga a la
encontrada en las formas particuladas, y se localiza próxima al dominio catalítico de
las subunidades α y β.

La formación del GMPc a partir de GTP se produce como se ve en la figura 3.

La subunidad α también juega un papel importante en la modulación de la actividad

GCs. Se ha observado que dos mutaciones puntuales en el dominio catalítico de la
subunidad α1 (D513A y D529A) causan una pérdida completa tanto de la actividad
basal de la GCs como de la estimulada por SNP, aunque esta subunidad mutada
seguía formando heterodímeros con la subunidad β (Yuen et al., 1994). Estos
resultados demostraron que dos mutaciones puntuales originan unas proteínas
dominantes negativas que podrían bloquear la vía del NO/GMPc de forma eficaz y
específica.

Dado que los sitios activos para GC y AC están íntimamente relacionados, estudios
mutacionales utilizando enzimas quiméricas han sugerido posibles sitios de
especificidad con respecto a sus substratos, el ATP y GTP (Liu et al., 1997a;b). Un
estudio ha revelado como la especificidad de la GC por el GTP está determinada por
tres residuos en las posiciones αR592, βE472 y βC541 (Sunahara et al., 1998).
 6 Introducción

Las observaciones descritas definen propiedades catalíticas y reguladoras de la GCs

que pueden ser atribuidas a distintos dominios de cada subunidad, sugiriendo que
puedan existir diferentes mecanismos moleculares de regulación de la GCs
(Weitmann et al., 1999).

Cys
Arg
SH
O
NH H N O
N 2
HN O
H2N N O
N O HN
H2N N OH GLU N
N OH HN
H2N N
O
H2N N N OH
O
OH
O
O O
P ASN H2N O
O O
O
O O ASP O
H2N P O O
P O O P
O H2N O O
O O ARG P O O
P O O ASP
O O O GMPc + PPi
O P
O
Me2+
O
O O
O
GTP
GLU

Estado de transición enzima-sustrato

Esquema I.3. Mecanismo catalítico de la actividad guanilato

ciclasa. El GTP se une a un sitio catalítico en guanilato ciclasa soluble
y a dos en las formas particuladas. Los anillos catalíticos se unen de
forma específica a residuos de la subunidad β (rojo) y los fosfatos se
unen a los residuos acídicos de la subunidad α (verde). Ambas
subunidades contribuyen al sitio catalítico con residuos aminoacídicos.

1.1.b. Isoformas

El análisis de GCs a partir de diversos tejidos de mamíferos demostró la existencia

de distintas isoformas con diferente composición en cuanto a sus subunidades, de las
cuales se han descrito cuatro tipos, (α1, α2, β1, β2), cada una de ellas codificada por
un gen diferente (Koesling et al., 1991a;b; Koesling & Friebe, 1999). Aunque
aparecieron pruebas de unos subtipos α3 y β3 en humanos, cuando se han clonado y
 Introduccón 7

comparado las secuencias estas subunidades, se corresponden con las subunidades α1

y β1 descritas en otros organismos (Zabel et al., 1998).
Las subunidades más abundantes y más extendidas en cuanto a su distribución en los
distintos tejidos son α1 y β1 (Garbers et al., 1979). Estas subunidades se clonaron por
primera vez a finales de los años 80 a partir de pulmón de rata y bovino por dos
grupos diferentes (Koesling et a. 1988; 1990; Nakane et al., 1988; 1990). La
expresión de cada una de las subunidades de forma individual da lugar a una proteína
que carece de actividad catalítica, mientras que la coexpresión de ambas origina la
GCs, susceptible de ser activada por NO (Buechler et al., 1991). Los pesos
moleculares de estas dos subunidades son de 82 kDa para la α1 y 70 kDa la β1
(Kamisaki et al., 1986a), aunque distintos estudios han encontrado pesos moleculares
menores para la subunidad α (Humbert et al., 1990), pudiendo este hecho explicarse
por la aparición de una degradación proteolítica de la enzima durante el periodo de
purificación. La caracterización de la subunidad de 70 kDa reveló una estructura
primaria de su ADN constituida por 3063 nucleótidos (Nakane et al., 1988).
La subunidad β2, clonada a partir de hígado de rata, tiene un peso molecular de 76
kDa y presenta 86 aminoácidos adicionales en su región C-terminal comparada con
la β1, conteniendo la secuencia consenso (-C-V-V-L-) (Yuen et al., 1990). El motivo
CAAX, donde A representa un aminoácido alifático y X es cualquier aminoácido, es
necesario para las modificaciones postraslacionales de isoprenilación o
carboximetilación y anclaje a la membrana, secuencia frecuente en la familia de las
proteínas ras y subunidades γ de proteínas G. Hasta la fecha, no existen evidencias
de que las subunidades β2 se puedan asociar a la membrana mediante estas
modificaciones.
Aunque la subunidad β2 puede formar heterodímeros con la α1, esta holoenzima
presenta menor actividad específica que el homodímero α1/β1. La coexpresión de β2
con α1, β1 origina una disminución en la formación de los heterodímeros α1/β1,
probablemente debido a la competición de β1 y β2 por la unión con α1. Este hecho
podría representar un mecanismo de regulación de la actividad de la enzima GCs
α1/β1. De hecho, este mecanismo se ha implicado en la aparición de hipertensión en
ratas (Gupta et al., 1997a). La menor sensibilidad de la forma β2 por el NO resulta de
la falta de un residuo de histidina entre los aminoácidos 86 y 129 de la β2, indicando
que la compleja interacción hemo-ligando entre las subunidades es diferente en las
formas de GCs que contienen la subunidad β2 (Gupta et al., 1997a;b).
Se ha clonado una isoforma α2 de 82 kDa que heterodimeriza con β1 y β2,
formándose heterodímeros del tipo α2/β1 que no presentan diferencias funcionales
respecto a α1/β1 (Russwurm et al., 1998). Esta nueva forma α2/β1 es también sensible
al inhibidor selectivo ODQ y al activador independiente de NO, YC-1 (ver en
capítulos posteriores). Por lo tanto, a pesar de las diferencias en cuanto a su
estructura primaria, las subunidades α1 y α2 son iguales en cuanto a su actividad.
Existe una variante de la subunidad α2 (α2i) que contiene 31 aminoácidos adicionales
y ha sido identificada en hígado, colon y endotelio humano (Behrends et al., 1995).
8 Introducción

Cuando esta nueva forma, así como la subunidad α2, se coexpresaron con la
subunidad β1 en células COS-7 y Sf9, la proteína α2/β1 fue sensible al NO, mientras
que la α2i/β1 no presentó actividad GCs. Dado que esta nueva subunidad es capaz de
dimerizar con la β1 y que, de hecho, la α2i compite con la α2 en la formación de
dimeros, la expresión de α2i puede ser un mecanismo potencial de regulación de la
actividad GC sensible a NO. Una célula podría modular el grado de respuesta a NO
mediante la expresión de distintas cantidades de subunidades alternativas de la
subunidad α.
Aunque hasta el momento no se habían descrito variantes de la subunidad α1,
recientemente Ritter et al. (2000) han encontrado en algunos tejidos la existencia de
tres tipos de ARNm, el mayor de los cuales contiene la secuencia completa para la
expresión de la subunidad α1. Las otras dos especies de ARNm han perdido parte de
la secuencia por corte y empalme. Las células que expresan estas especies
alternativas presentan una menor actividad enzimática GCs, proponiendo la idea de
que la expresión de variantes de α1 sea otro mecanismo responsable de una
señalización NO-GCs alterada.
En cuanto a las subunidades β, se han encontrado variantes alternativas de las
subunidades β1 (Chhajlani et al., 1991) y β2 (Behrends et al., 2000). En el primer
caso, la nueva subunidad presenta 33 aminoácidos menos que la forma original. En
cuanto a la variante de la subunidad β2, a esta isoforma le faltan 2 exones homólogos
al dominio N-terminal de unión al grupo hemo, sugiriendo que pueda ser insensible a
NO. Aunque se desconocen tanto la significación funcional y la distribución de estas
nuevas variantes de las isoformas β, estos descubrimientos revelan la heterogeneidad
de las subunidades de GCs y la posible diversidad de su regulación.
En cuanto a la ruta GCs-GMPc en invertebrados, recientemente se han detectado dos
isoformas de GCs: una β3 a partir de Manduca sexta, muy relacionada con β1 pero
que no precisa heterodimerización para presentar actividad catalítica (Nighorn et al.,
1999), y otra similar a las formas particuladas pero carente del dominio de unión a
ligando y que tampoco es activada por NO, sugiriendo la existencia de una nueva
forma de activación para esta isoforma de GC (Simpson et al., 1999).

1.1.c. Organización genómica de GCs

En los últimos tiempos, se han llevado a cabo estudios sobre en la localización y
organización de los genes que codifican para las subunidades de la GCs en humanos
que codifican para las isoformas α1 y β1 (Giuili et al., 1993). Estudios de hibridación
in situ han colocalizado ambos genes en el cromosoma cuarto, más exactamente en
4q32, indicando un papel interesante de la regulación y expresión coordinada de
ambas subunidades de GCs. Trabajos posteriores han localizado el gen que codifica
para α2 en el cromosoma 11 (Yu et al., 1996), mientras que el de la β2 se encuentra
en el cromosoma 13 (Behrends et al., 1999). Por lo tanto, el conocimiento de la
localización de las diferentes subunidades de la GCs en los cromosomas 4, 11 y 13,
 Introduccón 9

hará posible determinar si existen causas genéticas en enfermedades humanas

relacionadas con la vía NO/GMPc. De hecho, se ha demostrado como la hipertensión
en cierto tipo de ratas está asociada a una mayor expresión de la subunidad β2 en
células renales y menor expresión de la β1 respecto a animales sanos (Gupta et al.,
1997a;b; Deng & Rapp, 1995). Así, la actividad renal disminuida que aparece en
animales enfermos puede resultar de una mayor presencia del heterodímero α1/β2
respecto al α1/β1 más activo.
En otros animales no mamíferos, como el pez medaka, se ha descrito una
organización en tandem de los genes codificantes para las subunidades α1 y β1
(Mikami et al., 1999). De hecho, se ha encontrado como la región anterior al extremo
5´ de la subunidad α1 puede afectar a la expresión de la subunidad β1 de forma
coordinada. Estas observaciones proporcionan información adicional sobre la
existencia de un mecanismo de transcripción temporal y espacialmente coordinada
de ambas subunidades de la GCs durante la embriogénesis.

1.1.d. Regulación de la expresión de las subunidades α y β de GCs

En condiciones normales, el NO tiene diversos papeles fisiológicos y bioquímicos
importantes en los sistemas cardiovascular y pulmonar. Sustancias como la
acetilcolina, originan relajación de los vasos mediante la liberación de NO a partir
del endotelio, que incrementa la producción de GMPc en las células de músculo liso,
culminando en la fosforilación de diversas proteínas y en la vasodilatación (Moncada
et al., 1991a). En ciertas condiciones, se ha demostrado que cambios en los niveles
de GCs o en su actividad pueden jugar un importante papel en desórdenes
patofisiológicos (Linder et al., 1990; Crawley et al., 1992). Estudios recientes de
Ruetten et al. (1999) han demostrado como una regulación negativa de los
componentes de la ruta GCs/PKG I pueden representar uno de los eventos tempranos
en la patogénesis de la hipertensión. Otros autores han encontrado que niveles altos
de GMPc van acompañados de una mayor expresión de GCs (Papapetropoulos et al.,
1994).
Los cambios en los niveles y actividad de la GCs no se limitan a estados patológicos
sino que también demuestran una expresión regulada según las etapas del desarrollo.
Un ejemplo aparece en la disminución de ARNm para α1 en hígado de ratón o de
ambas subunidades α1 y β1 en pulmones de rata tras el nacimiento (Iida et al., 2000;
Bloch et al., 1997).
El grupo de Kloss et al. ha publicado recientemente (2000) como la potencia
vasodilatadora de SNP disminuye significativamente con la edad, observando
además que el nivel de expresión de la subunidad β1 en animales sanos de edad
avanzada era menor que en animales jóvenes. Otros autores han encontrado que la
subunidad β1 desaparece completamente en animales viejos, mientras que la
subunidad α1 aún está presente (Chen et al., 2000), sugiriendo que en ciertas
condiciones las subunidades α y β pueden estar reguladas de manera independiente.
10 Introducción

1.1.e. Regulación de la activación de GCs

Tanto las formas particuladas como la GCs precisan de cationes divalentes como
cofactores y moduladores alostéricos para expresar la actividad catalítica máxima. El
Mn2+ y el Mg2+ son dos cofactores positivos para estas enzimas cuya actividad
catalítica se basa en la ciclación de nucleótidos. El Mn2+ y el Mg2+ forman un
complejo con el GTP para unirlo al dominio catalítico y que tenga lugar la ciclación
enzimática (Waldman & Murad 1987). La disponibilidad de estos cationes puede
modular la actividad de la enzima, incrementando tanto su activación como su
afinidad por el sustrato (Wolin et al., 1982).
La inhibición de la GCs por Ca2+ está asociada con un incremento de la afinidad de
la enzima por su sustrato, ya que la presencia de Ca2+ disminuye tanto la Km como la
Vmax de la GCs. La inhibición es también dependiente de la concentración de GTP,
cuanto mayor es la concentración de Mg2+-GTP se observa una mayor inhibición de
la GCs por Ca2+ (Parkinson et al., 1999; Margulis et al., 2000).

Algunos estudios recientes revelan que las subunidades de la GCs son capaces de
homodimerizar formando enzimas inactivas, aunque en condiciones normales, el
heterodímero se forma de manera preferencial (Zabel et al., 1999). Existe la
posibilidad de un equilibrio entre los complejos formados por las subunidades α y β
de la GCs y la regulación de la misma, reflejado en los cambios de la capacidad de
hetero y homodimerización.

Es particularmente importante conocer cuál es la secuencia de hechos que suceden

tras la activación de la GCs para entender la capacidad de respuesta que se puede
esperar a posteriores estímulos que alcancen el interior de la célula. En primer lugar,
la disociación del NO una vez que se ha unido a la GCs y ha inducido su activación,
se ha calculado en unos 5 segundos a 37ºC. Esta tasa de disociación es acelerada en
presencia de iones Mg2+ y GTP (Kharitonov et al., 1997). Por otro lado,
recientemente se ha descrito que sus productos de reacción GMPc y PPi, también
inhiben a la enzima mediante una cinética de primer orden (Lee et al., 2000).
Resultados similares se han obtenido para la adenilato ciclasa (Dessauer et al., 1997).

También merece la pena mencionar la identificación de un inhibidor endógeno de la

GCs de naturaleza proteica, cuya capacidad de interaccionar con la enzima es
independiente de su estado de activación y cuyo sitio de interacción con la enzima se
encuentra alejado del sitio hemo (Kim et al., 1994).
Otros mecanismos de regulación de la GCs descritos son ADP-ribosilación y
fosforilación. El tratamiento de la GCs purificada de pulmón bovino con toxina
pertúsica indujo la ADP-ribosilación de la subunidad β. Esta modificación conlleva
un incremento de la actividad estimulada por NO (Tomita et al., 1997). Por otra
parte, Zwiller et al. demostraron que la GCs purificada se fosoforilaba “in vitro”
tanto por la PKC como por la PKA, y en ambos casos la fosforilación conllevaba un
incremento de la actividad (Zwiller et al., 1981; 1985). Estos mismos autores
 Introduccón 11

demostraron que la activación de PKC en células PC12 incrementaba la producción

de GMPc (Louis et al., 1993).
Aunque los agentes descritos puedan ejercer un efecto modulador sobre la actividad
de la enzima GCs, es importante describir la desensibilización de la enzima. Diversos
estudios han descrito que la estimulación de la vía con donadores de NO da lugar a
una desensibilización de la GCs a posteriores estímulos inducidos por el mismo
(Tsuchida et al.,1995) u otro compuesto nitrosodonador (Davis et al., 1997). Este
fenómeno aparece escasos segundos después de poner en contacto al sistema celular
con una fuente de NO y la recuperación se produce lentamente, llevando varios
minutos (Bellamy et al., 2000). La rápida inducción de este fenómeno y la lenta
recuperación son características clásicas asociadas con los receptores de
neurotransmisores (Jones et al., 1996). Este fenómeno se diferencia fácilmente de la
retroinhibición de GCs aparecida tras exposiciones crónicas a compuestos
liberadores de NO.
Tolerancia
La utilización de nitrovasodilatadores tanto en clínica como a nivel experimental,
resulta en la aparición de un fenómeno conocido como tolerancia. Aunque la
tolerancia a compuestos que generan NO ha sido ampliamente estudiada, el
mecanismo que media este fenómeno no está aún bien definido. Diferentes trabajos
relacionan la aparición de la tolerancia con una pérdida de actividad de la GCs.
Existen estudios que describen el concepto de tolerancia cruzada entre NO endógeno
y donadores exógenos de NO (Papapetropoulos et al., 1998) . En el mismo sentido se
pronuncian otros autores que han descrito como animales que no expresan la
isoforma endotelial de NOS, responden de forma mucho más potente a un estímulo
con NO. Mientras que los demás elementos de la vía, como PKG o enzimas
fosfodiesterasas, no presentan ningún cambio en su actividad funcional, la actividad
de la GCs se encuentra incrementada, fenómeno que podría ser considerado como lo
opuesto a la tolerancia (Brandes et al., 2000).
Generalmente, se acepta que la tolerancia no afecta a los pasos por debajo de la
activación de GCs, ya que la respuesta a péptidos natriuréticos y a análogos de
GMPc permeables no se ven afectadas (Marzin et al., 1993). Sin embargo, algunos
trabajos apuntan a que la exposición prolongada a NO o análogos de GMPc
conducen a una disminución de la expresión de la PKG I (Soff et al., 1997). Otros
autores han descrito que el GMPc media un proceso de disminución de la expresión
de NOS endotelial desencadenado por NO en tratamientos prolongados con el
compuesto (Munzel et al., 2000).
En cuanto a la expresión de la encima GCs, cuya modulación redundaría en una
regulación de la ruta NO/GMPc, se ha observado que el tratamiento con agentes
donadores de NO provoca una disminución en la acumulación de GMPc en respuesta
a estos mismos compuestos, sin producirse alteraciones en la EC50 para los mismos
(Ujiie et al., 1994). Estos efectos parecen estar mediados por una disminución en los
12 Introducción

niveles de ARNm de las subunidades α1 y β1, implicando al NO en la regulación

negativa de los niveles de la GCs (Ujiie et al., 1994; Filippov et al., 1997). Es
interesante destacar que agentes inhibidores de la síntesis de proteínas
(cicloheximida) o de la síntesis de ácidos ribonucleicos (actinomicina D), bloquean
la regulación negativa del NO sobre los niveles de GCs, sugiriendo que se produce
por un mecanismo mediado por transcripción y traslación (Filippov et al., 1997).
Algunos autores han descrito la posibilidad de la influencia del estado de
fosforilación de la proteína GCs para la disminución de sus niveles (Liu et al.,
1997a;b).

Debido a las similitudes existentes entre el GMPc y el AMPc, se plantea la

posibilidad de que exista una regulación cruzada entre las dos vías de señalización.
Se ha descrito que tratamientos que elevan los niveles de AMPc intracelular
conducen a una menor cantidad de GCs funcional. Esta disminución podría deberse a
una disminución de los niveles de ARNm que codifica para la enzima, a una menor
síntesis de la enzima (Papapetropoulos et al., 1995), o bien a una mayor velocidad de
degradación de la subunidad β1 de la enzima (Shimouchi et al., 1993). Diversos
autores han descrito que tratamientos de 18 horas con SNP originaban una
disminución de la expresión de la enzima (Ujiie et al., 1994), efecto que se ha
relacionado con la activación de PKA (Papapetropoulos et al., 1996a;b) dado que la
regulación negativa de la acumulación de GMPc por SNP era inhibida por un
compuesto inhibidor de PKA, el H-89. Acompañando estos cambios, los niveles de
proteína α1 disminuyeron cuando las células se pretrataron con zaprinast, apoyando
la idea de que el GMPc puede modular los niveles de GCs por una vía que implicaría
la activación de PKA (Papapetropuolos et al., 1996a;b).

Otros estudios han revelado que la expresión de la subunidad β1 de la enzima

desaparece en animales de edad avanzada, previniendo la capacidad de elevar los
niveles de GMPc, y señalando la disminución de una de las subunidades como
posible mecanismo de regulación de la ruta (Chen et al. 2000).

Resultados recientemente publicados sobre las posibles causas de la inhibición de la

GCs, señalan la importancia del estado reductor de la célula para prevenir el efecto
de compuestos presentes en el medio fisiológico y que podrían modificar la
activación de la enzima (Dierks & Burstyn, 1998). Así, se ha demostrado que
concentraciones fisiológicas de ácido L-ascórbico disminuyen la acumulación de
GMPc en respuesta a la estimulación con NO, vía inhibición directa de la GCs o
atrapando el NO antes de alcanzar a la enzima. Estos efectos son prevenidos por las
altas concentraciones de GSH existentes en el medio celular en condiciones normales
(Schrammel et al., 2000). Se conoce que la actividad de GCs está modulada por el
estado redox, dado que tanto los agentes reductores como oxidantes son capaces de
incrementar o suprimir la actividad de la enzima dependiendo de su concentración
(Waldman & Murad, 1987;Wu et al., 1992). Los mecanismos por los cuales los
agentes reductores previenen la tolerancia originada por el tratamiento con SNP
 Introduccón 13

puede estar relacionada con el mantenimiento del hierro del grupo hemo en estado
reducido, facilitando por tanto la reacción entre el NO y el hemo, o bien previniendo
la oxidación de grupos tioles críticos. Aunque los mecanismos por los cuales los
tioles están implicados en la actividad GCs aún no están bien definidos, se ha
demostrado que la activación de la enzima por NO conduce a la formación de
puentes disulfuros que inactivan reversiblemente a la enzima (Brandwein et al.,
1981; Kamisaki et al., 1986b). Algunos estudios han puesto de manifiesto que la
exposición de las células a agentes depletores de tioles solubles, conducen a una
disminución en la actividad GCs. La oxidación masiva de la enzima conduce
igualmente a una pérdida de su actividad enzimática. Algunos autores proponen que
la aparición de aniones superóxido podría ser, en parte, causante de la tolerancia a
nitroglicerina (Münzel et al., 1995).

1.2. HERRAMIENTAS FARMACOLÓGICAS PARA EL ESTUDIO DE LA

GCs

1.2.a. Los donadores de NO

Estos agentes se caracterizan porque su descomposición libera al medio al menos una

molécula de NO, siendo el NO el activador por excelencia de la enzima GCs objeto
de este estudio. Dada la importancia de estos compuestos, su estudio se realiza en
otro capítulo.

1.2.b. El YC-1, un activador de la GCs independiente de NO

El 1-benzil-3-(5-hidroxi-metil-2-furil)indazol ó YC-1, se ha descrito como un

inhibidor de la agregación plaquetaria (Ko et al., 1994; Wu et al., 1995), y de la
proliferación de células de músculo liso (Yu et al., 1995).

HO Esquema I.4. Estructura química del

YC-1.
O
N N

Recientemente se ha demostrado que el YC-1 induce la activación de la GCs,

actuando bien directamente sobre la enzima produciendo su activación con una EC50
= 10-30 µM (Mülsch et al., 1997), bien sensibilizándola respecto a sus activadores
gaseosos, el NO y CO, y reduciendo la velocidad de disociación de estos del grupo
hemo (Friebe et al., 1999; Friebe & Koesling, 1998; Denninger & Marletta, 1999;
Kharitonov et al., 1999). El efecto activador del YC- 1 se ha demostrado tanto in vivo
(Mülsch et al., 1997; Friebe et al., 1998) como con la enzima purificada (Friebe et al.
14 Introducción

1996; Friebe & Koesling 1998), originando un efecto sobre la propia enzima
independiente de otros mecanismos celulares.

Diversos trabajos han concluido que el YC-1 disminuye la presión sanguínea y es

capaz de relajar vasos tolerantes a nitroglicerina (Ruetten et al., 1998), lo cual señala
a este compuesto como potente droga antihipertensiva, reforzado por el hecho de que
el YC-1 presenta una disociación lenta respecto de la GCs (Friebe & Koesling,
1998).

Toda la expectación surgida alrededor de este compuesto se basa precisamente en su

mecanismo de acción, independiente por una parte de NO, pero a su vez potenciador
del efecto de éste y sensible a O2- . La capacidad del O2- de inhibir la actividad de
GCs estimulada por YC-1 podría ser explicada por una interacción del O2- con el
grupo hemo de la enzima (Gerzer et al., 1981), aunque este hecho ha sido rebatido
por otros autores como se describe a continuación. El YC-1 no activa la GCs por
liberación de NO, lo cual se ha verificado mediante la medida de sus metabolitos,
nitritos y nitratos (Mülsch et al., 1997). Además, se ha descrito que este compuesto
altera la cinética de la reacción enzimática disminuyendo la Km de la enzima para el
GTP e incrementando su Vmax. El YC-1 además potencia la acción de los activadores
gaseosos. La activación de la enzima por YC-1 y NO conjuntamente produjo un
efecto superaditivo a concentraciones bajas. Por ejemplo, una concentración de 3 µM
YC-1, que ejerce pequeños efectos sobre la activación de la GCs y sobre la relajación
vascular, incrementó el efecto de la NTG y SNP en 10 veces, tanto en el efecto
vasodilatador inducido por estos compuestos, como en los niveles de GMPc
observados tras la estimulación de los mismos (Mülsch et al., 1997; Rothermund et
al., 2000). El hecho de que la estimulación de la GCs por YC-1 sea independiente de
NO puede justificar el efecto aditivo de las acciones de este compuesto respecto a sus
activadores gaseosos, NO y CO. El mecanismo propuesto para esta potenciación se
basa en una disminución de la velocidad de disociación entre el activador NO y la
enzima una vez que ha sido activada.

El CO, que en condiciones fisiológicas no es un buen activador de la enzima GCs, en

presencia de YC-1 produce incrementos muy significativos de la síntesis de GMPc.
La posibilidad de que el YC-1 modifique la estructura del dominio de unión al grupo
hemo en la enzima unida a CO daría lugar a un cambio conformacional, produciendo
un incremento de la actividad catalítica sin modificar los ligandos proximales de la
proteína (Denninger et al., 2000; Stone & Marletta, 1998; Sharma et al, 1999). La
importancia que podría tener el hecho de encontrar un compuesto capaz de modular
la respuesta de la GCs a NO ha provocado una intensa investigación sobre los
cambios conformacionales que pudieran ser responsables del efecto del YC-1.
Aunque en un principio se propuso que la activación de la GCs por parte del YC-1
era dependiente del grupo hemo (Friebe et al. 1996), estos mismos autores han
realizado estudios posteriores en los que se presentan argumentos en contra de una
interacción directa entre el YC-1 y el grupo hemo de la enzima. Basados en el
 Introduccón 15

estudio de su patrón de absorción y apoyados por el hecho de que el YC-1 se une a la

enzima independientemente de cual sea el estado de activación de ésta, e incluso a la
enzima carente de dicho grupo prostético, han propuesto que la interacción se
produce probablemente en un centro alostérico (Friebe & Koesling, 1998). Toda la
controversia respecto al mecanismo de acción del compuesto, nos da una idea del
desconocimiento que aún existe sobre los usos potenciales y los efectos asociados
que pudiera reportar su aplicación.

Se ha llegado a postular la posibilidad de que existiera una sustancia endógena,

similar al YC-1, que se encuentre de forma específica en ciertos tejidos o tipos
celulares. Dependiendo de la presencia de dicho modulador, el CO tendría mayores o
menores propiedades activadoras sobre la GCs. La existencia de este compuesto
explicaría la diferente capacidad activadora que presenta el CO in vivo e in vitro,
donde apenas se detecta su efecto (Friebe et al., 1996). Este hecho estaría apoyado
por el modelo que presenta el mismo autor, en el que se propone un sitio regulador
en la estructura de la GCs, evolucionado a partir de un domino de unión a GTP y
similar al sitio de unión para la forskolina en la ACs. El YC-1 podría unirse a este
sitio afectando a las propiedades catalíticas de la enzima, así como a la disociación
del NO (Friebe et al., 1999) (Esquema 5).
Adenilato ciclasa Guanilato ciclasa
soluble YC-1

C2
Fors ?
kolina

ATP C1 GTP
AMPc GMPc

Esquema I.5. Esquema tomado de Friebe et al., 1999.

Mientras que en un principio se descartó la capacidad del YC-1 de inhibir la

degradación de nucleótidos cíclicos (Ko et al, 1994), datos posteriores demuestran
que el YC-1 sí disminuye la actividad de enzimas fosfodiesterasas, prolongando la
permanencia del GMPc en el citosol celular. Estos mismos estudios han puesto de
manifiesto que el tratamiento con YC-1 no parece afectar directa ni indirectamente a
la actividad de la adenilato ciclasa, ni a la degradación del AMPc (Hwang et al.,
1999; Friebe et al., 1998; Galle et al., 1999).

1.2.c. ODQ, inhibidor de la actividad GCs

Recientemente se ha descrito al 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-α]quinoxalina-1-ona

(ODQ) como un inhibidor específico de la GCs, que interacciona con el grupo hemo
de la enzima oxidándolo (Schrammel et al., 1996). Ha sido utilizado para examinar la
especificidad de la activación de la GCs inducida por donadores de NO (Brunner et
16 Introducción

al., 1996). Este compuesto es capaz de prevenir los efectos vasodilatadores de los
donadores de NO a una concentración de 10 µM y, por otro lado, no afecta a otros
elementos como las GC particuladas, las NO sintasas, adenilato ciclasa ó canales de
K+ sensibles a ATP (Garthwaite et al., 1995; Olson et al., 1997).

O
O
N N Esquema I.6. Estructura química
del ODQ.

1.3. FORMAS PARTICULADAS DE LAS GUANILATO CICLASAS

Se han identificado siete isoformas de la GC particulada en mamíferos, de la GC-A a

la GC-G. Presentan estructuras altamente conservadas entre sí, incluyendo un
dominio extracelular en el extremo amino terminal que en algunos casos une
ligandos bien definidos (GC-A,-B,-C), un dominio transmembrana, un dominio
citoplasmático junto a la membrana, un dominio regulador que comparte una
significativa homología con proteínas quinasas, una región bisagra, y un dominio
catalítico en el extremo C terminal (Esquema 7).

Extremo amino-terminal

Dominio extracelular

Dominio transmembrana
Dominio juxtamembrana

Dominio regulador

Región bisagra

Dominio catalítico

Extremo carboxi-terminal

Esquema I.7. Estructura de las GC particuladas. Esquema

tomado de Lucas et al., 2000.
 Introduccón 17

Dentro de las estructuras de las GC particuladas, los dominios extracelulares son los
que presentan menor homología, reflejando la especificidad funcional para la unión
de diferentes ligandos. Se ha descrito que dichos dominios, que representan la zona
de unión a los ligandos, poseen sitios de glicosilación variables según el subtipo; la
glicosilación de estos dominios parece ser importante para la unión del ligando y la
actividad catalítica (Fenrick et al.,1996; Hasegawa et al., 1999a), pero no parece ser
necesaria para la distribución de los receptores en la superficie celular (Hasegawa et
al., 1999b). Este grupo de enzimas asociadas a membrana poseen un domino de
homología con quinasa que no tienen las forma solubles de la enzima (Aparicio et
al., 1996). El receptor guanilato ciclasa se presenta como fosfoproteína en el estado
basal y, tras la unión del ligando, tiene lugar una defosforilación del receptor que da
lugar a una desensibilización y una disminución de la actividad GC inducida por el
ligando (Potter et al., 1994).

Los dominios catalíticos de las enzimas adenilato ciclasas y de las formas

particuladas y solubles de la guanilato ciclasa, son estructural y funcionalmente
homologas (Krupinski et al., 1989). Estas enzimas precisan de la dimerización para
presentar actividad catalítica. Las formas particuladas forman homodímeros, cuyos
sitios de unión al sustrato presentan coperatividad positiva entre sí, obteniendo un
coeficiente de Hill para estas enzimas mayor que uno.

Las GCp se han clasificado, según su especificidad de ligando, como receptores de

péptidos natriuréticos (GC-A,-B), receptores de unión de péptidos intestinales (GC-
C) y receptores huérfanos (GC-D,-E,-F,-G).

Las isoformas GC-A y GC-B son activadas por unión de péptidos natriuréticos de
tipo A, B y C. La forma GC-C se describió originalmente como receptor de la familia
de enterotoxinas bacterianas estables al calor (STs), pero recientemente se ha
demostrado que existen péptidos endógenos en mamíferos, como la guanilina,
uroguanilina y linfoguanilina, que son capaces de unirse y activar estos receptores
(Currie et al., 1992; Hamra et al,., 1993; Forte et al., 1999a y b).

Las guanilato ciclasas tipo receptores de péptidos natriuréticos, incluyendo GC-A, -B

y –G, se expresan ampliamente en multitud de tejidos, como el tejido adiposo,
médula adrenal, cerebro, pulmón, hígado, intestino y músculo esquelético. Los
subtipos GC-C,-D, -E y -F presentan una cola C terminal aparte de la estructura
general descrita para las formas particuladas, y no se encuentran tan ampliamente
distribuidos en todos los tejidos, sino que tienen una localización más específica
(Fülle et al., 1995; Yang et al., 1995; Schulz et al., 1998).

Hasta el momento, se han caracterizado tres tipos de péptidos natriuréticos: el ANP,

BNP y CNP. Los dos primeros presentan en su estructura madura un anillo de 17
aminoácidos y una secuencia C terminal, conservados en ambos tipos hormonales.
Además, sus genes codificantes están organizados en tandem (Huang et al., 1996;
18 Introducción

Tamura et al., 1996). El péptido natriurético tipo C (CNP) mantiene el anillo, pero
carece de la extensión C terminal y su efecto es menos potente que el de los otros dos
péptidos.

El principal mecanismo por el cual los péptidos natriuréticos inducen sus efectos
fisiológicos implica la activación de los receptores acoplados a guanilato ciclasas y la
consecuente acumulación de GMPc intracelular (Esquema 8).

Basal

Desensibilizada

Péptido
natriurético

Activada

Esquema I.8. Regulación de las GC particuladas por su ligando. En estado

basal, la GCp se presenta como un complejo homo-oligomerizado (1). Cada
monómero de este complejo se encuentra fosforilado en residuos de serina o
treonina del dominio quinasa de la enzima. En estas condiciones, el péptido
natriurético se une a un sitio de alta afinidad formado por el dímero (2), y eso
conlleva una modificación del dominio quinasa resultando en la unión de ATP
a este dominio (3). Se produce la activación de los dominios catalíticos y el
incremento de la velocidad máxima de producción de GMPc (4). La
asociación de ATP con el dominio quinasa reduce la afinidad por el ligando
extracelular e induce la defosforilación, la disociación de ATP y el péptido
natriurético conduce a una desensibilización de la enzima (5). La regeneración
de los receptores al estado basal requiere la refosforilación de los dominios
quinasa de la enzima (tomado de Lucas et al., 2000).

Aunque el CNP es menos potente que los otros péptidos estudiados a la hora de
inducir efectos fisiológicos como diuresis, natriuresis y relajación del músculo liso
 Introduccón 19

(Sudoh et al., 1990), este péptido representa el ligando primario para la GC-B,
presentando una afinidad 50-500 veces superior al ANP y BNP (Koller et al., 1991).
El CNP estimula la actividad guanilato ciclasa e incrementa los niveles de GMPc
intracelulares en los tejidos que expresan GC-B (Moriwaki et al., 1998; Chrisman &
Garbers, 1999; Tao et al., 1999).

2. VIA NO-GC-GMPc

2.1. El Oxido Nítrico como molécula señalizadora.

Fue a mediados del siglo pasado cuando se descubrió la capacidad de la

nitroglicerina de originar una dilatación de los vasos, y su aplicación en la clínica
para el tratamiento de problemas vasculares ha sido de gran importancia a lo largo de
los años siguientes, aún ignorando el mecanismo de acción de esta sustancia (Marsh
et al, 2000).

No fue hasta los años setenta cuando se relacionó a la nitroglicerina con la activación
de la enzima GCs y el consecuente incremento en los niveles de GMPc intracelular.
Durante la década siguiente, se intensificó la investigación sobre el campo,
llegándose en 1987 a establecer que el NO radical (NOi) era el principio activo de
los nitratos orgánicos. Con anterioridad, se había considerado al NO como un gas
tóxico, carente de aplicaciones terapéuticas. Primeramente, se descubrió el factor
relajante derivado del endotelio (EDRF) y su capacidad de inducir vasodilatación
(Furchgott and Zawadski, 1980). Seguidamente, se llegó a concluir que el EDRF era
idéntico al NO (Palmer et al. 1987; Ignarro et al., 1987), del cual ya se conocía su
capacidad de activar a la GCs (Murad et al., 1978).

Desde entonces se ha producido un progreso revolucionario en el conocimiento de

las funciones del NO. Se le ha identificado como el vasodilatador endógeno por
excelencia, implicándole en múltiples procesos biológicos. La falta de NO puede
originar desórdenes y enfermedades, mientras que concentraciones elevadas del
mismo también pueden provocar efectos adversos. Se ha descrito que el NO inhibe
enzimas tales como las ribonucleótido reductasas (Kwon et al., 1991; Lepoivre et al.,
1991) e inhibe los complejos I y II de la cadena respiratoria mitocondrial al
interaccionar con los complejos hierro-azufre (Welsh et al., 1991); del mismo modo
inhibe a la aconitasa. También induce la ADP ribosilación e inhibición de otras
enzimas como la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (Brune et al., 1994), y daña
directamente el ADN por desaminación de sus bases (Wink et al., 1991; Nguyen et
al., 1992). Además, la producción de NO se ha implicado en daños provocados por la
isquemia (Bruhwyler et al., 1993), toxicidad neuronal mediada por glutamato
(Dawson et al., 1993), inflamación (Billiar et al., 1992), y una de las vías principales
de defensa contra virus, bacterias y otros parásitos (Oswald et al., 1994). El NO
20 Introducción

produce adiciones radical-radical, siendo esta reacción con gran probabilidad la

responsable de las acciones directas del compuesto.

La vía de transducción de señales mayoritaria cuando el NO se sintetiza por las

isoformas constitutivas de NOS, llegándose a concentraciones por debajo del
micromolar, es la unión al grupo hemo de la GCs (Ignarro et al., 1982; Waldman &
Murad, 1987). Esta señal inicia la conversión de GTP a GMPc. Los niveles de GMPc
intracelular regulan la fisiología celular por activación de proteínas quinasas,
apertura directa de canales iónicos y alteración de los niveles de nucleótidos cíclicos
por regulación de fosfodiesterasas (PDEs). En los siguientes apartados se hace una
descripción más detallada de todos los elementos que participan en esta vía de
transducción de señales.

2.2. EL ÓXIDO NÍTRICO

2.2.a. Química y reactividad del NO

El óxido nítrico es una molécula de pequeño tamaño y estructura muy simple, de

carácter fuertemente hidrofóbico. A temperatura y presión ambientales, se encuentra
en estado de gas incoloro, presentando una solubilidad en agua similar a la del
oxígeno puro. Una de las características más relevantes del NO y que le convierten
en una molécula única, es que se trata de una especie paramagnética, ya que posee un
electrón desapareado.

N+O NO•

Sin embargo, aunque muchos de los comportamientos químicos de esta molécula

están dominados por el hecho de ser un radical, el NO difiere respecto de otros
radicales en que no dimeriza en condiciones de Tª y presión ambientales. Sin
embargo, una reacción que puede producirse fácilmente dando lugar a un compuesto
más estable es la de oxidación, originando NO+, que reaccionaría con nucleófilos
produciendo su nitrosilación.

2.2.a.1. Reacción del NO con Oxígeno

El NO es capaz de reaccionar con el oxígeno (O2), una de las moléculas

biológicamente más significativas, que presenta dos electrones no enlazantes. La
reacción de NO con O2 en estado gaseoso resulta en la formación de NO2. La
cinética de esta reacción es de segundo orden para el NO y de primer orden para el
O2 tanto en fase gaseosa (Olbregts et al., 1985) como en acuosa aeróbica (Lewis &
Deen, 1994), indicando que la descomposición del NO en el aire no es lineal respecto
a la concentración. Cuando la concenetración de NO es alta, éste se degradará
rápidamente, mientras que a concentraciones menores la velocidad de
descomposición será menor.
 Introduccón 21

2NO + O2 2NO2

-d[NO]/dt=k [NO]2. [O2]

En fase gaseosa, el NO2 es el producto final, mientras que en solución acuosa se

descompone a nitritos y nitratos según las reacciones:

2 NO2 N2O4

N2O4 + H2O NO2- + NO3- + 2H+

-d[NO]/dt=4k [NO]2. [O2]

Teniendo en cuenta que el NO existe aún en solución a una concentración mayor que
la de NO2, las reacciones descritas a continuación se producirán de forma
predominante (Feelisch et al., 1991; Lewis & Deen, 1994):

NO + NO2 N2O3

N2O3 + H2O 2 NO2- + 2 H+

Considerando las reacciones que tienen lugar en solución, deducimos que pueden
existir hasta 7 especies de óxidos de nitrógeno simultáneamente en la solución. La
importancia de estas especies radica en que, tanto el ácido conjugado de NO2- como
el N2O3, pueden originar una reacción de nitrosilación de grupos tioles como se
describirá más adelante.

2.2.a.2. Reacción de NO con superóxido

El producto de la reducción del O2, el superóxido (O2-), es también capaz de

reaccionar con el NO formando el peroxinitrito, producto estable (Koppenol et al.,
1992). La reacción que a continuación se describe tiene como producto final dos
potentes oxidantes que podrían ser responsables de la oxidación de gran variedad de
moléculas biológicas (Radi et al., 1991) y, por tanto, de parte de la toxicidad que se
ha visto mediada por el NO.

O2- + NO• -
OONO
-
OONO + H+ HOONO [•OH + NO2] NO3- + 2H+

2.2.a.3. Reacciones de nitrosilación

La nitrosilación de grupos tioles sirve para prolongar la actividad biológica del NO,
actuando estos derivados como reservorios que pueden liberar NO de forma lenta
(Stamler et al., 1992; Keaney et al., 1993). También se ha propuesto que la alteración
del estado redox de grupos tioles críticos podría servir para regular la actividad de
determinadas proteínas (Lipton et al., 1993). Por ello, el mecanismo de formación de
22 Introducción

nitrosotioles alcanza gran relevancia. Aunque esta reacción no estaría favorecida en

condiciones anaeróbicas o en ausencia de metales de transición, en presencia de O2 el
tiol podría sufrir una lenta autoxidación para dar lugar a un radical tiil, seguido de
una simple adición de radicales con el NO:

O2•-
O2
+ NO•
R-SH R-S• R-S-N O

De forma alternativa el NO puede reaccionar con el O2 para producir especies

nitrosantes, como se ha descrito en el apartado anterior, que finalmente llegarían a
formar el nitrosotiol y NO2-.

Todas las reacciones de formación de nitrosotioles que dependan de alguna manera

del oxígeno, serán lentas y poco eficientes ya que se precisa de una autooxidación del
tiol o formación de •NO2. Sin embargo, los metales de transición catalizan la
oxidación del tiol, favoreciendo la formación de FeII-NO+ que atacaría al R-SH
directamente, formándose nitrosotioles capaces de transferir el grupo NO+ a otros
grupos sulfidrilos de proteínas para formar uniones covalentes más estables (Lipton
et al., 1993; Stamler et al., 1994).

Las reacciones de nitrosación o nitrosilación de sustratos endógenos pueden jugar un

importante papel en cuanto al transporte y al mecanismo de acción del NO in vivo.
Este tipo de alteraciones se han postulado como las responsables de la inhibición por
NO de los receptores NMDA (Stamler et al., 1994), la inhibición de adenilato ciclasa
(Duhe et al., 1994) y la activación de PKC (Gopalakrichna et al. 1993). Las uniones
covalentes formadas serán reversibles cuando el NO regrese a niveles basales. El NO
también produce nitrosilación de proteínas G (Goligorsky et al., 1994) y de
diferentes tipos de receptores.

2.2.a.4. Reacción de NO con Oxihemoglobina

La unión del O2 al FeII del grupo hemo se produce de la misma forma que se une el
NO. Al igual que la unión de este último, el complejo se puede representar como la
combinación de dos formas resonantes:

[FeII-O2 FeIII-O2-] + NO FeIII + NO3-

Se produce según una reacción de primer orden dependiente de la concentración de

NO que reacciona directamente con el O2 unido al grupo hemo, sin desplazarlo
primero de esta unión, mediante la formación intermedia de nitritos (Herold 1998;
Eich et al., 1996).
 Introduccón 23

2.3. BIOSÍNTESIS DE ÓXIDO NÍTRICO

Dado que el NO no puede ser almacenado, liberado, ni inactivado por mecanismos

convencionales, la regulación biosintética es más relevante en el caso del NO que en
el de otros mensajeros, puesto que va a ser la regulación de su síntesis la que
determine su concentración.

La familia de enzimas responsables de la síntesis del NO in vivo se denomina como

óxido nítrico sintasa (NOS) (L-arginina,NADPH-oxígeno oxidoreductasa) y de ella
existen tres isoformas: dos que se expresan constitutivamente (NOS I y NOS III) y la
tercera que se expresa de forma inducida por diferentes citoquinas (NOS II). La
reacción que catalizan todas ellas es similar. La conversión de la arginina a NO es
catalizada en dos pasos independientes, en los cuales se produce una oxidación que
implica 5 electrones.

NH 3+
H
N NH+
-OOC

NH
L-arginina
Esquema I.9. Esquema de la
O2 NADPH síntesis de NO por NOS.

H2O NADP+

NH 3+
H
N NH 2
-O OC

NHOH

O2 1/2 NADPH

+
H2O 1/2 NADP

NH 3+
H
N NH 2 + NO
-OOC

L-citrulina O

La estequiometría impar de la transferencia de electrones permite la generación de un

radical libre, el NO (Schmidt et al., 1993; Förstermann et al., 1994).
24 Introducción

2.3.a. Estructura de las NOS

Las formas activas de las isoenzimas NO sintasas son homodímeros. A su vez, cada
subunidad posee un dominio reductasa en la región carboxiterminal, y un dominio
oxigenasa en la aminoterminal.

Las secuencias de unión al cofactor tetrahidrobiopterina y al sustrato L-arginina, así

como el grupo hemo y la proteína moduladora calmodulina, se encuentran en el
extremo N-terminal (Bredt et al., 1991), mientras que la unión de los cofactores de
oxidoreducción (NADPH, FAD y FMN) se produce en la porción C-terminal de cada
subunidad. Existe una interacción reductasa–oxigenasa crucial para la función de la
NOS, de forma que el dominio reductasa sólo puede reducir al grupo hemo de la
subunidad opuesta del heterodímero, quedando el modelo de activación como se
representa en el esquema 10.

Dominio reductasa Dominio oxigenasa

L-Arg
O2

- NADPH FMN
OOC FAD heme
hemo BH4 NH2

CaM

L-citrulina
NO

Esquema I.10. Dominios y cofactores de la NO

sintasa. La linea discontinua muestra la transferencia de
electrones. Esquema tomado de Pffeifer et al., 2000.

La observación de que la presencia de calmodulina es necesaria para la actividad de

NOS permitió la purificación de tres subtipos activos: un tipo endotelial (NOSe)
(Pollock et al., 1991), uno neuronal (NOSn) (Bredt & Snyder, 1990; Mayer et al.,
1990; Schmidt et al., 1991) y un tipo inducible (NOSi) (Hevel et al., 1991; Yui et al.,
1991; Stuehr et al., 1991; Evans et al., 1992). A partir de ahora nos referiremos a
estas enzimas como NOS III, NOS I y NOS II respectivamente.

Los polipéptidos que forman cada una de las subunidades de la enzima presentan un
peso molecular que varía de 130 a 160 kDa, dependiendo del subtipo de NOS. El
criterio de clasificación se basa en las propiedades físicas y bioquímicas de las
enzimas purificadas, teniendo en cuenta principalmente la regulación de la actividad
por el Ca2+ libre y su localización subcelular y tisular.
 Introduccón 25

Todas las formas de NOS unen calmodulina en un proceso dependiente (NOS I y

NOS III) o independiente (NOS II) de Ca2+. En el caso de las dos primeras
isoformas, a la concentración de Ca2+ en reposo (<100nM) no unen calmodulina y
por tanto están inactivas, mientras que una elevación de la [Ca2+]i a niveles >500nM,
provoca una unión de la calmodulina y por lo tanto una activación de las enzimas.
Teniendo en cuenta que la Km para la L-arginina de estas isoformas (2-4 µM) está
muy por debajo de la [L-arginina]i, que se encuentra en el rango de 100-800 µM,
estas enzimas trabajan a concentraciones saturantes de un modo totalmente
independiente de la concentración de sustrato (Förstermann et al., 1994). La
expresión de NOS I y NOS III es constitutiva en los tejidos en los que están
presentes, aunque existen mecanismos de regulación a nivel de su expresión
(Förstermann et al., 1995; Bredt & Snyder, 1990).

A diferencia de las dos anteriores, la NOS II no se expresa de manera constitutiva,

sino que es inducida por determinados estímulos como infecciones bacterianas y
víricas y procesos tumorales. La NOS II une calmodulina de forma independiente a
la [Ca2+]i.

2.3.a.1. NOS I o neural

Esta enzima se localiza en la fracción citosólica soluble y tiene una masa molecular
de 150-160 kDa. Se ha detectado en numerosas regiones del sistema nervioso central
como el bulbo olfatorio accesorio, el núcleo tegmental pedunculopontino, el cerebelo
y, en menor cantidad, en el giro dentado del hipocampo, el bulbo olfatorio principal,
los colículos superiores e inferiores, el núcleo supraóptico, así como en la corteza
cerebral y en el caudado putamen (Bredt et al., 1990; Dawson et al., 1991). Esta es la
isoforma presente en nuestro modelo celular (Rodriguez-Pascual et al., 1996).

La amplia localización de la NOS I en el sistema nervioso central da una idea de la

importancia del NO como mensajero biológico en multitud de procesos dentro del
sistema nervioso.

En esta isoforma se han identificado unos dominios PDZ que le permiten

interaccionar con otras proteínas como la PSD-95 en células neurales ó el complejo
de la distrofina en células musculares. Estas interacciones permiten una localización
de la NOS I próxima a los receptores de NMDA y/o canales de Ca2+, permitiendo así
una rápida activación.

El proceso de activación de esta enzima viene mediada por el incremento de la

[Ca2+]i, originada por la apertura de canales iónicos asociados a receptores
ionotrópicos específicos de diferentes neurotransmisores. El incremento en la [Ca2+]i
origina una activación de la calmodulina, dando lugar a la formación del complejo
NOS/Ca2+-CaM y disparando la actividad catalítica de la enzima. La formación de
NO dará lugar a la activación de la ruta de segundos mensajeros de síntesis de
GMPc.
26 Introducción

Además de la regulación de la NOS I por parte de la calmodulina, se ha descrito que

su propio producto de reacción puede regular directamente la actividad de la enzima
(Rengasamy et al., 1993; Vickroy et al., 1995; Schwartz et al., 1997), probablemente
por unión al grupo hemo (Griscavenge et al., 1994). También se ha descrito la
regulación por fosforilación (García-Cerdeña et al., 1996). Incluso se ha descrito una
proteína que interacciona con la NOS desestabilizando el dímero e inhibiendo su
actividad (Jaffrey et al., 1996).

Estudios farmacológicos apoyan la idea de que el NO esta implicado en mecanismos

de plasticidad sináptica como mensajero retrógrado en procesos de potenciación a
largo plazo o LTP, gracias a su capacidad de difundir a la neurona presináptica
(Kantor et al., 1996; Roskams et al., 1994; Okere et al., 1996), implicando a su vez la
activación de la GCs (Boxal et al., 1996; Calabresi et al., 1999). También existen
datos sobre la regulación por parte del NO del desarrollo neural (Bredt & Snyder,
1994; Hess et al., 1993).

Hasta ahora se ha descrito la importancia del NO como mensajero en la transmisión

nerviosa. Sin embargo, en determinadas circunstancias, el NO puede convertirse en
agente tóxico, como ocurre en la enfermedad de Alzheimer y Corea de Huntington.

Mediante el empleo de anticuerpos específicos contra la NOS I, se ha detectado esta

isoforma en tejidos distintos del sistema nervioso central como la médula espinal,
ganglios simpáticos y glándulas adrenales (Dun et al., 1992; 1993). También se
encontró en poblaciones neuronales que interaccionan con músculo liso y con vasos
sanguíneos de gran calibre, contribuyendo a su dilatación (Desai et al., 1991) y en
tejidos no neuronales como epitelio de pulmón, útero, estómago, islotes pancreáticos,
mácula densa del riñón y músculo esquelético humano (Kobzik et al., 1994).

2.3.a.2. NOS II o inducible

Esta proteína se encuentra en la fracción soluble y posee un peso molecular de 125-

135 kDa. Se diferencia de las otras dos isoformas en que su actividad no es
dependiente de [Ca2+]i y una vez expresada es activa para producir NO. La inducción
de su expresión alcanza un grado tal que las células producen enormes cantidades de
NO. Señales como lipopolisacáridos de la pared bacteriana y algunas citoquinas son
capaces de iniciar el proceso de síntesis de NOS II. Los altos niveles de NO
generados por la enzima causan efectos citotóxicos y citostáticos sobre los
microorganismos causantes de la infección o sobre células tumorales (Nathan &
Hibbs 1991).

La NOS II se ha detectado en macrófagos, donde fue caracterizada por primera vez,

en linfocitos, neutrófilos, hepatocitos y células mesangiales, así como en células
endoteliales y musculares de los lechos vasculares, donde contribuye a la hipotensión
generalizada asociada a choques sépticos (Buttery et al., 1993). Su expresión puede
 Introduccón 27

inducirse en el sistema nervioso en estados patológicos como infecciones virales e

isquemia (Simmons & Murphy, 1992).

2.3.a.3. NOS III o endotelial

Esta proteína se aisló por primera vez a partir de células endoteliales de aorta bovina
y, aunque comparte el mecanismo de activación y su expresión constitutiva con la
isoforma I, se diferencia de ésta por ser una proteína particulada que se puede
traslocar al citosol mediante fosforilación en residuos de serina (Förstermann et al.,
1991).

La producción de NO por la isoforma endotelial es la responsable de la dilatación de

los vasos (Palmer te al., 1987; Ignarro et al., 1987). Al igual que en el caso de la
NOS I, el proceso se inicia por la interacción de agonistas con receptores específicos,
que originan un incremento en los niveles de [Ca2+]i, bien por su entrada a través de
canales o por liberación desde orgánulos intracelulares. A su vez, el NO conduce a la
activación de la GCs en células musculares y, finalmente, a la fosforilación de ciertos
sustratos protéicos que conduce a una disminución de [Ca2+]i en dichas células,
provocando la relajación de los sistemas contráctiles como se desarrollará más
adelante.

3. DONADORES DE ÓXIDO NÍTRICO

El NO participa en numerosos procesos tanto fisiológicos como patofisiológicos,

dependiendo de la concentración que se alcance de esta sustancia. Así,
concentraciones de NO entre 5 y 450 nM dan lugar a una relajación de los vasos y
por tanto a un control de la presión sanguínea, inhibición de la agregación y adhesión
de las plaquetas, estando también involucrado en la neurotransmisión. Se han
detectado concentraciones de hasta 15 µM en las reacciones anafilácticas del
organismo ante infecciones bacterianas o víricas o en procesos tumorales (Lehmann,
2000). Estas diferentes acciones del NO están mediadas por diferentes mecanismos.
Así, a bajas concentraciones el NO activa fundamentalmente a la enzima GCs,
mientras que a elevadas concentraciones el NO puede producir reacciones muy
diferentes como la nitrosilación de proteínas (Lipton et al., 1993; Van der Vliet et al.,
1995). Por otra parte, otros estudios han puesto de manifiesto que la toxicidad
mediada por NO se debe, en parte, a daños en el ADN al producir una desaminación
de sus bases (Zhang et al., 1994; Wink et al, 1991).

La disparidad entre las múltiples acciones del NO y los efectos tan distintos que
ejerce a unas u otras concentraciones, vienen a resaltar la importancia de conocer la
capacidad de los diferentes donadores de NO de liberar este compuesto al medio
donde se realizan los experimentos.
28 Introducción

Dada la capacidad del NO de estimular a la GCs, las medidas de GMPc se han

utilizado como medidas indirectas de la producción de NO (Murad, 1986). Sin
embargo, existen muy pocos estudios acerca del comportamiento de la actividad de
esta enzima cuando se expone a diferentes concentraciones de NO o cuando la
exposición a éste es prolongada. Por tanto, las medidas de GMPc, en muchos casos,
no son un reflejo de la producción de NO.

El NO como droga activa, tiene un gran potencial terapeútico. Sin embargo, es

extremadamente inestable. El NO presente en el aire se oxida a NO2, mientras que en
solución acuosa y en presencia de oxígeno tiene una vida media muy corta por
oxidación a nitritos. Aunque se han descrito algunos compuestos que añadidos a las
soluciones de NO son capaces de prevenir la oxidación de éste (Furchgott et al.,
1980), actualmente se prefiere la utilización de moléculas asociadas a NO que actúan
como donadoras de éste al medio acuoso. A continuación se describen algunas de las
drogas utilizadas como donadores de NO.

3.1. Nitroprusiato Sódico

Los efectos vasodilatadores del nitroprusiato sódico (SNP) son mediados por la
liberación de NO. Sin embargo, el mecanismo de liberación de NO a partir de dicho
compuesto sigue siendo incierto. Contrariamente a la creencia generalizada, el SNP
no se descompone espontáneamente para liberar NO, a no ser que se le exponga a la
luz (Butler et al., 1987); la generación de NO es dependiente de su contacto con
tejidos y parece estar mediado por proteínas ligadas a la membrana (Kowaluk et al.,
1992). El SNP es un inhibidor de la agregación plaquetaria más potente que los
nitratos (Chirkov et al., 1999). Sin embargo, el uso de este compuesto se encuentra
limitado por el hecho de que, tras su descomposición para liberar la molécula de NO
que posee en su estructura, se producen como metabolitos grupos ciano que podrían
originar toxicidad por acumulación en tratamientos de más de 72 horas (Smith et al.,
1974).

O
N N
C N C
Na2 Fe
C C C
N N
N
Esquema I.11. Estructura química del SNP

SNP

A pesar de los potenciales problemas derivados de su descomposición, es uno de los

compuestos más ampliamente utilizados tanto en estudios clínicos como en el
laboratorio.
 Introduccón 29

3.2. Diazeniodiolatos (NONOatos)

Estos compuestos son sales que presentan el grupo aniónico (N(O)NO)- en la

posición 1 de la estructura. Este grupo puede ser generado mediante la adición de dos
moléculas de NO a una molécula de un nucleófilo, normalmente una amina
secundaria, añadiendo una base para mantener el grupo en su forma aniónica estable.
En general, el nucleófilo disuelto se expone a 3-5 atmósferas de NO en condiciones
anaeróbicas (Morley et al., 1993), y el producto se puede aislar como un polvo
blanco relativamente estable. Los primeros diazeniodiolatos fueron preparados por
Drago (Drago et al., 1960), aunque los experimentos realizados por el grupo de
Keefer fueron decisivos para establecer la importancia de este tipo de compuestos
como una excelente fuente de liberación de NO in vitro e in vivo de manera
controlada (Keefer et al. 1996).
H 2N
- +
O NH 2 -
O
+
N -N + N -N
-
N -O N-O -
H 2N
DEA/NO

H 2N - SPER/NO
O
+
N-N
+ N -O -
H 3N

DETA/NO
Esquema I.12. Estructuras químicas de los NONOatos

Cuando se disuelve en tampón acuoso a pH fisiológico o se introduce en sangre, el

NONOato regenera NO y el nucleófilo original. En la figura aparece el equilibrio de
síntesis y disociación del DEA/NO, el NONOato originado a partir de dietilamina,
aplicable a los demás compuestos de este grupo.
-
O
NaOCH3
NH + 2NO
+
N -N+
H
N-O - Na+

Aunque estos compuestos son estables en su forma sólida, se descomponen en

solución a pH neutro liberando hasta 2 radicales de NO por molécula (Sarkar et al.,
1996; Yin et al., 1997; Brilli et al., 1997; Homer et al., 1998; Ekrhovd et al., 1998;
Du et al., 1998). La descomposición de los NONOatos sigue una cinética de primer
30 Introducción

orden (Ramamurthi et al., 1997) y no es catalizada por tioles o albúmina (Morley et

al., 1993). A diferencia de otros tipos de donadores de NO, la eficacia biológica de
los NONOatos es predecible a partir de su tasa de descomposición in vitro,
determinada por el aducto nucleofílico, la temperatura y el pH. Los NONOatos son
estables en disoluciones alcalinas, pero la neutralización del medio o su acidificación
inicia su descomposición inmediata. La estabilidad no depende, en resumen, más que
de su estructura. Por lo tanto, se pueden diseñar diazeniodiolatos de acuerdo con el
perfil de liberación deseado, teniendo vidas medias que van desde 1 minuto hasta dos
días. Así, una infusión en bolo de DEA/NO sería útil para producir una caída local y
pasajera de la presión sanguínea en segundos, mientras que el DETA/NO es capaz de
originar un flujo constante de NO durante días.

Tabla I.1. Vidas medias de NONOatos

DEA/NO DETA/NO SPER/NO

t1/2 a 37ºC 2 min 20 hrs 39 min

(Keefer et al., 1996)

Las ventajas de este tipo de drogas donadoras de NO respecto al NO puro son la

estabilidad de los donadores y la posibilidad de controlar la cantidad, lugar y
velocidad de producción de NO. Además, a partir de estos compuestos es posible
obtener unas prodrogas selectivas de órganos, que precisan bioactivación a través de
enzimas presentes en uno u otro tejido preferentemente (Saavedra et al., 1997).

3.3. Nitrosotioles

Los S-nitrosotioles (RSNO), también conocidos como tionitritos, son los análogos
sulfurados de los nitritos alquílicos RONO. La mayoría de ellos son inestables en su
estado puro a temperatura ambiente. La importancia de estos compuestos radica en
que, además de descomponerse de manera no enzimática para liberar NO, estos
compuestos se han detectado in vivo y pueden ser responsables de los mecanismos de
procesos biológicos que se han atribuido al NO. Esto ha hecho que se preste más
atención a la química y farmacología de estos compuestos.

Los nitrosotioles se forman a partir de tioles y cualquier agente nitrosante

electrofílico del tipo XNO, que actúa como agente capaz de ceder una molécula de
NO+ como se refleja en la ecuación (Williams et al., 1996).

RSH + XNO RSNO + X + H+

Entre los nitrosotioles que se han logrado purificar y caracterizar, cabe resaltar a la
N-acetil-DL-penicilamina (SNAP) y al nitrosoglutation (GSNO), este último
detectado de manera endógena.
 Introduccón 31

H 3C CH 3
C O OH
O N-S
HN CH 3

O
SNAP

Esquema I.13. Estructura química del SNAP.

Entre sus propiedades físicas, cabe destacar el color verde que presenta el SNAP en
su estado sólido y su coeficiente de extinción molar a 590 nm (∆ε= 10 M-1.cm-1)
(Williams et al., 1996). La descomposición de los nitrosotioles se produce según la
ecuación:

2 RSNO RSSR + 2 NO

La descomposición puede ser iniciada por un proceso fotoquímico o inducido por

iones de metales de transición, como el Cu2+. Sin embargo, en ausencia de luz y
metales contaminantes en una solución a temperatura ambiente y pH fisiológico, el
compuesto permanecerá estable. (Singh et al., 1996; Sexton et al., 1994). La
descomposición de los S-nitrosotioles por fotolisis se produce por una ruptura del
enlace S-N, resultando en una liberación de NO•. La importancia de la cantidad de
iones metálicos en la descomposición de estos compuestos hace que se hayan
obtenido resultados muy diferentes en cuanto a las velocidades de descomposición
del SNAP (Ignarro et al., 1981; Mathews et al., 1993).

Otra importante reacción de los nitrosotioles es aquella en que el grupo nitro es

transferido a otra molécula con un grupo tiol, esto es, la transnitrosilación. En
principio, esta reacción podría ocurrir directamente, actuando los nitrosotioles como
portadores de NO+, o indirectamente por una pérdida inicial del NO (ecuación
anterior) que luego se oxida a un estado de oxidación superior del nitrógeno que
permitirá la nitrosilación de aminas, etc. El intercambio del grupo NO entre
nitrosotioles y tioles ha sido demostrado por diferentes autores (Meyer et al., 1994),
pero en ciertas condiciones los nitrosotioles se descompondrán a su vez, dando lugar
a una mezcla de disulfitos. La reacción implica el ataque del anion tiolato y se
produce de manera más rápida que la simple descomposición del compuesto a pH
fisiológico, dependiendo del pKa del tiol.

RSNO + R´S RS + R´SNO

R´SH RSH
32 Introducción

Este proceso puede resultar biológicamente importante en el caso de que el grupo tiol
al que se realiza la transferencia sea un residuo de cisteína de una proteína, cuya
modificación pueda conducir a una alteración de su actividad.

Esta reacción de transnitrosilación se dará, por ejemplo, entre el SNAP y GSH con
una constante de equilibrio de 18,6, mostrando que la formación de GSNO está
favorecida (Singh et al., 1996). A su vez, el GSNO reacciona con el GSH intracelular
para liberar NO•.

3.4. Nitratos orgánicos

Aunque en los estudios realizados en este trabajo no se ha utilizado ningún

compuesto con esta estructura, parece interesante hacer referencia a ellos dado que la
NG, primer donador de NO descrito y utilizado, pertenece a este grupo. Los nitratos
orgánicos utilizados en terapeútica presentan cuatro, tres (NG), dos o un grupo
nitrosilo (NITROOXY) unido a una molécula orgánica simple que hace de portadora.
Su potencia farmacodinámica disminuye en ese mismo orden. Estos compuestos
producen una relajación de la musculatura de los vasos, actuando preferentemente
sobre las venas (Parker et al., 1987) por liberación de NO a través de un paso
reductor (Ahlner et al., 1991). A pesar de la intensa investigación al respecto, el
mecanismo responsable de la liberación de NO a partir de estos compuestos es
pobremente comprendido. La estabilidad de los compuestos orgánicos es
ampliamente reconocida, así como el hecho de que no se descomponen
espontáneamente para liberar NO. Por ello, se han señalado diversas enzimas
celulares como responsables de las reacciones que conducen a la liberación del NO.
Algunas de las enzimas de las cuales sí han aparecido datos más convincentes son la
glutation-S-transferasa (Simon et al., 1996), la citocromo P450 reductasa (McGuire
et al., 1998) o bien una combinación de procesos enzimáticos y no enzimáticos.

4. SISTEMAS EFECTORES DEL GMPc

4.1. PROTEÍNA QUINASA DEPENDIENTE DE GMPc

Tras el incremento intracelular de los niveles de GMPc por activación de la GCs o

por inhibición de la degradación del GMPc mediada por fosfodiesterasas, el próximo
paso en la acción del nucleótido cíclico es la estimulación de una proteína quinasa
dependiente de GMPc (Gill et al. 1976). Estas enzimas son proteínas serina/treonina
quinasas de las cuales se han descrito dos subtipos en tejidos de mamíferos, PKG
tipo I con una localización citosólica y la PKG II asociada a membranas (Hofmann et
al., 1992, Butt et al., 1993; Francis & Corbin, 1994a y b).
 Introduccón 33

BNP
ANP CNP
NO
Análogos de GMPc
Receptor

GC-P
GC-S

Canal iónico GMPc

Otros
efectores
PDE
PKG P Sustrato
Proteínas
Fosofoproteínas fosfatasas

Canales de Na+
Efectos fisiológicos Sustrato
Na+
Canales de Cl+
Nuleótidos
cíclicos
Canales de K+ Canales [Ca2+]i
iónicos Proteínas de
unión a GTP
Citoesqueleto
Ca2+

Canal de Ca2+ Endocitosis

Liberación de
neurotransmisores

Esquema I.14. Esquema de activación de la PKG.

Tomado de Wang et al, 1997.
34 Introducción

El holoenzima del tipo I es un dímero compuesto de dos subunidades idénticas de

unos 76 kDa, apareciendo dos subtipos de esta enzima, según un proceso de corte y
empalme alternativo a partir del mismo gen, denominadas Iα y Iβ. El tipo II también
es un dímero compuesto de dos subunidades iguales de 86 kDa cada una (Gamm et
al., 1995).

La secuencia de aminoácidos de cada subunidad se ha dividido en seis dominios, de

los cuales el 2 y 3 son sitios de unión a GMPc de distinta afinidad. Así, cada
molécula del enzima une dos moléculas de GMPc. Los sitios de unión de GMPc se
diferencian entre sí por sus parámetros cinéticos: mientras que uno de ellos,
denominado lento, presenta mayor afinidad por el sustrato y se disocia más
lentamente de éste, el otro, denominado rápido, posee menor afinidad y por lo tanto
se disocia mucho más rápidamente. Entre ambos sitos aparece coperatividad positiva,
es decir, la unión del ligando a ambos dominios enlentece la disociación del mismo,
prolongando la activación de la enzima. Además, la ocupación de ambos sitios es
necesaria para la activación completa de la enzima.

Además de los dominios de unión a GMPc, estas enzimas presentan un dominio de

dimerización en el extremo aminoterminal, un dominio catalítico, uno autoinhibitorio
y un sitio de autofosforilación. Los subtipos I y II de la PKG se autofosforilan in
vitro en presencia de Mg2+ y ATP (Francis & Corbin, 1994b). Este proceso no se ve
afectado por la presencia de sustrato, sugiriendo que se produce de forma preferente
sobre la fosforilación de sustratos exógenos. La autofosforilación en el caso de la
PKG Iα incrementa la disociación del GMPc del sitio de alta afinidad,
incrementando, en cambio, la afinidad del AMPc para este sitio, apareciendo así el
fenómeno de activación cruzada que existe entre las dos vías del AMPc y GMPc
(Butt et al., 1993).

En cuanto a su distribución en los tejidos, mencionar que la PKG I se expresa en

cantidades importantes en músculo liso, plaquetas y células de Purkinge en el
cerebelo (Kleppisch et al., 1999; Keilbach et al., 1992). Sin embargo, el subtipo II se
ha encontrado en la mucosa intestinal (Markert et al., 1995), hígado (Gambaryan et
al., 1996) y regiones específicas del cerebro (El-Husseini et al., 1998). La amplia
expresión de las PKG se refleja en la diversidad de funciones que presentan,
estableciendo a estas enzimas como mediadores predominantes de la cascada de
señalización del GMPc.

4.1.a. Acción sobre el sistema cardiovascular

La capacidad de distintos compuestos de elevar los niveles de GMPc intracelular, o

los análogos de éste de producir la relajación de los vasos sanguíneos, sugirió por
primera vez la implicación de la PKG en los mecanismos de vasodilatación.
Recientemente, se han llevado a cabo nuevos estudios, y se ha visto la aparición de
hipertensión en animales manipulados genéticamente para no expresar PKG I,
 Introduccón 35

reafirmando la implicación de la PKG en los bien conocidos efectos vasodilatadores

del NO (Pfeifer et al., 1998). Aunque el músculo liso presenta gran número de
proteínas que podrían ser fosforiladas por PKG I, aún no se ha descrito una relación
directa entre la fosforilación de una proteína en concreto con la aparición de la
relajación vascular. Sin embargo, la disminución de la [Ca2+]i en músculo liso como
consecuencia de la activación de PKG ha sido ampliamente descrita (Febel et al.,
1988; Cornwell & Lincoln, 1989; Geiger et al., 1992; Ruth et al., 1993). Este efecto
podría explicar la vasodilatación. Se han propuesto varias causas posibles de esta
disminución del calcio en el citosol. Por un lado, se ha propuesto que la inhibición
del receptor de IP3 por fosforilación inhibiría el incremento de [Ca2+]i inducida por
agonistas (Lincoln et al., 1995; Tertyshnikova & Fein, 1998). También se ha
sugerido que la PKG I podría regular los canales de K+ activados por Ca2+,
produciendo una hiperpolarización de la membrana que no permitiría una posterior
entrada de Ca2+ vía canales voltaje-dependientes (Alioua et al., 1998; Zhuo et al.
1998). Experimentos recientes sugieren que puede haber una activación de proteínas
fosfatasas relacionadas con la desensibilización al Ca2+ inducida por GMPc (Lee et
al, 1997). La fosforilación de una pequeña proteína Heat–Shock–Related (HSP-20)
podría disminuir su capacidad de interaccionar con los filamentos intermedios,
modificando el efecto de contracción del músculo liso (Beall et al., 1997).

4.1.b. Inhibición de la agregación plaquetaria

El efecto antiagregante de la PKG I sobre plaquetas esta mediado por fosforilación

de proteínas específicas como la VASP (fosfoproteína estimulada por
vasodilatadores), que se fosforila en respuesta a análogos de AMPc y GMPc (Butt et
al., 1994; Wang et al., 1998). El efecto del GMPc desaparece en animales que no
expresan la PKG I mientras que el AMPc sigue teniendo efecto, lo cual revela que
ambos nucleótidos actúan por dos vías diferentes y que una no puede suplir a la otra,
es decir, el efecto del NO /GMPc/PKG es vital para evitar la agregación plaquetaria.
Aunque aún no se conocen los sitios donde actúa la PKG I para inhibir la activación
de las plaquetas, la acción sobre la VASP parece modular la actividad de moléculas
de adhesión y, por tanto, ser responsable del efecto sobre plaquetas (Horstrup et al.,
1994).

4.1.c. La PKG en el sistema nervioso

Ya se ha comentado anteriormente el papel del NO como mensajero retrógrado en el

aprendizaje y, más concretamente, a nivel sináptico en el fenómeno de LTP. La
implicación de la PKG en la inducción de la LTP está basada en el descubrimiento de
que los inhibidores de PKG I bloquean la LTP y que los activadores de ésta la
potencian (Zhuo et al, 1994; Arancio et al., 1995). De hecho, se han encontrado altos
niveles de expresión de PKG I en neuronas piramidales del hipocampo, apoyando la
idea del papel potencial de la proteína en LTP (Kleppisch et al., 1999).
36 Introducción

Otros efectos de PKG en la neurotransmisión incluyen la regulación de corrientes de

Ca2+ neuronales (Meriney et al., 1994), de liberación de neurotransmisores
(Akamatsu et al., 1993; Pineda et al., 1996) y de activación de canales de K+
(Furukawa et al., 1996).

La isoforma neuronal de NOS es sustrato de múltiples proteínas kinasas, incluyendo

PKA y PKG (Bredt et al., 1992; Dinerman et al., 1994). La fosforilación disminuye
la actividad de NOS, pudiendo este proceso servir como una retroinhibición de la
ruta de señalización de la NOS.

Existen varias formas mediante las cuales la PKG puede regular las funciones
celulares, siendo una de ellas a través de la actividad de proteínas fosfatasas. Se ha
caracterizado como sustrato de la PKG a la DARPP-32, una proteína inhibidora de
fosfatasa I. Esta proteína también es fosforilada por PKA, y se encuentra en grandes
cantidades en la sustancia nigra, donde también se expresan GCs y PKG (Walaas &
Greengard, 1984; Ariano et al.,1983). La DARPP-32 es fosforilada en respuesta a
estímulos, entre otros, dopaminérgicos (Snyder et al., 1994 ) y esta fosforilación es
modulada por la vía NO/GMPc (Tsou et al., 1993). El hecho de que la PKG pueda
modular la actividad de proteínas fosfatasas a través de una proteína reguladora
plantea la posibilidad de que la vía NO /GMPc pueda inducir, no sólo la fosforilación
de proteínas, sino también modificar su defosforilación.

4.2. Activación cruzada de PKA/PKG

Dada la estrecha relación entre la PKG y la PKA, no es extraño que ambas enzimas
compartan la especificidad de ciertos sustratos. En ambos casos, los dos tipos de
proteínas quinasas transfieren un grupo fosfato desde el ATP a residuos de serina y
treonina de proteínas que presentan una secuencia del tipo RRXSX, siendo X
cualquier aminoácido. La homología existente entre los dominios funcionales de
ambas enzimas permite que la PKG pueda ser activada por AMPc, aunque con una
afinidad mucho menor que por el GMPc (Gill et al., 1976). La afinidad de la PKG
por el AMPc se incrementa por la autofosforilación de la enzima (Landgraf et al.,
1986). La concentración submáxima de AMPc que induce la autofosforilación de la
PKG está cercana a la concentración de éste nucleótido cíclico en mucho tejidos. Así,
por ejemplo, la elevación de los niveles de AMPc en el músculo liso conduce a una
relajación mediada probablemente por la activación cruzada de PKG (Francis &
Corbin, 1994b).

De la misma forma, la PKA puede ser activada por GMPc (Dills et al., 1976). La
existencia de esta comunicación entre las dos vías pone de manifiesto la complejidad
del estudio de los efectos de una de ellas, teniendo en cuenta que pueden afectarse
elementos de la otra ruta implicada.
 Introduccón 37

4.3. Proteínas de unión a GTP

La mayoría de las proteínas pertenecientes a esta familia juegan importantes papeles

en la señalización intracelular. Sin embargo, sólo las isoformas α de las Gi, sensibles
a toxina pertúsica son susceptibles de ser fosforiladas por PKG I. La Giα se ha
relacionado con canales iónicos y con la activación del proceso mitogénico que
alcanza el núcleo (Lepetre et al., 1994; Crouch & Simson, 1994). La fosforilación de
esta proteína por PKA impide la separación de la Giα de las subunidades βγ
(Imaizumi et al., 1991), pudiendo representar éste un mecanismo de acción para la
fosforilación de Giα.

Existen otras proteínas de esta familia que también son fosforiladas por PKG, las
Rap, pero se desconoce su función fisiológica.

5. EL GMPc Y LA SEÑALIZACIÓN CELULAR

Compuestos exógenos y endógenos, incluyendo hormonas, neurotransmisores y

toxinas, producen respuestas celulares a través de GMPc. Los mecanismos
bioquímicos mediadores de esas respuestas incluyen su síntesis por la familia de las
guanilato ciclasas, la unión y activación de enzimas efectoras (ej. PKG), y su
degradación por las fosfodiesterasas. La especificidad de las respuestas celulares a
GMPc viene determinada por dominios de unión de GMPc en las proteínas diana.
Existen dos tipos de sitios alostéricos para la unión de GMPc en las células
eucariotas. Uno de ellos aparece en las proteínas quinasas dependientes de GMPc y
AMPc, así como en los canales iónicos regulados por nucleótidos cíclicos, con gran
homología de secuencia entre sí, mientras que las fosfodiesterasas reguladas por
GMPc presentan el otro tipo de sitio alostérico. El resultado del incremento en los
niveles de GMPc viene determinado por el tipo y la combinación de las proteínas
diana y los sustratos, las enzimas encargadas de la metabolización del GMPc y su
localización y organización en compartimentos dentro de la célula.

Numerosos estudios han descrito que el GMPc induce la relajación, tanto del tejido
muscular liso, como de vías respiratorias e intestino (Murad et al., 1986; Katsuki et
al., 1977). La relajación del músculo liso fue una de las primeras funciones
fisiológicas directamente relacionada con la síntesis y acumulación del GMPc.

Los incrementos de GMPc en el músculo liso se han relacionado con la activación de

proteínas quinasas y la consecuente fosforilación de numerosas proteínas musculares.
El GMPc puede disminuir la actividad de la fosfolipasa C en preparaciones
vasculares y cultivos de células de músculo liso y, por tanto, disminuirá la formación
de inositol fosfatos, efecto mediado por la activación de PKG (Rapoport et al., 1986;
Hirata et al., 1990). Estos eventos bioquímicos pueden disminuir la concentración de
calcio libre en el citosol, dando lugar a una fosforilación de cadenas de miosina
38 Introducción

disminuida, y en consecuencia a una relajación. Otros efectos interesantes regulados

por el GMPc en el músculo liso serían el transporte de Ca2+ y/u otros cationes a
través de la membrana y la regulación de la actividad de proteínas fosfatasas.

Otros efectos del GMPc incluyen la fototrasducción en la retina, secreción intestinal

inducida por enterotoxinas, inhibición de agregación y adhesión plaquetaria y efectos
inducidos por péptidos natriuréticos en tejidos como el hígado, vasos sanguíneos y el
cerebro, muchos de los cuales están mediados por la actividad de PKG, como se verá
más adelante (Waldman & Murad, 1987).

5.1. Fosfodiesterasas reguladas por GMPc

La caracterización de los perfiles bioquímicos, farmacológicos y estructurales han

identificado al menos 10 familias diferentes de PDEs en mamíferos. Cada miembro
de estas familias contiene un dominio catalítico conservado de unos 270 aa en el
extremo C-terminal. Este dominio rompe el enlace fosfodiester, hidrolizando el
nucleótido cíclico a su correspondiente nucleótido 5´-monofosfato (McAllister-Lucas
et al., 1995). Todas las enzimas PDEs contienen dominios reguladores heterogéneos
y funcionan como dímeros, aunque el significado funcional de este último permanece
desconocido.

Las familias de PDEs 1, 2, 3 y 10 hidrolizan tanto GMPc como AMPc, mientras que
las familias 5, 6 y 9 hidrolizan específicamente GMPc. La actividad de las PDEs es
crucial para la señalización celular, dado que regulan las concentraciones celulares
de los nucleótidos cíclicos, afectando así las subsequentes respuestas celulares. Las
PDEs regulan las funciones cardiacas, esteroidogénesis adrenal, respuesta eréctil
masculina y fototrasducción (Juilfs et al., 1999). Estas enzimas se localizan en sitios
específicos dentro de la célula, próximas a determinadas proteínas, modulando los
niveles de nucleótidos en compartimentos específicos.

El GMPc regula la actividad de PDEs mediante tres mecanismos diferentes: a)

incrementando la actividad a través de una acción de masa; b) alterando la tasa de
hidrólisis de AMPc por competición con el sitio catalítico; y c) regulando la
actividad enzimática por interacción directa con sitios alostéricos específicos (Turko
et al., 1999).

La presencia de sitios alostéricos no catalíticos permite al GMPc regular la actividad

de PDEs en diversas formas. El dominio de unión a GMPc en las PDEs 2, 5, 6 y 10
contiene dos sitios homólogos en tandem de unos 110 aminoácidos localizados en el
extremo N-terminal. Contienen una secuencia de aminoácidos diferente de las
quinasas dependientes de nucleótidos cíclicos y canales activados por éstos,
representando un tipo diferente de proteínas reguladas por el GMPc. PDE10 cataliza
la hidrólisis de ambos nucleótidos cíclicos, pero su función fisiológica no esta aún
bien definida. PDE2 está ampliamente distribuida y es muy abundante en células
adrenales bovinas, existiendo como homodímeros de subunidades de entre 100-150
 Introduccón 39

kDa y catalizando la hidrólisis del GMPc y AMPc. El GMPc se une a los sitios
alostéricos, estimula la actividad PDE2 e incrementa la hidrólisis del GMPc
formando un mecanismo de retroinhibición que regula los niveles intracelulares de
GMPc. Igualmente, el GMPc aumenta la degradación del AMPc mediada por PDE2,
regulando de forma cruzada su concentración intracelular (McAllister-Lucas et al.,
1993).

La PDE3 se caracteriza por ser inhibida por GMPc, provocando una menor
degradación del AMPc, sustrato de esta enzima. De hecho, algunos efectos del
GMPc se basan en un incremento de los niveles de AMPc, que conduce finalmente a
una activación de PKA

Las propiedades específicas de las fosfodiesterasas de GMPc o de tipo 5 son que

hidrolizan específicamente este nucleótido y que unen el GMPc a un sitio alostérico.
Existen al menos cuatro tipos de fosfodiesterasas de tipo 5 expresadas en tejidos de
vertebrados, tres de los cuales se expresan exclusivamente en células fotorreceptoras
(Beavo & Reifsnyder, 1990). El cuarto isoenzima parece estar más ampliamente
distribuido en el sistema cardiovascular.

Los sitios de unión alostéricos de la PDE 5 son homólogos a los del tipo 2, pero no a
los de la familia de proteínas quinasas, pudiendo estar derivados del sitio catalítico
(Charbonneau et al., 1990; Shabb & Corbin, 1992). Una propiedad interesante del
sitio alostérico es que la unión del GMPc es estimulada varias veces por inhibidores
competitivos del sitio catalítico (Francis et al., 1980).

El hecho de que las PDEs tipo 5 unan GMPc a un sitio alostérico no-catalítico
sugiere que estas enzimas también funcionan como proteínas receptoras de GMPc.
Estudios realizados con la enzima purificada han demostrado que al retirar el
extremo amino terminal, que contiene el sitio de unión alostérico, resulta en una
activación de la enzima (Thomas et al., 1990a; b). Este hecho sugiere que el dominio
amino terminal puede servir como regulador de la actividad catalítica. Así, la unión
del GMPc desinhibiría la actividad catalítica de la misma forma que ocurre en la
proteína quinasa dependiente de GMPc. Francis y Corbin han propuesto que el papel
de este sitio de unión es permitir que la enzima sea fosforilada por PKG en el N-
terminal de la molécula. La fosforilación podría alterar la asociación con otras
proteínas o subunidades de la PDE, inhibiendo la hidrólisis de GMPc, o provocar la
traslocación de la enzima a un compartimento diferente de la célula.

5.2. Canales iónicos activados por nucleótidos cíclicos

Otro mecanismo desencadenado por la elevación de los niveles de nucleótidos

cíclicos en el interior celular, es la modulación de corrientes iónicas a través de
canales. Los canales activados por GMPc se expresan en diferentes tipos de células.
Estos canales presentan seis dominios transmembrana, incluyendo un poro de
conducción de iones entre los dominios 5 y 6. Además, presentan en el citoplasma
40 Introducción

dos dominios reguladores interactivos, formados por los extremos C y N terminales

de la proteína.

Los canales de respuesta específica para un determinado nucleótido cíclico presentan

un dominio en el extremo C-terminal de unión al nucleótido, homólogo al de las
proteínas quinasas activadas por estos mismos ligandos (Biel et al., 1999a),
residiendo la sensibilidad selectiva para los nucleótidos en las ocho láminas β y las
tres hélices α del C-terminal, al igual que en las PKAs y PKGs. Por lo tanto, aunque
todos estos canales activados por nucleótidos cíclicos reconocen tanto al AMPc
como al GMPc, ciertas isoformas son más sensibles a uno de ellos en particular.
Características estructurales específicas de la región del poro confieren a estos
canales una selectividad en su permeabilidad iónica. Aunque todos los canales de
esta familia conducen iones monovalentes, son más permeables en condiciones
fisiológicas a Ca2+ que a Na+. Además, el Ca2+ es capaz de bloquear la actividad de
los canales interaccionando directamente con sitios de unión de alta afinidad e
indirectamente activando otras proteínas como la calmodulina.

La principal familia de canales modulados por nucleótidos cíclicos regulan el flujo

de iones Ca2+ y Na+ en la células, y se compone de proteínas heterotetraméricas
formadas por el ensamblaje de subunidades α y β, que se abren directamente por
nucleótidos cíclicos. Sólo las subunidades α constituyen canales monoméricos
funcionales cuando se expresan en sistemas heterólogos (Biel et al., 1999a). Al
contrario de los canales sensibles a hiperpolarización, este subtipo de proteínas
presenta muy baja sensibilidad a voltaje.

Se han descrito tres tipos de subunidades tipo α homólogas en células fotorreceptoras

(conos y bastones), neuronas olfatorias, pancreas, hígado, testículos, ovarios, riñones,
pulmón, cerebro, corazón, glándulas adrenales e intestino (McCoy et al., 1995). Las
subunidades tipo 3 se han encontrado en papilas gustativas de rata, pudiendo
representar moléculas cruciales en los órganos sensoriales (Misaka et al., 1997). Sólo
se han identificado dos subunidades de tipo β, productos de un procesamiento de
“corte-empalme” (Biel et al., 1999a).

Dentro de esta familia de canales iónicos, existe un tipo que es activado tanto por
unión directa de nucleótidos cíclicos al canal o por hiperpolarización de la membrana
plasmática (Ludwig et al., 1998;1999). Hasta el momento se han caracterizado hasta
cuatro subtipos a partir de cerebro de ratón (McCoy et al., 1995). Estos canales
poseen una característica estructural única en la región que forma el poro y en el
cuarto dominio transmembrana, que le confieren una selectividad en cuanto a la
permeabilidad de iones y una sensibilidad a voltaje respectivamente.

Se ha sugerido que las subunidades β actúan como reguladores internos de la

actividad de estos canales, confiriéndoles propiedades específicas tales como la
afinidad por AMPc (Biel et al., 1999a). Otras regiones moduladoras de estos canales
 Introduccón 41

incluyen el segmento N-terminal y el péptido de unión entre el 6º dominio

transmembrana y el dominio citoplasmático de unión al nucleótido, que determina la
afinidad del agonista y la apertura del canal, constituyendo la base de la trasducción
visual en los fotorreceptores y la regulación de la percepción olfatoria por AMPc
(Biel et al., 1999a).

El GMPc media la fototrasducción en células fotorreceptoras, conos y bastones, y

regula la neurotransmisión en la retina. De hecho, los fotorreceptores representan el
principal tipo celular que posee efectos GMPc/canales activados por nucleótidos
cíclicos, planteándose la hipótesis de que la mutación selectiva del gen que codifica
para uno de estos tipos de canales, sea la responsable de la falta de sensibilidad al
color en humanos (Biel et al., 1999b).

Tanto el NO como el GMPc también incrementan la liberación de neurotransmisores

en el hipocampo a través de los canales activados por nucleótidos, donde se les ha
implicado en la mediación de LTP en la transmisión sináptica (Meffert et al.,1994;
Arancio et al., 1995).

6. APOPTOSIS

El proceso apoptótico se considera actualmente como un hecho normal que forma

parte del desarrollo del sistema nervioso, pudiendo jugar un importante papel en las
patologías neurodegenerativas y el envejecimiento. Las evidencias de que se dispone
en la actualidad indican que la supervivencia de las neuronas y su muerte son
procesos altamente regulados, y dependen de un número de factores internos y
externos con consecuencias vitales para el buen funcionamiento del organismo.

Kerr et al. (1972) describieron dos tipos de muerte celular, distinguiendo entre
“necrosis”, que está causada por un daño y provoca inflamación del tejido, y la otra
denominada “apoptosis”, que aparece de forma normal durante el desarrollo. Estos
autores describieron los cambios morfológicos que tienen lugar en el proceso de
muerte celular, tales como el encogimiento de la célula, permeabilización de la
membrana, condensación de la cromatina y fragmentación del ADN. Estos cambios
contrastan con los acaecidos cuando la muerte celular está causada por sustancias
tóxicas, trauma e isquemia, donde las células y sus orgánulos tienden a hincharse
llegando a romperse por el proceso conocido como necrosis. A partir de estos
descubrimientos, se postuló que las células tienen la capacidad de autodestruirse por
activación de un programa suicida intrínseco de la célula cuando no son ya
necesarias o han sufrido un daño importante. Este relevante proceso fisiológico se
describió como apoptosis. Los cambios morfológicos que se desarrollan en la
necrosis y apoptosis están bien definidos en diferentes sistemas celulares (Tabla 2).
42 Introducción

Tabla I.2. Características de los procesos de muerte celular

Necrosis Apoptosis
Pérdida de homeostasis celular Sin modificaciones aparentes
Alteración de la permeabilidad de la membrana Sin cambios iniciales en la permeabilidad de la
(pérdida de K+, entrada de Na+; caída del membrana
potencial de membrana)
Expansión de los compartimentos Condensación del citosol
citoplásmicos
Destrucción de la mitocondria y otros Orgánulos intactos; formación de cuerpos
orgánulos apoptóticos a partir de la superficie celular
Depleción de ATP Sin pérdida de energía
Disminución de la síntesis de macromoléculas Activación de la síntesis de macromoléculas
Afección de las células colindantes Afección de células individuales
Agregados de cromatina poco compactos Aparición de agregados de cromatina
altamente condensados
Atrofia pasiva Degeneración activa

El reconocimiento de la apoptosis como un proceso fisiológico normal se debe a

estudios genéticos llevados a cabo en nematodos. Se ha identificado un conjunto de
genes llamado ced, necesarios para que el procesamiento de la célula muerta se lleve
a cabo de una manera efectiva, mientras que otro miembro de esta familia, el ced-3,
es esencial para que se produzca la apoptosis (Ellis et al., 1991; Yuan et al., 1993).
La ced-3 codifica para una cisteína-proteasa, homóloga a la enzima convertidora de
interleukina-1β (ΙCΕ). Hasta el momento, se han identificado al menos 11 miembros
de la familia CED/ICE de proteasas implicadas en la apoptosis (Chinnaiyan & Dixit,
1996; Kuida et al., 1996). Estas enzimas, denominadas caspasas, son cistein-
proteasas que rompen ciertas proteínas tras residuos específicos de ácido aspártico,
se encuentran como zimógenos, y son activadas por auto-degradación (Thornberry &
Lazebnik, 1998); se activan unas a otras constituyendo una cascada proteolítica que
desemboca en la muerte de la célula (Nagata, 1997).

Estudios anteriores han mostrado que una de las características identificativas del
proceso apoptótico es la ruptura del ADN en las regiones internucleosomales,
resultando la formación de una escalera de ADN constituida por fragmentos de 180-
200 pares de bases o múltiplos de éstos en una electroforesis en gel de agarosa
(McConkey et al., 1988; Compton, 1992). La causa de esta fragmentación en forma
de escalera se ha atribuido a la activación de endonucleasas por Ca2+/Mg2+
(Kyprianou et al., 1988), ADNasa I (Arends et al., 1990; Peitsch et al., 1993), o
ADNasa II (Barry & Eastmann, 1993). Sin embargo, cada vez aparece con más
fuerza la idea de que las características morfológicas de la apoptosis no siempre están
asociadas a la fragmentación del ADN (Cohen et al., 1992), y que este proceso
 Introduccón 43

también puede aparecer en células necróticas (Collins et al., 1992), haciéndose

necesario un estudio morfológico simultáneo para identificar las células apoptóticas.

Se han utilizado muchos parámetros para examinar la muerte celular. Éstos incluyen
las pruebas de exclusión de colorantes para comprobar la integridad de la membrana,
microscopía de contraste de fase para estudiar diversas características descritas
anteriormente, y el patrón de fragmentación de ADN.

Es importante puntualizar que la inhibición de la síntesis de proteínas y nucleasas

previenen las características descritas para la apoptosis, conociéndose en la
actualidad que tras la inducción de apoptosis es necesaria la síntesis de
macromoléculas para desencadenar los procesos propuestos.

La aparición de procesos apoptóticos en el sistema nervioso central, parece estar

implicado en mecanismos de adaptación durante el desarrollo del sistema nervioso
(Oppenheim, 1991). La explicación general para este fenómeno es que la
supervivencia de las neuronas en el desarrollo de vertebrados depende de factores
neurotróficos específicos secretados por células de los tejidos que inervan las
neuronas.

6.1 Caspasas

Se han descrito 10 tipos de estas enzimas con afinidades para diferentes sustratos.
Esta familia de proteasas comparte con otras enzimas de este tipo la necesidad de
sufrir una proteolísis limitada para su activación. Para las caspasas, ésta resulta de la
ruptura en un segmento interdominio para dar una enzima heterodimérica,
conteniendo ambas cadenas componentes esenciales de la maquinaria catalítica. A
veces se libera un péptido N-terminal que no es necesario para esta actividad
enzimática. El papel de este péptido sólo se conoce en el caso de las caspasas 1 y 8,
donde se comporta como un dominio de interacción que modula la actividad. La
estructura tridimensional de las caspasas 1 y 3 revela dos heterodímeros que
interactúan vía las cadenas cortas, dando lugar a moléculas con dos sitios activos.
Presentan un bolsillo de reconocimiento (S1) adaptado para aceptar un residuo Asp
del sustrato. Otros bolsillos (S2-S4) confieren a las distintas caspasas la especificidad
por el sustrato.

Las caspasas no son las únicas enzimas que participan en la apoptosis, ya que
también las nucleasas y proteínas quinasas pueden estar implicadas, pero son
absolutamente necesarias para producir los bien definidos eventos que caracterizan
este tipo de muerte celular.

Las caspasas implicadas en apoptosis se dividen en iniciadoras y ejecutoras, aunque

el orden en que se produce la activación de estas enzimas no siempre es igual en
diferentes procesos apoptóticos. En la figura se propone la secuencia de activación de
las caspasas para inducir apoptosis.
44 Introducción

Esquema I.15. Cascada de activación de caspasas. Tomado de Wallach,

1997; Ellis et al., 1991; Martins et al., 1997.

6.2. Inducción de apoptosis

Existe una amplia variedad de compuestos que inducen apoptosis en el SNC. Entre
ellos, podemos destacar cómo la desaparición del factor neurotrófico NGF (del inglés
“nerve growth factor”) del medio celular da lugar a la aparición de apoptosis en
neuronas simpáticas, sensoriales y motoneuronas; lo mismo ocurre al retirar el suero
o la insulina en determinados tejidos neurales. Por el contrario, algunos de los
llamados factores neurotróficos inducen apoptosis al entrar en contacto con algunos
tipos de neuronas (Yokoyama et al., 1997).

La disminución de la concentración de K+ en el medio de cultivo resulta en apoptosis

de neuronas cerebelares (Enokido et al., 1997; Shimoke et al., 1998). De la misma
 Introduccón 45

forma, un incremento en los niveles de Ca2+ citosólico también induce la muerte

neuronal (Wei et al., 1998). Algunos compuestos moduladores de la fosforilación de
proteínas, como el ácido okadaico, son capaces de producir apoptosis; agentes que
provocan daños en el ADN celular, aminoácidos excitatorios como el glutamato y el
ácido kaínico, la dopamina, algunos péptidos, el estrés oxidativo, lípidos como las
ceramidas y el ácido retinoico, irradiación, sustancias neurotóxicas , e incluso el NO,
son agentes causantes de la muerte por apoptosis (ver rev. Sastry et al., 2000).

En cuanto a este papel del NO en la inducción de apoptosis, actualmente se ha

aceptado una doble acción de éste radical sobre el proceso.

6.2.a. El NO como inductor de apoptosis

La citotoxicidad mediada por NO ha sido largamente discutida en la literatura,

describiéndose algunos tipos celulares que desarrollan un proceso apoptótico en
respuesta a NO, como los macrófagos, islotes pancreáticos, neuronas y timocitos
(Brune et al., 1998; Kim et al., 1999). Se ha encontrado que la activación de las
caspasas y la fragmentación del ADN está asociada con los procesos apoptóticos
desencadenados por NO. La participación del NO en la apoptosis inducida por estrés
oxidativo puede deberse a que el NO reacciona con los aniones superóxido formados
en estas condiciones fisiológicas, formando peroxinitritos, que constituyen un
potente oxidante que induce citotoxicidad, así como apoptosis en muchos tipos
celulares (Li & Billiar, 1999).

La sensibilidad a la toxicidad inducida por NO varía de forma muy significativa en

diferentes tipos de células. Por ejemplo, concentraciones por debajo del milimolar de
donadores de NO inducen una rápida muerte de macrófagos, mientras que no tienen
efecto alguno sobre hepatocitos (Li & Billiar, 1999). Aunque los factores
determinantes de la sensibilidad al NO no están bien definidos, la generación
simultanea de especies reactivas de oxígeno, así como la supresión de mecanismos
celulares antioxidantes, podrían modular esta sensibilidad. El daño causado por el
NO sobre el ADN por desaminación, oxidación y/o ruptura de las cadenas, es otro
factor que contribuye al desencadenamiento de apoptosis. La activación de la vía de
las caspasas y la fragmentación del ADN han sido asociadas con este tipo de
apoptosis.

6.2.b. El NO como supresor de la apoptosis

Estudios recientes demuestran como el NO funciona como un potente agente

antiapoptótico en linfocitos B, eosinófilos, folículos ováricos, células endoteliales y
hepatocitos (Kim et al., 1999; Li et al., 1999). En general, la cantidad de NO
necesaria para producir sus efectos antiapoptóticos es mucho menor que la necesaria
para inducir apoptosis. Las acciones antiapoptóticas del NO se han comprobado in
vivo en el hígado (Saavedra et al., 1997; Ou et al., 1997; Rai et al., 1998).
46 Introducción

Los mecanismos por los cuales el NO previene de la apoptosis parecen ser múltiples.
Por un lado, induce la expresión de proteínas citoprotectoras, como la hemo
oxigenasa-1 y Bcl2 (Kim et al., 1995; Suschek et al., 1999). Por otra parte, se ha
demostrado como el NO inactiva de forma reversible a las distintas caspasas vía
nitrosilación del residuo conservado de cisteína del dominio catalítico (Li et al.,
1997; Mannik et al., 1999). De hecho, la nitrosilación ha sido propuesta como un
mecanismo para limitar la activación de las caspasas (Rossig et al., 1999). Además
de este efecto de inhibición directa de las caspasas, el NO también previene el
procesamiento proteolítico de las procaspasas, impidiendo su activación (Li et al.,
1999).

6.2.c. Implicación de la vía del GMPc

Como ya se ha detallado en los capítulos anteriores, numerosos efectos del NO están

mediados por GMPc, sin embargo, la implicación de éste nucleótido cíclico en el
proceso de la apoptosis no es un hecho consensuado. Por una parte, varios estudios
han demostrado que el NO induce apoptosis vía GMPc (Shimojo et al., 1999; Loweth
et al., 1997; Suenobu et al., 1999), mientras que en otros trabajos realizados en
linfocitos B, eosinófilos, neuronas y folículos ováricos, se ha visto que la prevención
de la apoptosis está mediada por GMPc (Kim et al., 1999). Aunque la PKG parece
ser el sistema efector del proceso antiapoptótico, también podría estar implicada la
PKA.

7. MODELOS CELULARES

7.1 Células cromafines de médula adrenal

Las células cromafines son responsables de la síntesis, almacenamiento y liberación

de adrenalina y noradrenalina al torrente sanguíneo durante la estimulación del
sistema nervioso simpático. Esta característica justifica que sean estudiadas como
modelo neuroendocrino, así como desde el punto de vista de la Neurociencia, dadas
las importantes similitudes que presentan respecto a las neuronas adrenérgicas.

A principios de siglo se describió que la glándula adrenal estaba inervada por

terminales nerviosos colinérgicos y que es la acetilcolina liberada por estos nervios la
que constituye el estímulo primario para la liberación de catecolaminas por las
células cromafines (Feldberg et al., 1934). La acetilcolina se une a receptores
nicotínicos y produce una despolarización de la membrana plasmática, apertura de
canales de Ca2+ dependientes de voltaje, entrada de Ca2+ y estimulación de la
secreción (Douglas et al., 1967a;b).

La médula adrenal constituye la parte interna de la glándula adrenal, y es responsable

de la respuesta simpática de liberación de adrenalina y noradrenalina. El origen
 Introduccón 47

embrionario de las células cromafines de la médula adrenal es particularmente

importante, dado que sus células progenitoras migran durante el desarrollo desde la
cresta neural del ectodermo hasta la parte interna de la glándula adrenal en
desarrollo. La cresta neural constituye un grupo de células de desarrollo transitorio,
que surgen de la región dorsal del tubo neural y que rápidamente migran y se
dispersan en diferentes rutas, para dar lugar a los nervios simpáticos
postganglionares o a las células cromafines de la médula adrenal, así como a células
de Schwann y melanocitos. Los factores humorales que estas células encuentren
durante su migración, determinan el destino final de su fenotipo. Así, los
glucocorticoides producidos por el otro tipo celular que forma la glándula adrenal, la
corteza, originan dos efectos vitales para la diferenciación de los precursores hasta
células cromafines. Por un lado, previenen la diferenciación de las células cromafines
a neuronas simpáticas postganglionares, y por otro, inducen la expresión en un alto
porcentaje de las células de la enzima responsable de la transformación de
noradrenalina en adrenalina, la feniletanolamina-N-metil transferasa (PNMT)
(Unsicker, 1993).

Una de las similitudes existentes entre las células cromafines y las neuronas
postganglionares, consecuencia de su origen embriológico común, es que, tras la
diferenciación celular, pierden la capacidad de multiplicarse (Tischler et al., 1993).

La médula adrenal forma parte del sistema nervioso simpático, en el que las células
postganglionares no emiten axones hacia los órganos diana, sino que vierten las
neurohormonas al torrente sanguíneo.

Durante el periodo final del desarrollo embrionario, terminales nerviosos de neuronas

preganglionares alcanzan la médula y establecen contactos sinápticos con las células
cromafines. La mayoría de estas fibras preganglionares entran en la glándula por el
nervio esplácnico torácico superior. Estudios anatómicos han descrito como cada
neurona preganglionar debe controlar al menos 750 células cromafines en lo que se
ha venido a llamar “unidad secretora” (Marley & Prout, 1965; Tomlinson &
Coupland, 1990).

Los nervios simpáticos y la médula adrenal se complementan, e incluso pueden

llegar a sustituirse mutuamente en cuanto a su función fisiológica de estimulación.
Sólo una pequeña proporción de células del organismo está inervada por fibras
simpáticas, por lo que la liberación de adrenalina y noradrenalina a partir de la
médula adrenal permite una estimulación indirecta de estas células no inervadas
directamente (Guyton, 1988).

La médula adrenal está formada, además de las células cromafines, por células
ganglionares, células de soporte (de Schwann para fibras nerviosas y las llamadas
sustentaculares rodeando a las células cromafines), así como fibroblastos, mastocitos,
48 Introducción

linfocitos y las células endoteliales de los vasos (Coupland, 1865; Kobayashi &
Coupland, 1993).

Las células cromafines tienen apariencia poligonal, presentando el núcleo desplazado

hacia un polo de la célula, mientras que el polo opuesto contiene la mayor parte de
unas vesículas especializadas en almacenar las catecolaminas, los gránulos
cromafines. Aunque suelen ser muy homogéneas en cuanto a su morfología, existen
dos tipos bien diferenciados de células, según presenten o no la enzima PNMT,
hecho que determinará que las células transformen la noradrenalina en adrenalina.
Así, se distinguen células adrenérgicas y noradrenérgicas, según produzcan,
almacenen y secreten uno u otro compuesto (Eränko, 1952; 1955). Se ha descrito un
control neural diferente para las células adrenérgicas y noradrenérgicas (Folkow &
von Euler, 1954). Además, fisiológicamente diferentes estímulos promueven una
secreción diferencial de adrenalina y noradrenalina, ya que las células de uno u otro
tipo presentan diferentes receptores para sustancias que estimulan la médula por vía
sanguínea (Núñez et al., 1995; Vollmer,1996).

Una célula cromafín puede contener hasta 30.000 gránulos, cuya composición
química incluye, además de catecolaminas en una concentración de hasta 0,6 M,
ADP, proteínas, péptidos, lípidos, calcio, y ATP en una concentración 0,15 M
(Winkler, 1976; Miras-Portugal et al, 1994). La concentración extraordinariamente
alta de catecolaminas que se acumulan en el interior de los gránulos cromafines es
consecuencia de una síntesis muy efectiva en estas células. La síntesis de
catecolaminas constituye una compleja secuencia de reacciones químicas catalizadas
por diferentes enzimas, que culmina en la producción de adrenalina y noradrenalina
partiendo del aminoácido tirosina. La regulación de esta compleja secuencia de
reacciones enzimáticas recae en la primera de las enzimas de la ruta, la tirosina
hidroxilasa.

El potencial de membrana de las células cromafines en reposo se ha estimado que es

de 50 mV (Artalejo, 1995; Calvo et al, 1995). Como las neuronas, este potencial de
membrana es una consecuencia directa de la acción electrogénica de la ATPasa de
Na+/K+, que acumula K+ en el interior de la célula a la vez que excluye Na+, así como
de un flujo de K+ a través de canales abiertos en reposo.

Las células cromafines son eléctricamente excitables, mostrando potenciales de

acción con características similares a los descritos en axones neuronales (Biales et
al., 1976; Brandt et al, 1976). La despolarización de las células se produce cuando la
acetilcolina liberada por las neuronas preganglionares interacciona con receptores
nicotínicos de membranas de las células cromafines. Las aproximaciones
experimentales se realizan mediante despolarización con alto K+ o con veratridina,
suponiendo la participación en mayor o menor media de diferentes canales iónicos de
la membrana.
 Introduccón 49

Como resultado de los estudios de “patch-clamp”, se han descrito en células

cromafines hasta 15 canales iónicos diferentes, que contribuyen a las propiedades
eléctricas de las células tanto en reposo como tras la estimulación con diferentes
secretagogos (Artalejo, 1995).

Los receptores de acetilcolina o receptores colinérgicos se clasifican en nicotínicos y

muscarínicos, siendo los primeros de tipo ionotrópico, responsables de respuestas
sinápticas rápidas, y metabotrópicos los segundos, pasando su acción biológica por
una ruta de señalización intracelular (Nicholls et al, 1994). El receptor de tipo
nicotínico es un pentámero compuesto por cuatro subunidades diferentes, que
conforman un cilindro alrededor de un poro central hidrofóbico, cuya apertura se
activa por unión del ligando a la subunidad α. Existen distintas formas de las
subunidades α y β, hecho que determina el diferente comportamiento de los
receptores nicotínicos de tipo muscular y neuronal. A este último tipo pertenecen los
receptores nicotínicos presentes en las células cromafines (Criado et al., 1992). Estos
canales activados por acetilcolina son capaces de permear tanto iones Na+ como Ca2+
(Nooney et al., 1992), y se desensibilizan en presencia sostenida del agonista
(Callewaert et al., 1991), existiendo péptidos que modulan negativamente las
corrientes nicotínicas mediante un incremento en la velocidad de desensibilización
(Artalejo, 1995).

Entre los canales iónicos encontrados en células cromafines podemos destacar los
canales de Na+ activados por voltaje. Estos canales amplifican la despolarización
iniciada por la activación del receptor nicotínico cuando la estimulación se realiza
con dosis bajas de acetilcolina, mientras que a dosis altas del ligando se activan
canales de Ca2+ y se inactivan los de Na+ (Kidokoro & Ritchie, 1980).

Los canales de Ca2+ dependientes de voltaje representan el modo más eficaz de

estimular la entrada de calcio, iniciando así la secrección de catecolaminas en las
células cromafines. Diversos estudios han descrito en las células cromafines bovinas
al menos cuatro tipos de canales de Ca2+ voltaje-dependientes: L ,N, P y Q,
caracterizando a cada uno de ellos por el bloqueo de la corriente de calcio con
diferentes drogas ó toxinas (revisiones Spedding & Paoletti, 1992; Dunlap et al.,
1995). Todos estos canales pertenecen al grupo denominado “canales activados por
alto voltaje”, caracterizándose por experimentar en mayor o menor medida todos
ellos una inactivación por despolarización sostenida (Artalejo, 1995).

Un tercer tipo de canales iónicos, los de K+ activados por voltaje, participan en la

regulación del potencial de membrana en reposo y en potenciales de acción,
controlando la excitabilidad de las células. En células cromafines se han identificado
varios de estos canales, algunos de los cuales están implicados en la repolarización
de la membrana y otros en la hiperpolarización de la misma.
50 Introducción

Los distintos canales iónicos descritos participan en la despolarización inducida por

estímulos de secrección. Los estímulos secretores, como la acetilcolina, producen
una despolarización de la membrana celular que se traducen en un incremento en la
[Ca2+]i, conduciendo finalmente a la exocitosis del contenido de los gránulos
cromafines.

La acción biológica de células como las neuronas, células neurosecretoras y

endocrinas, precisa de la exocitosis de vesículas especializadas en respuesta a
estímulos específicos, lo que se conoce como exocitosis regulada, y que se
caracteriza por requerir el incremeto en [Ca2+]i. Este proceso utiliza esencialmente el
mismo mecanismo que la secrección constitutiva, pero con componentes reguladores
adicionales (Burgoyne & Morgan, 1993).

La exocitosis de células neuroendocrinas como las cromafines se produce en una

escala de tiempo de 50ms-1s, de forma mucho más lenta que la liberación de
neurotransmisores.

7.1.a. Rutas de 2º mensajeros

Se han descrito en las células cromafines receptores para un gran número de agentes
hormonales como la histamina, el ATP, adenosina, GABA, péptidos, endotelina,
dopamina, etc... (revisión de Burgoyne, 1991). La interacción de estas sustancias con
sus receptores a nivel de la membrana plasmática de las células, produce una
modulación de la respuesta secretora a través de distintas rutas de 2º mensajeros.

Las proteínas G están implicadas en la transducción de señales biológicas desde los

receptores a nivel de membrana, hasta enzimas efectoras a nivel intracelular o
canales iónicos (revisión Nicholls, 1994). Dentro de las células cromafines, las
proteínas G están implicadas en la autoinhibición de la secreción por los productos
secretados (Albillos et al, 1996; Currie & Fox, 1996) y en la activación de canales
catiónicos en células cromafines de algunas especies, contribuyendo a la
despolarización de la membrana plasmática (Inoue & Imanaga, 1995).

El calcio, además de su efecto en la secreción, activa rutas de señalización

intracelular como las señales mediadas por PKC y por la calmodulina, proteína
ligante de Ca2+ (Burgoyne, 1991). Respecto a esta última, ya se ha descrito su
capacidad de activación de las enzimas NOS. También es importante mencionar la
activación de proteínas quinasas dependientes de Ca2+/calmodulina, que a su vez
están implicadas en procesos como la fosforilación de la enzima TH, regulando la
síntesis de catecolaminas.

Otro efecto mediado por la Ca2+/calmodulina es la activación de una adenilato

ciclasa sensible a este complejo, identificada en células cromafines (LeDonne &
Coffee, 1980; Anderson et al., 1992). Los incrementos de los niveles de AMPc
inducen una fosforilación de sustratos protéicos por PKA, que también fosforila a la
 Introduccón 51

enzima TH (Haycock, 1993). Respecto a los efectos del AMPc sobre la respuesta
secretora, se han descrito efectos contrapuestos, por un lado inhibitorios según lo
descrito en los trabajos de Morita et al. (Morita et al., 1991), y por otro
estimulatorios, describiéndose un efecto facilitador por el grupo de Artalejo et al.
(Artalejo et al., 1994).

En cuanto al GMPc, Aunis et al. describieron en 1978 la existencia de una ruta de 2º

mensajeros en las células cromafines basada en el GMPc. Este grupo detectó una
actividad enzimática tanto en fracciones solubles como particuladas de la médula
adrenal bovina (Aunis et al., 1978). Otros autores describieron posteriormente como
algunos secretagogos, entre ellos la acetilcolina (Nakaki et al., 1988) y el óxido
nítrico gas (Dohi et al., 1983), eran capaces de incrementar los niveles de GMPc
intracelular.

Los péptidos natriuréticos, descritos como ligandos de las guanilato ciclasas de

membrana, son sintetizados, almacenados y liberados a partir de las células
cromafines (Okazaki et al., 1989; Niina et al., 1996).

En cuanto a los elementos de la vía NO/GMPc objeto de este estudio, se ha descrito

la producción endógena de NO en preparaciones citosólicas de la glándula adrenal
bovina, siendo éste capaz de activar a la GCs presente en la preparación (Palacios et
al., 1989). Se ha identificado la presencia tanto de la enzima NOS tipo I como de la
PKG I en las células cromafines (Rodriguez-Pascual et al., 1996).

7.2. Células endoteliales

Otra fracción de las células que conforman la médula adrenal son las endoteliales,
que constituyen las paredes de los vasos sanguíneos de la médula adrenal, incluidas
dentro de lo que se conoce como microvasculatura. La elevada vascularización de la
médula adrenal proporciona una vía rápida de salida hacia la circulación general o
sistémica del cocktail hormonal secretado por la glándula (Coupland & Selby, 1976).
Las células endoteliales disponen de un sistema de transporte de catecolaminas
(Banerjee et al., 1985).

Actualmente, es bien conocido que las células endoteliales son capaces de generar
una respuesta ante estímulos con propiedades vasoactivas, respondiendo mediante la
generación de incrementos en la [Ca2+]i (Weintraub et al., 1992), lo que conlleva la
producción y liberación de diferentes sustancias paracrinas con capacidad para
relajar o para contraer las células de la musculatura lisa vascular (Newby &
Henderson, 1990; Graier et al., 1994). Entre los factores liberados por las células
endoteliales con actividad relajante destaca el óxido nítrico (Kelm et al., 1988;
Rosenblum, 1992). En cuanto a las sustancias con actividad vasoconstrictora, las
células endoteliales liberan las llamadas endotelinas, una familia de péptidos que
incrementan la [Ca2+]i lo que resulta en una potente vasoconstricción (Yanagisawa et
al., 1988; Furchgott & Vanhoutte, 1989). Además de las acciones vasomotoras, los
52 Introducción

factores liberados por las células endoteliales pueden interaccionar con las células
cromafines vecinas y modular la secreción de catecolaminas (Ohara-Imaizumi &
Kumakura, 1991; Torres et al., 1994; Rodríguez-Pascual et al., 1996).
 Materiales y métodos 53

1.MATERIALES
Productos
Los materiales utilizados en este trabajo de investigación fueron de las siguientes
casas comerciales.
Los plásticos de cultivo utilizados fueron: botellas de 75 cm2 de FALCON,
multiplacas de 24 pocillos (2 cm2/pocillo) y de 6 pocillos (5.5 cm2/pocillo) de
COSTAR
Como anticuerpos se han utilizado:
Primarios:
-anti-GCs subunidad α y ß, anticuerpos policlonales de conejo generados frente a las
subunidades α (GCpep8) y β (GCpep3) de GCS en el laboratorio de la Dra. Doris
Koesling del Departamento de Farmacología de la Universidad Libre de Berlín
(Alemania) de acuerdo al método descrito por Guthmann et al. (1992).
-anti-GCs policlonal de conejo específico para la subunidad β de CAYMAN y
CALBIOCHEM.
-anti-α actina (20-33) de conejo de SIGMA.
-anti-pSer (clon 4A9) monoclonal de ratón y anti-pThr (1E11) monoclonal de ratón
fueron de BIOMOL.
-anti-pTyr-HRP (3B12) monoclonal de ratón de Amersham.
Secundarios:
-anti-IgG TRITC, anti-IgG de conejo conjugado a isotiocianato de
tetrametilrodamina (TRITC) de SIGMA.
-anti-IgG HRP, anti IgG de conejo conjugado a peroxidasa (HRP) de AMERSHAM.
-anti-IgG de ratón generado en cabra y ligado a agarosa de SIGMA.
-anti –IgM de raton generado en cabra y conjugado a peroxidasa (HRP) de PIERCE.
Controles negativos:
-suero normal de conejo de SIGMA.
Controles positivos:
-fosfoproteinas aisladas de músculo de conejo, específicas para anticuerpos de pSer.

Los kits para radioinmunoensayo de GMPc, las películas fotográficas Hyperfilm-

ßmax (18x24 cm) y los casetes para autorradiografía (18x24 cm), así como el
complejo de peroxidasa biotinilada-streptavidina, los reactivos para ECL (Enhanced
Chemoluminiscence Western blotting), las membranas de PVDF para
inmunotransferencia Hybond ECL y las películas Hyperfilm-ECL fueron de
AMERSHAM. EL sustrato quimioluminiscente Super Signal fue de PIERCE. Las
membranas Centricon-30 para concentrar proteínas fueron de AMICON. El colágeno
54 Materiales y Métodos

aislado de placenta bovina fue de BIOCHROM. Los análogos permeables de GMPc,

β-fenil-1,N2-eteno-8-bromoguanosina 3’:5’-monofosforotioato cíclico, isómero Rp
(Rp-8-Br-PET-GMPcS) y β-Fenil-1,N2-eteno-8-bromoguanosina,3´,5´-monofosforo-
tioato cíclico, isómero Sp (Sp-8-Br-PET-GMPcS), fueron de BIOLOG. El ß-
mercaptoetanol, dodecilsulfato sódico (SDS), glicina, los patrones coloreados (rango
4-250 kDa) para electroforesis, la acrilamida y bisacrilamida, TEMED y persulfato
amónico empleados para preparar los geles para electroforesis fueron de BIO-RAD.
También fue de esta compañía el reactivo de ensayo de proteínas basado en la
detección espectrofotométrica del complejo proteína-Azul de Coomasie Brillante G-
250 (Bradford, 1976). La colagenasa (EC.3.4.24.3) de Clostridium histolyticum,
HEPES, fluoruro de fenilmetilsulfonilo, análogo permeable de GMPc 8-bromo-
GMPc (8Br-GMPc), el BSA fracción V y la RNAsa T1 fueron de ROCHE-
BOEHRINGER MANNHEIM. El Acido Okadaico, NECA, Cipermetrina, Caliculina
A, los inhibidores de proteínas quinasas N-[2-(metilamino)etil]-5-
isoquinolinesulfonamida (H-8), N-[2-((p-bromocinamil) amino)etil]-5-
isoquinolinesulfonamida (H-89), KT-5823, el péptido inhibidor de caspasa 3
(DEVD-CHO) y glutation-monoetilester fueron de CALBIOCHEM. El medio de
cultivo Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) y el suero bovino fetal normal
o inactivado por calor fueron de GIBCO. Los antibióticos penicilina/streptromicina,
kanamicina y anfotericina fueron de ICN o GIBCO. Las soluciones de revelador y
fijador GBX para autorradiografías fueron de KODAK. El azul Tripán, ácido
tricloroacético, ácido ascórbico, ácido perclórico y el detergente Triton X-100 fueron
de MERCK. El kit de viabilidad celular Live/Dead Viability/Citotoxicity, el tinte
para ADN SYBR-Gold, el Pico Green, el RiboGreenTM RNA Quantitation Reagent,
la solución de montaje para inmunos Prolong Antifade kit y el SNAP fueron de
MOLECULAR PROBES. El kit de extracción de ADN fue de TAKARA. El kit de
extracción de ARN RNAeasy Midi kit fue de QUIAGEN. El kit de RT-PCR
utilizado fue Access RT-PCR System de PROMEGA. El kit SYBRR Green PCR
Core Reagents fue de PE BIOSYSTEMS. El péptido natriurético de tipo C fue de
PENINSULA. Los donadores de NO SPER/NO, DETA/NO y DEA/NO, así como el
YC-1 fueron de ALEXIS. La solución de Percoll fue de PHARMACIA. La
urografina empleada en los gradientes de densidad para purificar células cromafines
fue de SCHERING. El CO2 y el N2 líquido fue de la compañía SEO. La albúmina de
suero bovino, el detergente Tween-20, rojo neutro, citosina arabinofuranósido,
fluorodeoxiuridina, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), los ácidos etilendiamino
tetraacético (EDTA) y etilenbis(oxietileno nitrilo) tetraacético (EGTA), los
inhibidores de proteasas leupeptina y pepstatina, el detergente Nonidet P40, azul de
bromofenol, 4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI), gelatina-glicerol, toxina pertúsica
de Bordetella pertussis, nitroprusiato sódico (SNP), acetilcolina, L[butionina-[S,R]-
sulfoximina (BSO), fenol y cloroformo fueron de SIGMA. El inhibidor específico de
la guanilato ciclasa soluble 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-ona (ODQ) fue
de TOCRIS-COOKSON. La agarosa fue de Pronadisa. Otros reactivos y materiales
de carácter general no indicados en esta extensa lista fueron de grado analítico.
 Materiales y métodos 55

Instrumental general
A continuación se detalla una lista de aparatos de carácter general que se han
empleado en la realización de este trabajo de investigación.
Para las centrifugaciones se emplearon las siguientes centrífugas:
Centrífuga de mesa de baja velocidad Omnifuge 2.0 RS Heraeus para la obtención y
lavado de células cromafines bovinas.
Para la purificación de células cromafines en gradientes de densidad se empleó una
centrífuga preparativa refrigerada Sorvall RC-5C.
En la mayoría de los experimentos se usaron microfugas para tubos Eppendorf de
Beckman y Heraeus.
Todas las tareas realizadas bajo atmósfera ésteril se efectuaron con campanas de
flujo laminar vertical Gelaire modelos Twin 30 y TC 48 de Flow. Los cultivos
celulares se mantuvieron en un incubador Heraeus termostatizado a 37ºC y con flujo
controlado de CO2 al 5 %.
Los materiales de cultivo se esterilizaron mediante autoclaves Autotester-G de
Selecta (alta capacidad) o Certoclav (baja capacidad). Los medios de cultivo se
esterilizaron por filtración empleando una bomba peristáltica Millipore y membranas
Acrocap de 0,2 µm de tamaño de poro (Gelman Sciences).
Para la perfusión de las glándulas adrenales bovinas se emplearon 2 bombas
peristálticas LKB de Pharmacia con 3 canales cada una permitiendo la perfusión
simultánea de 6 glándulas.
Para el contaje de células se utilizó un microscopio óptico Leitz HM-Lux3. Para la
observación de los cultivos celulares se dispuso de un microscopio de contraste de
fases Wilovert.
La adquisición directa de imágenes de quimioluminiscencia y de los geles de DNA
marcados con tintes específicos se realizaron con el sistema de Bio-Rad Fluor-S
Multimager.
Los estudios de inmunofluorescencia se analizaron con un microscopio Nikon
Eclipse TE 200 acoplado a una cámara Slow Scan Cool CCD Chamera Hammamatsu
4880-80 con los filtros B-2A FITC para calceina y G-1B TRITC para el homodimero
de etidio.
Las suspensiones celulares se sonicaron en un sonicador Ultrasonic Braun Labsonic.
La radiactividad procedente del ß 3H se cuantificó en contadores de centelleo líquido
Beckman LS 3801 y LS 6000 IC.
Las medidas de determinación de proteínas se realizaron en un espectrofotómetro
Pharmacia LKB-Ultrospec III. Para la determinación fluorimétrica de catecolaminas
se empleó un espectrofluorímetro Perkin Elmer LS 50 B controlado por ordenador y
con baño termostatizado modelo Frigomix U.
56 Materiales y Métodos

Para los experimentos previos de RT y PCR se utilizó el termociclador Gene Amp

PCR System 2400 de Perkin Elmer, y para los experimentos de cuantificación se
empleó el ABI PrismR 7700 Sequence Detector y el software asociado de Applied
Biosystems.
La electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS y la
inmunotransferencia se realizaron empleando el sistema Hoefer miniVe de
Amersham Pharmacia alimentado con una fuente modelo EPS 601 también de
Amersham Pharmacia. El análisis cuantitativo de los autorradiogramas se realizó
empleando un densitómetro Molecular Dynamics empleando el programa
ImageQuant perteneciente al Instituto de Bioquímica (C.S.I.C.)-Facultad de
Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid.
Para las incubaciones que requirieron condiciones controladas de temperatura se
emplearon placas calentadoras Plactronic y baños Tectron ó Unitronic 320 R de
Selecta y calentador en multibloque de Lab-Line.
Cuando se necesitó aspirar medios se emplearon bombas de vacío Millipore o Eyela.
Para la preparación de disoluciones se emplearon balanzas de precisión AND ER-60
A y granatario AND FX2000, así como pHmetros Crison 2001 y Metrohm 654. Las
soluciones o suspensiones se agitaron con agitadores magnéticos Agimatic-S de
Selecta, orbitales Luckham 802 o para tubos Heidolph Reac 2000. El agua de alta
calidad empleada para la preparación de las soluciones se obtuvo de un aparato Milli-
Q Water Purification System de Millipore. Para la limpieza de todo tipo de material
se empleó agua obtenida de un aparato Milli-Ro Plus también de Millipore. Una
máquina Scotsman AF 10 produjo el hielo picado utilizado en muchos de los
experimentos. Como cámara fría se emplearon frigoríficos de Liebherr. Para
congelar se utilizaron congeladores Liebherr a -20ºC y Revco a -80ºC.
Las disoluciones se pipetearon empleando pipetas automáticas Gilson o Eppendorff.
En el área de cultivos se emplearon pipetas de aspiración Pipetboy Acu de Integra
Biosciences.
 Materiales y métodos 57

2.METODOS
Obtención de células adrenomedulares
Las células cromafines se obtuvieron a partir de glándulas adrenales bovinas
mediante perfusión con colagenasa (EC.3.4.24.3) y posterior purificación en
gradiente de densidad según el método descrito por Miras-Portugal et al. (1985) y
modificado por Wilson (1986).
Las glándulas adrenales bovinas se extrajeron de los animales unos 20-30 minutos
después de su muerte. Las glándulas se mantuvieron en un medio salino (Locke de
lavado) a 4ºC hasta el momento de su procesado en el laboratorio.

Locke de lavado (pH=7,4)

NaCl 154,0 mM
KCl 5,6 mM
NaHCO3 3,6 mM
Glucosa 5,6 mM
HEPES 5,0 mM
Penicilina 50,0 UI/ml
Streptomicina 50,0 µg/ml

Solución de lavado + albúmina

Locke de lavado conteniendo:
Albúmina 2,5 g/l

Solución para perfusión con colagenasa

Locke de lavado + albúmina conteniendo:
Colagenasa 172,5 UI/l

Una vez en el laboratorio y aproximadamente 45 min-1 hora después de la muerte

del animal, se les retiró exceso de grasa y tejido conjuntivo que rodeaba a las
glándulas y se canularon a través del orificio de la vena medular central para
proceder a su perfusión.
Las arterias adrenales forman un plexo subcapsular a partir del cual se dividen en dos
tipos de vasos. Por un lado, las arterias corticales, que drenan la corteza, y, por otro,
las arterias medulares, que cruzan la corteza sin ramificaciones y alcanzan la médula
directamente. Los capilares corticales procedentes de las arterias corticales forman
un plexo venoso que drena también en la médula. Por tanto, la médula recibe sangre
arterial procedente de las arterias medulares y sangre venosa procedente de la
corteza. Dentro de la médula, los capilares medulares convergen en la vena medular
central que, por tanto, recibe toda la sangre que entra en la glándula (Vinson et al.,
1985) y abandona la glándula por un ancho orificio fácilmente canulable para la
58 Materiales y Métodos

perfusión, pudiendo considerarse ésta de carácter retrógrado, puesto que va de venas

a arterias.
Para favorecer el flujo de las diferentes soluciones a través de la glándula, se
efectuaron pequeños cortes longitudinales en la superficie externa de las glándulas a
nivel de cápsula y corteza.
Por medio de una jeringa y con objeto de eliminar la mayor cantidad posible de
sangre retenida en los vasos, se introdujeron a través de la cánula varios mililitros de
solución de lavado. Esta solución de lavado no contiene iones Ca2+ y Mg2+ de
manera que se evita la coagulación de la sangre en los vasos, debilitándose además
las uniones celulares a través de desmosomas.
Seguidamente, las glándulas se perfudieron en un baño termostatizado a 37ºC bajo
atmósfera estéril, en primer lugar, con solución de lavado mediante el uso de una
bomba peristáltica de flujo 1,5-2 ml/min por glándula. La segunda perfusión se
realizó con la misma solución de lavado a la que se había añadido albúmina de suero
bovino a una concentración final de 2,5 g de albúmina/litro. La adición de esta
proteína de origen bovino nos garantiza una cierta protección de las células contra las
proteasas que pudieran estar siendo liberadas al medio.
Por último, las glándulas se perfundieron en circuito cerrado con 200 ml de solución
de lavado conteniendo colagenasa (172,5U/litro). Debido a que la colagenasa
comercial que se utiliza contiene además de colagenasa (estrictamente
clostridiopeptidasa A), otras proteasas, lipasas, etc.; a esta solución de perfusión se le
añadió también albúmina de suero bovino con objeto de minimizar el daño celular
producido por estas otras enzimas.
El tiempo de digestión con colagenasa es de 1 hora aproximadamente. Ya que la
médula adrenal es mucho más sensible que la corteza a la acción de la colagenasa,
transcurrido ese período la corteza permanece intacta y, sin embargo, la médula
adrenal se digiere y presenta un aspecto reblandecido, pudiendo desprenderse
fácilmente de la corteza. A continuación las glándulas se abrieron longitudinalmente
y, con la ayuda de un bisturí, las médulas se rasparon para obtener una papilla que
contiene trozos de tejido sin digerir, matriz extracelular digerida y células
adrenomedulares.
Se hizo pasar esta papilla a través de una malla de nylon de 250 µm de diámetro de
poro lavándose con solución de lavado. La solución obtenida se centrifugó en una
centrífuga de mesa Heraeus de baja velocidad a 100xg durante 10 min a 20ºC. El
sobrenadante resultante se desechó y el sedimento conteniendo las células se
resuspendió de nuevo en solución de lavado, y se pasó por otra malla de nylon de 82
µm de diámetro de poro, centrifugandose en las mismas condiciones que la vez
anterior. El sedimento resultante contenía las células adrenomedulares totales.
 Materiales y métodos 59

Purificación de células cromafines y endoteliales

Se han usado 2 técnicas diferentes para purificar células adrenomedulares a partir de
la suspensión inicial: 1) centrifugación isopícnica en gradiente de densidad, y 2)
sembrado diferencial (Livett, 1984).
Quizás el método más utilizado es el primero y se basa en el hecho de que diferentes
tipos celulares presentan diferentes densidades de flotación, de tal manera que
centrifugadas en gradientes de naturaleza continua o discontinua equilibran en
diferentes regiones a lo largo del tubo del gradiente.
Para la separación tanto de células cromafines como endoteliales del resto de células
que contaminan la suspensión inicial (eritrocitos, rara vez corticales, además de
debris y otros fragmentos subcelulares) se han empleado dos medios diferentes para
crear gradientes de densidad: el Percoll y la urografina (Lemaire et al., 1983;
Kilpatrick et al., 1980; Role y Perlman, 1980).
1. Gradientes discontinuos de urografina
El uso de gradientes discontinuos de urografina resultó ser el método que ofreció una
mayor pureza en cromafines. Por esta razón, se usó este tipo de gradiente en
prácticamente todos los cultivos.
Urografina es el nombre comercial de una mezcla de amidotrizoato sódico y
meglumina (10:66) (p/p). La solución comercial es del 76% (p/v) en urografina y el
gradiente discontinuo consta de 2 fases, 15 y 7,5% (ver esquema). Las células
adrenomedulares totales se resuspendieron en la fase de urografina al 15% y sobre
ella se depositó la fase al 7,5%. El gradiente se centrifugó a 7.700xg durante 20 min
a 20ºC en una centrífuga Sorvall rotor SS-34.

Tras la centrifugación, las células cromafines equilibran en la interfase entre las 2

bandas de urografina, mientras que endoteliales y eritrocitos aparecen como un
precipitado en el fondo del tubo.

(corticales)
urografina 7.5% 7700xg
cromafines
20 min
urografina 15%
con las células 20ºC T
eritrocitos,
endoteliales

Figura II.1. Gradiente de Urografina. Este esquema muestra el aspecto

inicial y final del gradiente de urografina utilizado para purificar células
cromafines.
60 Materiales y Métodos

Se recogió la banda de células cromafines y se lavaron varias veces (al menos 2) con
solución de lavado mediante centrifugaciones a baja velocidad para eliminar la
urografina. Tras la última centrifugación las células se resuspendieron en 5-10 ml de
medio de cultivo Dulbecco's modified Eagle's medium (ver composición en la tabla
que se incluye) para su posterior contaje.
Cuando las preparaciones de células cromafines obtenidas no resultaban de la pureza
exigida para los experimentos (cromafines >85-90%, ver capítulo siguiente), la
purificación a partir de gradientes discontinuos de urografina se combinó con la
técnica de sembrado diferencial para incrementar el grado de pureza del cultivo
(Unsicker & Müller, 1981). Esta técnica explota las diferencias en las afinidades que
los diferentes tipos de células que componen el cultivo tienen por las superficies de
plástico de las placas de cultivo. Las células cromafines, dado su origen neural,
tienen una baja afinidad para adherirse a los plásticos de cultivo, necesitando, o bien
un tiempo considerable para fijarse al substrato, o la ayuda de superficies tratadas
con colágeno. Sin embargo, las células que contaminan el cultivo, mayoritariamente
células endoteliales, presentan gran afinidad por el plástico por lo que requieren un
tiempo mucho más corto para adherirse.
Por esta razón, cuando las células cromafines son purificadas por sembrado
diferencial, se resuspenden a una densidad de 106 cel/ml en medio de DMEM
conteniendo 10% (v/v) de suero bovino fetal. A continuación 30 ml de esa
suspensión celular se siembran en botellas de cultivo de 75 cm2 de superficie y se
mantienen en una estufa de cultivo a 37ºC durante al menos una hora. Tras ese
período las células endoteliales tuvieron tiempo suficiente para adherirse al substrato,
mientras que las células cromafines permanecieron flotando en el medio. Este medio
enriquecido en células cromafines se retira, las células se centrifugaron a baja
velocidad y se resuspendieron en medio fresco DMEM con 10% de suero inactivo
(5-10 ml).
Estimación del número de células. Integridad y pureza del cultivo
La estimación del número de células, así como de su pureza en cromafines se realizó
mediante contaje de las mismas en una cámara de Neubauer. Para esta determinación
sólo se contaron las células vivas capaces de excluir el colorante Azul Tripán. Este
colorante se preparó a una concentración del 0,5% (p/v) en una solución tamponada e
isosmótica (138 mM NaCl; 48,5 mM KH2PO4; pH 7,2) según Keith y Elliot (1979).
Se tomó una alícuota diluida de células cromafines resuspendidas en medio DMEM,
y se mezcló con solución de colorante. Por otro lado, otra alícuota se diluyó con el
colorante Rojo Neutro que en este cultivo tiñe las células cromafines de acuerdo a
Stuart et al. (1974) y Role y Perlman (1980). Según estos autores, el colorante se
comporta como una base débil y se acumula preferentemente en el entorno acídico de
los gránulos cromafines. El colorante se preparó en condiciones isosmóticas a una
concentración de 0,3 mg/ml en NaCl al 0,9 % (p/v).
 Materiales y métodos 61

Una parte de estas mezclas (células en Azul Tripán y células en Rojo Neutro) se
transfirieron a la cámara y se procedió a su contaje. El número de células/campo se
transforma en células/ml de acuerdo a la relación que tiene en cuenta el volumen de
la cámara:

Nº células/ml = Nº células contadas x 10 4 x dilución

En todas las preparaciones efectuadas para este trabajo de investigación la viabilidad

estimada, es decir, el porcentaje de células que excluyeron el colorante vital Azul
Tripán, fue superior al 95%.
En cuanto a la pureza del cultivo en células cromafines, generalmente fue >95%.
Como ya se ha comentado en el capítulo anterior, cuando la pureza del cultivo fue
menor de un 85-90%, las células fueron posteriormente purificadas por sembrado
diferencial.
Mantenimiento en cultivo
Todo el proceso descrito para la obtención de células en cultivo primario, se realizó
en condiciones de estricta esterilidad bajo una campana de flujo laminar vertical. El
material utilizado (vidrio o instrumental del tipo tijeras, pinzas, mallas de nylon,
puntas de pipeta, etc.) estaba previamente esterilizado en autoclave. El material de
plástico (tubos de centrífuga, pipetas, superficies de cultivo, etc) se adquirió
esterilizado mediante irradiación. Los medios de cultivo y disoluciones empleados
fueron esterilizados mediante filtración a través de membranas Acrocap de 0,2 µm de
tamaño de poro empleando una bomba peristáltica Millipore. Además, los medios de
lavado y perfusión se suplementaron con antibióticos (penicilina 50 UI/ml y
streptomicina 50 µg/ml).
Las células cromafines resuspendidas en medio de DMEM se diluyeron a la densidad
adecuada con medio DMEM conteniendo:

Suero bovino fetal inactivado por calor 10 % (v/v)

Penicilina 100 UI/ml
Streptomicina 100 µg/ml
Kanamicina 100 µg/ml
Anfotericina 2,5 µg/ml
Citosina arabinofuranósido 10 µM
Fluorodeoxiuridina (FDU) 10 µM

Aunque los cultivos utilizados fueron prácticamente puros en cromafines, la pequeña

proporción (<5%) de células endoteliales que aparecieron contaminando a las
primeras tras el proceso de purificación, puede llegar a convertirse en un problema
debido a su alta capacidad de multiplicación. Para evitar la invasión del cultivo por
62 Materiales y Métodos

estas células, y dado que las cromafines son células de cultivo primario y no sufren
divisiones, se añadieron los antimitóticos FDU y citosinarabinofuranósido. El empleo
del suero inactivado frente a suero normal también dificultó la proliferación de
células endoteliales debido a la destrucción en el proceso de inactivación de factores
esenciales para la división de dichas células.
Las células se sembraron a densidad variable entre 0,5-5x106 cel/ml en placas de
cultivo de diferente formato dependiendo del tipo de experimento a realizar. Estas
placas se trataron previamente con una preparación de colágeno para facilitar la
adhesión de células cromafines procededente de placenta bovina, presentándose en
una solución de 0,1% (p/v) de colágeno soluble en ácido. El tratamiento consiste en
cubrir los pocillos de las placas de cultivo con 1 ml/ 10 cm2 de área de cultivo con
una mezcla colágeno-DMEM (1:1). Las placas de cultivo se incuban durante ½ hora
y después se lavaron con DMEM para inmediatamente después sembrar las células
cromafines.
Las células se mantuvieron en una estufa a 37ºC en 95% aire/ 5% CO2. En estas
condiciones, las células están perfectamente adheridas al plástico de las placas
después de 24 horas. Estas células se utilizaron no mas allá del 5º día en cultivo para
evitar que pudieran sufrir transformaciones que las alejaran del fenotipo que
muestran en el órgano intacto. Ya que se ha demostrado que el suero contiene
factores que pueden afectar sistemas de 2º mensajeros celulares, el medio de cultivo
se cambió 24 horas antes del experimento por un medio que no contiene suero con
objeto de minimizar las posibles influencias del suero en dicho sistema.
 Materiales y métodos 63

Medio de Cultivo Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)

Componente mg/L
Sales Inorgánicas
CaCl2 (anhidro) 200
Fe(NO3)·9H2O 0,10
KCl 400
MgSO4 (anhidro) 97,67
NaCl 6400
NaH2PO4·H2O 125

Otros componentes
D-Glucosa 1000
Rojo Fenol 15
Piruvato sódico 110

Aminoácidos
L-Arginina·HCl 84
L-Cistina·2HCl 62,57
L-Glutamina 584
Glicocola 30
L-Histidina HCl·H2O 42
L-Isoleucina 105
L-Leucina 105
L-Lisina HCl 146
L-Metionina 30
L-Fenilalanina 66
L-Serina 42
L-Treonina 95
L-Triptófano 16
L-Tirosina Na2 104,18
L-Valina 94

Vitaminas
D-pantotenato Ca 4
Cloruro de colina 4
Acido Fólico 4
i-Inositol 7,20
Nicotinamida 4
Piridoxal HCl 4
Riboflavina 0,40
Tiamina HCl 400
64 Materiales y Métodos

2. Gradiente continuo de Percoll

Los dias de cultivo en que quisieron aislarse células endoteliales además de
cromafines, se sometió la papilla obtenida por digestión de la médula adrenomedular,
a gradiente de densidad de percoll (Kilpatrick et al., 1980) para eliminar las células
corticales, que presentan menor densidad. Para formar el gradiente se mezclaron 20
ml de solución de lavado conteniendo la suspensión celular con 20 ml de Percoll
isotónico (18 ml de percoll y 2 ml de solución de lavado 10 veces concentrada) y se
centrifugó en una centrífuga Sorvall con rotor SS-34 a 20.000xg durante 30 min a
20ºC. Durante esta centrifugación se generó un gradiente continuo de densidad (1,04-
1,14 g/l). La fracción correspondiente a una mezcla de células cromafines y
endoteliales (mayoritariamente las primeras) se recogió entre las densidades 1,05-
1,07 (Livett, 1984). Las células corticales quedaron en la parte superior del gradiente,
mientras que los eritrocitos sedimentaron casi en el fondo del tubo a una densidad de
1,08-1,1 g/l.
La mezcla de células cromafines y endoteiales se lavó dos veces con Locke con el
objeto de eliminar el percoll y se resuspendieron en un volumen conocido de medio
para proceder a su contaje como ya se ha descrito.
Una vez se hubieron contado las células totales obtenidas, se procedió a la
separación de ambos tipos celulares por sembrado diferencial. Durante el tiempo de
cultivo las células endoteliales son capaces de proliferar aumentando su número
hasta alcanzar la confluencia ocupando toda la superficie del recipiente en que se
encuentren. Cuando se llega a este estado se procede al pase de éstas células para
aumentar su número.
Por otra parte, las células cromafines que se habían recogido en el sobrenadante de
las botellas, se sembraron en placas tratadas como ya se ha descrito en el apartado
anterior.
Pasaje de células endoteliales
Se retiró el medio de cultivo y se lavó la monocapa con Locke normal sin calcio,
previamente esterilizado. A continuación se añadieron 10-15 ml de solución de
tripsina (tripsina 0,1%, EDTA 0,025% en Locke normal sin Ca2+).
Se mantuvo en el incubador durante 2 min y se observaron al microscopio para
comprobar como las células se iban desligando de la matriz y se levantaban de la
superficie de la botella. Cuando fue necesario se administraron unos golpes enérgicos
en el fondo de la botella para facilitar la separación de las células del mismo. La
acción de la tripsina se detuvo añadiendo 10-15 ml de DMEM con suero 10%, ya que
éste inhibe la acción de dicha enzima. Se recogió el medio sobrenadante conteniendo
las células y se centrifugó a 100xg durante 10 min a 20º. El sedimento se resuspendió
en el volumen conveniente de medio DMEM con 10% de suero para sembrarlas en
pocillos o covers según conveniencia, y se utilizaron para realizar los ensayos.
 Materiales y métodos 65

Solución de Locke sin Ca2+ (pH 7,4)

NaCl 154mM
KCl 4,4mM
MgSO4 1,2mM
KH2PO4 1,2mM
NaHCO3 4mM
Glucosa 56mM
HEPES 10mM

Se han utilizado células del 2º pase en todos los experimentos.

Determinación de óxido nítrico

Preparación de los donadores de NO
La preparación de las soluciones de los compuestos donadores de NO fueron de vital
importancia dado que cada uno de estos compuestos posee unas características
particulares en su capacidad de liberar NO. Así por ejemplo el SNAP se disolvió en
DMSO, según especificaciones del fabricante, preparando una solución nueva cada
día que se realizó el experimento, y se cuidó especialmente de proteger esta solución
stock de la luz, ya que ésta incrementa de manera significativa la descomposición del
compuesto, y por tanto la liberación de NO.
Los Nonoatos (DEA/NO, SPER/NO y DETA/NO) se disolvieron según se ha
descrito por Keefer et al. (1996). Se prepararon soluciones stock cada día en una
solución NaOH 0,01N, para evitar una descomposición espontánea del compuesto a
pH neutro, lo que supondría un error en la concentración utilizada en el ensayo.
Además, los compuestos sin disolver, se trataron con nitrógeno antes de cerrar el
envase, para eliminar la humedad presente en el aire que puede provocar la
descomposición de los mismos. La concentración de la solución stock se controló
midiendo la absorbancia a 250 nm según los coeficientes de extinción molar 8.000
M-1 cm-1 para SPER/NO y 6.500 M-1 cm-1 para DEA/NO (Ramamurthi and Lewis,
1997), y para el DETA/NO 7.680 a 251 nm según especificaciones del fabricante.
El nitroprusiato sódico se preparó a diario disolviéndolo en tampón y protegiéndolo
de la luz para evitar su descomposición.

1. MEDIDA DE ÓXIDO NÍTRICO CON OXIHEMOGLOBINA

Este ensayo de la hemoglobina se basa en la reacción del NO con la hemoglobina
reducida (HbO2) según la ecuación:
66 Materiales y Métodos

-
•NO + HbO2 ONOO + metHb

-
NO3
La oxidación de la hemoglobina se produce de forma estequiométrica con el NO y
ocurre de manera más rápida que la rección entre el oxígeno y el NO (Hevel &
Marletta, 1994). Gracias a ello, la liberación de NO se puede monitorizar midiendo la
formación de metHb a 401 nm. El método original empleaba el cambio en la
absorbancia que ocurría en el tiempo entre 401 y 411 nm (A401-A411). En cualquier
caso el punto isosbéstico para la conversión de HbO2 a metHb ocurre a 411 nm, y no
debería cambiar. Por tanto, el ensayo puede simplificarse mediante la medida del
incremento de la absorbancia a 401 nm. Por otro lado también puede medirse la
desaparición de HbO2 por disminución de la absorbancia a 576 nm. Cuando se
utilizaron concentraciones bajas del donador de NO, se midió la aparición de metHb
a 401 nm. Por el contrario, cuando se utilizaron concentraciones elevadas de
donadores de NO, estudiamos la desaparición de HbO2 a 576 nm.

Cada vez que se preparó una solución de hemoglobina, se calculó su concentración

de acuerdo con la ecuación:

[HbO2](µM)= [1,013(A576)- 0,3269(A630)- 0,7353(A560)] x 102

Conocida la concentración inicial de hemoglobina reducida, se calcularon los

coeficientes de extinción molar para ambas longitudes de onda. Para ello se realizó
un proceso de calibrado para verificar la exactitud en la medida del NO. Este proceso
consiste en establecer una recta con diferentes concentraciones de HbO2 , midiendo
los cambios en su absorbancia antes y después de su oxidación cuantitativa a metHb,
utilizando una solución de ferricianuro potásico. Así comprobamos que los cambios
en la absorbancia fueron constantes y que se mantuvo una relación lineal entre la
absorbancia tras la transformación total a metHb y la concentración del compuesto
de partida.:∆ελ401=54.346 ± 1.727 M-1 cm-1; ∆ελ576=13.237 ± 2.580 M-1 cm-1.

La estimación de la liberación de NO a partir de donadores de NO se realizó

paralelamente en ausencia y presencia de células. En el primer caso diferentes
concentraciones de donadores de NO se añadieron a una cubeta que contenía 500 µL
de solución tampón, en la que se incluyó una concentración de hemoglobina de 10
µM o 70 µM según se fuera a medir la absorbancia a 401 o 576 nm. La mezcla se
mantuvo a 37ºC durante los tiempos necesarios y posteriormente se leyó la
absorbancia.
 Materiales y métodos 67

Para hacer el estudio dosis-respuesta en presencia de células, éstas se mantuvieron en

cultivo en placas de 24 pocillos a una densidad de 106 células. Se les retiró el suero
24 horas antes de realizar el experimento para evitar que restos de éste pudieran
interferir en la reacción. Inmediatamente antes del experimento se lavaron los
pocillos dos veces con solución Locke eliminando así el colorante rojo fenol del
medio de cultivo, cuyos máximos de absorbancia se encuentran a 390-430nm o 560-
610 nm y coincidían por tanto con los de medida de la HbO2 y metHb. A
continuación, se le añadió al pocillo 1,5 mL del tampón con la concentración
correspondiente de HbO2, se tomaron 500 µL de este medio para medir su
absorbancia a tiempo 0 y utilizar este valor como blanco de cada experimento en
particular. Inmediatamente después, al medio restante con las células se le incorporó
el donador de NO. Tras 10 min en el caso de DEA/NO y 15 min en el caso de
SPER/NO y SNAP de incubación a 37ºC, se recogieron 500 µL y se midió su
absorbancia.
A cada uno de estos valores de absorbancia se le sustrajo el obtenido al incubar el
mismo tiempo la concentración utilizada de HbO2 en el experimento, pero sin añadir
ningún donador de NO. Esto nos permitió reducir la posible interferencia de otros
mecanismos celulares incluyendo la liberación basal de NO (Schwartz et al, 1998).
Solución de Locke Normal (pH 7,4)

NaCl 140mM
KCl 4,7mM
MgSO4 1,2mM
KH2PO4 1,2mM
ClCa2 2,5mM
NaHCO3 4mM
Glucosa 5,5mM
HEPES 10mM
EDTA 0,07mM

Para llevar a cabo el estudio en función del tiempo, las células se mantuvieron en
cultivo en placas de 6 pocillos a una densidad de 5.106, se les retiró el suero 24 horas
antes del ensayo y se lavaron dos veces con solución Locke. La incubación se llevó a
cabo con 5,5 mL del tampón con la concentración de HbO2 correspondiente,
tomando 500 µL a tiempo 0 como ya se ha descrito. A continuación se le añadió el
compuesto donador de NO y a los diferentes tiempos se recogieron 500 µL del medio
de incubacion y se midió la absorbancia. Igual que en el caso anterior, se hicieron
medidas a los mismos tiempos con las células, pero en ausencia del donador
estudiado, restándole estos valores a los obtenidos en las medidas con el donador.
68 Materiales y Métodos

2. Determinación de nitritos
Es bien conocido que el NO reacciona rápida y espontáneamente con O2 para
producir varios óxidos de nitrógeno:
2NO + O2 2NO2
2NO + 2NO2 2N2O3
2N2O3 + 2H2O 4NO2- + 4H+

De estos compuestos el NO2- es estable tras la descomposición del NO en solución

acuosa. Por lo tanto la determinación de nitritos en solución es una forma indirecta
pero muy precisa de calcular la cantidad de NO liberado en el medio.
El ensayo para la detección de pequeñas cantidades de NO2- según el método descrito
por Misko et al.(1993) se basa en la formación de compuestos N-nitrosilados a partir
de nitritos en medio ácido y la subsecuente N-nitrosilación del 2,3-diaminonaftaleno
(DAN) a 2,3-naptotriazol (NAT), un derivado fluorescente del primero.
La intensidad fluorescente para el NAT es al menos 90 o 100 veces más alta que la
obtenida para una concentración equimolecular de DAN cuando la solución es
excitada a 375nm y la emisión se detecta al máximo para el NAT, 415 nm. El límite
de detección para el NAT es menor de 10 nM, y la fluorescencia se mantiene lineal
hasta concentraciones mayores de 6 µM.
Además, la cuantificación de nitritos se calibró mediante una recta patrón con
estándares conocidos de nitritos.
El experimento se llevó a cabo en un mililitro de solución Locke que contenía el
donador de NO a una concentración conocida y se le añadieron 100 µL de DAN a
partir de un stock 0,025 mg µL-1preparado fresco en 0,62 M HCl. Tras una
incubación de 15 min a 37ºC se paró la reacción añadiendo 50 µL de 2,8 N NaOH.
La medida de la absorbancia del NAT formado por reacción de los nitritos presentes
en el medio con DAN, se realizó a λex =375 nm y λex= 415 nm.
El compuesto 2,3-diaminonaptaleno se preparó fresco cada día y se mantuvo
protegido de la luz para evitar modificar sus propiedades de emisión fluorescente.

DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR

Este ensayo se basa en la determinación simultanea de las células vivas y muertas
por sondas que miden dos parámetros reconocidos de la viabilidad celular, la
actividad esterasa intracelular y la integridad de la membrana plasmática.
Las células vivas se distinguen por la presencia en el citosol de actividad esterasa
inespecífica. Esta actividad se determina por la conversión de la calceina AM,
análogo de calceína permeable para las células y no fluorescente, en calceína libre
 Materiales y métodos 69

intensamente fluorescente. Esta sonda es retenida por las células vivas por su
naturaleza polianiónica, produciendo una fluorescencia verde intensa a las longitudes
de onda Ex/em 495 nm/515 nm. Por otro lado el homodímero de etidio (EthD-1) se
introduce en las células que presentan la membrana dañada, sufriendo un incremento
de su fluorescencia de 40 veces por interacción con los ácidos nucleicos y emitiendo
una fluorescencia roja intensa a las longitudes de onda ex/em 495 nm/635 nm. La
determinación de la viabilidad celular se basa, por tanto, en parámetros físicos y
bioquímicos.
Para realizar este estudio se cultivaron las células en placas de 24 pocillos a una
densidad de 5.105 células por pocillo. Previo al ensayo se lavaron las células con
solución Locke para eliminar el colorante del medio de cultivo y evitar su
interferencia en el método. La incubación con las sondas se realizó en este mismo
medio a una concentración 1 M calceína AM y 8 M homodímero de etidio
durante 30 minutos a 37ºC.
A continuación y sin retirar las sondas del medio, se tomaron imágenes de la
fluorescencia con la cámara Slow Scan Cool CCD de Hammamatsu 4880-80
acoplada a un microscopio Nikon Eclipse TE 200, utilizando los filtros B-2A FITC
para la calceína, y G-1B TRITC para el homodímero de etidio por ser los que
presentaban los pasos de longitudes de onda más adecuados a los máximos de
excitación y emisión de cada una de las sondas.
Como control negativo se introdujo un pocillo con la misma concentración de las
sondas pero en ausencia de células, comprobándose que no se obtenía señal
fluorescente de ninguna de las dos sustancias ya que carecen de fluorescencia sin
interacción con las células.
Ensayo fluorimétrico de cuantificación del ADN total
Este ensayo se utilizó para evaluar la pérdida de células cuando los cultivos se
sometieron a distintos tratamientos. Las células muertas pierden la capacidad de
adhesión al sustrato en caso de cromafines, o bien a la placa directamente en el caso
de endoteliales, y por tanto en el lavado anterior a la extracción quedaron eliminadas
del cultivo.
El ensayo fluorimétrico de ADN se basa en el aumento de fluorescencia que se
produce cuando el compuesto bisbencimidazol (Hoechst 33258) se une al ADN
(Downs y Wilfinguer, 1983; Labarca y Paigen, 1980). Es un método rápido y
sencillo para determinaciones cuantitativas de ADN en extractos celulares, donde la
cromatina se disocia mediante el empleo de un tampón de alta concentración salina
para hacer totalmente accesible el ADN al agente fluorescente. El ensayo es además
extremadamente sensible ya que se pueden llegar a detectar hasta 10 ng de ADN. El
aumento de fluorescencia del compuesto se produce inmediatamente al entrar en
contacto con el ADN y se mantiene constante durante al menos 16 horas. La reacción
es lineal en un amplio rango de concentraciones de ADN.
70 Materiales y Métodos

Las células se levantaron de los pocillos donde habían sido cultivadas y tratadas con
50 µl de tampón de extracción (NH4OH 1 N; Tritón X-100 0,1%) y se les añadieron
450 µl de tampón de ADN de alta concentración salina (0,1 M KH2PO4; 2 M NaCl;
10 mM EDTA; pH= 7,2). La solución se sonicó para conseguir una perfecta
homogeneización y a continuación se centrifugó a 13.000 rpm. Para el ensayo se
tomaron alícuotas de 100 µl del sobrenadante.
El ensayo se realizó en cubetas que contienen las muestras y el reactivo de Hoechst
(200 ng/ml) en un volumen final de tampón de ADN de 2 ml. La fluorescencia se
midió a una longitud de onda de excitación de 356 nm y una longitud de onda de
emisión de 458 nm.
El cálculo de las concentraciones de ADN se realizó interpolando los valores de
fluorescencia obtenidos en una recta patrón construida con ADN estándar en un
rango de concentraciones de 0-1.000 ng. Este estandar se preparó a una
concentración de 50 µg/ml que se comprobó midiendo la absorbancia a 260 nm
(A50 g/ml=1).
Extracción del ADN presente en el citosol
Dado que está establecido que la fragmentación del ADN es uno de los hechos que se
producen al desencadenarse la muerte celular programada o apoptosis, quisimos
comprobar si aparecía una mayor cantidad de ADN en el citosol y si éste había sido
degradado por la acción de endonucleasas. Para ello las células en cultivo que habían
sido sometidas al tratamiento en estudio se sometieron, tras un lavado con PBS, a
digestión suave, en un tampón de composición: 20 mM EDTA; 0,5% TritonX-100; 5
mM Tris-base; pH= 8. Este medio respeta la integridad nuclear de forma que permite
aislar solamente los ácidos nucleicos que han salido del núcleo y que estan
parcialmente degradados por enzimas endonucleasas. Las células se agitaron durante
15 min en hielo en presencia de este tampón para asegurar la ruptura de las
membranas citosólicas. El extracto se recogió en tubos eppendorff y se centrifugó 10
min a 14.000 xg. El sobrenedante se recogió en un tubo limpio y se añadió RNAsa,
previa inactivación de ADNsas contaminantes por calor, a una concentración de 0,1
mg/mL y se incubó 30 min a 37º. A continuación se añadió Proteinasa K a una
concentración de 0,1 mg/mL y se incubó durante dos horas a 56º para eliminar las
proteínas que pudieran existir en los extractos.

PBS (pH= 7,4)

NaCl 8,00 g/L

KCl 0,20 g/L
Na2HPO4 1,44 g/L
KH2PO4 0,24 g/L
 Materiales y métodos 71

Se realizó la extracción de ADN adicionando un volumen de una mezcla fenol-

cloroformo. La mezcla se agitó en el vortex y se dejó 15 min a 4º para que se
separaran las dos fracciones. Tras una centrifugació de 5 min a 14.000xg, se recogió
la fracción acuosa que quedó en la parte superior del tubo.
Se midió el volumen exacto de ésta fase y se precipitó el ADN añadiendo 0,1
volúmenes de acetato amónico 2 M y 2 volúmenes de etanol absoluto. Esta mezcla se
mantuvo a -20ºC durante 24 horas. Transcurrido este tiempo, se centrifugó 15 min a
14.000 xg y se retiró el sobrenadante, quedándonos con un precipitado muchas veces
prácticamente indetectable. El precipitado se lavó con etanol 75% muy frío mediante
una nueva centrifugación, se retiró el sobrenedante y se dejó secar el precipitado al
arie para eliminar todos los restos de etanol. Este precipitado se resuspendió en un
volumen pequeño de TE y se utilizó para medir el ADN o bien para realizar una
electroforesis en geles de agarosa.

Ensayo fluorimétrico de cuantificación del ADN citosólico

La cuantificación del ADN citosólico se realizó con la sonda fluorescente PicoGreen,
un agente que se introduce en los ADN de doble cadena sufriendo un cambio en su
espectro de emisión. Este ensayo es extremadamente sensible, capaz de detectar
hasta 25 pg/mL. La medida se realizó en un espectrofluorímetro a las longitudes de
onda de excitación y emisión óptimas para la fluoresceína. El rango de detección
lineal del ensayo es de más de cuatro ordenes de magnitud de concentración de ADN
(de 25 pg/mL a 1000ng/mL) y se mantiene en presencia de varios compuestos que
suelen contaminar las preparaciones de ácidos nucleicos, como las sales, urea, etanol,
detergentes, proteínas y agarosa. También está optimizado para evitar la contribución
a la señal de la posible contaminación con ADN monocatenario ó ARN.
Tanto la sonda PicoGreen como las muestras se diluyeron en TE (10mM Tris-HCl;
1mM EDTA; pH=7,5) que se preparó en agua estéril y libre de ADNasas. La
dilución del agente se realizó en el momento de su utilización en un recipiente de
plástico ya que se puede adsorber a las paredes de cristal. Además, debe protegerse
de la luz ya que es extremadamente fotosensible.
Para establecer la recta patrón se preparó una solución stock de ADN bicatenario a
2 g/mL calculado en base a la absorbancia a 260 nm en una cubeta de 1cm (A260=
0,04 corresponde a 2 µg/mL). Las concentraciones de la recta patrón se pueden
establecer de alto o bajo rango según la cantidad que se estima obtener en las
muestras.
Tanto las muestras problema como las correspondientes a la recta patrón se diluyeron
en 1 mL de TE al que se añadió 1 mL del reactivo PicoGreen diluido 1:200. Las
cubetas se agitaron y la fluorescencia se leyó tras 5 min de incubación a temperatura
ambiente y protegidas de la luz. Las condiciones de lectura se fijaron a 480 nm la
longitud de onda de excitación y en 520 nm la de emisión. Las ventanas se ajustaron
72 Materiales y Métodos

con el punto de la recta patrón de mayor concentración. Para minimizar los efectos
de la descomposición por la luz, todas las muestras se mantuvieron el mismo tiempo
antes de hacer la lectura de la fluorescencia.
Los datos se procesaron restando a cada valor obtenido el de la fluorescencia del
blanco, para después construir una recta patrón e interpolar los valores de
fluorescencia de nuestras muestras.
Electroforesis en geles de agarosa
Una vez precipitado el ADN extraído del citosol y resuspendido en un volumen de
aproximadamente 50 L de TE, una parte se mezcló con tampón de electroforesis 6
veces concentrado y se sometió a electroforesis en un gel de agarosa preparado al
2%. La electroforesis se realizó a voltaje constante de 50 V durante 2 horas.
Finalizada la electroforesis el ADN se tiñó con el colorante fluorescente específico
para ácidos nucleicos SYBR Gold. Éste es el marcaje fluorescente más sensible de
que se dispone para la tinción de ácidos nucléicos en geles. Se trata de un derivado
asimétrico de la cianina, que incrementa su fluorescencia unas 1.000 veces por unión
a ácidos nucleicos y presenta un alto rendimiento. El máximo de excitación para el
complejo colorante-ácido nucleico es a 300 nm en ultravioleta y de 495 nm en
visible. El máximo de emisión se encuentra en 537 nm.
Este compuesto penetra en los geles de agarosa gruesos o de alto porcentaje de forma
rápida y no precisa de posterior lavado dada la baja emisión que presenta en estado
libre.
El tinte se mantuvo a –20ºC en una solución de DMSO 10.000 veces concentrada.
Para su utilización se diluyó en tampón TE (ver apartado anterior) o en TAE ( 40
mM Tris-acetato; 1 mM EDTA; pH= 7,5-8). El gel se introdujo en un volumen
suficiente del tinte como para cubrirlo por completo y se incubó durante al menos 30
minutos a temperatura ambiente en agitación orbital ligera y protegido de la luz.
Inmediatamente después las bandas de ADN se visualizaron mediante
transiluminación ultravioleta y se capturó la imagen obtenida mediante una cámara
digital (Sistema Flúor-S de Bio-Rad).
Medida de la actividad de caspasas
Se dispone de sustratos específicos para las diferentes caspasas unidos a una
molécula de naturaleza fluorescente. Estos sustratos no presentan fluorescencia a
menos que sean hidrolizados por las caspasas.
Según estas características del ensayo, el incremento en la emisión del compuesto
fluorescente es directamente proporcional a la actividad de la caspasa estudiada,
siempre que el sustrato se encuentre en el medio a concentraciones saturantes para
evitar un agotamiento del mismo.
 Materiales y métodos 73

La medida de la actividad puede hacerse de forma cuantitativa mediante una recta

patrón con cantidades conocidas de la molécula fluorescente libre, o bien referir los
resultados a un control en el que no se ha estimulado la actividad caspasa.
Las células en cultivo se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con un tampón
de composición: 1% triton X-100; 10% sacarosa; 5 mM EDTA; 2 mM DTT; 50 mM
HEPES; 1 mM PMSF; Pepstatina 10 µg/mL; Leupeptina 10 µg/mL; (pH= 7,4). El
extracto se centrifugó 10 min a 14.000xg a 4ºC y se recogió el sobrenadante.
El ensayo se realizó en placa de 96 pocillos en un volumen final por pocillo de 100
L de un tampón de reacción que contiene 100 mM Hepes; 10%sacarosa; 10 mM
DTT; 2 mM EDTA; 0,1%CHAPS; pH=7,4 para digerir las membranas plasmáticas.
El sustrato específico de la caspasa se añadió a cada pocillo a una concentración final
de 100 M y la reacción se disparó por adición del extracto. En ese momento se
midió la fluorescencia y consideramos esta medida como t=0.
Tras 90 min de incubación a temperatura ambiente y protegido de la luz se volvió a
medir la fluorescencia (t=90min).
El incremento de fluorescencia por acción de la ruptura del sustrato por la caspasa se
calculó por diferencia entre las dos medidas de fluorescencia, ∆Fluo.=(Ft0-Ft90).
Además se incluyeron dos controles, por un lado se incubó el mismo tiempo la
misma concentración de sustrato en el tampón de reacción pero en ausencia de
extracto celular para comprobar que no aparecía un incremento en la fluorescencia
por efecto de la luz u otro factor externo. Por otro lado, se introdujo un inhibidor
espécífico de la caspasa en estudio en un medio que incluía tanto sustrato como
extracto celular, comprobándose que no se producía incremento en la fluorescencia,
garantizando así la especificiad del ensayo.
ESTUDIOS INMUNOCITOQUÍMICOS
Para realizar los estudios inmunocitoquímicos, las células cromafines y endoteliales,
se sembraron en cubreobjetos de 15 mm de diámetro, previamente tratados con
colágeno en el caso de las células cromafines, a una densidad de 2.105 células. Una
vez que las células estuvieron bien adheridas a la superficie de cultivo (2 días), se
fijaron con una mezcla de acetona:metanol (1:1) muy fría durante 2 minutos. Los
cubreobjetos se dejaron secar al aire y se guardaron a –20ºC.
Para la detección inmunocitoquímica de los antígenos estudiados en este trabajo de
investigación, las células, ya fijadas, se atemperaron durante al menos 1 hora, y se
preincubaron en placas petri durante 2 períodos de 10 min en medio salino
tamponado con fosfato.
Para los estudios de inmunofluorescencia, los cubreobjeto se preincubaron durante 1
hora con medio PBS + 4% (p/v) de leche deslipidizada en polvo como agente
bloqueante. A continuación se dejó secar al aire unos instantes y se efectuó la
incubación con el anticuerpo primario en un volumen pequeño de medio PBS-4%
leche que se depositó sobre el cubreobjeto. Usualmente la incubación con el
74 Materiales y Métodos

anticuerpo primario se efectuó a 4ºC durante aproximadamente 15 horas. El exceso

de anticuerpo se lavó dos veces con el medio de bloqueo durante 10 minutos. La
incubación con el anticuerpo secundario ligado a rodamina se efectuó durante 1 hora
a temperatura ambiente. El exceso de anticuerpo 2º se eliminó también con 2 lavados
de 10 minutos con PBS-4% leche. A continuación, las monocapas se incubaron
durante 5 min a temperatura ambiente con el compuesto fluorescente marcador del
ADN 4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a una concentración de 1 µM en medio
PBS con objeto de visualizar fácilmente los núcleos celulares.
A continuación se montaron los cubreobjetos en portaobjetos con una gota de la
solución de montaje específica Prolong Antifade Kit.
Los estudios de inmunofluorescencia se analizaron con un microscopio Nikon
Eclipse TE 200 acoplado a una cámara Slow Scan Cool CCD Chamera Hammamatsu
4880-80 con el filtro G-1B TRITC específico para la rodamina.
Determinación de los niveles intracelulares de GMPc
Los niveles intracelulares de GMPc se determinaron mediante un radioinmunoensayo
basado en la competición entre el GMPc procedente de extractos desproteinizados de
células y una cantidad fija de [3H]-GMPc en su unión a un anticuerpo generado en
conejos frente al antígeno GMPc ligado a albúmina, que reconoce específicamente al
nucleótido. Transcurrido un período de incubación en el que se alcanza el equilibrio,
mediante técnicas sencillas es posible separar el nucleótido libre del que está
específicamente ligado a la proteína. Cuanto mayor cantidad de radiactividad
permanezca unida a la proteína, significará que en el extracto de partida había menos
nucleótido que compite. Comparando con una serie de tubos en los que se añadió
cantidades conocidas de GMPc patrón se puede conocer con exactitud la cantidad de
nucleótido cíclico en el extracto celular (Harper & Brooker, 1975).
Para esta determinación, las células cromafines se sembraron en multiplacas de 24
pocillos a una densidad de 106cel/pocillo en 1 ml de medio de cultivo. Previo al
ensayo se cambió el medio a las células por uno sin suero 24 horas antes. Cuando la
determinación se realizó en células endoteliales, éstas se sembraron en placas de 24
pocillos y se mantuvieron hasta que alcanzaron confluencia. El suero se retiró del
medio 4 horas antes del ensayo. Para realizar el experimento, se retiró el medio
DMEM y se lavaron los pocillos una vez con 500 µl de solución de Locke.
A continuación se preincubaron durante 30 minutos con el mismo medio.
Dependiendo del experimento particular, este medio de preincubación contuvo
diferentes agentes cuyo efecto se quiso estudiar. En general, en la preincubación y
también durante el período de estimulación, al medio se le añadió 3-isobutil-1-
metilxantina (IBMX) a una concentración final de 0.5 mM con objeto de inhibir las
fosfodiesterasas y de esta manera aumentar la sensibilidad del ensayo. Durante el
período de estimulación las células se incubaron con los agentes cuyo efecto sobre
los niveles intracelulares de GMPc se quiere evaluar. Para terminar el período de
estimulación se aspiró el sobrenadante, se añadieron a cada pocillo 300 µL de una
 Materiales y métodos 75

solución de ácido tricloroacético (TCA) al 6% (p/v), las células se rasparon y se

recogió el medio en un tubo eppendorff. Esta solución ácida precipita las proteínas y
tras una centrifugación en Microfuga, el sobrenadante constituye el extracto
desproteinizado. Para evitar la precipitación de la proteína de unión a GMPc, estos
extractos ácidos se neutralizaron añadiendo gota a gota una solución de 3 M KOH,
1,5 M trietanolamina hidrocloruro (TEA) hasta que la mezcla alcanzó el pH neutro
según el papel indicador.
El radioinmunoensayo se realizó en un volumen final de 200 µl, que contenía los
siguientes volúmenes de las diferentes soluciones (en µl):

RIA-GMPc [3H]-GMPc Tampón Patrón Extracto Blanco Anticuerpo

No GMPc 50 100 - - - 50
Patrones 50 - 100 - - 50
Blanco 50 - - - 100 50
Extracto 50 - - 100 - 50

El blanco de los ensayos consiste en un tubo que contiene una proteína que desplaza
completamente al GMPc del anticuerpo. Una vez alcanzado el equilibrio, para
separar el nucleótido ligado a proteína del que se encuentra libre, se precipitó el
anticuerpo con una solución de SO4(NH4)2 al 60% (p/v). Tras una centrifugación en
Microfuga el precipitado contiene el [3H]-GMPc y GMPc frío ligado al anticuerpo.
La radiactividad se determinó en cuentas por minuto (cpm) con un contador de
centelleo líquido.

5
C0 / Cx

0
0 2 4 6 8
pmol GMPc/tubo

Figura II.2. Calibración de las medidas de nucleótidos cíclicos.

Ejemplos de recta de calibrado para los ensayos del nucleótido
cíclico GMPc mediante radioinmunoensayo.
76 Materiales y Métodos

El GMPc contenido en los extractos se determina por interpolación en rectas

construidas tras linealización de curvas de calibrado obtenidas con los tubos "No
GMPc" y los de los patrones (conteniendo de 0,5-8 pmol de GMPc). En estas rectas
se representan pmol de nucleótido cíclico/tubo frente a Co/Cx siendo Co la
radiactividad en cpm unida al anticuerpo en ausencia de GMPc no marcado y Cx, el
valor de radiactividad unida al anticuerpo para cada extracto problema.
Tanto la preparación de los extractos celulares como la incubación con el anticuerpo
se realizan a 4ºC en hielo para evitar tanto la degradación del nucleótido cíclico
como la desnaturalización térmica de la proteína. Además el tampón en el que se
llevó a cabo el radioinmunoensayo contenía EDTA como quelante de cationes
divalentes Ca2+ y Mg2+ que son esenciales para la actividad de fosfodiesterasas
residuales que pudieran haber resistido el proceso de extracción.
Este ensayo, tal como se ha descrito, presenta una alta especificidad para el GMPc,
además de una sensibilidad adecuada para las cantidades de dicho nucleótido
presentes en las células.

Detección de la guanilato ciclasa soluble mediante inmunotransferencia

La detección de la guanilato ciclasa soluble se realizó por técnicas de
inmunotransferencia empleando un anticuerpo comercial (Calbiochem y Cayman)
generado contra un péptido sintético derivado de una secuencia conservada de las
subunidades α1 y β1 de guanilato ciclasa soluble.
Las células mantenidas en cultivo en placas de 6 pocillos a una densidad de 5.106 se
lisaron con 300 µl de tampón 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5 mM PMSF
tamponado con 20 mM Tris a pH 7.4 que contenía los inhibidores de proteasas:
Leupeptina 10 µg/mL, Pepstatina 10 µg/mL, Antipaina 50 µg/mL, Aprotinina 1
µg/mL, Pefabloc 1mg/mL y PMSF 200 µg/mL. El homogenado se centrifugó a
14.000 xg durante 10 minutos a 4ºC, recogiéndose el sobrenadante. Después de
determinar la concentración de proteínas, dos volúmenes de extracto celular se
mezclaron con un volumen de una solución 3 veces concentrada del tampón de
muestras de electroforesis (concentraciones finales: 10% (v/v) glicerol; 5% (v/v) ß-
mercaptoetanol; 2% (p/v) dodecilsulfato sódico (SDS); 0,0005% azul de bromofenol;
62,5 mM Tris-HCl). Con objeto de desnaturalizar las proteínas, las muestras se
sometieron a 100ºC durante 10 minutos en un calentador en multibloque.
El extracto celular se analizó mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en
presencia de dodecilsulfato sódico (Laemmli, 1970). Las muestras proteicas se
aplicaron en pocillos de geles de 10% (p/v) de acrilamida en el sistema de
electroforesis Hoefer miniVe (Amersham) y la electroforesis se desarrolló a 4ºC en
tampón 0,1% SDS, 200 mM glicina; 25 mM Tris; pH 8,3, durante 55 minutos a un
voltaje constante de 200 V. Uno de los pocillos del gel se reservó para una mezcla de
patrones proteicos coloreados de peso molecular conocido.
 Materiales y métodos 77

Tras el proceso electroforético, los geles se equilibraron durante 10 minutos en

tampón de transferencia (192 mM glicina; 20% (v/v)metanol; 25 mM Tris; pH 8,3) y
se transfirieron a una membrana de PVDF (previamente humedecida en metanol y
equilibrada en el mismo tampón) durante 2 horas (4ºC) a una intensidad de 300 mA.
Finalizada la transferencia, se incubó con PBS 0,01% Tween 20 con 3% leche
deslipidizada durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se realizó la
incubación con el anticuerpo primario (anti-sGC 1:1.000) durante toda la noche a
4ºC con agitación orbital continua. Tras la eliminación del exceso de anticuerpo
lavando con PBS +0,05% Tween 20, se realizó la incubación con el anticuerpo
secundario ligado a peroxidasa (anti-IgG HRP de conejo, 1:10.000) a temperatura
ambiente durante 1 hora. El exceso de anticuerpo secundario se lavó con tampón
PBS + Tween-20 y la membrana se reveló con el sustrato luminiscente (Pierce)
siguiendo las instrucciones del suministrador.
Para verificar que las dos bandas que aparecían correspondían a las dos subunidades
de la guanilato ciclasa soluble, se utilizaron los péptidos derivados bien de la
subunidad 1 o de la 1 que habían sido usados como antigenos para la producción
del anticuerpo de la casa Cayman. Tres blots con extractos celulares se revelaron en
paralelo bien con el anticuerpo anti-sGC sólo, o bien con éste mismo previamente
bloqueado con el péptido ( 10 g de anti-sGC + 200 ng de péptido ) o con el (
10 g de anti-sGC + 240 ng de péptido ) durante 10 min. La detección se realizó
normalmente con las concentraciones de anticuerpo secundario y los medios ya
descritos.
La captura de las imágenes de quimioluminiscencia, así como el análisis de las
mismas se realizó con el sistema Flúor-S de Bio Rad.
Con el objeto de asegurar que se había cargado la misma cantidad de proteína en
todas las calles, se procedió a la eliminación del anticuerpo anti-sGC de la membrana
y posterior detección de actina, considerada una proteína constitutiva cuya expresión
se mantiene constante (independientemente de los tratamientos a los que se sometan
las células). Para ello se trató la membrana con una solución 100 mM 2-
mercaptoetanol, 2% SDS; 62,5 mM Tris-HCl; pH=6,7 durante 30 minutos a 50 ºC
con agitación ocasional. Este tratamiento consigue romper la unión antígeno-
anticuerpo, de forma que se puede realizar la detección de otra proteína en la misma
membrana. Después de este tratamiento, la membrana se bloqueó con PBS-0,05%
Tween y 5% leche y se realizó la incubación con el anticuerpo primario anti- actina
en el medio de bloqueo a una concentración 1:1.000 durante toda la noche a 4ºC o 1
hora a temperatura ambiente. Se eliminó el exceso de anticuerpo por lavados con
PBS y se incubó con anti-IgG-HRP 1:5.000. El revelado y cuantificación se llevó a
cabo como se ha descrito anteriormente.
Inmunoprecipitación de guanilato ciclasa soluble
Para llevar a cabo estos experimentos se utilizaron células sembradas en placas de 6
pocillos a una densidad de 5x106 células/pocillo. El suero se retiró 24 horas antes del
78 Materiales y Métodos

experimento y las células se sometieron a diferentes tratamientos. Las células se

lavaron y se adicionaron 300 µL del tampón de lisis de composición 100 mM NaCl,
20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1% Nonidet-P40, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 200
µg/mL PMSF, 10 µg/mL leupeptina, 10 µg/mL pepstatina; pH=7,5. El extracto se
centrifugó en Microfuga a 14.000 xg durante 15 min a 4ºC. El sobrenadante se
recogió y con objeto de disminuir la unión inespecífica al anticuerpo secundario
utilizado para la inmunoprecipitación, estos sobrenadantes se incubaron durante 1
hora a 4ºC con dicho anticuerpo (anti-IgG de conejo generado en cabra y ligado a
agarosa) a una dilución de 1:18. Posteriormente estos extractos se centrifugaron en
Microfuga a 200 xg durante 1 min para precipitar el anticuerpo ligado a agarosa y el
sobrenadante se recogió para la incubación con el anticuerpo primario.
De estos sobrenedantes se tomó un volumen de cada muestra, que contenía la misma
cantidad de proteínas en todos los casos, y dichas fracciones se llevaron a un
volumen final de 1 mL con tampón de lisis 2% BSA en ausencia de detergente, al
que se añadió el anticuerpo primario (anticuerpo policlonalclonal frente a guanilato
ciclasa soluble generado en conejo) a una dilución de 1:100. Esta incubación se
realizó a 4ºC durante aproximadamente 15 horas.
Paralelamente a esta incubación el anticuerpo secundario se equilibró en tampón de
lisis que contenía 10% BSA (p/v) en una dilución 1:5. Se centrífugo a 200 xg 1 min
retirándose el sobrenadante y resuspendiéndose en un volumen pequeño de tampón
de lisis. A continuación se añadió el anticuerpo secundario a las muestras incubadas
con el anti-sGC, a una dilución final de 1:18 y se incubó durante 1 hora a 4ºC.
Posteriormente los tubos se centrifugaron, el sobrenadante se aspiró y el sedimento
de agarosa se lavó 5 veces con 1 ml de tampón de lisis pero sin inhibidores ni
albúmina. Finalmente el sedimento se solubilizó en 30 µl de tampón 10% (v/v)
glicerol; 5% (v/v) ß-mercaptoetanol; 3% (p/v) dodecilsulfato sódico (SDS); 0,005%
(p/v) azul de bromofenol; 62,5 mM Tris-HCl; pH 6,8. Con objeto de desnaturalizar
las proteínas los tubos se sometieron a 95ºC durante 5 minutos en un calentador en
multibloque y después se centrifugaron en Microfuga para eliminar las moléculas de
agarosa.

Determinación del estado de fosforilación de la guanilato ciclasa soluble

Los sobrenadantes obtenidos por inmunoprecipitación de la enzima, descrito en el
apartado anterior, fueron analizados mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (Laemmli, 1970). Las muestras
se aplicaron en pocillos de geles de 7,5 % (p/v) de acrilamida y la electroforesis se
desarrolló a 4ºC, manteniendo un voltaje constante de 200 V. Uno de los pocillos del
gel se reservó para una mezcla de patrones proteicos coloreados de peso molecular
conocido. La electroforesis se detuvo cuando la banda azul de bromofenol llegó al
final del gel. A continuación se procedió a transferirlo a una membrana de PVDF,
como ya se ha descrito.
 Materiales y métodos 79

El bloqueo de las membranas se realizó en tampón TBS (10 mM Tris-HCl; 150 mM

NaCl; 10 mM NaF; 0,05% Tween 20; pH=7,4) con 2% BSA. La incubación con el
anticuerpo primario se llevó a cabo en este mismo medio. Este medió se eligió por no
presentar grupos fosfato que pudieran competir en la unión de los anticuerpos anti-
fosfoserina, fosfotreonina y fosfotirosina con nuestra proteína. La presencia de NaF,
inhibidor de fosfatasas nos asegura que el estado de fosforilación de la guanilato
ciclasa soluble no se ve modificado durante el proceso de inmunodetección.
La fosforilación de los extractos se determinó mediante detección de residuos
fosforilados con anticuerpos específicos:
-para secuencias fosforiladas en residuos de serina (anti-pSer). La dilución del
anticuerpo primario fue 1:10.000. Los lavados se realizaron con medio TBS y la
incubación con el anticuerpo secundario, anti-IgM-HRP de ratón, se hicieron a una
dilución 1:20.000 en medio de bloqueo.
-para secuencias fosforiladas en residuos de treonina (anti-pThr). La dilución
del anticuerpo primario fué 1:10.000. El anticuerpo secundario utilizado fue anti-
IgG-HRP de ratón a una dilución 1:20.000.
-para secuencias fosforiladas en residuos de tirosina (anti-pTyr-HRP). El
bloqueo y lavados fueron como se ha descrito. La dilución del anticuerpo primario
utilizada fue 1:1.000. No fue necesaria la incubación con anticuerpo secundario ya
que el anticuerpo primario está unido a HRP.
En todos los casos el revelado se realizó con Super Signal Substrate de Pierce, como
se ha descrito previamente.

Determinación de catecolaminas de células cromafines

Para este tipo de experimentos, las células se sembraron en multiplacas de 24
pocillos a una densidad de 0,5 ó 1x106 cel/pocillo/ml de medio de cultivo.
Adrenalina y noradrenalina son moléculas con propiedades de óxido-reducción que
pueden detectarse gracias a este comportamiento químico. Para la determinación de
catecolaminas totales (A+NA), se utilizó la detección fluorimétrica. La técnica usada
en este trabajo de investigación explota estas características redox.
Este método se basa en la oxidación de las catecolaminas a sus derivados
fluorescentes trihidroxi indólicos (lutinas) (Elworthy, 1986). Esta oxidación tiene
lugar en presencia de oxidantes como ferricianuro y las catecolaminas llevan
rápidamente a cabo una ciclación dando lugar a las formas adrenocromo. Estas
formas adrenocromo o noradrenocromo se isomerizan tras el tratamiento con una
base fuerte y forman 1-metil-3,5,6-trihidroxi indol (adrenolutina) ó 3,5,6-trihidroxi
indol (noradrenolutina), respectivamente.
80 Materiales y Métodos

HO OH

CATECO LAM INAS

HO N
R
Figura II.3. Esquema de la
-4H
reacción de formación de
O OH
los derivados trihidroxi
FO RM AS
ADRENO CRO M O indol. (R=H, noradrenalina;
O N R=CH3, adrenalina).
R

HO OH

FO RM AS
HO N LUTINA

Las lutinas fluorescentes son compuestos muy inestables que rápidamente podrían
oxidarse dando lugar a derivados no fluorescentes. La adición de ácido ascórbico
junto con la base fuerte estabiliza la fluorescencia, alargando la vida de las lutinas
fluorescentes.
Para este experimento, las células se lavaron 2 veces con solución de Locke y se
preincubaron durante 30 min en esa misma solución. Dependiendo del experimento
particular las células fueron preincubadas con determinados agentes previo al
período de estimulación. La estimulación se realizó en un volumen final de 200 µl de
solución de Locke conteniendo el compuesto a estudiar su efecto sobre la secreción.
Tras el período de estimulación, el medio extracelular conteniendo las catecolaminas
liberadas se transfirió a tubos Eppendorf preenfriados a 4ºC y sobre las células se
añadieron 300 µl de 10 % (v/v) ácido acético. Las células se rasparon en esa solución
y se centrifugaron en Microfuga obteniéndose un sobrenadante que contenía las
catecolaminas no liberadas por las células. Las medidas se realizaron en cubetas para
fluorescencia que contenían 100 µl de medio extracelular ó 10 µl del sobrenadante
procedente de las catecolaminas no liberadas (en este caso se igualó a un volumen de
100 µl con solución de Locke). A las cubetas se añadieron 500 µl de tampón fosfato
(6 µM CuSO4, 0,2 M NaH2PO4; pH 7,0). La oxidación se disparó añadiendo 50 µl
de oxidante 2 mM K3Fe(CN)6 y la reacción se detuvo a los 5 minutos exactos con
500 µl de una solución conteniendo 1 N KOH y 8 mg/ml ascorbato. Las cubetas se
dejaron reposar al menos 5 min y se midió la fluorescencia de las mismas excitando a
una longitud de onda de 410 nm, registrándose la emisión a 520 nm.
 Materiales y métodos 81

800

Fluorescencia (u.a.)
600

400

200

0 1 2 3 4 5
Adrenalina (nmol)

Figura II.4. Ejemplo de recta de calibrado para la

determinación de catecolaminas mediante el método
fluorimétrico

Para conocer la cantidad de catecolaminas presentes tanto en el medio extracelular

como la que permaneció en el interior de las células tras el período de estimulación,
las medidas obtenidas se compararon con valores obtenidos para una serie de cubetas
con cantidades crecientes de adrenalina patrón a las que se sometió a idéntico
protocolo que a las muestras celulares. Para este fin se construyó una recta de
calibrado de rango 0,5-5 nmol de adrenalina. Como puede verse en el ejemplo de
recta patrón, dentro de ese rango se cumplió una perfecta linearidad y las
catecolaminas en las muestras se determinaron por interpolación en dicha recta.
EXPERIMENTOS DE PCR SIMPLE Y CUANTITATIVA
Extracción de ARN
Para la extracción del ARN total de células cromafines, se utilizaron células
sembradas a una densidad de 5.106 células por pocillo. El procedimiento de
extracción del ARN se realizó con un kit cuyo fundamento está basado en la
capacidad de unión del ARN a una membrana de gel de sílice en presencia de una
elevada concentración de sales (RNAeasy Midi kit, Quiagen). Se emplearon
raspadores celulares estériles para levantar las células de las placas y se utilizaron
600 µl de tampón desnaturalizante (conteniendo isotiocianato de guanidina y β-
mercaptoetanol, 10 µl/ml) para resuspender las células. Las muestras, una vez
disgregadas, se pasaron varias veces a través de agujas estériles de tamaño 20-G
(0,9mm Ø) para completar la homogenización y disminuir la viscosidad del lisado. A
continuación, se añadió un volumen igual de etanol, para conseguir las condiciones
óptimas de unión, y las muestras se centrifugaron a > 8.000 xg en columnas que
contenían la membrana de sílicagel a la que se unen por adsorción moléculas de
ARN mayores de 200 nucleótidos. Por tanto los ARN 5.8S, 5S y de transferencia
quedaron en el eluído. Después de cada extracción y de forma rutinaria, las muestras
82 Materiales y Métodos

de ARN se trataron con ADNasa I (RQ1 RNAse-Free DNAse, Promega) durante 1

hora a 37ºC, tras lo cual se limpiaron y se resuspendió el ARN en un volumen final
de 30-50 µl de agua estéril libre de ARNasas.
Cuantificación de ARN
En los ensayos de RT seguida de PCR-cuantitativa, la cantidad de ARN fue un factor
crítico y fundamental para mantener el rigor en la estimación de las cantidades
relativas en cada tubo de reacción. Por tanto, las muestras de ARN que se destinaron
a este tipo de experimentos se cuantificaron empleando un método fluorimétrico de
gran sensibilidad, que emplea el reactivo de Molecular Probes RiboGreenTM RNA
Quantitation Reagent. El RiboGreen unido a ARN tiene el máximo de excitación a
500 nm y el de emisión a 525 nm y permite una cuantificación de hasta 1ng/ml de
ARN.
RT-PCR simple
Las reacciones de RT-PCR simple se llevaron a cabo en un solo paso empleando el
kit Access RT-PCR System de Promega. La utilización de las dos enzimas en un solo
tubo de reacción se hizo posible gracias a las diferentes temperaturas a las que cada
una de ellas desarolla su actividad enzimática. La transcriptasa inversa AMV tiene
una actividad óptima a 48ºC y se inactiva a 94ºC, temperatura de desnaturalización a
la que comienzan los ciclos de PCR y aparece la actividad enzimática de la
polimerasa Tfl1.
En un volumen final de 25 µl por tubo o reacción, se añadieron, en un tampón
común, 0,05u de cada enzima, transcriptasa inversa AMV y polimerasa Tfl1, 1,5 mM
Mg2+, la mezcla de dATP/dCTP/dGTP/dUTP (0,2 mM cada uno), la pareja de
oligonucleótidos específicos para cada subunidad α y β (300 nM) y 0,5-1 µg de ARN
limpio y purificado. La reacción se desarrolló siguiendo el siguiente esquema:

45 min, 48 ºC 2 min, 94 ºC 40 ciclos 7 min, 68 ºC

Transcripción in Desnaturalización e 40s, 94 ºC desnaturalización Elongación
vitro inactivación de AMV 30s, 60 ºC anillamiento

1min 30s, 68 ºC elongación

Cada reacción de RT-PCR se realizó en paralelo con un control sin ARN y para cada
nueva muestra de ARN se realizó un control en el que no se añadió la transcriptasa
inversa AMV. De este modo en todo momento se tuvo la seguridad de que los
fragmentos amplificados en cada reacción correspondían a secuencias del ARNm
presente en las células.
Los oligonucleótidos específicos empleados para amplificar las subunidades y
fueron diseñados utilizando el programa de Applied Biosistems, Primer Express.
 Materiales y métodos 83

Subunidad Fordward Reverse pb

1 TTTGCAAACTGATTTT TATCCAGGCATAGGA 351

CCCA TGGATG
1 ACGTTACGAGCCCTG CTACCTCCCCTGTGTG 451
GAAG GATC

RT y PCR-cuantitativa: método de SYBR-green

El método que se empleó para la cuantificación de la expresión de las dos
subunidades de GCs de células cromafines, se basa en la detección directa de la
aparición de un producto de PCR mediante la medida de la fluorescencia emitida por
el complejo formado por SYBR green y la doble cadena de ADN en formación.
Dicho método permite una cuantificación relativa de la expresión de los genes en
estudio gracias a la normalización respecto a un gen de referencia, que suele ser de
los demominados “house keeping”, cuya expresión no debe variar a lo largo del
tiempo, entre distintos tipos celulares o como consecuencia de tratamientos
farmacológicos, y por tanto su amplificación por PCR permanecerá constante y
proporcional en cada experimento que se realice. En nuestro caso, el gen de
referencia elegido fue el del ARN ribosómico 18S ya que la expresión de los
habitualmente empleados, como el de la β-actina o la GADPH, no es tan constante
como se pensaba.
Puesto que la cuantificación final se basa en una normalización respecto al gen de
referencia, interesa que se amplifique en el mismo rango en que lo hacen los genes
que se estudian. Para conseguir ese rango de amplificación similar se utilizó la
técnica de “competimers”, primers cuyo extremo 3´OH está modificado, de manera
que no permiten la amplificación una vez pegados a sus secuencias complemetarias
en el ADNc (Competimer™ Technology, Ambion). En una reacción de PCR previa
se comprobó cual era la realción primer/competimer óptima (1:9, 2:8 ó 3:7) que
permitía una amplificación del gen de referencia dentro del rango de la que se
producía con los oligonucleótidos de las subunidades de GCs. La relación óptima
resultó ser 3:7 que se corresponde con la cantidad recomendada para el estudio de
genes con un nivel moderado de expresión.
El molde para la reacción de PCR es el ADNc sintetizado en una reacción previa de
transcripción inversa, en la que se pueden emplear como cebadores oligo-dT o
hexanucleótidos. La elección de unos u otros está sujeta a los requerimientos
experimentales y, en nuestro caso, teniendo como referencia un ARN ribosómico,
obligaron al empleo de los segundos frente a los primeros.
De modo que para la reacción de RT se añadieron, en un tampón común, 1,25U/µl de
transcriptasa inversa MultiScribe, 0,5U/µl de Inhibidor de ARNasa, 5,5 mM MgCl2,
84 Materiales y Métodos

la mezcla de dATP/dCTP/dGTP/dUTP (0,5 mM cada uno), hexanucleótidos (2,5

µM) y 1 µg de ARN limpio y purificado, para un volumen final de 25 µl por tubo. La
reacción tuvo lugar según se refleja en la siguiente tabla:

10 min, 25 ºC 45 min, 48ºC 5 min, 95ºC

Incubación Transcripción inversa Inactivación de la
enzima

Los ADNcs que fueron analizados en un mismo experimento, se obtuvieron en el

mismo día a partir de reacciones de RT paralelas para, de ese modo, evitar introducir
errores debidos a la posible variación “día a día/interdía” en la eficiencia de la
reacción. Además, siempre que el número de tubos lo permitió, se realizaron
premezclas de todos los componentes, a excepción del ADNc con el que se disparan
la reacciones, para minimizar los posibles errores de pipeteo.
Para cada reacción se añadieron 2,5 µl de tampón 10x, 1,5µl de MgCl2 25mM, 2 µl
de dNTPs (concentración final: 200 µMdATP, 200 µM dCTP, 200 µM dGTP y 400
µM dUTP), 0,25 µl de AmpliTaq Gold (5U/µl), la cantidad adecuada de primers
específicos y agua hasta un volumen final de 25 µl. La reacción de PCR se programó
según el siguiente esquema:

10 min, 95 ºC 40 ciclos 7 min, 68 ºC

Activación del enzima 40s, 94 ºC desnaturalización Elongación
AmpliTaq Gold 30s, 60 ºC anillamiento
45s, 68 ºC elongación

Análisis de datos
Los resultados presentados en este trabajo de investigación corresponden a un
mínimo de tres experimentos realizados en duplicado o triplicado y obtenidos a partir
de, al menos, dos preparaciones distintas de células. Los valores indicados en el texto
o presentados en los gráficos representan el valor medio ± la desviación estándar de
la muestra de valores experimentales.
Las curvas concentración-respuesta para obtener valores de EC50 ó IC50 se
ajustaron a un modelo sigmoidal de la forma logaritmo de la concentración frente a
la respuesta. Tanto para estos ajustes como para la propia realización de los gráficos
presentados en este trabajo se utilizaron los programas Figure Processor que emplea
el ajustador de ecuaciones Parameter Fitter (Biosoft), y Origin 6.0 para Windows.
 Materiales y métodos 85

Las comparaciones entre pares de valores medios se realizaron por medio de una
prueba t de Student. Las significaciones estadísticas indicadas en las figuras
corresponden a los valores: *** (diferencia extremadamente significativa) p< 0,001;
** (diferencia muy significativa) p<0,01; * (diferencia significativa) p<0,05; n.s.
p>0,05.
 Objetivos 87

El grupo en el que se ha desarrollado el presente trabajo había caracterizado con

anterioridad la vía de señalización basada en el NO/GMPc en las células cromafines
bovinas, así como su papel en la regulación del proceso neurosecretor. Debido al
enorme interés suscitado por los procesos en los que estaba implicado el NO, a los
diferentes mecanismos por los que este compuesto puede ejercer su acción y al gran
número de compuestos empleados como fuente de NO exógeno, en la literatura
existen numerosas controversias. Algunas de ellas surgen por el uso de diferentes
donadores y distintas concentraciones de NO. Actualmente se sabe que existen
distintos mecanismos implicados en las acciones del NO, dependiendo de la
concentración a la que este compuesto se produzca. A bajas concentraciones de NO
el principal sistema efector es la guanilato ciclasa soluble. Por tanto los objetivos
planteados en este trabajo fueron:

-La caracterización de diferentes donadores de NO, en cuanto a su capacidad

para producir NO en medios fisiológicos y su potencia para activar a la
guanilato ciclasa soluble.

-Estudiar los mecanismos implicados en la regulación de la actividad

guanilato ciclasa soluble, prestando especial atención a la posible implicación
de la vía de señalización del GMPc.

-Estudiar el efecto de tratamientos prolongados con bajas concentraciones de

NO sobre la actividad guanilato ciclasa soluble como posible causa del
fenómeno de tolerancia a nitrovasodilatadores.

-Analizar los mecanismos implicados en la desensibilización de la guanilato

ciclasa soluble tras estimulación prolongada con NO.

- Estudiar el efecto del tratamiento prolongado con un activador de la

guanilato ciclasa soluble (YC-1) independiente de la producción de NO.
 Resultados 89

1. LAS CÉLULAS CROMAFINES BOVINAS

Durante años, las células cromafines se han utilizado como modelo de secrección en
estudios sobre mecanismos endocrinos, funcionamiento nueronal y de la biología de
los procesos secretores. Las células cromafines derivan, durante el proceso de
embriogénesis, de los mismos precursores que las neuronas simpáticas, por lo que
presentan algunas propiedades en común con las neuronas, tal como la presencia de
canales de Na+ y Ca+ dependientes de voltaje y una variedad de proteínas
“específicas de neuronas” (Burgoyne , 1991).
La médula adrenal bovina está formada por un parénquima endocrino de donde se
aislan las células cromafines. Está constituida en aproximadamente un 50% por
células no cromafines, entre las que se cuentan células ganglionares, fibras nerviosas,
fibroblastos y células endoteliales, siendo estas últimas el tipo celular no cromafin
mayoritario (Kobayashi & Coupland, 1993). Esto determina que sea necesario un
proceso de obtención y purificación que permita el aislamiento de poblaciones de
alta pureza en cromafines, sin redundar en un menor rendimiento.
Como se ha descrito en el apartado de Materiales y Métodos, las características de
digestión de la médula permiten que, ajustando el tiempo de tratamiento, la corteza
permanezca intacta y no se produzcan contaminaciones con células corticales en
nuestros cultivos. Los dos métodos descritos, originan un rendimiento de
aproximadamente un 5% respecto al total de 500 millones de células cromafines que
se estima en las gándulas adrenales (Phillips et al., 1982). A pesar de éste bajo
rendimiento, el número de células que se suelen obtener, se puede considerar
razonable y suficiente para el tipo de ensayos que se aplican.
La figura muesta la fotografía de un cultivo de células cromafines 72 horas después
de su aislamiento y sembrado. Al observarlas en contraste de fase, estas células se
distinguen de manera practicamente inequívoca gracias a ciertas características como
la forma redondeada, un halo brillante, y su tendencia a agregarse entre sí. Muchos
autores han descrito que, con el tiempo en cultivo, estas células tienden a emitir
prolongaciones en forma de neuritas (Uinsicker et al, 1980). En las fotografías
presentadas se pueden distinguir principios de dichas prolongaciones.
Estudios morfológicos clásicos indican que las catecolaminas, adrenalina y
noradrenalina, se almacenan en distintas células en la glándula adrenal, diferenciando
por tanto entre células adrenérgicas y noradrenérgicas (Hillarp & Hökfelt, 1955;
Eranko et al., 1955). La diferencia principal entre ambos subtipos celulares, radica en
la presencia o ausencia de la enzima feniletanolamina-N-metiltransferasa (PNMT),
que transforma la noradrenalina a adrenalina por metilación. Estudios de
inmunofluorescencia, distinguiendo células cromafines por marcaje con anticuerpos
contra la enzima tirosina hidroxilasa, y entre ellas el subtipo adrenérgico por marcaje
específico con anticuerpos contra PNMT, han permitido determinar que la población
adrenérgica constituye, normalmente, un 80-85% de las células cromafines aisladas
en cultivo.
90 Resultados

En estudios previos realizados por nuestro grupo, se demostró que las células
cromafines bovinas presentan los elementos de la ruta NO-GMPc, esto es, NOS I,
GCs y PKG 1 (Rodríguez-Pascual et al., 1995a). Este hecho hace que éste tipo
celular sea útil en el estudio de los procesos mediados por la elevación de los niveles
de GMPc, inducidos por la activación de GCs. Estos estudios se basaron en la
medida de los niveles de GMPc, considerando ésta medida como una cuantificación
indirecta de la cantidad de NO que activa a la GCs. Los efectos del NO son
dependientes del tiempo y la dosis introducida.
 Resultados 91

Figura IV.1. Fotografía de células cromafines

bovinas en cultivo. Las fotografías muestran
tres cultivos de células cromafines. En el panel
A se marca una célula endotelial contaminante,
que se observa en un plano inferiror. En los
paneles B y C se marcan células cromafines con
prolongaciones en forma de neuritas.

C
92 Resultados

2. MOLÉCULAS DONADORAS DE ÓXIDO NÍTRICO

En la actualidad se dispone de varios tipos de agentes liberadores de NO:
diazeniodiolatos, más conocidos como NONOatos, S-nitrosotioles, nitrosocomplejos,
nitratos y nitritos orgánicos, sidnoniminos y aductos nucleófilo-NO. Estos
compuestos presentan efectos biológicos muy diversos, incluso a veces opuestos
entre sí (Chen & Schofield, 1993; Desole et al., 1994). Estas diferencias podrían
explicarse por las concentraciones empleadas de los diferentes compuestos, así como
los distintos tiempos de incubación y otras variaciones en las condiciones
experimentales.
Para nuestro estudio se seleccionaron cuatro donadores de NO: nitroprusiato sódico,
SNAP, DEA/NO y SPER/NO. El primero, pertenece al grupo de los nitritos
orgánicos, y ha sido ampliamente utilizado en los estudios relacionados con el NO;
se caracteriza porque, en ausencia de células, no es capaz de liberar el óxido nítrico.
El SNAP es uno de los S-nitrosotioles más utilizados. Este compuesto libera
espontáneamente NO y comparte con el SNP su sensibilidad a la luz. Los dos últimos
compuestos, el DEA/NO y SPER/NO son NONOatos, caracterizados por su
descomposición espontánea y consecuente liberación de NO en condiciones de pH
fisiológico.
Aunque existen algunos estudios sobre estos compuestos abordando las diferencias
entre los efectos obtenidos según del donador que se introduzca, y estudiando
parámetros de liberación y vidas medias de algunos de ellos, se ha comprobado que
los distintos tipos celulares utilizados, así como las condiciones experimentales
específicas, impiden que estos resultados puedan, en su conjunto, ser considerados
como una pauta válida para comparar y elegir un donador frente a otros (Ionnadis et
al., 1996; Keefer et al., 1996). Por eso, el primer paso de este trabajo se centra en la
caracterización de varios compuestos donadores de NO, de origen químico muy
diverso, siempre teniendo en cuenta las condiciones experimentales particulares de
nuestro modelo celular, para poder seleccionar el más adecuado a cada estudio en
particular.

2.1. LIBERACIÓN DE NO A PARTIR DE DISTINTOS DONADORES DE NO

Para determinar la cantidad de NO en el medio de incubación, utilizamos los dos
métodos ya descritos: la reacción de NO con hemoglobina reducida (Miles et al.,
1996; Privat et al, 1997; Murphy & Noack, 1994), y la determinación de nitritos
(Misko et al., 1993). Las determinaciones de NO y nitritos descritas en este apartado,
se llevaron a cabo tanto en ausencia como en presencia de células. En ausencia de
células no se pudieron obtener datos de liberación de NO a partir de SNP, ya que se
ha descrito que este donador precisa de algún mecanismo celular para liberar este
compuesto (Bates et al., 1991).
 Resultados 93

2.1.a. Determinaciones en ausencia de células

2.1.a.1. Determinación de la estequiometría de los donadores de NO
La cuantificación de los nitritos originados en el medio acuoso por reacción del NO
con el oxígeno, representa un fiel reflejo de la cantidad de NO que se ha liberado al
medio, ya que la generación de NO2- se produce de forma equimolecular respecto de
las moleculas de NO liberadas, y que a su vez los nitritos reaccionan 1 a 1 con el
compuesto utilizado para su determinación, el DAN, convirtiéndolo en NAT. Así,
conociendo la concentración de partida del donador y la cantidad de nitritos que se
detectan, obtenemos una relación de las moléculas de NO que se liberan por cada
molécula de compuesto inicial (tabla 1). Puesto que esta reacción se lleva a cabo en
medio ácido y los NONOatos se descomponen a este pH, la medida de nitritos nos
sirvió para determinar la estequiometría de la reacción de descomposición de
DEA/NO y SPER/NO.
Dado que no pudimos garantizar la descomposición de SNAP en ningún medio
específico, no fué posible establecer la estequiometría para este compuesto. En el
caso de SNAP, los valores que se reflejan en la tabla son las concentraciones de
nitritos y NO alcanzadas tras 15 min de incubación.

Tabla IV.1. PRODUCCION DE NO Y NITRITOS POR DONADORES DE

NO
Donador- Nitritos NO Etequiometría
NO
(µM) (µM)
(µM)

10 0.22 ± 0.03 0.19 ± 0.03 N.D.

25 0.44 ± 0.20 0.47 ± 0.09 N.D.
SNAP 50 1.08 ± 0.03 0.78 ± 0.07 N.D.
100 2.06 ± 0.05 2.28 ± 0.11 N.D.

1 1.15 ± 0.20 _ 1.15

DEA/NO 2.5 3.03 ± 0.34 _ 1.20
5 6.27 ± 0.81 _ 1.25
1 1.40 ± 0.30 _ 1.4
2.5 4.30 ±0.07 _ 1.72
SPER/NO 5 9.67 ± 0.38 _ 1.94
7.5 14.37 ± 0.50 _ 1.92
 94 Resultados

2.1.a.2. Liberación de NO al medio de incubación a lo largo del tiempo

Se realizó una cuantificación del NO que se había liberado a partir de una
concentración de donador, a lo largo de periodos de tiempo de hasta 60 min. El
ensayo se realizó mediante la oxidación de hemoglobina, producto que al reaccionar
con NO se fué acumulando en el medio en ausencia de células. La determinación de
la cantidad de hemoglobina oxidada presente en fracciones de medio recogidas a
distintos tiempos, nos proporciona una idea de la cinética de descomposición de cada
compuesto (figura 2). Las concentraciones de donadores estudiadas fueron, de 5 M
SPER/NO, 2,5 M DEA/NO, 100 M SNP y SNAP 250 M. La cantidad de NO
liberado por SNP, ha sido calculada de acuerdo al modelo propuesto por Brunner et
al. (1995).

5 DEA/NO
SPER/NO
2,5
4
2,0
[NO] µM

3
[NO] µM

1,5

2
1,0

1
0,5

0,0 0
0 10 20 30 40 50 60 0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (min) Tiempo (min)

6 SNAP 0,5 SNP

5 0,4

4
[NO] µM
[NO] µM

0,3
3
0,2
2

0,1
1

0 0,0
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (min) Tiempo (min)

Figura IV.2. Medida de NO en función del tiempo. Los

donadores se introdujeron en un medio a pH fisiológico, quedando
a las concentraciones especificadas en el texto, en presencia de
hemoglobina reducida. Fracciones de medio se fueron retirando y la
oxidación ocurrida determinada por espectrofotometría.

La representación semilogarítmica de estos valores, considerando la estequiometría

1,2 para el DEA/NO, 2 para la SPER/NO, según se calculó antes, y 1 para el SNAP
 Resultados 95

deducida según su estructura química, nos permitieron calcular la vida media para los
donadores.
Donador t1/2
SNAP 37± 4 hrs.
SPER/NO 37± 3 min.
DEA/NO 3.9± 0.2 min.

2.1.a.3. Velocidades de liberación de NO

Según los datos obtenidos en el apartado anterior, se representó la concentración de
NO obtenida por minuto, obteniendo el perfil de velocidad de liberación de NO (fig
3).
La cantidad de hemoglobina oxidada y aparecida en cada intervalo de tiempo a que
se recogió medio para realizar la medida, se calculó teniendo en cuenta la cantidad de
donador que ya se había descompuesto en los tiempos anteriores.

DEA/NO 2,5 µM SP/NO 5 µM

Figura IV.3. Velocidad de liberación

de NO. Representación de la cantidad
de NO liberado por una concentración
de donador a distintos tiempos. Medidas
realizadas en ausencia de células por
oxidación de hemoglobina.

2.1.b. Determinaciones en presencia de células

2.1.b.1. Liberación de NO a partir de donadores en función del tiempo
SNAP 250 µM
96 Resultados

Se midió la oxidación de hemoglobina en un medio en presencia de células, al que se

añadió una concentración de donador. La cantidad de NO liberado se calculó
midiendo la absorbancia en fracciones de medio recogido a distintos tiempos. La
medida de la oxidación de la hemoglobina, en un medio en presencia de células al
que se añade una determinada concetración de donador, nos permite evaluar la
cantidad de NO a la que están expuestas las células (figura 4).

5
NO (µM)

0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (min)

Figura IV.4. Liberación de NO a partir de donadores en

función del tiempo en presencia de células. Medida de la
liberación de NO por reacción con hemoglobina reducida a partir
de 5 µM DEA/NO („), 5 µM SPER/NO (z) y SNAP 500 µM (S)
en un medio con células. Los experimentos se realizaron por
triplicado y los datos representados son una media ± S.E. a partir
de tres preparaciones celulares diferentes.

No se pudo realizar este mismo estudio para el SNP, ya que se produjeron reacciones
redox, debidas probablemente a la estructura resultante tras la liberación del NO,
cuya acumulación en el medio da lugar a errores en la cuantificación.

2.1.b.2. Efecto de los donadores de NO sobre los niveles de GMPc en función del
tiempo
A las células utilizadas para este tipo de medidas, se les retiró el suero del medio,
como ya se ha descrito en Materiales y Métodos. Para medir la activación de la GCs
al añadir NO exógeno, se realizó una preincubación de las células con un inhibidor
inespecífico de fosfodiesterasas, el IBMX, a una concentración 0,5 mM durante 30
min previo a la adición del compuesto activador. Además, el IBMX se mantuvo en el
medio durante la estimulación, con el objeto de impedir que el GMPc sintetizado
fuera degradado por las fosfodiesterasas. La preincubación con el IBMX causa un
 Resultados 97

incremento de dos veces en los niveles de GMPc, siendo el contenido basal en

células cromafines bovinas de 1,9 ± 0,1 pmol/106 células.
Tras la preincubación, se añadió al medio una concentración de donador a partir de
una solución madre muy concentrada, de manera que la cantidad de NaOH 0,01 N
adicionado en el caso de los NONOatos, no modificó el pH del medio en que se
realizó la estimulación. También en el caso del DMSO en el que estaba disuelto el
SNAP, la cantidad incorporada al medio para lograr la concentración de donador no
fue nunca superior a un 2%; se realizaron controles introduciendo el vehículo que
demostraron no tener ningún efecto sobre los niveles de GMPc basales, ni sobre la
capacidad de respuesta a NO. En la figura se representan las cantidades de GMPc
acumulado a lo largo de la estimulación.
Las concentraciones de donadores utilizadas para obtener una estimulación máxima
de la enzima, se determinaron según la cantidad de NO que se había calculado que
liberarían. Así, para los NONOatos DEA/NO y SPER/NO, se eligieron
concentraciones de 2,5 y 5 M respectivamente. El DEA/NO, según se aprecia en la
figura 1, produce una elevación en los niveles de GMPc muy rápida, alcanzando el
máximo a los 10 min de incubación; si se mantiene durante tiempos más largos el
donador en el medio, los niveles de GMPc que se detectan disminuyen
significativamente. En cambio, la SPER/NO produjo un incremento en los niveles de
GMPc más lento, tardándose 30 min en alcanzar los valores máximos del nucleótido
cíclico; estos niveles son más sostenidos en el tiempo y su caida más lenta.
Por otro lado, el nitrosotiol SNAP produjo un incremento de los niveles de GMPc
extremadamente rápido y estable en el tiempo, alcanzándose el máximo a los 15 min
de incubación. Cuando introdujimos el SNP como sustancia donadora de NO
exógeno, obtuvimos también una elevación muy rápida de los niveles de GMPc en
los primeros 10 min de incubación. Tanto el SNAP como el SNP, mantuvieron los
niveles de GMPc elevados en tanto en cuanto el agente se encontraba presente en el
medio, debido a que presentan una t1/2 más larga y liberan NO durante más tiempo.

250 SPER/NO 200 DEA/NO

200
pmol GMPc/106 cels

150

150
100
100

50
50

0 0
0 10 20 30 40 50 60 0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (min) Tiempo (min)

50 SNAP SNP
250

40
GMPc/106 cels.

200

30
150

20 100
98 Resultados

2.2. PRODUCCIÓN DE GMPc EN RESPUESTA A DISTINTAS DOSIS DE

DONADORES DE NO
En el estudio de la dosis-respuesta a los distintos donadores de NO, se realizó una
preincubación con el inhibidor de fosfodiesterasas, como ya se ha descrito en el
apartado anterior.
Los efectos de la activación de la GCs obtenidos con los cuatro donadores
estudiados, fueron dependientes de la concentración añadida de éstos compuestos
(Fig 6), y el efecto máximo obtenido fue comparable en todos los casos,
alcanzándose unos niveles de GMPc de unos 150 pmol por 106 células. Los tiempos
de incubación con los compuestos donadores de NO, no fueron iguales para todos los
compuestos, si no que se ajustó según los resultados obtenidos en el apartado
anterior, para conseguir el tiempo al que la estimulación era máxima, y fueron de 15
minutos para SNAP, SPER/NO y SNP, mientras que el DEA/NO se midió a 10 min.
de estimulación.
 Resultados 99

Figura IV.6. Curvas dosis respuesta para la acumulación de

GMPc en respuesta a donadores de NO. Las células,
sembradas a una densidad de 106 por pocillo, se preincubaron
con IBMX 0,5 mM y después se estimularon con los donadores
de NO a concentraciones crecientes. Los experimentos se
realizaron por triplicado y los datos representados son una
media ± S.E. a partir de tres preparaciones celulares diferentes.

Gracias a este experimento se consiguieron establecer los valores de EC50 para los
cuatro compuestos. El DEA/NO demostró ser el donador más potente, con una EC50
de 0,38 ± 0,02 M. Una concentración del compuesto de tan solo 0,1 M, ya fue
capaz de producir un incremento de los nieles de GMPc, obteniéndose un máximo de
activación a 2,5 M. La adición de concentraciones mayores, de hasta 25 M
ensayados, no fue capaz de originar mayores incrementos del nucleótido cíclico.
Los valores de EC50 y concentración de de cada donador para obtener el máximo o el
umbral de activación, se representan en la tabla en concentraciones M para cada
compuesto.

Tabla IV.2. Concentraciones de donadores de NO y el NO producido por

ellos, que producen umbral de activación, activación máxima y estimulación
Umbral de EC50 Activación máxima
activación
Donador [Donador] [NO] M [Donador [NO] M [Donador [NO] M
M ] M ] M
SNAP 1 0.006 317± 42 1.8± 0.2 750 3.8± 0.4
SPER/NO 0.05 0.02 1.12± 0.5± 0.2 5 2.4± 0.2
0.46
100 Resultados

DEA/NO <0.05 <0.05 0.38± 0.5± 0.1 2.5 2.2± 0.5

0.02
SNP 5 N.D. 36.3± N.D. 100 N.D.
0.02

Es de particular interés el efecto que muestra el SNAP. Así como los otros donadores
una vez alcanzado el máximo de activación no fueron capaces de incrementar los
niveles de GMPc obtenidos, el SNAP muestra una disminución en dichos niveles al
introducir concentraciones superiores a 1 mM.
Se ha descrito que la presencia de glutation reducido en el medio, da lugar a una
facilitación de la liberación de NO a partir de nitrosotioles. Para comprobar si éste
efecto aparecía en nuestro modelo, y si ello daba lugar a un cambio en la
acumulación de GMPc por tratamiento con SNAP, se intrudujo en el medio de
incubación una concentración elevada de GSH. Como se muestra en la figura, el
cotratamiento con SNAP y glutation siguió el mismo comportamiento a dosis
crecientes de SNAP que en ausencia de glutation. A dosis altas de SNAP se previno
el incremento en la acumulación de GMPc, llegándose a alcanzar niveles del
nucleótido cíclico que representan tan sólo el 10% de la estimulación máxima
obtenida. Sin embargo, la curva dosis respuesta se encuentra desplazada dos ordenes
de magnitud a la izquierda respecto a la misma en ausencia del GSH. Esto apoya la
idea de que el glutation podría potenciar el efecto del SNAP, mejorando la liberación
de NO. Esta potenciación del efecto de SNAP podría ser debida a que el glutation
reaccionara con el NO formando nitrosoglutation, que se comporta como un
resevorio de NO, prolongando así el tiempo que el NO permanece activo en el medio
y capaz de provocar estimulación (Hogg et al., 1996; Chiueh et al, 1999).
De la misma manera y con el objeto de distinguir si la estructura disulfito resultante
tras liberarse el NO era la responsable del efecto de inhibición observado, se
procedió a realizar una incubación con el AP-SS. Este compuesto presenta la misma
estructura química que el SNAP pero sin el NOn. Como se observa en la figura 7, el
compuesto no produjo ningún efecto de activación, ni redujo los niveles basales.
Por otro lado, el AP-SS tampoco tuvo ningún efecto sobre la capacidad de activación
de la enzima por otro donador de NO diferente. Los experimentos presentados en la
figura 8, se realizaron por estimulación con SNP 100 M como fuente de NO,
introducido conjuntamente con SNAP, AP-SS, o DMSO tras la preincubación con
IBMX. Se comprobó que el DMSO a la concentracion máxima que se introdujo en el
medio (2,8%) no modificaba la capacidad de respuesta de la GCs. Del mismo modo,
el análogo del SNAP carente de NO tampoco redujo esta respuesta, mientras que la
misma concentración de SNAP, impidió el incremento de los niveles de GMPc por
encima de aquellos que se obtenían con el SNAP directamente. Estos representan un
25% de la repuesta máxima obtenida con SNP 100 M.
 Resultados 101

[SNAP] µM

Figura IV.7. Dosis-respuesta a SNAP en presencia de GSH. Dosis-

respuesta a AP-SS. Tras la preincubación de 30 min con IBMX, se
realizaron incubaciones de 15 min con el SNAP + GSH 1 mM (g) o
bien AP-SS (n). Los valores presentados corresponden a los
incrementos de GMPc tras sustraer los niveles basales como una media
± S.E. de tres experimentos realizados en triplicado.

200

160
pmol GMPc/10 cels
6

120

80
***
***
40

0
SNAP 5mM
Control SNAP 5mM AP-SS 5mM
+GSH 1mM

Figura IV.8. Capacidad de activación de GCs. Las células se

preincubaron 30 min en presencia de IBMX y a continuación 15 min con el
medio de estimulación sin (barras abiertas), o con SNP 100µM (barras
grises). Los valores presentados corresponden a los incrementos de GMPc
tras sustraer los niveles basales como una media ± S.E. de tres experimentos
realizados en triplicado
102 Resultados

3. ESTIMULACIÓN DE LA GCS POR YC-1.

A continuación introdujimos un nuevo compuesto sintético, el YC-1, que se ha
descrito como activador directo de la enzima GCs. Este compuesto, representa una
herramienta muy útil para mantener a la enzima GCs activada sin introducir NO en el
medio, evitando por lo tanto otros efectos reguladores que pueda tener el radical
sobre los elementos de la ruta.
En primer lugar quisimos comprobar que, en nuestro modelo experimental, el YC-1
era capaz de elevar de forma efectiva los niveles de GMPc. Los experimentos se
realizaron tanto en células cromafines como endoteliales. De esta forma pudimos
comparar la capacidad de este compuesto de inducir activación en distintos tipos
celulares, ya que se ha descrito que pueden existir diferencias muy importantes según
el modelo con el que se trabaje (Wegener et al., 1997).
Para llevar a cabo estas medidas de activación de la enzima, la células cromafines se
prepararon como en experimentos anteriores, retirando el suero 24 horas antes de la
determinación de GMPc. Sin embargo, las células endoteliales, que se mantienen en
cultivo con suero no inactivado, precisan de factores presentes en este medio para
mantener íntegra su funcionalidad. Por ello, a estas células se les retiró el suero tan
solo 4 horas antes de la estimulación, evitando así provocar alguna modificación en
el estado celular por ausencia de dichos factores.
El día del ensayo las células se preincubaron durante 30 min con IBXM 0,5 mM,
como se ha descrito anteriormente. A continuación se realizó la estimulación con
YC-1. El medio de estimulación, solución Locke, contenía 3 mg/mL de BSA para
permitir que, a altas concentraciones, el YC-1 se mantuviera estable en solución
(según especificaciones del suministrador). El tiempo de estimulación fue de 10 min.
Como se muestra en la figura, la activación de la GCs se produce de forma dosis
dependiente, tanto en células cromafines como en endoteliales. La EC50 calculada
para el YC-1 en células cromafines fue de 90,1±11,2 M. La introducción
simultanea en el medio de estimulación de 10 M ODQ con el objeto de inhibir la
GCs, redujo los incrementos del nucleótido cíclico obtenidos con todas las
concentraciones de YC-1 (fig 9, panel A). Estas observaciones demuestran que el
YC-1 activa de forma directa a la enzima.
Sin embargo, las células endoteliales no mostraron una activación tan significativa
como en el caso de las células cromafines (figura 9, panel B). A la máxima
concentración de YC-1 utilizada, los niveles de GMPc no llegaron a triplicar los
niveles basales. Al introducir el ODQ, la producción de GMPc se inhibió por
completo, llegando incluso a alcanzar concentraciones inferiores a la basal.
 Resultados 103

60 15
A B
***
50

pmol cGMP/10 cells ***

10 **
40
6

30 *
***

20 5
***

***
10 *

0 0
0,00 10 100 0,00 10 100
[YC-1] µM [YC-1] µM

Figura IV.9. Dosis-respuesta de YC-1 sobre los niveles de

GMPc acumulados. Estudio realizado en células cromafines
(panel A) o endoteliales (panel B). Los experimentos se
llevaron a cabo en ausencia (z) o presencia de ODQ 10 µM
(„).). Los valores presentados corresponden a los incrementos
de GMPc tras sustraer los niveles basales como una media ± SE
de tres experimentos realizados en triplicado.

No fue posible estudiar el efecto de dosis mayores de YC-1 dado que, al realizar
estimulaciones con concentraciones superiores a 500 M, las células perdieron
adhesión a las placas donde se habían mantenido en cultivo. Este efecto no se debió a
que la concentración de DMSO en el que se encuentra disuelto el YC-1 sea tóxica, ya
que ésta no superó nunca el 2%.
A pesar de que las respuestas en ambos tipos celulares son muy diferentes en cuanto
a su magnitud, quedó demostrado que en los dos casos el YC-1 es capaz de activar la
síntesis de GMPc y que éste efecto es prevenido por tratamiento con el inhibidor de
la GCs. Por lo tanto, el efecto del YC-1 está mediado por activación directa de la
enzima.
Se quiso comprobar si la activación de la síntesis de GMPc a través de NO, tenía una
respuesta comparable en los dos tipos celulares y, por tanto, las diferencias residían
en su capacidad de ser activadas por YC-1 en particular, o si la ruta estaba expresada
de forma diferente en ambos cultivos. Para ello introdujimos DEA/NO en cultivos de
células cromafines y endoteliales a una concentración 1 M, que había producido la
máxima estimulación en experimentos de dosis-respuesta.
104 Resultados

300 A B
***
*** 40
pmol GMPc/10 cels.

200 30
6

20
100
10

0 0
YC

YC
YC E M

YC E µM
D
EA

EA
-1

-1
+ 1µ

+
-1 A/N

-1 A/N
/N

/N
D

D
25
25

25 O

25 O
O

O
0µ

0µ
0µ 1µ

0µ 1µ
1
M

M
M M

M M
Figura IV.10. Efecto sinergístico de YC-1 con NO. Las células se
preincubaron con IBMX durante 30 min. A continuación se estimuló
durante 10 min con YC-1, DEA/NO o ambos simultaneamente. Los
valores presentados corresponden a los incrementos de GMPc tras
sustraer los niveles basales como una media ± S.E. de tres
experimentos realizados en triplicado.

La figura muestra una capacidad de activación muy diferente en ambos modelos

celulares, apareciendo una respuesta 16 veces superior en células cromafines que en
endoteliales cuando estimulamos con NO. Esta diferencia puso de manifiesto una
capacidad muy distinta de activación de la enzima GCs en los dos tipos celulares.
Por otro lado, se ha descrito con anterioridad una potenciación del efecto del NO por
el YC-1 (Hwang et al., 1999; Becker et al., 2000). Según el mecanismo de acción
propuesto para el YC-1, que se describe en la introducción, éste compuesto
prolongaría el tiempo de unión de los activadores gaseosos de la GCs, el NO y CO, a
la enzima. Esto conduciría, por tanto, a un tiempo de activación más prolongado,
además del incremento descrito en la velocidad máxima de la enzima (Friebe &
Koesling, 1998; Mülsch et al., 1997; Rothermund et al., 2000). La introducción
simultanea del YC-1 junto con DEA/NO como fuente de NO produjo un incremento
en los niveles de GMPc superior a los inducidos por cada uno de estos compuestos
por separado. Además, estos incrementos fueron superiores a la suma de los efectos
conseguidos por la estimulación con cada uno de ellos. De estos resultados podemos
concluir que el YC-1 presenta efecto sinérgico con el NO en cuanto a la activación
de la GCs, tanto en células cromafines como en endoteliales.
 Resultados 105

4. MODULACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA GCs

Las reacciones de fosforilación representan uno de los mecanismos más extendidos
en cuanto a la regulación de distintas respuestas biológicas. Esto implica la
activación de una proteína quinasa, que a su vez fosforile a una proteína diana,
modificando su estado y por tanto su actividad.
Según se ha descrito en la introducción, la ruta de activación NO-GCs tiene como
uno de sus efectores de señalización a la PKG. Esta kinasa es activada por el GMPc
y, una vez activa, es capaz de fosforilar a otras proteínas en residuos de serina y
treonina modificando su actividad (Lincoln & Cornwell, 1993; Francis & Corbin,
1994b).
Para las formas particuladas de la guanilato ciclasa se ha descrito como la
defosforilación de la enzima conduce a una desensibilización de la misma (Potter &
Garbers, 1994; Potter, 1998). Estudios anteriores han mostrado que la GCs se puede
fosforilar in vitro por proteínas quinasas dependientes de Ca2+ (PKC) y de AMPc
(PKA) incrementando su actividad (Zwiller et al, 1981, 1985; Louis et al. 1993). Sin
embargo, hasta el momento no se ha establecido si la PKG, elemento de la ruta NO-
GMPc, podría modular la actividad de la GCs.
4.1. DESENSIBILIZACIÓN DE LA GCs
En estudios anteriores se ha visto que una activación con un donador de NO como el
SNP, daba lugar a una “modulación negativa” dosis dependiente en una posterior
respuesta a estimulación por este mismo compuesto (Papapetropoulos et al., 1996b).
Sin embargo, en estos estudios no quedaba claro si este fenómeno era debido a un
efecto del NO propiamente dicho, o si estaba mediado por el segundo mensajero, el
GMPc.
Por ello, en primer lugar se realizaron experimentos encaminados a determinar si el
incremento en los niveles de GMPc y la activación de la PKG modificaban la
capacidad de respuesta a NO. Se incrementaron los niveles de GMPc con el péptido
natriurético de tipo C (CNP), capaz de interaccionar con un receptor de membrana
acoplado a una guanilato ciclasa particulada (Rodriguez-Pascual et al 1996). Para
ello las células se incubaron durante 5 minutos con CNP 100 nM y posteriormente se
estimularon con SNP 50 M 15 min, manteniendo la actividad fosfodiesterasa
inhibida.
La figura 11 muestra los resultados de la activación obtenida tras la estimulación
realizada, bien a continuación de la preincubación con CNP, o bien realizando
lavados intermedios con solución Locke en presencia de IBMX. Se observa como,
haciendo una estimulación a continuación del tratamiento con CNP, la respuesta
obtenida representa un 68% de la producida en células control no sometidas a
preincubación con CNP. Al introducir tiempos de lavado de hasta 25 minutos entre la
preincubación y la estimulación con NO, la respuesta se redujo a un 53% respecto al
106 Resultados

control. Cuando el tiempo de lavado fue mayor de 45 minutos, la capacidad de

respuesta se fué recuperando y llegó a alcanzar niveles control.

60

50 **
pmol GMPc/10 cels.

40 ***
***
6

30
***

20

10

0
0 10 25 45 60
Tiempos de lavado (min)

Figura IV.11. Inhibición de la respuesta a SNP por elevación

previa de los niveles de GMPc. Las células cromafines se
estimularon con 50 µM de SNP (barra abierta) en presencia de
IBMX 0,5 mM; las barras rayadas muestran experimentos donde,
previo a la estimulación con SNP, las células se habían sometido a
incubación con CNP 5 min, dejando después un tiempo de lavado en
ausencia de ningún agente estimulante (IBMX presente en el
medio). Los valores presentados corresponden a los incrementos de
GMPc tras sustraer los niveles basales como una media ± S.E. de
dos experimentos realizados por triplicado.

Dado que el incremento en los niveles de GMPc intracelular era capaz de producir
una desensibilización de la GCs a posteriores estimulaciones con NO, nos
planteamos la cuestión de si este efecto era debido a una activación de la proteína
quinasa dependiente de GMPc. Para ello introdujimos un análogo permeable del
nucleótido cíclico, el Sp-8-Br-PET-cGMPS, descrito como un activador potente y
selectivo de la PKG. Las células se preincubaron con diferentes concentraciones de
este compuesto en presencia de 0,5 mM IBMX durante 10 minutos, y después se
estimularon con 50 M SNP o basal durante 15 minutos. Previo al
radioinmunoensayo para la determinación del GMPc obtenido, se separó el análogo
del GMPc como se describe en Materiales y Métodos.
En la figura se muestra como el pretratamiento con el activador de la PKG resultó en
una disminución de la síntesis de GMPc respecto al control cuando las células se
estimularon con NO. El efecto mostró ser dosis dependiente. La activación de la GCs
en respuesta a SNP se redujo en un 42,3% por tratamiento con 7,5 M Sp-8-Br-
PET-cGMPS.
 Resultados 107

60

50

pmol GMPc/10 cels.

*** **
40

6
*** *** ***
30

20

10

0
0 0.5 1 2.5 5 7.5
[Sp-8-Br-PET-cGMPS] µM

Figura IV.12. Efecto de la activación de PKG sobre la

acumulación de GMPc inducida por estimulación con
SNP. Las células se preincubaron con concentraciones
crecientes del análogo de GMPc (barras grises) o control
(barra abierta) en presencia de IBMX y a continuación se
estimuló con SNP durante 15 min. Los valores presentados
corresponden a los incrementos de GMPc tras sustraer los
niveles basales como una media ± S.E. de dos experimentos
realizados por triplicado.

Tras comprobar que la activación de la ruta daba lugar a una desensibilización de la

GCs a un estímulo con NO y que este efecto podía estar mediado por la activación de
la PKG, introdujimos inhibidores de ésta proteína quinasa y de proteínas fosfatasas
alternativamente para determinar si se prevenía o potenciaba la desensibilización
(figura 13).
Así comprobamos que, al introducir el KT-5823, inhibidor específico de PKG,
conjuntamente con el CNP durante la preincubación, la respuesta a un estímulo
posterior con SNP era de la misma magnitud que la del control. Este hecho reafirmó
que la activación de la proteína kinasa G era responsable de la desensibilización de la
GCs.
Además, se introdujeron inhibidores de Ser/Thr fosfatasas esperando que potenciaran
el efecto inhibidor, dado que todo parecía indicar que éste se producía por una
fosforilación de la GCs por PKG. Sin embargo, los inhibidores utilizados, el ácido
okadaico, la caliculina A y la cipermetrina, no sólo no potenciaron este efecto, sino
que lo previnieron. Aunque los tres compuestos revirtieron el efecto de la
desensibilización, fue el efecto de la caliculina A el que presentó mayor significación
estadística. Este hecho indica que, la proteína fosfatasa implicada en el efecto, es
probablemente de tipo1 ó 2A.
108 Resultados

80
*** ***
***

pmol GMPc/10 cells

60 ***

6
40

20

0
Pretratamiento con CNP - + + + + +
Estimulación con SNP + + + + + +
KT-5823 - - + - - -
Cipermetrina - - - + - -
Acido Okadaico - - - - + -
Caliculina A - - - - - +

Figura IV.13. Prevención de la desensibilización por inhibición de PKG

o proteínas fosfatasas. Las células se trataron con 100 nM CNP en un
medio conteniendo IBMX 0,5 mM durante 10 min, seguido de un lavado de
25 min y estimulación con SNP 50 µM 15 min. Se ensayaron los inhibidores
KT-5823 0,5 µM, ac. okadaico 100 nM, cipermetrina 10 nM ó caliculina A
10 nM, los compuestos estaban presentes durante todo el tiempo de
incubación. Los valores presentados corresponden a los niveles de GMPc
obtenidos por estimulación con el SNP, restándoles el basal, dado como
media de tres experimentos realizados por triplicado ± S.E. a partir de
cultivos distintos. La significación estadística se calculó respecto a las
células prestimuladas con CNP (barra negra).

4.1.a. Implicación de las proteínas fosfatasas en la inhibición de GCs

Se estudió el efecto de las proteínas fosfatasas sobre la actividad GCs. Para ello, en
una primera aproximación se introdujeron inhibidores de distintas proteínas
fosfatasas y se midió la activación de la GCs en las células cromafines bovinas. Las
células, se sometieron a una preincubación de 10 min con los inhibidores de
proteínas fosfatasas en presencia de IBMX. Seguidamente se realizó una
estimulación con SNP, comparando la acumulación de GMPc inducida en cada caso.
Como se muestra en la figura, los compuestos inhibidores de proteínas fosfatasas
incrementaron de manera significativa y de forma similar entre ellos la capacidad de
activación de la GCs. Los incrementos sobre el control de activación fueron de 40,9
± 22% en el caso de caliculina A, de 28,9 ± 3,5% para ácido okadaico y de 36,9 ±
4,9% para la cipermetrina. Estos compuestos no modificaron los valores de actividad
 Resultados 109

basal. Los resultados sugieren que existe en las células una actividad tónica de
proteínas fosfatasas, que inhiben la actividad GCs sensible a NO.

100
cels. ***

80 ***
***
6

60
pmol GMPc/10

40

20

0
Ac

Ac
Co

Ca

Co
C ip

Ca

C ip
id o

id o
n tr

l ic u

n tr

l ic u
e rm

e rm
ol

ol
ok

ok
l in

l in
e tr

e tr
aA
ad

ad

aA
in a

in a
a ic

a ic
o

o
Figura IV.14. Incremento de la acumulación de GMPc por inhibición
de proteínas fosfatasas. Las células se incubaron con 0,5 mM IBMX y los
inhibidores de proteínas fosfatasas durante 10 min en el caso de caliculina
A y 30 min el ácido okadaico y la cipermetrina. A continuación se estimuló
con SNP 50 µM (barras grises) ó basal (barras abiertas) durante 15 min.
Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos representados son
una media ± S.E. a partir de tres preparaciones celulares diferentes.

Aunque existen pocas herramientas farmacológicas que activen específicamente las

proteínas fosfatasas, se ha descrito que el NECA (5´-(N-etilcarboxamido)adenosina)
es un activador de la actividad de proteínas fosfatasas citosólicas en células
cromafines, mediante la estimulación de un receptor de adenosina tipo A2b (Mateo et
al., 1995; Casado et al., 1992). Se planteó si la activación de las proteínas fosfatasas
afectaría, al igual que ocurría con su inhibición, a los niveles de GMPc, para lo cual
se analizó el efecto de la preincubación con NECA sobre los niveles basales de
GMPc y sobre la activación inducida por tratamiento con SNP.
Para este estudio se realizó una preincubación de 30 min con 100 M NECA,
concentración que produce el máximo incremento en la actividad fosfatasa (Mateo et
al., 1995). A continuación se realizó la estimulación con SNP 50 M o basal en
presencia de 0,5 mM IBMX. Como se observa en la figura, los niveles basales de
GMPc se incrementaron 1,5 veces en las células preincubadas con el NECA respecto
al control. Por el contrario, los niveles de GMPc obtenidos por estimulación con SNP
se redujeron un 50,5 ± 7,8% en células pretratadas con NECA respecto al control.
110 Resultados

La introducción de dos inhibidores de la actividad de proteínas fosfatasas durante el

tiempo de incubación con el NECA, bien la cipermetrina 10 nM o bien ácido
okadaico 100 nM, fueron capaces de prevenir esta reducción.

80

***
60
pmol GMPc/10 cels.

***
6

40

20

0
NECA NECA
C

C
on

on
C

C
C l

Ac
C

Ac ol
tro

tro
ip

ip
on
on

.o
er

er
.o
l

tro
tr

m o
ka
ka

l
et

et
da
da

rin

rin
ic
ic

a
o

Figura IV.15. Efecto de la activación de las proteínas fosfatasas

sobre los niveles basales y estimulados de GMPc. Tras la
preincubación con NECA, las células se estimularon con SNP
(barras grises) o basal (barras abiertas) en presencia de IBMX 0,5
mM durante 15 min. El tratamiento con ac. okadaico o cipermetrina
se realizó durante la preincubación con NECA. Los experimentos se
realizaron por triplicado y los datos representados son una media ±
S.E. a partir de tres preparaciones celulares diferentes.

El hecho de que tanto el pretratamiento con CNP, como se ha visto en el apartado

anterior, como la preincubación con NECA, redujeran la acumulación de GMPc
inducida por SNP y que en ambos casos los inhibidores de fosfatasas citosólicas
previnieran estos efectos, sugería que ambos compuestos podrían compartir un
mecanismo común que fuera responsable de la modulación negativa.
Las células se preicubaron con ambos compuestos simultaneamente, NECA y CNP,
para determinar si sus efectos eran acumulativos. Sin embargo, la inhibición causada
por ambas drogas conjuntamente fue equivalente a la producida por cada una de ellas
por separado, apoyando la idea de que ambos compuestos comparten un mismo
mecanismo.
 Resultados 111

4.1.b. Cambios en el nivel de fosforilación de la subunidad de la GCs en

respuesta a distintos tratamientos
Dado que, tanto la modificación de la actividad de la proteína kinasa G como de
proteínas fosfatasas producían una inhibición en la actividad de la GCs, iniciamos el
estudio del estado de fosforilación de las subunidades de la enzima, pensando que
fuera la modificación de éste estado el causante de la disminución en la actividad.
En primer lugar se realizó una inmunotransferencia a partir de extractos obtenidos de
células cromafines, utilizando un anticuerpo policlonal para las subunidades  y 1
de la GCs. Así se detectaron dos bandas de peso molecular 78 y 70 kDa,
correspondientes a las subunidades y respectivamente. La especificidad de estas
dos bandas detectadas se comprobó introduciendo alternativamente el péptido
correspondiente a cada subunidad. Estos péptidos se utilizan como inmunógenos para
la generación del anticuerpo, y en este caso como bloqueantes de la unión del
anticuerpo.
Anti-GCs

78 kDa

70 kDa

Control +pept.s +pept.s

ub.α ub.β

Figura IV.16. Inmunodetección de GCs en extractos de células

cromafines bovinas. Se realizó una electroforesis de 20 µg de GCs
purificada y se transfirió la proteína a membranas de PVDF, detectando
la GCs con 1 µg/mL de anti-GCs sólo (control) o previamente incubado
con 60 ng/mL de péptido α u 80 ng/mL de péptido β. Las flechas
indican la posición de las bandas correspondientes a los pesos
moleculares de 70 y 78 kDa. Los pesos moleculares se calcularon
utilizando patrones coloreados de precisión y amplio espectro (Bio-
Rad).

Seguidamente se estudió si la modificación de las actividades de proteínas quinasas y

fosfatasas afectaban al estado de fosforilación de la enzima GCs. Para ello ésta se
inmunoprecipitó a partir de extractos solubles de células cromafines, como se ha
descrito en materiales y métodos. Se realizó la electroforesis e inmunotransferencia
de los precipitados, y la detección con anticuerpos contra residuos fosforilados en
serina, treonina y tirosina. Aunque en experimentos de inmunodetección (Western
Blots) el anticuerpo reconoce ambas subunidades de la enzima, la
inmunoprecipitación se produce de la subunidad preferentemente, como se
comprueba según el peso molecular de la banda detectada. El marcaje con
anticuerpos anti-fosfotreonina y anti-fosfotirosina no reveló inmunorreactividad en el
112 Resultados

inmunoprecipitado. Sin embargo, cuando se utilizaron anticuerpos anti-fosfoserina,

apareció inmunorreactividad en la banda correspondiente al peso molecular de la
subunidad .
AntiPser

75 kDa

AntiGCs

Figura IV.17.A. Análisis de la GCs inmunoprecipitada. En el panel superior

aparece la imagen de un experimento representativo detectando residuos de Ser
fosforilados (anticuerpo clon 4 A9) en GCs inmunoprecipitada de células
sometidas a distintos tratamientos. El panel inferior muestra el resultado de la
incubación de la misma membrana con anti-GCs.

250
**

200
% Fosforilación

*
150

100 *
***
50

0
C

KT

N iper
on

EC

EC m
-5

C
P
tro

A+ etr
82
l

in
a

Figura IV.17.B. Estado de fosforilación de la GCs. Resultados de los

análisis densitométricos de las inmunodetecciones representados como la
media ± S.E. de tres experimentos diferentes. Los valores están normalizados
según la cantidad de fosforilación y de proteína GCs detectada, calculando el
cociente en cada experimento (anti-fosfoserina/antiGCs) para corregir las
variaciones en la carga.
 Resultados 113

Como se observa en la figura 17, la subunidad estaba fosforilada en condiciones

basales y el nivel de fosforilación disminuyó a un 55,3 ± 5,7% respecto al control
cuando las células se preincubaron con CNP durante 5 min seguido de 25 min de
lavado. En células tratadas con NECA durante 30 min, la fosforilación de la
subunidad disminuyó un 20% aproximadamente, mientras que la preincuabación
con KT-5823 produjo un incremento en la fosforilación detectada de 1,7 veces el
valor del control. Por otro lado, la incubación con NECA y cipermetrina
simultáneamente, duplicó los valores de fosforilación del control. La estimación de
estos valores se obtuvo haciendo un cociente con los datos de la densitometría de las
membranas incubadas con anticuerpos anti-fosfoserina, normalizando el valor
respecto a la cantidad de GCs detectada por el anticuerpo específico en estas mismas
membranas.
Paralelamente se realizó una estimación del estado de fosforilación a lo largo del
tiempo, para determinar si esta modificación de la proteína era responsable del
cambio en la actividad presentada en la figura 11. Tal y como se describió en el
apartado anterior, las células se incubaron durante 5 min con CNP 100 nM en
presencia de IBMX, seguido de un periodo de lavado variable tras el cual se estudió
su estado de fosforilación mediante inmunoprecipitación e inmunodetección con
anticuerpos anti-fosfoserina. La preincubación con CNP produjo una disminución de
la fosforilación de la enzima GCs. Este estado se mantenía hasta 25 min después de
la preincubación, y después la fosforilación comenzaba a recuperarse volviendo a
niveles similares a los obtenidos en condiciones de no estimulación.

100

80
% Fosforilación

60

40

20

0
0 10 25 45 60
C
on
tro

Tiempo de lavado (min)

l

Figura IV.18. Estado de fosforilación de la GCs en función del tiempo.

Cociente de la integración de los volúmenes de inmunodetecciones de
residuos de serina fosforilados respecto a la cantidad de GCs en la misma
membrana. Los resultados se representan como porcentajes respecto a un
control no tratado (barra abierta). Las células se preincubaron con 100 nM
CNP (barras grises), seguidas de periodos de lavado. Tras lisar las células se
inmunoprecipitó la GCs y se realizó una electroforesis y transferencia a
membrana. Se reveló el blot con anti-fosfoserina y se reprobó con anti-GCs.
Los valores representados corresponden a un experimento representativo.
114 Resultados

4.1.c. Efecto de la inhibición de PKG sobre los niveles de GMPc inducidos por
SNP
Se ha observado que la inhibición de la PKG por KT-5823 no sólo prevenía el efecto
inhibitorio del CNP, sino que era capaz de incrementar el nivel de fosforilación de la
subunidad de la GCs. Por ello se procedió a estudiar el efecto de éste y otros
inhibidores de PKG tanto sobre los niveles basales de GMPc, como en los
estimulados por SNP.
Los cuatro inhibidores de PKG ensayados produjeron un incremento en los niveles
de GMPc inducidos por NO. Como se puede apreciar en la figura 19, el orden de
potencias de los inhibidores reveló que el KT-5823 presenta un efecto equivalente al
del análogo de GMPc, el Rp-8-Br-PET-cGMPS. A su vez, ambos compuestos
demostraron ser más potentes que el H-8, y éste más que el otro análogo de GMPc
ensayado, el Rp-8-pCPT-cGMPS. El hecho de que la inhibición de la PKG tenga un
efecto potenciador sobre la acumulación de GMPc en las condiciones basales revela
que exisite una activación tónica de PKG en condiciones de no estimulación.
Además, la inhibición de la enzima quinasa produce un incremento muy significativo
de la activación de GCs.

175
***
***
150
pmol GMPc/10 cels.

125
***
6

100
***
75

50

25

**
0
C

KT

KT

R
on

-8

p-

p-

on

-8

p-

p-
-5

-5
8-

8-

8-

8-
tro

tro
82

82
pC

Br

pC

Br
l

l
3

3
-P

-P
PT

PT
ET

ET
-c

-c
-c

-c
G

G
G

G
M

M
M

M
PS

PS
PS

PS

Figura IV.19. Efecto de la inhibición de PKG sobre los niveles de

GMPc. Las células se trataron con 2µM H-8, 0,5 µM KT-5823 y 5
µM Rp-8-pCPT-cGMPS durante 30 min y 0,5µM Rp-8-Br-PET-
cGMPS durante 10 min en solución Locke con 0,5 mM IBMX. Tras
el periodo de preincubación, se realizó una estimulación con SNP 50
µM (columnas grises) o medio basal (columnas abiertas) durante 15
min. La figura muestra la media de cuatro experimentos realizado en
triplicado ± S.E. a partir de cultivos distintos.
 Resultados 115

Para comprobar si la potenciación observada era debida a un efecto específico sobre

la GCs, se estudió si la inhibición de PKG tenía algún efecto sobre la respuesta a
CNP. Como se observa en la figura 20, los niveles de GMPc alcanzados por
activación de la guanilato ciclasa particulada no se vieron modificados por el estado
de activación de la PKG. Por ello podemos concluir que los efectos observados son
debidos a cambios en la actividad de GCs.

50

pmol GMPc/10 cels. 40

30
6

20

10

0
H

KT
C

-8
on

-5
tro

82
l

Figura IV.20. Efecto de la inhibición de PKG sobre la

actividad de GC particulada. Las células se trataron con 2µM
H-8, 0,5 µM KT-5823 o basal durante 30 min en solución
Locke con 0,5 mM IBMX. Tras el periodo de preincubación se
realizó una estimulación con CNP 100 nM durante 10 min. La
figura muestra la media de cuatro experimentos realizado en
triplicado ± S.E. a partir de distintos cultivos.

Dado que la inhibición de PKG potenciaba la respuesta de la GCs a NO, procedimos

a comparar la eficacia del KT-5823 para incrementar los niveles de GMPc inducidos
por la activación con SNP, con su potencia en la inhibición de PKG. Para ello
realizamos experimentos de dosis respuesta en los que las células se incubaron
durante 30 min con concentraciones crecientes de KT-5823 y posteriormente se
estimularon con el SNP 50 M. Como se muestra en la figura 21, las
concentraciones crecientes de inhibidor dieron lugar a una mayor síntesis de GMPc
por parte de la GCs a igualdad de estímulo, estableciéndose una EC50 de 240 ± 5 nM.
Este valor se corresponde con el descrito por Grider et al. para la inhibición de PKG
(Ki= 234 nM) (Grider et al., 1993). Estos resultados apoyan la idea de que la
actividad de PKG modifica la capacidad de activación de GCs.
116 Resultados

150 ***

***

pmol GMPc/10 cells 125

***
6

100
***

75
*

50

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

[KT-5823] µmol/L

Figura IV.21. Representación del incremento de respuesta a SNP

en función de la inhibición de la PKG por dosis crecientes de KT-
5823. Las células se preincubaron 30 min en presencia de 0,5 mM
IBMX y dosis crecientes de KT-5823 (hasta 0,5 µM; dosis mayores
provocaron una pérdida de adhesión de las células a la superficie de
cultivo). Después se estimularon 15 min con SNP 50 µM manteniendo
el inhibidor de PKG. Los resultados se representan como media ± S.E.
de dos experimentos realizados por triplicado a partir de cultivos
diferentes.

Los mayores incrementos en GMPc producidos por estimulación de GCs con SNP
podrían ser debidos a una mayor sensibilidad de la enzima al NO, o podrían afectar a
los parámetros cinéticos de la enzima respecto a su sustrato, el GTP. Por ello se trató
de esclarecer cual era el mecanismo realizando dos curvas dosis-respuesta para SNP,
en presencia y ausencia de KT-5823 0,5 M. Los experimentos se realizaron como
en el caso anterior, preincubando las células durante 30 min con el inhibidor de PKG,
seguido de una estimulación de 15 min con SNP a concentraciones crecientes y así se
calcularon las EC50 para cada una de las condiciones. Estos experimentos resultaron
en una EC50= 58,3 ± 2,1 M para SNP en ausencia de la inhibición de PKG y EC50=
61,4 ± 3,03 M cuando la proteína quinasa había sido previamente inhibida. Como
se observa en la figura, el KT-5823 fue capaz de incrementar la acumulación de
GMPc inducida por todas las concentraciones de SNP ensayadas, alcanzándose un
máximo de activación con una concentración de SNP equivalente en ambas
condiciones del ensayo. Estos resultados muestran que, las cantidades de NO
necesarias para producir una activación submáxima y máxima de GCs, no se ven
modificadas por la inhibición de PKG, indicando que el estado de fosforilación de la
enzima no afecta a la interacción hemo-NO, y que las diferencias observadas en la
 Resultados 117

activación de ésta pueden ser debidas a la modificación de los parámetros cinéticos

de la enzima respecto a su sustrato.

400

•
pmol GMPc /106 cels.
300

200

100

0
0 10 100
[SNP] µM

Figura IV.22. Curvas dosis respuesta para los niveles de

GMPc inducidos por SNP en presencia o ausencia de KT-
5823. Las células se preincubaron durante 30 min en presencia
(círculos) o ausencia (triángulos) de 0,5 mM KT-5823 y se
estimularon con dosis crecientes de SNP durante 15 min. Los
resultados presentados corresponden a una media ± S.E. de dos
experimentos realizados en triplicado a partir de cultivos
diferentes.

4.1.c.1. Relación de la inhibición de PKG y Ser/Thr proteínas fosfatasas

Dado que, tanto la inhibición de PKG como la de Ser/Thr proteínas fosfatasas
originaban un incremento en los niveles de GMPc inducidos por SNP, se ensayó la
combinación de ambos tipos de inhibición. Este tipo de experimentos pretendió
determinar si los dos tipos de enzimas, que habían demostrado tener un efecto sobre
la actividad de GCs, actuaban al mismo nivel o si presentaban efectos
independientes, y por lo tanto sumatorios. Para ello, como se muestra en la figura, se
introdujeron tres inhibidores de PKG diferentes, así como dos inhibidores de
proteínas fosfatasas.
Como se puede observar en la figura 23, entre los dos inhibidores de PKG
introducidos, el KT-5823 induce una mayor potenciación de la respuesta a SNP que
el H-8, lo cuál se puede explicar por la mayor selectividad y especificidad del KT-
5823 respecto a la PKG. Este resultado apoya la idea de que la actividad de la PKG
conlleva una inhibición de la actividad GCs, con lo cual su inhibición conduce a la
potenciación de la respuesta a NO.
Por otro lado, el tratamiento con acido okadaico, inhibidor de la actividad fosfatasa,
conduce a una pequeña potenciación de la respuesta a NO, de lo cual se puede
deducir que la actividad tónica de estas fosfatasas también produce una inhibición de
118 Resultados

GCs. Sin embargo, la combinación de cualquiera de los inhibidores de PKG con el

ácido okadaico, alcanza el mismo nivel de activación de la GCs, a pesar de que el
KT-5823 y el H-8 presentan efectos de distinta magnitud por sí mismos. Por una
parte, el hecho de que la inhibición de PKG por KT-5823 conjuntamente con la de la
actividad fosfatasa no supere el nivel de activación obtenido con el primero, indica
que la inhibición completa de la PKG bloquea de por sí la ruta de modulación de la
actividad GCs. Además, el hecho de que el cotratamiento de H-8 con el ácido
okadaico potencie el efecto del primero hasta alcanzar el mismo nivel que el
producido por el KT-5823, no viene sino a confirmar que, tanto la PKG como la
actividad fosfatasa están implicadas en la modulación del estado de la GCs y que la
activación de cada una de ellas está relacionada con el de la otra.

*
300
% Respuesta

200

100

0
Co

Ac

H-

H-

KT

KT c. o
8

8+
.o
nt

-5

-5 ka
A
ka
ro

82

82 da
Ac
l

da

3+ ico
.o
ico

ka
da
ico

Figura IV.23. Efectos de la combinación de inhibidores de fosfatasas y PKG

sobre el incremento de GMPc inducido por SNP. Los inhibidores de PKG, H-8 2
µM y KT-5823 0,5 µM, se incubaron con las células 30 min en presencia de IBMX
0,5 mM. A continuación se estimularon con SNP 50 µM durante 15 min. El mismo
protocolo se aplicó para el inhibidor de fosfatasas, ácido okadaico 100 nM y la
combinación de ambas clases de inhibidores. Los valores de GMPc obtenido se
compararon con un control de estimulación sin ningún pretratamiento (barra
abierta). La figura muestra la media ± S.E. de tres experimentos realizados en
triplicado con distintos cultivos. La diferencia entre todos los tratamientos y el
control son muy significativas (p<0.001).

Siguiendo con el estudio, se probaron los efectos de otro inhibidor de fosfatasas, la

caliculina A, sola y en combinación con el ya ensayado KT-5823. También se
introdujo un inhibidor de PKG análogo de GMPc, el Rp-8-Br-PET-cGMPS. Como se
puede ver en la figura, los resultados fueron similares a los obtenidos en el ensayo
anterior. Tanto la caliculina A, como el Rp-8-Br-PET-cGMPS produjeron un
incremento de la respuesta a SNP, siendo superior el efecto cuando era la PKG la que
 Resultados 119

se bloqueaba directamente. Además, la inhibición simultanea de PKG y proteínas

fosfatasas no superó la potenciación de la respuesta obtenida con KT-5823 ó Rp-8-
Br-PET-cGMPS, indicando de nuevo la existencia de un mecanismo común de
modulación de la actividad GCs.

300
% Respuesta

200

100

0
KT
C
C

KT

R
al
on

p-

p-
-5

-5

+C
ic

8-

8-
tr o

82

82
ul

Br

Br
al
l

in

3+

ic
PE

PE a A
a

ul
C
A

T-

T-
in
al

cG

cG
ic
ul

M
in

PS

PS
a
A
Figura IV.24. Efecto de la inhibición de proteínas fosfatasas y PKG sobre los
incrementos de GMPc inducidos por SNP. Los inhibidores de PKG, Rp-8-Br-
PET-cGMPS 0,5 µM y KT-5823 0,5 µM, se incubaron con las células 30 min en
presencia de IBMX 0,5 mM. A continuación se estimularon con SNP 50 µM durante
15 min. El mismo protocolo se aplicó para el inhibidor de fosfatasa, caliculina A 50
nM y la combinación de ambos inhibidores. Los valores de GMPc obtenido se
compararon con un control de estimulación sin ningún pretratamiento. Los
resultados se expresan como porcentaje de respuesta. La figura muestra la media ±
S.E. de tres experimentos realizados en triplicado con distintos cultivos. La
diferencia entre todos los tratamientos y el control son muy significativas (p<0.001).

4.2. EFECTO DE LA TOXINA PERTÚSICA SOBRE LA ACUMULACIÓN

DE GMPc
Se ha descrito con anterioridad que la subunidad β de la enzima guanilato ciclasa
soluble, purificada a partir de pulmón bovino, es susceptible de sufrir ADP
ribosilación (Tomita et al., 1997). Por este motivo y con el objeto de describir si ésta
modificación de la enzima podría ser otra de las formas de regulación de GCs, se
probó el efecto de la toxina pertúsica sobre la respuesta a NO.
Así, se realizaron experimentos en los que se preincubaron células cromafines con
toxina pertúsica a una concentración de 1 g/mL durante 4 horas, o bien 100 ng/mL
durante 24 horas. A continuación se sometió a estas células a una estimulación con
120 Resultados

un donador de NO, el DEA/NO 1 M durante 10 min, que origina una acumulación

máxima de GMPc, según se ha visto en capítulos anteriores de resultados. En la
figura 25 se aprecia como ambos tratamientos con la toxina originaron una reducción
de la respuesta a NO de aproximadamente un 50% respecto al control. Además, los
valores conseguidos con ambas condiciones de tiempo y concentración, resultaron
ser muy similares. Es decir, el tratamiento con toxina pertúsica originaba sobre la
actividad de GCs un efecto inhibidor. Este efecto inhibitorio sobre la producción de
GMPc estimulada por NO, no ha sido observada en experimentos realizados con la
enzima purificada. Esta discrepancia podría ser explicada por el hecho de que el
tratamiento de las células con toxina pertúsica produce ADP-ribosilación de
diferentes proteínas G; del tipo Gi (Stryer & Bourne, 1986; Sontag et al., 1991). La
ADP-ribosilación de estas proteínas podría alterar otras vías de señalización, que
sean responsables de la inhibición observada. Esto plantea la posibilidad de que la
ADP-ribosilación de proteínas G desencadene algún cambio a nivel de segundos
mensajeros que, a través de diferentes rutas señalizadoras, diera lugar a la inhibición
de la producción de GMPc inducida por NO.

160
pmol GMPc/10 cels.

120
6

***
80 ***

40

**
0
C

PT µg/
C

PT µg/

PT 0 n

PT 0 n
on
on

X ml
X ml

1 l
1 l

X g/m
10 h

X g/m
10 h
tro
tro

4
4

24

24
h l

h l

Figura III.25. Efecto de Toxina Pertussis sobre la acumulación de

GMPc inducida por DEA/NO. Las células se preincubaron con las
concentraciones de toxina y los tiempos indicados. A continuación se
lavaron dos veces y se estimularon durante 10 min con DEA/NO 1 mM
en presencia de IBMX 0,5 mM o basal (0,5 mM IBMX). Los resultados
presentados son la media ± S.E. de tres experimentos realizados en
triplicado a partir de distintos cultivos.

Por otro lado se observó que el tratamiento de 4 horas había producido un

incremento sobre los niveles basales de GMPc. Este hecho se correlaciona con el
descrito por otros autores de activación de la GCs de forma independiente de NO,
por ADP-ribosilación directa de la enzima (Tomita et al., 1997; Sanchez-Margalet et
al., 1994 y 1996). Esto conduciría a un incremento de los niveles de GMPc,
 Resultados 121

desencadenando la activación de la proteína quinasa G, que como se ha demostrado

en el apartado anterior, conduce a la inhibición de la actividad GCs.

5. EFECTO DEL TRATAMIENTO CON AGENTES ESTIMULADORES DE

LA RUTA DURANTE PERIODOS PROLONGADOS
Como se ha descrito en los capítulos anteriores, la actividad de la enzima GCs está
regulada por el estado de fosforilación de ésta. Este mecanismo de regulación se
manifiesta tras periodos cortos de estimulación de la enzima, y la inhibición de la
misma desaparece unos 45-60 min tras retirar el agente estimulante. Sin embargo,
cuando se somete a pacientes con deficiencias cardiovasculares a tratamientos con
donadores de NO, aparece el fenómeno descrito como tolerancia. A pesar de que se
trata de un problema bien definido e identificado en el caso de tratamientos in vivo,
no se ha descrito cual es el mecanismo molecular responsable del mismo. Por ello, en
este capítulo el objetivo será estudiar el posible mecanismo a nivel de la ruta NO-
GMPc-PKG.
Dado que la GCs es la enzima responsable del incremento en los niveles de GMPc,
se podría pensar que ésta enzima fuera también el punto donde se produce la
regulación de la vía (Kharitonov et al., 1997). Además, estudios anteriores han
demostrado que el tratamiento con NO da lugar a una menor respuesta de la GCs a
una nueva estimulación con NO. En sentido contrario se ha encontrado que una
inhibición de la síntesis endógena de NO, conduce a una mayor sensibilidad de la
enzima GCs a estimulación por NO (Moncada et al, 1991b; Papapetropoulos et al.,
1996b).
Aunque el mecanismo implicado en este fenómeno todavía no se conoce, se ha
postulado que la oxidación de determinados grupos tioles de la proteína podrían
explicar la desensibilización de la misma.
También se ha barajado en múltiples ocasiones la posibilidad de que exista una
disminución en los niveles de proteína, es decir, una menor cantidad de GCs, después
de someter a las células a tratamientos con NO durante periodos prolongados de
tiempo ( Baltrons & García, 1999).
Como fuente de NO se ha utilizado un donador de la familia de los NONOatos, el
DETA/NO, que en medios a pH fisiológico y a 37ºC tiene una vida media de 20
horas y una estequiometría de 2 moléculas de NO por molécula de DETA/NO. El
donador de NO se renovó en el medio de cultivo cada 24 horas en el caso de
estimulaciones de 48 horas y superiores. Teniendo en cuenta la velocidad de
descomposición, la estequiometría, la constante de oxidación y la concentración de
O2, con una concentración de donador de 50 M se estaría manteniendo una
concentración de NO en torno a 0,7 M. La incubación con NO se lleva a cabo en
ausencia de inhibidores de fosfodiesterasas.
122 Resultados

5.1. ESTUDIO DE LA MODULACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA GCs

TRAS TRATAMIENTOS PROLONGADOS CON NO O YC-1
En primer lugar se estudió si la capacidad de activación de la enzima GCs se veía
modificada por el tratamiento con el donador de NO, DETA/NO, durante tiempos de
24 y 48 horas.
Para ello se mantuvieron las células en el medio de cultivo, al que se añadieron
diferentes concentraciones del donador DETA/NO. El suero se retiró del medio de
incubación 24 horas antes de realizar la medida. Transcurrido el periodo de
tratamiento, se midió la cantidad de GMPc acumulado por las células, así como la
cantidad de segundo mensajero que era capaz de sintetizar la enzima en respuesta a
un estímulo con NO en forma de DEA/NO 1 M durante 10 min en presencia de
IBMX.
Los valores de nucleótido cíclico detectados tras 24 y 48 horas de tratamiento con el
NO, presentaron un incremento moderado respecto al valor basal de células no
tratadas. Sin embargo, la respuesta al estímulo presentó diferencias muy
significativas, como se observa en la tabla que resume los resultados obtenidos.
Además, paralelamente se realizó un control del estado celular, para evitar que las
diferencias en la actividad de la enzima pudieran estar influidas por una pérdida de
células, o una toxicidad del agente estimulante. La cuantificación de proteínas reveló
que no existía una pérdida de células.

Tabla IV.3. Efecto del tratamiento prolongado con

NO sobre la actividad GCs
%Actividad %Actividad
Tratamiento (conc.) 24 h tto. 48 h tto.
DETA/NO 5 M 67,5 ± 1,6 68 ± 1,7
DETA/NO 10 M 71,5 ± 6,2 73,8 ± 4
DETA/NO 25 M 65,4 ± 5,03 63,3 ± 2,1
DETA/NO 50 M 65,1 ± 4,5 41,07 ± 7,5

Los resultados presentados en la tabla corresponden a una media ±

S.E. de tres experimentos realizados en triplicado a partir de
distintos cultivos.

Mediante tinción con azúl tripan y por un estudio de viabilidad celular (ver
Materiales y Métodos), se excluyó que las diferencias observadas se debieran a un
menor número de células. A los valores originales se les restó la cantidad de GMPc
que aparece en condiciones basales, y se corrigieron respecto a cantidad de proteína
cuantificada en cada una de las condiciones. El valor control expresado en pmoles de
 Resultados 123

GMPc por mg de proteína fue considerado como el 100% de activación, refiriéndose

a éste los demás valores presentados.
Una vez comprobado que tras someter a la GCs soluble a dosis de NO que mantienen
la ruta activada durante tiempos largos, su capacidad de respuesta se ve
significativamente disminuida, comprobamos si este efecto era mediado por la propia
actividad de la enzima. Para ello, repetimos el mismo estudio utilizando como agente
estimulante el YC-1, cuya capacidad de activar la ruta ha sido previamente
demostrada, considerando que su efecto está mediado por activación directa de la
GCs.
Así, se sometieron las células en cultivo a tratamientos con dosis crecientes de YC-1
durante 24 y 48 horas. Durante estos periodos de incubación no se retiró el suero del
medio, dado que el compuesto precisa de la presencia de éste para mantener su
solubilidad, como se ha explicado en materiales y métodos. Al igual que en el
apartado anterior, tras la preincubación con el agente, las células se sometieron a un
estímulo de 10 min con DEA/NO 1 M en presencia de IBMX.
Los valores de GMPc detectados en las células tratadas con YC-1, pero no sometidas
a la estimulación posterior con DEA/NO fueron 1,52; 2,04 y 2,5 veces el valor del
basal no tratado, en incubaciones con YC-1 10, 50 y 100 M respectivamente
durante 24 horas. En tratamientos de 48 horas, estos incrementos del nivel basal
fueron de 2,3; 2,28 y 2,13 veces a las concentraciones especificadas.
La característica propia del YC-1 de potenciar los efectos del NO, obligó a tomar
unos controles de estimulación particulares para cada concentración de YC-1
ensayada. Estos controles se hicieron introduciendo la concentración de DEA/NO
que se utiliza para la estimulación, junto con la concentración de YC-1 presente en
cada una de las condiciones de preincubación. Los niveles de GMPc obtenidos tras
10 min de estímulo fueron los valores de referencia o control respecto a los cuales se
estimó la variación en la actividad de la GCs.
El estudio de la cantidad de proteínas, reveló que existía una pérdida de células del
cultivo. La cuantificación de las mismas nos permitió ajustar la actividad a la
cantidad de proteína en cada caso, comparando así los valores obtenidos con el
control de estimulación. La tabla presenta los valores obtenidos en porcentaje de
activación de la enzima respecto al control. A los valores originales se les restó la
cantidad de GMPc que aparece en condiciones basales, y se corrigieron respecto a
cantidad de proteína cuantificada en cada una de las condiciones. El valor control
expresado en pmoles de GMPc por mg de proteína fue considerado el 100% de
activación.
124 Resultados

Tabla IV.4. Efecto de la activación prolongada de

GCs sobre su capacida de respuesta a NO
%Actividad %Actividad
Tratamiento (conc.) 24 h tto. 48 h tto.
YC-1 10 M 88,37 ± 18,7 72,88 ± 6,1
YC-1 50 M 43,8 ± 11,2 37,9 ± 5,3
YC-1 100 M 36,9 ± 2,4 30,5 ± 8,1
Los resultados presentados en la tabla corresponden a una media ± S.E.
de tres experimentos realizados en triplicado a partir de distintos
cultivos.

La pérdida de células descrita, causada por el tratamiento con YC-1, dió lugar a un
estudio más profundo que se presenta en un capítulo posterior.
Como se ha visto, el tratamiento con agentes que activan la vía NO-GMPc durante
periodos superiores a 24 horas, produce una disminución de la respuesta de GCs a
NO. Con el fin de determinar cuando empieza a ser detectable este efecto, realizamos
un estudio con DETA/NO 50 M en intervalos de tiempo de 2, 4, 8, 24, 48 y 72
horas. En el momento de la estimulación, se retiró el medio y se añadió Locke
normal con el DEA/NO 1 M o bien YC-1 250 M durante 10 min.
La producción de GMPc en respuesta a DEA/NO disminuyó de forma muy
significativa en células tratadas con DETA/NO, alcanzándose la máxima reducción
en las células sometidas a tratamiento durante 24 ó 48 horas.
Los valores de activación se representan como pmol GMPc/mg prot, de forma que se
corrigen las pérdidas de células que se han descrito en el caso de tratamientos con
YC-1.

900
A
800
pmol GMPc/ mg prot.

700

600

500

400
0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tiempo (horas)
 Resultados 125

1500

B
1250
pmol GMPc/ mg prot.

1000

750

500

250

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tiempo (horas)
Figura IV.26. Efecto de diferentes tiempos de tratamiento con
DETA/NO sobre la estimulación de GCs. La incubación se realizó con
una dosis 50 µM DETA/NO y a continuación se estimuló con DEA/NO 1
µM (A) o YC-1 250 µM (B)10 min en presencia de IBMX 0,5 mM. Los
valores presentados son una media ± S.E. de dos experimentos realizados
en triplicado a partir de cultivos diferentes.

5.1.a. Importancia del estado reductor de la célula para la inducción de

tolerancia a NO.
Diferentes autores han descrito la importancia que puede tener el estado reductor de
las células en la interacción de determinadas moléculas de carácter oxidante, como el
NO, con proteínas celulares (Dierks & Burstyn, 1998). Aparte de sus dianas
específicas, el NO y sus derivados (NOx) pueden reaccionar con grupos tioles de
proteínas. La nitrosilación de estos grupos en enzimas o proteínas estructurales,
puede contribuir a modificar sus funciones por cambios en la estructura de los sitios
catalíticos y/o alostéricos (Becker et al., 1995). Esto nos sugirió la posibilidad de que
el efecto inhibitorio que aparecía en tratamientos prolongados con NO pudiera estar
mediado, al menos en parte, por un cambio en la estructura de la enzima GCs que la
hiciese más sensible a degradación ó modificara su actividad.
Para comprobar si, efectivamente, un cambio en el estado reductor de la célula y, por
lo tanto en la capacidad de neutralizar interacciones no deseadas con proteínas,
modificaba en algún sentido la regulación de la vía en los tratamientos a largo plazo
con NO, introdujimos dos sustancias de efecto opuesto. Uno de ellos , el BSO, es un
inhibidor de la síntesis de novo de glutation reducido. Su presencia en el citosol
conllevaría una disminución en la capacidad reductora de la célula. Por el contrario,
el análogo permeable del glutation, glutation-metilester, incrementaría la cantidad de
126 Resultados

moléculas con poder reductor en el medio intracelular, potenciando la capacidad de

la célula de neutralizar interacciones no deseadas con proteínas.
El estudio se realizó introduciendo alternativamente el BSO o el glutation-metilester
en el medio de cultivo, solos o conjuntamente con DETA/NO, y observando si
modificaban en algún sentido el efecto inhibidor de este último. Los tratamientos se
mantuvieron durante 48 horas, tras lo cual las células se sometieron a estimulación
con DEA/NO 1 µM.
A
***

6 DETA/NO tto.48 h
pmol GMPc/10 cels.

**
*
6

200
* B
160
pmol GMPc/10 cels.

***
6

120
***
DETA/NO tto.48 h
80

***
40

0
BSO BSO
C

G
C

on

SH
on

SH

0,

1
1
0,

tr o

5
tro

m
-M
-M

m
5

M
l
l

E
m
E

M
M

Figura IV.27. Modificación de la respuesta a DEA/NO por el estado

reductor de las células. En el panel A se han representado los niveles de
GMPc obtenidos para los distintos tratamientos indicados en presencia (barras
rayadas) o ausencia (barras abiertas) de DETA/NO durante la incubación con
los compuestos. En el panel B aparecen los valores de GMPc obtenidos por
estimulación de las células con DEA/NO 1 µM durante 10 min tras haber
mantenido a las células con los tratamientos indicados una vez restados los
valores basales de cada condición que aparecen en A. Los valores presentados
son una media ± S.E. de dos experimentos realizados en triplicado a partir de
diferentes cultivos celulares.
 Resultados 127

Como se observa en la figura 27, el tratamiento con GSH-ME no modificó los

niveles basales de GMPc ni en células incubadas con DETA/NO durante 48 horas ni
en las células control. Respecto a los niveles de GMPc obtenidos tras una nueva
estimulación con NO (DEA/NO 10 min), la presencia de GSH-ME redujo
parcialmente estos niveles en células control, pero no afectó al GMPc producido en
las células pretratadas con DETA/NO. El hecho de que el GSH-ME disminuya la
respuesta a NO en células control puede reflejar que el NO esté siendo atrapado por
el GSH-ME , reacción que se ha descrito en la introducción (Mayer et al., 1998).
El tratamiento con BSO produjo un incremento sobre los niveles del GMPc medido
en células no estimuladas con DEA/NO (panel A). Este incremento fue muy
significativo tanto en las células control tratadas con 1mM BSO, como en las tratadas
con DETA/NO 48 horas a las dos concentraciones del BSO ensayadas. Estos
incrementos pueden explicarse pensando en que una menor concentración de GSH en
el medio por el bloqueo de su síntesis hace que haya menor secuestro del NO por
parte de éste, existiendo mayor cantidad de NO disponible para estimular la GCs.
También podría deberse a la inhibición de la actividad fosfodiesterasa por parte del
BSO, debido a su carácter oxidante, como ya se ha demostrado para otros
compuestos de estas características (Leoncini & Signorello, 1999).
En cuanto al efecto del BSO sobre la respuesta a NO (panel B), la dosis más baja
ensayada, 0,5 mM BSO, redujo de forma muy significativa los niveles de GMPc
obtenidos por estimulación con NO, tanto en células control como en las tratadas 48
horas con DETA/NO. Sin embargo, este mismo compuesto añadido a una
concentración de 1 mM incrementó la respuesta a NO en células control y no
modificó la de células tratadas 48 horas con DETA/NO. Este efecto podría explicarse
por la inhibición de la degradación del GMPc, como ya se ha comentado.

5.2. EXPRESIÓN DE LA ENZIMA GCs

Como ya se ha demostrado en capítulos anteriores, la elevación de los niveles de
GMPc da lugar a una desensibilización de la ruta, y este efecto se produce por una
modificación en el estado de fosforilación de la GCs a tiempos cortos. Sin embargo,
en tratamientos más prolongados sería posible que disminuyera la cantidad de la
enzima, y que este hecho fuera el responsable de los cambios tan importantes
observados en la actividad de la GCs.
Horas de tratamiento

0 2 4 8 24 48 72

Subunidad α

Subunidad β

Figura IV.29. Inmunodetección de la GCs. Las células se trataron con

DETA/NO 50 µM durante los tiempos indicados (horas). A continuación
se hizo una detección con anti-GCs. La fotografía corresponde a un
experimento representativo.
128 Resultados

El análisis de los niveles de las dos subunidades de la enzima (α y β) mediante

inmunotransferencia, reveló que la disminución de la actividad estaba acompañada
por una reducción de los niveles de enzima. Aunque se observan cambios en las dos
subunidades, la reducción más importante se aprecia en la subunidad β.

5.2.a. Vida media de la enzima GCs

La concentración de una proteína en una célula es el resultado del equilibrio existente
entre la velocidad de síntesis y de degradación de la misma. El efecto observado
sobre los niveles de GCs cuando las células se someten a un tratamiento prolongado
con DETA/NO, podría deberse a una inhibición de la síntesis de la proteína, o bien a
un aumento en la velocidad de degradación de la misma. Se llevaron a cabo
experimentos incubando durante distintos tiempos las células con un inhibidor de la
síntesis proteica, la cicloheximida, con DETA/NO y con ambos compuestos juntos.
Posteriormente las células se estimularon con DEA/NO y se cuantificó el GMPc.

Cicloheximida
120 DETA/NO
Ciclo.+ DETA/NO
100
% Actividad

80

60

40

20

0 10 20 30 40 50
Tiempo (horas)
Figura IV.29. Modificación de la respuesta a NO. Tras la incubación
con cicloheximida 10 µg/mL ó DETA/NO 50 µM ó ambos compuestos
simultáneamente durante los tiempos indicados, se estimularon con
DEA/NO 1 µM 10 min y se midió el GMPc producido por las células en
cada una de las condiciones. Los resultados representan la media ± S.E. de
dos experimentos realizados en triplicado a partir de cultivos distintos.

El ajuste lineal de los valores representados en la figura nos permitió calcular la vida
media de la proteína para cada uno de los tratamientos, de manera que podemos
comparar el efecto de cada uno de ellos sobre la actividad GCs. El tratamiento con
CHX reveló que la vida media para la actividad de GCs era de 55 ± 3,6 horas,
superior a la obtenida cuando las células se incubaron con DETA/NO 30,6 ± 0,1
horas (Fig 30). Realizando los mismos experimentos en presencia de ambos
compuestos, cicloheximida y DETA/NO, la vida media fue de 23,36 ± 1,6 horas.
 Resultados 129

0,0

-0,2

ln A/Ao -0,4

-0,6

-0,8

-1,0

-1,2
0 10 20 30 40 50
Tiempo (horas)
Figura IV.30. Representación semilogarítmica de la actividad en
función del tiempo. Se ha representado el ln del cociente de la actividad
obtenida a cada tiempo respecto a la actividad inicial en función del tiempo
según la ecuación lnA/A0=-K.t. La pendiente nos permite calcular el valor
de k y el valor de la vida media de la enzima en cada una de las
condiciones (t1/2=ln2/K).

Estos resultados indican que, aunque el NO podría afectar a la velocidad de síntesis

de la GCs, el hecho de que en presencia del inhibidor de la síntesis de proteínas el
DETA/NO disminuya la vida media de la actividad, indica que también estaría
modificando bien a la actividad de la enzima propiamente dicha ó a la velocidad de
degradación de la proteína

A
75 kDa
Ci

Ci
Ci

Ci
DE
DE
Co

clo

clo
clo

clo
TA
TA
nt

h.

h.
h.

h.
ro

/N
/N
l

+D
4h

48

+D
O
O

h
48
4h

ET

ET
h

A
4h

48

B
h

Figura IV. 31. Detección por inmunotransferencia de las subunidades de

GCs. El panel A muestra los resultados de la detección con el anticuerpo anti-
GCs, donde podemos diferenciar las dos subunidades de la enzima. La
fotografía presenta un experimento representativo de tres realizados en las
condiciones indicadas. Se diferencian las subunidades α y β de la enzima. En el
panel B se muestra el control de carga realizado con anti-α actina.
130 Resultados

En la figura 31 se observa que tanto el tratamiento con DETA/NO como con

cicloheximida redujeron significativamente el nivel de la subunidad βde la GCs,
atribuyendo las disminución observada en la actividad a una menor cantidad de
enzima activa. Esta reducción fue aún mayor en presencia de las dos drogas juntas.
Estos resultados podrían indicar que el NO disminuye la estabilidad de la subunidad
, provocando una degradación de la misma.
La velocidad de síntesis de una proteína depende de la cantidad de ARNm que
codifica para dicha proteína y del proceso de síntesis propiamente dicho. Por ello
también se han realizado experimentos para analizar si el tratamiento con NO afecta
a los niveles de los RNAm que codifican para las dos subunidades de la GCs ( 1 y
β1). Mediante la técnica de RT-PCR cuantitativa, observamos que el tratamiento con
DETA/NO durante 16 ó 24 horas producía una reducción muy significativa de los
niveles de los ARNm que codifican para las dos subunidades.
Como control endógeno se ha utilizado el ácido ribonucleico ribosomal 18s. El
tratamiento con DETA/NO no modifica los niveles de expresión de éste ácido
ribonucleico. Además nos sirve para corregir posibles diferencias en la eficiencia de
la reacción de transcripción inversa.
Los resultados obtenidos cuando se analizan los ARNm contrastan con los obtenidos
cuando se analizan los niveles de proteína de las dos subunidades. Mientras que los
ARNm de las dos subunidades se reducen en la misma proporción, solamente se
observa una variación en los niveles de la cadena proteica correspondiente a la
subunidad β.

5.2.b. Mecanismo de regulación de la expresión

Se han realizado diferentes estudios encaminados a dilucidar el mecanismo
molecular implicado en la reducción de la actividad y de los niveles de las
subunidades de la proteína GCs por tratamientos prolongados con NO. Los efectos
del NO pueden producirse por un mecanismo dependiente ó independiente de la
producción de GMPc.
Para llegar a comprender dicho mecanismo, se realizaron experimentos combinando
la presencia del donador de NO, DETA/NO, que como ya se ha descrito produce una
disminución tanto de la actividad como de la expresión de la GCs, con compuestos
que bloquean los elementos de la vía.

75 kDa
Rp
DE

- P
DE

O
Co

DE
DQ

TA
TA
nt

TA
ET
ro

/N
/N

/N
l

O
O

O
+O

+
Rp
DQ

-P
ET
 Resultados 131

100

% Subunidad β
80

60 *** *** ***

40

20

0
D

D p-
C

ET

ET Q

p-

ET P
on

+O

+R
Q

PE
tr o

A/ 1 0

A/ E T
10

D
50

T
N µ

N
l

O M

O 10
µM

10
µM

50

50 µM
µM
µM

µM
Figura IV.32. Modulación de la expresión de la subunidad β de la GCs. Los
extractos solubles de las células sometidas a tratamientos con DETA/NO 50 µM,
ODQ 10 µM ó Rp-PET 10 µM durante 48 horas se analizaron por
inmunotransferencia y los resultados de la cuantificación densitométrica se
presentan como una media ± S.E. de al menos 5 experimentos realizados con
distintos cultivos. En la fotografía se muestra un experimento representativo del
análisis por inmunotranferencia de las células sometidas a los tratamientos
indicados donde se diferencian las subunidades α y β de la enzima.

Los compuestos inhibidores bien de la GCs, el ODQ, o bien de la PKG, el Rp-8-Br-

PET-cGMP, se añadieron al medio una hora antes de introducir el donador de NO, de
manera que la ruta estuviera bloqueada y no pudiera responder al NO. Como se
aprecia en la figura 32, la expresión de la subunidad β de la GCs disminuye en un
50% cuando las células se someten a un tratamiento de 48 horas con DETA/NO. Este
efecto de regulación negativa de la expresión de la enzima, no se previene por
inhibición de la misma con ODQ. Por el contrario este tratamiento causó por si
mismo una caída en los niveles de la enzima. El tratamiento con el inhibidor de PKG
previno la disminución causada por el tratamiento con DETA/NO sin modificar él
mismo los niveles de GCs.
Se analizó el efecto de un activador de la PKG conjuntamente con los dos
tratamientos que habían demostrado tener un mayor efecto de regulación negativa
sobre los niveles de la enzima, el DETA/NO y el ODQ (figura 33). El tratamiento
simultaneo con el Sp-8-Br-PET-cGMP y el donador de NO produjo la misma
reducción sobre la expresión de la subunidad de la enzima que el DETA/NO por sí
mismo. Lo mismo ocurrió con el ODQ. De la misma forma, se realizó un tratamiento
con CNP con el objeto de determinar si la activación de la vía mediante el
incremento de los niveles de GMPc era suficiente para modificar los niveles de GCs.
Sin embargo, el CNP no demostró tener un efecto significativo sobre la cantidad de
enzima.
132 Resultados

75 kDa

Co

DE

CN

O
-
DE
DQ

DQ
n

TA

TA
tro

+
/N
l

/N

Sp
O

-P
- ET
+
Sp
140

-P
ET
120
% Subunidad β

100

80
*** ***
*** ***
60

40

20

O -P
C

D E
on

ET

N
D

ET P

Sp
+S

Q T
P
Q
tr o

A/ ET
50

10 1 0
10

p-
50

N 10
l

µM µM
0
µM

O
µM

nM

50 µM

+
µM
Figura IV.33. Modulación de la expresión de la subunidad β de la GCs.
Los extractos solubles de las células sometidas a tratamientos con
DETA/NO 50 µM, ODQ 10 µM, CNP 500 nM Sp-PET 10 µM durante 48
horas se analizaron por inmunotransferencia y los resultados de la
cuantificación densitométrica se presentan como una media ± S.E. de al
menos 4 experimentos realizados con distintos cultivos. En la fotografía se
muestra un experimento representativo del análisis por inmunotranferencia
de las células sometidas a los tratamientos indicados donde se diferencian
las subunidades α y β de la enzima.

Estos resultados indican que el efecto de regulación de la expresión de la enzima

GCs causada por el NO está mediado, al menos en parte, por la activación de la
PKG.

5.2.c. ARNm de la GCs

Dado que la síntesis de una proteína depende de la cantidad de ARNm disponible
que codifica para ella, estudiamos si el tratamiento con NO, que provoca una caída
de la actividad GCs y de los niveles de proteína (subunidad β), también modifica los
niveles de mensajero para ésta.
Como vemos en la figura 34, el tratamiento de las células durante 16 horas con
DETA/NO, reduce en un 50% la cantidad de ARNm para las subunidades α1 y β de
la GCs.
 Resultados 133

Puesto que el DETA/NO incrementa los niveles de GMPc y éste a su vez activa a la
PKG, en primer lugar se analizó si la PGK estaba implicada en el mecanismo. Las
células se incubaron con Rp-8-Br-PET-cGMP una hora antes de la adición del
DETA/NO y posteriormente se analizaron los niveles de ARNm de las subunidades
α1 y β1. Según se muestra en la figura la presencia de este inhibidor previno
completamente el efecto del DETA/NO, indicando que la actividad de PKG participa
en el mecanismo de control de la expresión de las dos subunidades de la GCs. Esta
hipótesis se confirmó realizando experimentos con otro inhibidor de la PKG, el KT-
5823, que también previno el efecto del DETA/NO.
Experimentos en los que se introdujo el inhibidor de PKA, H-89, revelaron que éste
tratamiento no prevenía el efecto del DETA/NO, sino que los niveles de mensajero
disminuyeron aún más que con el NO solo. Este hecho revela que la PKA podría
estar implicada en el mantenimiento de los niveles de ARNm para las subunidades de
GCs.
DETA/NO 50 µM
2,0
*** ***
1,6
***
ARNm α

1,2
**
0,8

0,4

0,0

2,0 ***
*** ***

1,5
ARNm β

**
1,0

0,5

0,0
R
R

KT
C

H
R

p-
p-
on

-8
p-

-
PE
PE

58

9
PE
tro

1µ
23
T
T
l

M
30
3µ

15

1µ
M

µM
µM

Figura II.34. Cuantificación del ARNm de las subunidades α1 y β1 de la GCs.

Análisis por PCR cuantitativa del ARNm de las subunidades. Las células fueron
sometidas a 16 horas de tratamiento con los agentes que se detalla en la figura y a
continuación se extrajo el ARNm para su cuantificación. Las barras blancas
representan la cantidad presente en células no tratadas. Los datos representados son
la media ± S.E. de tres experimentos realizados por duplicado con distintos cultivos.
La significación estadística indicada se ha calculado respecto al tratamiento con
DETA/NO solo. El valor de ese tratamiento presentó una diferencia muy
significativa respecto al control (p< 0,001).
134 Resultados
18s α β
p.de b.

Figura 35. Fragmentos amplificados por

PCR. Gel en el que se han corrido los
productos amplificados en un experimento de
PCR cuantitativa. Las bandas corresponden a
los fragmentos amplificados con los primers
para las subunidades α, β y 18 s.

400
300
200

6. EFECTO DE LA EXPOSICIÓN PROLONGADA A YC-1

Dado que se ha descrito que el YC-1 es un activador directo de la enzima GCs,
planteamos experimentos para determinar cual era el efecto del tratamiento durante
periodos prolongados de tiempo con este compuesto.
En experimentos realizados anteriormente y ya descritos, comprobamos que, en
nuestros modelos celulares, el YC-1 era capaz de incrementar de manera efectiva los
niveles de GMPc. Además, este efecto era prevenido por tratamiento con el inhibidor
de GCs, ODQ a una concentración 10 µM.
Los datos expuestos en el capítulo anterior muestran que, efectivamente, el
tratamiento con YC-1 a 24 y 48 horas tiene un efecto regulador sobre la capacidad de
activación de la GCs. Este efecto muestra ser dependiente de concentración y del
tiempo de estimulación. Sin embargo, como se ha descrito en el capítulo anterior,
cuando las células se mantenían en presencia de YC-1 durante los periodos descritos
para la regulación de la enzima, se apreció un pérdida de células en la superficie de
cultivo. Esto nos llevó a realizar un estudio más detallado del efecto de este
compuesto sobre las células.
6.1. Efecto sobre la estructura y la capacidad de adhesión celular
Al observar al microscopio los cultivos primarios de células cromafines sometidos a
los tratamientos con YC-1, nos llamó la atención que el aspecto de las células había
cambiado. Estas células en cultivo presentan una morfología característica
redondeada, pero extendida de forma que quedan adheridas a la superficie de cultivo.
Sin embargo, los tratamientos con distintas concentraciones de YC-1, durante 24 o
48 horas, modificó su apariencia. Las células se volvieron redondeadas y menos
aplastadas, desprendiéndose fácilmente de la superficie de cultivo.
Si bien el efecto sobre las células cromafines era llamativo, los cambios acaecidos en
las pocas células endoteliales que contaminaban el cultivo fueron aún más evidentes.
Aunque en general estas células no representan más de un 5% del total de células en
 Resultados 135

el cultivo primario, las pocas que se encuentran, tienen una morfología muy distinta
de las cromafines, y por lo tanto es muy fácil localizarlas simplemente por
observación del cultivo al microscopio. Estas células son fusiformes, y mucho más
planas que las células cromafines. En cultivos de endoteliales puras, éstas tienden a
disponerse en paralelo, formando una estructura de aspecto tisular. Las células
endoteliales que fueron sometidas junto a las cromafines a un tratamiento con YC-1,
perdieron todas las características descritas. Por una parte, el aspecto de las células
aparecía redondeado, y se perdió su capacidad de adhesión al plástico de cultivo.
La importancia de las células endoteliales radica en que forman parte de los vasos
sanguíneos. Este hecho hizo que nos pareciera de gran relevancia estudiar el efecto
que el YC-1 pudiera ejercer sobre la integridad de este tipo celular. Por ello aislamos
y mantuvimos cultivos de endoteliales en los cuales se ensayaron los tratamientos
con YC-1, haciéndose un estudio de diferentes parámetros de viabilidad y
funcionalidad, en los dos tipos de células.
En primer lugar se llevaron a cabo estudios morfológicos más exhaustivos de ambos
tipos celulares. Cultivos prácticamente puros en cromafines, así como células
endoteliales confluentes de segundo pase, se sometieron a tratamientos con YC-1 a
dosis crecientes y durante tiempos que fueron desde 8 a 72 horas. En la figura 36 se
muestran micrografías de contraste de ambos cultivos tras 24 horas de incubación.
Los efectos sobre el aspecto morfológico celular fueron evidentes a las 16 horas de
tratamiento, y tras 72 horas de incubación se había perdido la adhesión de la mayoría
de las células. A concentraciones tan bajas como 5 µM el cambio en la morfología
era evidente, sobre todo en células endoteliales (fig 37).
Con el propósito de establecer si este efecto estaba relacionado con la capacidad del
YC-1 de activar la GCs, se introdujo en los cultivos el inhibidor de ésta enzima,
ODQ 10 µM. Esta concentración inhibía eficazmente la capacidad del YC-1 de
incrementar los niveles de GMPc, tanto en células cromafines como endoteliales. Sin
embargo, como se observa en la figura, este compuesto no evitó los cambios
observados en la morfología de ambos cultivos celulares. Además, dado que los
niveles de activación de la GCs que se alcanzan en células endoteliales son mucho
menores que en las cromafines a las mismas dosis, la activación de la vía no
explicaría que, en las primeras, los efectos fueran aún mas marcados que en estas
últimas. Por otro lado, los experimentos descritos en el capítulo anterior realizando
estimulaciones también muy prolongadas con NO, habrían originado alguna de estas
modificaciones en el caso de deberse a activación de la vía, mientras que no se
apreciaron en ninguno de los casos.
136 Resultados

Control YC-1 5 µM

YC-1 10 µM YC-1 25 µM

YC-1 50 µM YC-1 100 µM

Figura IV.36. Tratamiento de células cromafines con YC-1. Incubación
de cultivos de células cromafines durante 24 horas con concentraciones
crecientes de YC-1. Las fotografías son representativas de 3 experimentos
realizados con distintas preparaciones celulares.
 Resultados 137

YC-1 100µM

50 µM

Control YC-1 5µM

YC-1 25µM YC-1 50µM

Figura IV.37. Tratamiento de células

endoteliales con YC-1. Incubación de
cultivos de células endoteliales durante 24
horas con concentraciones crecientes de
YC-1. Las fotografías son representativas
de 3 experimentos realizados con distintas
preparaciones celulares.

YC-1 100µM
138 Resultados

- ODQ + ODQ

50 µM

Control

YC-1 25µM

YC-1 100µM

Figura IV. 38. Tratamiento con YC-1 en presencia de ODQ.

Las células endoteliales se incubaron con distintas
concentraciones de YC-1 durante 24 horas en presencia (dcha.) o
ausencia de ODQ (izqda). Las fotografías son representativas de 3
experimentos realizados con distintas preparaciones celulares.
 Resultados 139

6.2. Estudio del citoesqueleto celular

Es evidente que el mantenimiento de la morfología celular requiere a su vez la
presencia de un citoesqueleto intacto. El citoesqueleto celular está formado por
actina, tubulina y proteínas filamentosas intermedias. Por ello, para comprobar si los
efectos que habíamos observado sobre la morfología celular eran debidos a una
desorganización del citoesqueleto, realizamos un estudio de los filamentos de actina.
Para estudiar la organización de los filamentos de actina, llevamos a cabo
experimentos de inmunohistoquímica marcando las células con anticuerpos anti-
actina. Así observamos que los cambios morfológicos, tanto en el caso de las
cromafines como en el de las células endoteliales, eran debidos a que se había
perdido la estructura organizada de filamentos de actina. Los filamentos, no sólo eran
irreconocibles como tales, si no que además aparecieron condensaciones de los
monómeros de -actina (figuras 39 y 40).
La incubación simultanea con ODQ, con el objetivo que ya se ha descrito de
determinar si el efecto estaba mediado directamente por la activación de la GCs, no
fue capaz, una vez más, de prevenir esta desorganización en ninguo de los dos tipos
celulares.

10 µM

Control YC-1 50 µM

Figura IV.39. Efecto del YC-1 sobre la

organización de los filamentos de actina en
células cromafines. Las células se incubaron con
YC-1 50 µM durante 24 horas en ausencia y
presencia de ODQ 10µM, y se realizó el ensayo de
inmunohistoquímica como se descibe en métodos.
Las fotografías son representativas de 3
experimentos realizados con distintas preparaciones
celulares.

YC-1 50 µM + ODQ
141 Resultados

10 µm

Control Control+ODQ

YC-1 50µmol/L YC-1 50µmol/L

+ODQ

YC-1 100µmol/L YC-1 100µmol/L

+ODQ

Figura IV.40. Marcaje del citoesqueleto de células

endoteliales. Las células endoteliales confluentes se
incubaron con el tratamiento correspondiente durante 24
horas. Se marcaron con anti-α actina. Las fotografías son
representativas de 3 experimentos realizados con distintas
preparaciones celulares.
 Resultados 143

6.3. Estudio de la densidad celular de los cultivos

Las células endoteliales se distiguen en cultivo por su capacidad de dividirse
incrementando su número. Una vez que las células han alcanzado confluencia en la
superficie de cultivo, permanecen en estado de reposo, esto es, en fase G0. Las
diferencias entre las células en estado proliferativo o quiescente pueden determinar
que unos tratamientos influyan sobre ellas o no.
Por este motivo se evaluó el efecto que el YC-1 ejercía sobre las células endoteliales,
tanto en estado proliferativo, como una vez alcanza la confluencia. Se trataba de
precisar si el efecto sobre la morfología celular y el citoesqueleto se manifestaba
cualquiera que fuera el estado en que se hayaran las células en el momento de la
estimulación con YC-1.

100
+ODQ 10µM A

80
ADN%

60

40

20

100 B

80
ADN%

60

40

20

0
Co

YC

YC

YC

YC

YC
nt

-1

-1

-1

-1

-1
ro

5µ

10

25

50

10
l

0µ
µM

µM

µM

Figura IV.41. Cuantificaión del DNA de células endoteliales. Las

células endoteliales en estado preconfluente (A) y en estado confluente
(B), se trataron con concentraciones crecientes de YC-1 durante 24 h en
ausencia (barras ralladas) o presencia (barras grises) de ODQ 10 µM. El
valor 100 se corresponde con 3502 y 3802 ng ADN/pocillo en células
cromafines y endoteliales respectivamente. Los resultados representados
son la media de dos experimentos realizados en triplicado ± S.E.
144 Resultados

Sometimos los cultivos en ambos estados proliferativos a tratamientos con

diferentenes concentraciones de YC-1. A continuación se cuantificó el DNA extraído
de ellos, comparando las cantidades determinadas para los diferentes tratamientos
con controles a los que no se sometió a ningún agente. Además se llevaron en
paralelo tratamientos que incluían YC-1 y ODQ para estudiar si el efecto era
dependiente del incremento en los niveles de GMPc.
En la figura 41 se muestra como la disminución en los niveles de ácidos nucléicos
obtenidos, disminuía en mayor proporción cuando se trató de células en estado
proliferativo o preconfluente. Además, en ninguno de los casos la inhibición de la
enzima GCs fue capaz de prevenir estos efectos.
Se puede apreciar en la figura 42 como tras 24 horas de tratamiento de las células
cromafines con YC-1, aparece una menor cantidad de ADN, lo cual revela que existe
una pérdida celular, y que éste efecto no es prevenido por el tratamineto con ODQ.

100

***
80
***
% ADN

60

40

20

0
C

YC OD
YC
on

+
-1 Q 1
-1
tro

50 0
50
l

µM µM
µM

Figura IV.42. Cuantificaión del ADN de células cromafines.

Las céllulas cromafines se trataron durante 24 horas con las drogas
ensayadas. El valor 100 se corresponde con 3502 ng ADN/pocillo
en células cromafines Los resultados representados son la media
de dos experimentos realizados en triplicado ± S.E.

6.4. Estudio de la funcionalidad de células cromafines

La capacidad secretora de las celulas cromafines nos permitió realizar un estudio de
la funcionalidad de las mismas. Las células cromafines secretan catecolaminas en
respuesta a estímulos que incrementan la concentración de Ca2+ intracelular. El
estudio de la liberación de dichas sustancias tras la estimulación, permite valorar su
estado funcional.
 Resultados 145

Para realizar este estudio, se introdujeron concentraciones crecientes de YC-1, junto

con acetilcolina 100 µM o KCl 40 mM, sometiéndo a las células a una co-
estimulación de 2 minutos y cuantificando a continuación las catecolaminas
secretadas. Los resultados presentados en la figura 43A muestran que el YC-1
disminuyó la secrección de forma muy significativa en ambos casos de estimulación.
El hecho de que no solo presente este efecto inhibitorio sobre la estimulación con
acetilcolina, si no que se mantenga de una magnitud comparable al introducir
despolarización con K+, nos asegura que no se trata de un efecto sobre los receptores
nicotínicos.

120
A

100

***
% Secrección

80 ***
*** ***
60 ***

***
40
***
20

0
C

YC

YC

YC

YC
on

-1

-1

-1

-1
t ro

10

25

50

10
l

0
µM

µM

µM

µM
120
B
100
*
% Secrección

80 ** **

***
60

40 ***
***
20

0 ***
C

YC

YC

YC

YC

YC
on

-1

-1

-1

-1

-1
tr o

10

25

50

10
l

µM

0
µM

µM

µM

µM

Figura IV.43. Secrección de catecolaminas. Cuantificación de las

catecolaminas secretadas por células cromafines por coestimulación de 2min
con concentracines crecientes de YC-1 y 100µM Acetilcolina (barras
abiertas), o 40 mM KCl (barras grises) directamente (A) o tras preincubación
de 30 min con las concentraciones indicadas de YC-1 (B). Los valores
representados son la media de dos experimentos realizados en triplicado ±
S.E.
146 Resultados

La preincubación de las células durante 30 min con las concentraciones crecientes de

YC-1, que se representa en la figura 43B, para posteriormente someterlas a una
estimulación muestra una inhibición aún mayor de la secrección que la obtenida en el
caso en el que el YC-1 se adicionó junto con el secretagogo. La inhibición llega a ser
de un 100% a la concentración más alta ensayada, YC-1 100 M, cuando la
estimulación se realiza con acetilcolina. A esta misma concentración pero
estimulando con K+, la inhibición no es completa pero la secrección disminuye de
forma extremadamente significativa.
El estudio de las catecolaminas totales y la secrección basal no mostró diferencias
significativas. Esto, junto con el hecho de que la inhibición de la secrección por la
ruta NO/GMPc precisa tiempos más largos de 2 minutos (Rodriguez-Pascual et al.,
1995b) indica que el efecto de YC-1 se debe a una interacción del propio compuesto
con algún elemento de la maquinaria secretora.

6.5. Estudio de la viabilidad celular

Una vez comprobado que el YC-1 era capaz de desorganizar el citoesqueleto celular,
procedimos a comprobar si estos cambios podían indicar la existencia de
citotoxicidad. Para ello utilizamos sondas fluorescentes que distinguen
simultaneamente entre células vivas y muertas. En la figura 44 se muestran campos
de células tratadas con concentraciones crecientes de YC-1, o bien sin tratamiento,
durante 48 horas. En ninguno de los dos tipos celulares en los que se realizó el
estudio se retiró el suero 24 horas antes de la incubación con las sondas para evitar
inducción de citotoxicidad por falta de factores de crecimiento.
Los paneles B de cada una de las figuras, presentan las imágenes de las células
muertas, esto es, marcadas con el homodímero de etidio por unión a los ácido
nucléicos de forma dosis dependiente. La fluorescencia con esta sonda aumenta
cuanto mayor es la dosis de YC-1 con la que se ha realizado el tratamiento.
Simultaneamente, podemos obervar en los paneles C correspondientes a cada campo,
una disminución en el marcaje con calceína-AM, indicativo de células vivas.
Estos resultados indican la existencia de citotoxicidad por tratamiento prolongado
con YC-1.
La introducción durante el tratamiento de ODQ 10 µM, no fue capaz de prevenir
estos efectos (resultados no presentados).
 Resultados 147

Células cromafines

Control

50 µM

YC-1 5µmol/L

YC-1 10µmol/L

YC-1 25µmol/L

YC-1 50µmol/L

YC-1 100µmol/L
 Resultados 149

Células endoteliales

Control

50 µM

YC-1 5µmol/L

YC-1 10µmol/L

YC-1 25µmol/L

YC-1 50µmol/L

YC-1 100µmol/L

Figura IV. 44. Estudio de la viabilidad celular.

 Discusión 151

6.6. Estudio de la integridad del ADN celular

Los cambios morfológicos como la desorganización del citoesqueleto, pérdida de
funcionalidad y de viabilidad celular, son síntomas inequívocos de daño celular. Los
experimentos que se describen a continuación se diseñaron para determinar si la
muerte celular se debía a un proceso de necrosis o por el contrario el YC-1
desencadenaba una muerte celular programada o apoptosis. Existen algunas
diferencias entre ambos procesos que nos pueden dar la clave para conocer cual de
ellos se está produciendo. Una de las consecuencias más señaladas de la apoptosis es
la fragmentación del ADN. Una vez que se ha desencadenado la señal apoptótica y
cualquiera que sea su origen, ésta desemboca en la degradación de los ácidos
desoxirribonucléicos nucleares, originando fragmentos de ADN múltiplos de 150 o
200 pares de bases, que son capaces de salir del núcleo por poros que se originan en
la membrana nuclear.

0,5 A
+ ODQ 10 µ M
***
0,4 *** ***
**
ADN µg/pocillo

0,3

0,2

0,1

0,0

B *** + ODQ 10 µ M
1,6 ***
ADN µg/pocillo

1,2
*** ***

0,8

0,4

0,0
C

C
YC

YC
YC

YC
on

on
-1

-1
-1

-1
t ro

t ro
5

5
50

50
l

l
µM

µM
µM

µM

Figura IV.45. Presencia de ADN en el citosol celular.

Cuantificación de los ADNs recogidos de células endoteliales
(A) y cromafines (B) sometidas a distintos tratamientos con
YC-1 que originan fragmentación del material genético y su
salida del núcleo. Los valores representados son la media de
dos experimentos realizados en triplicado ± S.E.
152 Discusión

Por este motivo una de las formas de determinar si la citotoxicidad que estabamos
detectando era debido a un proceso apoptótico, se determinanó la cantidad de ADN
presente en el citosol. Para ello, mediante una técnica que permite extrer el ADN
citosólico, dejando intactos los núcleos, se llevó a cabo la medida de la cantidad de
este ácido nucleico presente en el citosol.
Como se muestra en la figura 45, el tratamiento con YC-1 a dosis de 5 M,
provocaron un incremento de 1,8 veces en la cantidad de ADN que había salido al
citosol, y con YC-1 50 M se aumentó 2,6 veces esta cantidad respecto al control.
Además, el tratamiento simultáneo con ODQ, como se venía realizando en todos los
ensayos descritos, no previno esta fragmentación del material genético celular. Muy
al contrario, la inhibición de la actividad GCs, pareció potenciar el efecto del YC-1.
A continuación, realizamos una electroforesis en geles de agarosa de los mismos
ADNs extraídos de los citosoles celulares. La aparición de un patrón de
fragmentación en escalera, muy característico de células apoptóticas, reafirmó el
hecho de que la citotoxicidad observada en los dos tipos celulares, era debida a la
desencadenación de un proceso apoptótico a raíz del tratamiento con YC-1.

ENDOTELIALES CROMAFINES

Pdb

800
600

400
200
/L

/L

/L

/L
5 0 l/ L
5 0 l/ L

5 0 l/ L
/L
l

YC 5µm l

YC 5µm l
ol

ol

ol

ol
ro

-1 ntro

ro

-1 ntro
ol
o
o

o
µm

µm

µm

µm
YC ont

YC ont
YC 5µm

YC 5µm
YC o

YC o
50
C

C
-1

-1
-1

-1
-1

-1

+ ODQ 10 µM + ODQ 10 µM

Figura IV.46. Electroforesis de ADN. Las muestras de

ADN extraído del citosol celular, se corrieron en un gel de
agarosa 2% y se tiñó con un colorante específico para
ácidos nucleicos.
 Discusión 153

6.7. Estudio de la actividad de caspasas

El papel de las caspasas como cascada de proteasas implicadas directamente en los
procesos apoptóticos ha sido ampliamente descrito. La activación de estas enzimas es
la responsable de la fragmentación del ADN nuclear. Aunque existen varias de estas
proteínas, y son interactivadas entre sí, una de las más estudiadas como señal de
apoptosis, es la caspasa 3. Sea cual sea el mecanismo iniciador de la señal apoptótica,
el proceso pasa con mucha probabilidad por la activación de esta proteasa.
Por ello en nuestro trabajo la medida de la actividad de la caspasa 3, culminó la
determinación de la existencia de un proceso apoptótico desencadenado por el
tratamiento prolongado con YC-1.

***
400 ***
***
% Activación de caspasa 3

***

300

200

100

0
YC-1 50µM - + + + +
ODQ 10µM - - + - -
DEVD-CHO 1µM - - - + -
DEVD-CHO 10µM - - - - +

Figra IV.47. Medida de la actividad de caspasa 3.

Determiminación de la activación de caspasa 3 por
tratamiento con YC-1 16 h en células cromafines (barras
blancas), y edoteliales (barras grises).

Según se refleja en la figura 47, el tratamiento con YC-1 provoca el incremento de la

actividad de caspasa-3. El ODQ no previno esta activación en ninguno de los casos.
Además el hecho de que el DEVD-CHO, inhibidor de la caspasa 3, sea capaz de
revertir completamente la medida de la actividad caspasa, garantiza la especificidad
del ensayo.
 Discusión 155

Dado que el objetivo de este trabajo de investigación ha sido el estudio de la

regulación de la enzima GCs en condiciones de activación fisiológicas, así como el
fenómeno de tolerancia desarrollado tras un aporte de NO exógeno, nos planteamos
en primer lugar la importancia de emular las condiciones que presumiblemente se
producen in vivo. En la actualidad, se dispone de un amplio abanico de drogas que
inciden sobre los elementos de la vía NO-GCs-PKG. Sin embargo, los datos que
aparecen en los distintos trabajos que abordan temas relacionados con el NO reflejan
la disparidad de concentraciones de agentes donadores de NO que se utilizan para
activar la ruta. Como consecuencia de este amplio rango de concentraciones,
aparecen efectos muy diversos, e incluso contrarios en distintos trabajos, que en
realidad, son consecuencia del diferente grado de activación de la vía, o bien de la
aparición de efectos colaterales desarrollados como consecuencia de las altas dosis
de NO introducidas y que son independientes de la activación de la GCs.
Para comprender mejor cuales son los mecanismos que se ponen en marcha tras el
estímulo con NO, se han estudiado distintos donadores de NO con el objeto de
encontrar los compuestos y las dosis más apropiadas para simular las condiciones de
estimulación natural o de tratamiento con vasodilatadores. Los donadores
seleccionados para este estudio se escogieron en función de sus diferentes vidas
medias y de sus diversas naturalezas químicas.
Los resultados de la caracterización demuestran que los cuatro compuestos
liberadores de NO tienen potencias muy diferentes entre sí en cuanto a su capacidad
de incrementar los niveles de GMPc en las células cromafines bovinas. Estas
diferencias pueden explicarse en cuanto a sus tasas de activación específicas y a los
mecanismos por los cuales producen NO. El rango de potencias obtenido en cuanto a
la estimulación de la síntesis de GMPc ha sido DEA/NO>SPER/NO>SNP>SNAP.
El DEA/NO presenta una EC50 de 0,4 µM, siendo el más potente entre los
compuestos estudiados. Este valor se correlaciona muy bien con el obtenido para la
estimulación de células endoteliales por Mayer et al. (1995), y para la de la enzima
GCs purificada a partir de pulmón bovino (Friebe et al., 1996). Sin embargo, la EC50
obtenida para la acumulación de GMPc por tratamiento con SNAP, es un orden de
magnitud más alto que el obtenido para SNP, resultados contrarios a los datos
publicados por otros autores para cardiomiocitos (Davis et al., 1997), así como para
células NIE-115 de neuroblastoma de ratón (Lipton et al., 1993) y rodajas de
cerebelo de rata (Southam & Garthwaite, 1991). Esta discrepancia se puede justificar
debido a los distintos tipos celulares empleados en los estudios, así como por el
hecho de que la liberación de NO a partir de SNAP varía según la composición del
medio en el que se encuentre disuelto.
Como se ha descrito en la introducción, la presencia de GSH incrementa la liberación
de NO a partir de nitrosotioles. Este efecto provoca que el valor de EC50 para la
estimulación de los niveles de GMPc por SNAP se reduzca en aproximadamente dos
órdenes de magnitud.
156 Discusión

Para comprobar si la distinta potencia en la activación de la GCs estaba relacionada

con una diferente liberación de NO a partir de estos compuestos, se midió la cantidad
de NO liberado por cada uno de ellos a partir de concentraciones crecientes del
compuesto de partida. A pesar de que el método de la oxidación de hemoglobina
precisa de unas condiciones de trabajo muy estrictas para asegurar una medida
correcta del NO, tanto su sensibilidad (el límite de detección teórico alcanza 1,3 M)
como la posibilidad de realizar medidas en continuo, hacen de este método un
instrumento muy atractivo para la cuantificación (Murphy & Noack, 1994).
En presencia de células, condiciones en las que el SNP libera NO, la reacción con la
hemoglobina se incrementó durante los primeros 15 minutos de medida, cayendo
posteriormente. Este efecto revela que se está produciendo alguna otra reacción de
oxido-reducción paralela que enmascara el verdadero efecto del NO liberado. De
todos modos, de acuerdo con estudios previos se puede afirmar que el SNP libera
pequeñas cantidades de NO a lo largo de periodos de tiempo prolongados (Bates et
al., 1992; Rao et al., 1991). En nuestros estudios, y con las condiciones
experimentales que se han empleado, no hemos detectado ninguna liberación de NO
a partir de SNP en ausencia de células, hecho lógico dado que, aunque el mecanismo
de descomposición de SNP no está aún bien definido, se sabe que este compuesto no
libera NO de manera espontánea, sino que sólo se produce por fotolisis, adición de
agentes reductores, o por transformación metabólica (Bates et al., 1992; Murphy &
Noack, 1994).
El estudio de los donadores pertenecientes a la familia de los NONOatos, la
SPER/NO y DEA/NO, condujo a la determinación de unas vidas medias y unas
cantidades de NO liberadas a partir de éstos comparables a las descritas por otros
autores en condiciones experimentales similares (Ramamurthi & Lewis, 1997). Por
otro lado, también coinciden con el comportamiento esperado según el modelo
matemático teórico establecido por Schmidt et al. (1997). La estequiometría (eNO)
calculada para la SPER/NO a 37ºC y pH=7,4 fue de 1:1,7-1,9, muy similar a la que
habían sido descrita por Ramammurthi & Lewis (1997) de 1,7 y Keefer et al. (1996)
de dos moléculas de NO a partir de cada molécula de SPER/NO. Para el DEA/NO la
estequiometría se ha calculado en 1:1,2. Este valor también está de acuerdo con datos
descritos anteriormente por varios grupos (eNO de 1 (Schmidt et al., 1997) y de 1,5
(Ramamurthi & Lewis, 1997)). Es importante señalar que, aunque según la estructura
química de este compuesto la estequiometría esperada fuera de 2, la gran
inestabilidad del mismo hace que la estequiometría pueda variar de unas
preparaciones a otras.
Sin embargo, la estequiometría del SNAP ha sido objeto de gran controversia en los
estudios realizados por diferentes grupos, describiendo concentraciones de NO
liberadas a partir de éste compuesto muy dispares (Matthews et al., 1996; Singh et
al., 1996). En este trabajo de investigación se han empleado los dos métodos ya
descritos para la determinación del NO liberado, obteniéndose resultados muy
 Discusión 157

similares entre ambos, lo cual nos asegura la fiabilidad de la medida obtenida.

Además, estos valores coinciden con los obtenidos por algunos autores siguiendo el
mismo método para realizar la determinación (Läfars & Gyllenhammar, 1995),
aunque resultan algo inferiores a los obtenidos por otros grupos (Ioannidis et al.,
1996). El mecanismo de liberación de NO a partir de nitrosotioles se encuentra lejos
de estar bien determinado, y ha demostrado ser altamente dependiente de los diversos
factores que integran el sistema como la concentración de tioles reducidos en el
medio y los metales de transición presentes (Dicks et al., 1996; Gordge et al., 1996;
Singh et al., 1996). En un tampón fosfato que contiene un quelante de metales de
carácter no oxido-reductor, como es el DTPA, se ha detectado una liberación
transitoria de NO a partir de SNAP correspondiente a menos de un 0,1% del donador
presente en condiciones de pH y temperatura fisiológicos (Haddah et al., 1994). Sin
embargo, en nuestras condiciones experimentales hemos detectado una liberación de
NO lineal a partir de SNAP a lo largo del tiempo. La cantidad de NO liberado a los
60 min representa menos de un 2% del SNAP presente, indicando que este
compuesto tiene una vida media muy larga. Sin embargo, al añadir GSH en el medio,
tras 15 minutos de incubación la cantidad de NO liberado era mucho mayor.
La medida de NO generado a partir de SNAP en un medio en ausencia de células fue
cuatro veces superior al detectado en presencia de las mismas. Este hecho se puede
explicar por las diferencias en el medio de reacción, dado que la presencia de células
contribuye en gran medida al contenido total de iones afectando a la liberación de
NO. Además, la inactivación del NO en presencia de células es más rápida cuanto
mayor es la concentración de NO (Kharitonov et al., 1994; Goldstein & Czapski,
1995). Apoyando esta idea, se ha demostrado que diversos donadores de NO son dos
ordenes de magnitud más potentes en la estimulación de preparaciones de GCs
purificada que en rodajas de cerebelo (Knowles et al., 1990; Southam & Garthwaite,
1991).
Existe una buena correlación entre la producción de NO y los icrementos de GMPc
obtenidos cuando se introducen los NONOatos como agentes estimulantes. Las
cantidades de NO producido por los dos NONOatos objeto de estudio, a
concentraciones que originan las acumulaciones máximas y submáximas (EC50) de
GMPc, son dos y tres veces mayores que los valores descritos para la constante de
disociación del NO de la GCs activada y que la concentración de NO que origina la
máxima acumulación del complejo nitrosilo, respectivamente (Stone & Marletta,
1996). En cualquier caso, estas diferencias se podrían explicar por el hecho de que
las medidas realizadas en este estudio son de tipo acumulativo, de forma que el NO
que se va liberando reacciona inmediatamente con la hemoglobina, lo cual lo protege
de la inactivación por parte de las células y, aunque a concentraciones bajas de NO
parece ser muy estable, su inactivación es mayor en medios en presencia de células o
tejidos (Knowles et al., 1990; Southam & Garthwaite, 1991).
158 Discusión

El comportamiento del SNAP es mucho más complicado. No se ha encontrado una

correlación entre el incremento de los niveles de GMPc y la producción de NO.
Además, se han necesitado niveles más altos de NO generado a partir de SNAP para
conseguir una elevación máxima o submáxima de los niveles de GMPc. Los
experimentos realizados en función del tiempo revelan que los niveles de GMPc
siguen una cinética paralela a la producción de NO a partir de NONOatos, e incluso a
partir del SNP si asumimos una liberación continua de NO. Sin embargo, cuando se
introdujo el SNAP se alcanzó un nivel de GMPc estable tras 15 min, a pesar de que
la concentración utilizada no causó la estimulación máxima de la síntesis de GMPc y
se ha observado una producción lineal de NO a lo largo del tiempo.
Por otro lado, en experimentos dosis respuesta se ha detectado un efecto bifásico sólo
cuando se utilizó el SNAP como donador de NO, disminuyéndose el incremento
inducido por el compuesto al introducir concentraciones de éste superiores a 1 mM.
Un perfil similar se ha descrito para el efecto del SNAP en rodajas de cerebelo de
rata (Southam & Garthwaite, 1991), así como cuando se trató la GCs purificada con
peroxinitritos en presencia de GSH (Friebe et al., 1996). En experimentos realizados
con un compuesto análogo de SNAP que carece de NO, éste no modificó los niveles
de GMPc basales ni los estimulados por SNP. Por lo tanto, el efecto inhibitorio
parece deberse a un mecanismo en el que participa el SNAP como agente donador de
NO, y es independiente del producto resultante una vez que se ha liberado el NO. En
presencia de GSH 1 mM, el efecto inhibitorio se observó incluso a concentraciones
más bajas de SNAP. Estos resultados, junto con el hecho de que sólo el SNAP a
concentraciones altas produce la caída en los niveles de GMPc, podría indicar que
este compuesto puede haber producido una modificación de la enzima, y
dependiendo del alcance de esta modificación, se puede observar una
desensibilización e incluso una inhibición. Como ya se adelantaba en la introducción,
otros estudios han encontrado que el mecanismo por el cual se produce la
desensibilización de la GCs se puede deber a una oxidación o bien a una nitrosilación
de grupos tioles libres cruciales para la actividad de la enzima (Davis et al., 1997).
La nitrosilación se ha descrito recientemente como una modulación de la función de
varias proteínas incluyendo algunas asociadas a membrana, proteínas citosólicas y
nucleares, estando favorecido este mecanismo por la presencia de S-nitrosotioles
(Lipton et al., 1993; Singh et al., 1996; Kaye et al., 1997).
Los cuatro compuestos estudiados han sido capaces de incrementar los niveles de
GMPc hasta niveles muy elevados en células cromafines bovinas, indicando la gran
capacidad de estas células de responder a NO. En estudios previos, se ha descrito que
la mayoría de las células cromafines expresan NOS I así como las subunidades y
de la GCs (Schwarz et al., 1998), y que estas células responden a acetilcolina con
incrementos transitorios de la actividad de NOS y de los niveles de GMPc
(Rodriguez-Pascual et al., 1995b; Schwarz et al., 1998). Dado que la respuesta
fisiológica es transitoria, los donadores de NO de vida media corta como el DEA/NO
pueden emular de forma bastante fiable la activación endógena de la vía NOS/GCs
 Discusión 159

en estas células. En general, se conoce bastante bien que mientras las formas
constitutivas de NOS cuando se activan producen pequeñas cantidades de NO
durante periodos de tiempo cortos, las formas inducibles de la enzima inducen una
liberación prolongada de grandes cantidades de NO (Förstermann et al., 1995). Por lo
tanto, los donadores de vida media corta a concentraciones bajas representan la
manera más fiable de imitar el comportamiento del NO sintetizado de manera
endógena por una isoforma constitutiva, mientras que los de vida media más larga
imitarían mejor la activación de la isoforma inducible.
Los datos obtenidos apoyan la idea de que diferentes donadores de NO poseen
potencias muy distintas a la hora de activar la GCs, y esto se correlaciona con su
capacidad de liberar NO, excepto en el caso de SNAP, donde parece que está
implicado un mecanismo más complejo. Debe tenerse en cuenta que son necesarias
concentraciones muy bajas de NO para activar a la enzima GCs, comparables a las
que se describen en este trabajo. Por ello, es necesario ser cuidadosos a la hora de
fijar las condiciones en las que se van a realizar los experimentos, de forma que se
escojan los donadores más adecuados, así como las concentraciones más razonables
para evitar reacciones imprevistas.
Una vez comprendida la capacidad de activación de la ruta por los distintos
donadores, se abordó el estudio de la regulación de la vía. Las alteraciones en la
regulación de la GCs contribuyen a la aparición de condiciones clínicas asociadas
con respuestas anómalas a NO como los desórdenes vasculares y la disfunción eréctil
(Katz et al., 1992; Christ et al., 1995). Por ello, es importante determinar cuál es el
mecanismo de regulación implicado.
En células vivas, la desactivación de GCs se produce con una t1/2 de unos pocos
segundos, permitiendo a la GCs responder de forma dinámica a fluctuaciones en la
concentración de NO. La desensibilización debe, por tanto, representar un
mecanismo de regulación temprano de la actividad de GCs que se desencadena en los
primeros momentos tras el estímulo con NO.
Diversos estudios han demostrado que la preincubación de las células o extractos
celulares con NO conducían a una atenuación de la activación de GCs con NO a
tiempos cortos en los que los niveles de enzima aún no estaban siendo afectados
(Papapetropoulos et al., 1996b; 1998). Algunos autores han propuesto que esta
desensibilización aparecida para el NO exógeno es un mecanismo que se produce in
vivo, y que no está mediado por depleción del sustrato ni por inhibición de la enzima
por su propio producto (Bellamy et al., 2000). Además, se ha demostrado que el
mecanismo de desensibilización se perdía en lisados celulares, sugiriendo la
necesidad de otro elemento citosólico implicado (Bunn et al., 1986; Gerzer et al.,
1981). En cualquier caso, no se ha determinado si este efecto está mediado por
GMPc.
En nuestro estudio nos hemos planteado si la activación de PKG regularía la
actividad de la GCs inducida por NO. El pretratamiento de las células cromafines
160 Discusión

con CNP, que estimula la producción de GMPc y la activación de PKG (Rodriguez-

Pascual et al., 1996), o alternativamente con un análogo de GMPc permeable a las
células (Sp-8-Br-PET-cGMPS), el cual es un potente activador de PKG, produjo una
reducción de los niveles de GMPc alcanzados por una posterior estimulación con
SNP. Estos resultados, junto con el hecho de que el inhibidor selectivo de PKG, el
KT-5823, a una concentración de 0,5 M sea capaz de prevenir de manera efectiva
el efecto de CNP, indican que la PKG participa en el mecanismo de regulación de la
vía, regulando los niveles de GMPc intracelular. La homeostasis dinámica de los
niveles de GMPc resulta del equilibrio entre la síntesis y la degradación del
nucleótido cíclico; esto implica que los efectos observados pueden ser explicados por
la activación de las fosfodiesterasas específicas o bien por la inhibición de la enzima
GCs.
Recientemente, se ha demostrado que, en tejido vascular, el factor natriurético tipo A
(ANF) induce la fosforilación y activación de fosfodiesterasas (Wyatt et al., 1998).
Sin embargo, diversos resultados presentados en este trabajo apoyan la idea de que
sea la actividad GCs la que está siendo modificada más que la degradación del
nucleótido cíclico. En primer lugar, todos los experimentos se realizaron en presencia
del inhibidor inespecífico de fosfodiesterasas, el IBMX, evitando así los posibles
efectos debidos a los cambios de la actividad de fosfodiesterasas. Por otro lado, la
función tiempo para la activación de fosfodiesterasas por fosforilación dependiente
de PKG reveló que ésta se incrementaba en el primer minuto de activación mientras
que, a tiempos más largos, la actividad de fosfodiesterasa cae de manera muy
significativa alcanzando niveles basales, tiempo al que se han realizado las
observaciones que nosotros presentamos (Wyatt et al., 1998). Por otro lado, otro dato
que apoyaría la modificación de la actividad GCs es que algunos tratamientos que
producen una acumulación mayor de GMPc cuando ésta se estimulaba con NO, tales
como la preincubación con inhibidores de PKG, no fueron capaces de incrementar la
acumulación de GMPc inducida por la activación de una GC de membrana con CNP.
El efecto inhibitorio observado por la pre-estimulación con CNP, no se potenció por
inhibición de proteínas fosfatasas, sino que la presencia de diferentes inhibidores de
proteínas fosfatasas previno el efecto causado por el CNP. En este sentido, el efecto
de CNP fue emulado por NECA, descrito anteriormente como un activador de una
proteína fosfatasa en estas células (Mateo et al., 1995). Por tanto, es posible que el
CNP esté activando una proteína fosfatasa a través de la activación de PKG. Esta
idea está apoyada por los resultados de otros autores que han demostrado la
participación de la activación de una proteína fosfatasa del tipo 2A en varias acciones
fisiológicas mediadas por PKG, tales como el incremento en las corrientes de K+
inducidas por Ca2+ en varios tipos celulares (White et al., 1993; Zhou et al., 1996).
En los resultados presentados se han analizado los efectos de varios inhibidores de
PKG sobre los niveles de GMPc basales o los inducidos por SNP. Todos los
inhibidores de PKG ensayados incrementaron ambos niveles del nucleótido cíclico,
siendo los más potentes en este efecto el Rp-8-Br-PET-GMPS y el KT-5823. Estos
 Discusión 161

compuestos inhiben la PKG por interacción con el sitio regulador o con el catalítico
respectivamente, y ambos son muy selectivos y específicos (Kase et al., 1987; Enan
& Matsumura, 1992). Estos datos indican que la actividad tónica de PKG produce
una retroinhibición de la GCs. Es importante señalar el hecho de que en este trabajo
experimental, las condiciones basales consisten en una preincubación de las células
con IBMX 0,5 mM durante 30 min. Este tratamiento produce un incremento de los
niveles de GMPc de dos veces con respecto a los valores observados en células no
tratadas y produjo una potenciación importante de los niveles del nucleótido cíclico
detectados tras estimulación (Rodríguez-Pascual et al., 1996). Por este motivo se
eligieron estas condiciones experimentales para la medida de GMPc. Por lo tanto,
este tratamiento podría ser responsable por sí mismo de la activación de la PKG en
nuestras condiciones basales.
Los inhibidores de proteínas fosfatasas imitaron los efectos de los inhibidores de
PKG, aunque la magnitud de su efecto fue siempre menor que la observada en
presencia de los últimos. El hecho de que una concentración de 100 nM de ácido
okadaico y de 10 nM de caliculina A potencie el efecto estimulador del SNP, y a su
vez prevenga del efecto inhibitorio causado tanto por CNP como por NECA, apoya
la idea de que exista una proteína fosfatasa de tipo 2A implicada en el mecanismo.
Aunque estos compuestos pueden inhibir tanto a la PP1 como a la PP2A, la
concentración de ácido okadaico necesaria para inhibir a la primera en células
intactas es mucho mayor que la que se ha empleado en este estudio (Klumpp et al.,
1990).
La caliculina A presenta una potencia mayor que la del ácido okadaico en la
prevención del efecto del CNP. Este hecho podría explicarse por una diferencia en la
permeabilidad de los compuestos, lo cual implica que se alcancen concentraciones
diferentes de cada uno de ellos en el interior de las células, y que el grado de
inhibición de las diferentes proteínas fosfatasas sea diferente. En cualquier caso, la
cipermetrina 10 nM presenta el mismo efecto. Este compuesto se ha descrito como
un inhibidor potente y específico de la proteína fosfatasa tipo 2B, sin afectar a las
proteínas fosfatasas 1 y 2A, al menos in vitro. Aunque con los datos de los que se
dispone es difícil saber cual es el tipo de fosfatasa implicada en el proceso y no se
puede descartar ninguna posibilidad, es razonable pensar que sea la PP2A la enzima
implicada y que en este caso la cipermetrina esté afectando a este tipo de fosfatasa,
ya que no existen datos de que la PKG active a la PP2B, mientras que la activación
de PP2A es un fenómeno bien documentado (White et al., 1993; Zhou et al., 1996).
Por otro lado, la activación de la PP2B depende de la interacción Ca2+/calmodulina
con la enzima, y tanto el CNP como el NECA han sido incapaces de inducir ningún
cambio en los niveles de [Ca2+]i en células cromafines, manteniéndose los niveles de
calcio intracelular en 150-170 nM (Mateo et al., 1995; Rodríguez-Pascual et al.,
1996). Por lo tanto, no es probable que la PP2B esté implicada en el mecanismo de
regulación descrito, aunque existen muchos ejemplos en la literatura sobre la
activación cruzada de diferentes proteínas fosfatasas, que podría también explicar
162 Discusión

porqué inhibidores de distintas proteínas fosfatasas tienen el mismo efecto (Chen et

al., 1998). De acuerdo con estos resultados existe una inhibición tónica de GCs en
ausencia de estimulación, que podría ser el resultado de una variación del grado de
fosforilación de varias proteínas. Un posible mecanismo que podría explicar estos
resultados es que la activación de PKG de lugar a la activación de una proteína
fosfatasa que, a su vez, defosforile a la GCs u otra proteína reguladora, causando a la
inhibición de su actividad.
En los experimentos de inmunoprecipitación de la enzima GCs, observamos una
clara relación entre el grado de fosforilación de la subunidad β de la enzima con la
actividad enzimática, apoyando la idea de que es la modificación del estado de
fosforilación de la enzima en sí misma, y no el de otras proteínas reguladoras
asociadas, la responsable de los cambios observados en su actividad. Tanto el CNP
como el NECA, los cuales causaron una inhibición de la respuesta a SNP,
disminuyeron el grado de fosforilación de la subunidad β de la GCs. En cualquier
caso, la preincubación con KT-5823 incrementó tanto la fosforilación de la
subunidad β como la acumulación de GMPc inducida por SNP. Estos resultados
confirman estudios previos que habían puesto de manifiesto que la GCs purificada a
partir de cerebro era fosforilada tanto por PKC como por PKA, y en ambos casos, la
fosforilación de la enzima daba lugar a un incremento de su actividad. Sin embargo,
estos autores no investigaron cual era la subunidad donde tenía lugar la modificación
(Zwiller et al., 1981; 1985). En experimentos realizados con células PC12 se ha
descrito que la fosforilación de la GCs en respuesta a la activación de PKC. Además,
el tratamiento de estas células con ésteres de forbol resultó en un incremento de la
síntesis de GMPc, indicando que la fosforilación incrementaba la actividad de la GCs
(Louis et al., 1993). El hecho de que el CNP disminuya la fosforilación de la
subunidad β y que el KT-5823 la incremente, apoya la idea de que la PKG media un
mecanismo de defosforilación responsable de estos efectos, y que actúa tanto sobre la
actividad basal como sobre la estimulada.
La cuestión que queda aún sin resolver y que precisa de mayor investigación se
refiere a la proteína responsable de la fosforilación de la GCs. De acuerdo con los
resultados presentados en este trabajo, debe tratarse de una serina quinasa, dado que
la inmunoreactividad sólo se ha detectado introduciendo el anticuerpo anti-
fosfoserina. De todos modos, dado que los anticuerpos contra residuos de treonina y
tirosina utilizados son monoclonales y sólo reconocen epítopos específicos, no se
puede descartar que exista también una fosforilación de la enzima en este tipo de
residuos. En cualquier caso, los experimentos realizados en células marcadas
metabólicamente con P32, coinciden en magnitud con los resultados obtenidos en los
experimentos realizados empleando el anticuerpo contra residuos de serina
fosforilados.
Con anterioridad, otros autores han descrito que las enzimas guanilato ciclasas A y B
(receptores de péptidos natriuréticos tipo A y B), están sometidas a un mecanismo de
 Discusión 163

desensibilización basado en la defosforilación de las mismas. Ambos receptores

están fosforilados en residuos de serina y treonina en células en reposo. Tras la
estimulación inicial, la actividad de estas enzimas disminuye con una cinética que
coincide con la defosforilación del receptor (Potter & Garbers, 1994; Potter, 1998).
Aunque la proteína fosfatasa implicada en este mecanismo no se ha identificado, se
ha demostrado que la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 2A es capaz de
defosforilar y desensibilizar al receptor del péptido natriurético tipo B de células 3T3
in vitro (Potter, 1998). Recientemente, también se ha descrito un mecanismo de
desensibilización de PKC mediante la defosforilación de la misma por PP1/2A
(Thiels et al., 2000).
Por otro lado, la GCs presenta muchas similitudes con la adenilato ciclasa, cuya
regulación por PKC ha sido descrita en diversos tipos celulares (Patrizio et al., 1997).
Otra serie de evidencias que apoyan la idea de que estas enzimas están reguladas por
un mecanismo de fosforilación es que la activación de PKC en pinealocitos de rata se
traduce en un incremento de la síntesis de nucleótidos cíclicos (Ogiwara et al., 1998).
Por tanto, la regulación de la actividad GCs que implica el proceso de fosforilación y
defosforilación descrito en este trabajo, se incluye dentro de la diversidad de
mecanismos reguladores de las enzimas productoras de nucleótidos cíclicos.
La implicación de la PKG en la regulación de los niveles de GMPc a través de la
activación de la fosfodiesterasa 5 ha sido probada en células de músculo liso (Wyatt
et al., 1998). Los resultados descritos en este trabajo demuestran la existencia de una
retroinhibición de la guanilato ciclasa soluble, que puede representar un mecanismo
de desensibilización regulando los niveles de la señal que lo desencadena, el GMPc.
Es razonable pensar que los incrementos en el GMPc y la activación de la PKG
conlleven a una inhibición de su síntesis además de la activación de su degradación.
Esto implicaría que los niveles de GMPc y, por tanto, sus efectos fisiológicos, son
determinantes para la regulación de su síntesis y su degradación.
El mecanismo de desensibilización de la GCs propuesto en el esquema es de gran
importancia a la hora de comprender como se recupera el sistema de un estímulo y se
prepara para recibir otra señal.
164 Discusión

Sin embargo, el fenómeno al que se viene denominando tolerancia a

nitrovasodilatadores no se explicaría por este mecanismo, ya que todas estas
modificaciones son reversibles y resultan de la respuesta a un estímulo puntual. La
vía de señalización permanecería inhibida sólo durante el tiempo necesario para que
el sistema se recuperase y volviese a las condiciones iniciales. Sin embargo, cuando
el estímulo se mantiene en el medio celular, es previsible que existan otras vías de
regulación, sobre todo, si tenemos en cuenta la naturaleza altamente reactiva del NO
y su capacidad de interaccionar con numerosas proteínas, modificando su actividad
(Stamler et al., 1992; Lipton et al., 1996; Jia et al., 1996).
Para estudiar cuales son las bases moleculares de la tolerancia, se han emulado las
condiciones que conducen a dicho efecto mediante el tratamiento continuado con un
donador de NO capaz de mantener una concentración constante en el medio. En estas
condiciones se ha observado que, efectivamente, la capacidad de respuesta en cuanto
a la producción de GMPc frente a un estímulo con dosis altas de NO se encontraba
disminuida en más de un 50%. El máximo de inhibición se detectó a las 48 horas de
tratamiento. Este fenómeno podría explicarse bien por un mecanismo que conlleve
una disminución de la actividad enzimática como consecuencia de la modificación de
residuos críticos que intervienen en el desarrollo de la reacción de síntesis de GMPc,
o bien por una disminución de los niveles de la enzima GCs.
 Discusión 165

Las reacciones de oxido-reducción representan un mecanismo posible para la

desactivación de enzimas. Estudios previos han demostrado que el estado de
oxidación del átomo de hierro del grupo hemo y de residuos de cisteína de la proteína
juegan un importante papel en el grado de actividad de la GCs. Se ha sugerido que la
desactivación de la enzima podría ocurrir por reacción directa de un agente oxidante
con el grupo hemo de la enzima, mientras que la oxidación de determinados grupos
tioles podría ser responsable de una inhibición de la actividad, tanto en condiciones
basales como de estimulación con NO (Dierks et al., 1998). Por otro lado, el grupo
de Clementi et al. ha demostrado que el tratamiento con DETA/NO está asociado con
una disminución en los niveles de glutation intracelular (Clementi et al., 1998). El
glutation es, por una parte, el antioxidante mayoritario en la célula, además de
representar la mayor fuente de grupos tioles no proteicos en el entorno fisiológico
(Meister et al., 1983; Jones et al., 1983). Estos mismos autores demostraron que la
adición de GSH a la preparación celular evitaba la inhibición de la cadena
respiratoria causada por el estrés oxidativo, indicando que la oxidación de las
proteínas de los complejos de la cadena de transporte electrónico era la responsable
de la inhibición observada (Clementi et al., 1998).
Aùn teniendo en cuenta lo anterior, la disminución de la actividad de la GCs por un
tratamiento continuado con NO no se podría explicar por un mecanismo redox, ya
que en las células sometidas a un tratamiento conjunto con DETA/NO y un derivado
permeable del GSH la producción de GMPc inducida por un estímulo puntual fue de
la misma magnitud que en las células tratadas con DETA/NO, y en ambos casos los
niveles del nucleótido cíclico alcanzados fueron aproximadamente un 50% menores
que los observados en las células control. Es más, la presencia del glutation
disminuyó ligeramente la producción de GMPc inducida por NO. Este efecto se
puede deber a que parte del NO reacciona con el GSH existiendo por tanto menos
NO para estimular a la GCs (Hogg et al., 1996). El GSH reacciona con NO
rápidamente, formando GSNO. La formación de este compuesto podría representar
un mecanismo fisiológico de regulación de la concentración de NO libre. Además, el
GSNO puede descomponerse para liberar NO, lo cual podría ayudar a prolongar el
tiempo de acción del NO. Algunas de las reacciones en las que participa el GSNO
son las de transnitrosilación. Puesto que este compuesto es un nitrosotiol, la
transferencia del grupo nitro a otros tioles, (como los presentes en los residuos de
cisteína) está favorecida (Chiueh & Rauhala, 1999). Sin embargo, este mecanismo no
parece estar implicado en la desensibilización de la GCs. De cualquier forma, las
concentraciones de NO empleadas en este trabajo, mucho más bajas que las
empleadas por otros autores, posiblemente no afecten de manera significativa a los
niveles intracelulares de GSH, de ahí que la adición de éste no modifique los efectos
producidos por NO. No obstante, el bloqueo de la síntesis de GSH da lugar a una
potenciación del efecto inhibidor causado por el DETA/NO y provoca por sí mismo
una desensibilización de la enzima. Esto revela que, efectivamente, una disminución
166 Discusión

en la capacidad reductora intracelular puede estar implicada en la tolerancia a

vasodilatadores.
Sin embargo, la tolerancia a nitrovasodilatadores no se puede explicar solamente
como una alteración de la actividad de la GCs, ya que existen numerosas evidencias
de variaciones importantes en los niveles de la enzima y por tanto de la capacidad de
respuesta de las células a NO.
Algunos autores han propuesto que la modulación de los componentes de la ruta
GCs/PKG Iαpuede ocurrir como uno de los eventos tempranos en el desarrollo de
patogénesis relacionadas con la respuesta disminuida a NO como la hipertensión
(Ruetten et al., 1999). Estos autores han descrito que el desarrollo de esta
enfermedad está acompañada de una disminución en la expresión de las subunidades
α1 y β1 de la GCs y en los niveles basales de GMPc presente. Aunque algunos
estudios anteriores habían encontrado una elevada expresión de GCs en células
cultivadas a partir de aorta de ratas hipertensas, estos resultados pueden deberse al
número de pasaje de las células, así como a la edad de las ratas empleadas en el
estudio (Papapetropuolos et al., 1994). De la misma forma, la exposición prenatal a
elevadas concentraciones de aluminio también origina una disminución en la
expresión de GCs, mecanismo que parece estar mediado por la activación de la vía
GCs/PKG, dado que en este mismo estudio los efectos fueron emulados por SNAP
(Llansola et al., 1999). El efecto contrario también se ha descrito en determinadas
situaciones fisiológicas, esto, es la expresión de GCs aparece incrementada en los
fallos cardiacos asociados con el secuestro de NO por parte de aniones superóxido en
endotelio ó durante el embarazo (Bauersachs et al., 1999; Itoh et al., 1998). En estos
estudios se aportan numerosas evidencias de la existencia de diferentes mecanismos
de regulación de la expresión de la GCs.
Según los resultados presentados en este trabajo, el tratamiento continuado con NO
se traduce en una menor expresión de los niveles de ARNm que codifica para las
subunidades α1 y β1 de la guanilato ciclasa soluble. Además, se observa una
disminución del nivel de la subunidad β1 de la proteína. Puesto que se necesita la
formación del heterodímero para que la enzima sea activa, la disminución de una de
las subunidades puede explicar la reducción de la actividad. El hecho de que se
reduzcan los niveles de ARNm que codifican para las dos subunidades, pero que
solamente se observe la reducción en la expresión de la subunidad β1, se podría
explicar por diferencias en la estabilidad de las dos subunidades de la proteína. Estos
resultados están de acuerdo con los obtenidos por otros autores que describen que en
animales hipertensos o de edad avanzada, en los que la respuesta vasodilatadora está
disminuida, la expresión de la subunidad β de la GCs se encuentra suprimida
(Bauersachs et al., 1997; Chen et al., 2000; Kloss et al., 2000). Otro dato que indica
que la estabilidad de las dos subunidades pueda ser diferente es el hecho de que los
niveles de sus ARNm son muy diferentes en células RFL-6, siendo mucho más
abundante el que codifica para la subunidad β1 (Shimouchi et al., 1993). En nuestras
 Discusión 167

células, también parece que existe más cantidad del ARNm que codifica para la
subunidad β1, aunque las diferencias también podrían deberse a diferencias de
eficiencia en la reacción de la polimerasa (PCR).
Por tanto, parece ser la subunidad β la más sensible a modulación. Esta idea viene
apoyada por el hecho de que en presencia de un inhibidor de la síntesis de proteínas,
los niveles de la subunidad αse mantienen prácticamente invariables durante los
tiempos estudiados (hasta 48 horas). Sin embargo, la subunidad β disminuye
rápidamente, indicando que el recambio de esta subunidad es mucho más rápido. La
disminución de la subunidad β1 fue todavía mayor cuando las células se incubaron
conjuntamente en presencia del inhibidor de la síntesis de proteínas y NO, aunque los
efectos de estos compuestos no fueron aditivos. Esto indicaría que el NO podría
afectar a la biosíntesis de esta subunidad (tal y como hemos demostrado que sucede a
nivel de la expresión de los ARNm) pero también a la velocidad de degradación de la
subunidad β1. El hecho de que en presencia del inhibidor de la síntesis de proteínas
se mantenga el efecto del DETA/NO indica que en el mecanismo implicado no se
requiere la síntesis de ninguna proteína. En células PC12, el NGF disminuye la
expresión de los ARNm de las subunidades α1 y β1 de GCs por un mecanismo que
requiere la síntesis de un nuevo factor que desestabiliza el ARNm (Liu et al., 1997b).
El valor de vida media calculado para la actividad GCs en presencia de la
cicloheximida, coincidiría con un recambio largo como han propuesto otros autores
(Liu et al., 1997b). Por otra parte, la vida media de la actividad enzimática se redujo
significativamente en presencia de NO, sugiriendo que la presencia dell NO
desestabiliza a la enzima y la hace más vulnerable a una posible degradación
proteolítica, efecto que se manifiesta principalmente sobre la subunidad β.
El mecanismo de la reducción de los niveles de guanilato ciclasa soluble como
consecuencia del tratamiento prolongado con NO podría estar causado por una
acción directa del NO, dada la elevada reactividad que presenta este radical. Por otro
lado, también podría estar mediado por la activación de la ruta de segundos
mensajeros. Para determinar los elementos implicados en este efecto, introdujimos en
el medio el ODQ como inhibidor de la GCs, solo o en combinación con el NO. Este
ensayo reveló que la inhibición de la GCs no era capaz de prevenir la disminución en
la expresión de la enzima causada por NO. Además, en las células tratadas con ODQ
solo se observó una disminución de la subunidad β de la enzima. Este hecho resultó
bastante sorprendente y, aunque no se ha descrito con anterioridad ningún efecto
similar, podría explicarse por el carácter oxidante del ODQ. El mecanismo propuesto
para la inhibición de la GCs por ODQ se basa en su unión a la enzima provocando la
oxidación del átomo de hierro del grupo hemo (Schrammel et al., 1996; Garthwaite
et al., 1995). La presencia continuada del ODQ en el medio podría a su vez provocar
la oxidación de algunos residuos de la proteína (como los grupos tioles de la
subunidad β1 esenciales para la actividad de la GCs). Esta modificación podría
desestabilizar a la enzima, modificando la interacción entre las subunidades, dando
lugar a su separación y haciéndolas más vulnerables a un ataque proteolítico.
168 Discusión

Sin embargo, la introducción de un inhibidor específico y selectivo de la PKG una

hora antes de la incubación con NO fue capaz de prevenir parcialmente el efecto de
éste sobre los niveles de la subunidad β1, sugiriendo la participación de la vía
GMPc/PKG en el proceso de regulación de los niveles de la GCs. Sin embargo, el
tratamiento con un análogo permeable del GMPc que se comporta como activador de
la PKG, no originó ningún efecto sobre los niveles de GCs, tanto solo como en
combinación con ODQ o NO. Tampoco observamos ningún efecto en los niveles de
GCs cuando las células se incubaron con el péptido natriurético tipo C (CNP), el cual
incrementa los niveles de GMPc mediante la activación de una GC de membrana y
produce la activación de la PKG (Rodríguez-Pascual et al., 1996). Aunque la falta de
efecto del CNP podría explicarse por una desensibilización de su receptor como
consecuencia de la presencia continuada de dicho compuesto (Potter & Garbers,
1994), el hecho de que la incubación con el activador de PKG tampoco se traduzca
en una reducción de los niveles de la proteína (no hemos estudiado su efecto sobre
los niveles de los ARNm), podría indicar que aunque la activación de la vía del
GMPc/PKG condujese a una reducción de los niveles de ARNm, sólo se observaría
una reducción de la proteína cuando en el medio exista un agente que incrementa su
inestabilidad.
En vista de estos datos, es posible que en el efecto del NO estén coexistiendo dos
mecanismos, uno que implicaría la oxidación por parte del NO bien del grupo hemo
o de residuos específicos de la enzima, como han sugerido algunos autores
(Papapetropoulos et al., 1996b) aumentando la inestabilidad de la subunidad 1
específicamente, y el segundo que implicaría la activación de PKG y regulación de
los niveles de ARNm.
Se han propuesto diferentes mecanismos implicados en la regulación de los niveles
de la guanilato ciclasa soluble. Así, en células PC12 tratadas con NGF y en células
del músculo liso de la arteria pulmonar tratadas con donadores de NO, la
disminución de los niveles de los ARNm que codifican para ambas subunidades de
la GCs se debe a que aumenta su inestabilidad. En este proceso participa la síntesis
de alguna nueva proteína (Liu et al., 1997b; Filippov et al., 1997). El estudio del
ARNm en animales hipertensos, que ya se ha visto que presentan una expresión de la
GCs disminuida, también han revelado poseer una menor cantidad de ARNm para la
subunidad β1 de la enzima (Gupta et al., 1997a; b). De la misma forma, en estudios
en los que el tratamiento de 18 horas con donadores de NO provocan una
disminución de la actividad de la GCs de hasta un 70%, se ha demostrado que estaba
relacionado con una disminución del ARNm del 50 y 45 % para las subunidades α y
βde la enzima respectivamente (Ujiie et al., 1994). Estos resultados concuerdan con
los presentados en nuestro trabajo, ya que la estimulación continuada con DETA/NO
durante 16 horas producía una disminución de los ARNm que codifican para ambas
subunidades de aproximadamente un 50% . Sin embargo, todavía desconocemos si
esta reducción se debe a una menor síntesis de los mensajeros ó a una mayor
degradación de los mismos.
 Discusión 169

La inhibición de la PKG con KT-5823 antes de la adición del NO previno el efecto

causado por DETA/NO sobre el nivel de los ARNm de ambas subunidades,
revelando que la PKG está implicada en el mecanismo de regulación. Además, al
introducir como inhibidor de la PKG un análogo permeable del GMPc, el Rp-PET-
cGMPS, a una concentración 100 veces superior al valor de la KI descrita para este
compuesto se abolió totalmente el efecto del DETA/NO sobre los niveles de los
RNAm. Se ha descrito que este compuesto a mayores concentraciones (11 M)
también puede inhibir a la PKA (Kase et al., 1987). Al incrementar la concentración
de Rp-PET-cGMPS utilizada, hasta concentraciones a las que estábamos afectando
ligera o completamente la actividad de PKA, su capacidad para prevenir la
disminución de los RNAm causada por el NO fue menor. Sugiriendo que inhibición
de la PKA afectaría de forma negativa a la expresión de la GCs, al menos en
presencia de NO. Por otro lado la introducción de H-89 como inhibidor de PKA en
presencia de DETA/NO a una concentración selectiva para ésta enzima, provocó una
disminución muy significativa en los niveles de los ARNm para ambas subunidades
de GCs. Estos resultados sugieren que la actividad de la PKA es necesaria para
mantener los niveles de ARNm, mientras que la activación de PKG produce una
modulación negativa de los mismos.
Sin embargo, los datos existentes en la bibliografía en los que se propone una
actividad de PKA implicada en la regulación de la GCs, van en sentido contrario a
los que nosotros proponemos. Diversos autores han mostrado que el tratamiento de
células de músculo liso de aorta de rata con zaprinast (un inhibidor de la
fosfodiesterasa tipo V), ó con IBMX (un inhibidor no específico de fosfodiesterasa)
se traducía en una reducción de los niveles del RNAm que codifica para la subunidad
β1. Estos mismos autores, observaron que la estimulación de las células con
forskolina o directamente la introducción de un análogo de AMPc producía el mismo
efecto que la incubación con los inhibidores de fosfodiesterasas (Papapetropuolos et
al., 1995; Shimouchi et al., 1993). Además, la inhibición de PKA por H-89 ó KT-
5720 previno estos efectos (Papapetropoulos et al., 1996a;b). Sin embargo, las
concentraciones utilizadas de estos inhibidores no garantizan una selectividad en su
efecto, pudiendo afectar también a la PKG, ya que alcanzan concentraciones 60
veces superiores al valor Ki descrita para inhibir a la PKG, lo cual indica que el
efecto que describen puede estar mediado por la inhibición de ésta y no de la PKA,
ya que se existen numerosas evidencias de la activación cruzada de las quinasas
dependientes de nucleótidos cíclicos. Así, el GMPc puede activar a la PKA y el
AMPc puede activar a la PKG (Torphy et al., 1982; Francis et al., 1988; Landgraf et
al., 1986; Forte et al., 1992; Ruiz-Velasco et al., 1998; Van Riper et al., 1997). De
cualquier forma, tampoco es sorprendente que existan mecanismos de regulación
diferentes en diferentes tipos de células, y que en un mismo tipo coexistan diferentes
mecanismos.
El hecho de que las variaciones en el ARNm vayan paralelas para ambas
subunidades es comprensible dado que existe una colocalización de los genes que
170 Discusión

codifican para ellos en el cromosoma 4 y se ha sugerido que este hecho pueda jugar
un papel importante en la regulación y expresión coordinada de las dos subunidades
de las GCs (Guilli et al., 1993). Aunque en mamíferos todavía no existe ningún dato
de la expresión coordinada de ambos genes, en un tipo de pez (Medaka) se ha
demostrado que los genes que codifican para las subunidades α1 y β1 están
organizados en tándem, y que es posible que la expresión de ambos esté coordinada
(Mikami et al., 1999). También hay evidencias de que puedan estar regulados de
forma independiente, ya que se ha demostrado que en músculo liso de aorta de ratas
de edad avanzada existe una pérdida de la subunidad β1, mientras que la α1 está
presente (Chen et al., 2000). También existen datos de que en algunos casos que
disminuye la expresión de β1 se incrementa la expresión de β2 (Gupta et al.,
1997a;b). Todo esto refleja que el/los mecanismo/s de regulación de esta enzima son
extraordinariamente complejos.
Según nuestros resultados, y siendo siempre conscientes de que éstos no son mas que
una pequeña pieza dentro de un mecanismo muy complejo, hemos propuesto el
siguiente mecanismo para explicar la desensibilización de la GCs por tratamientos
prolongados con NO.

P ro te a s a s

β
NO PKG

GMPc -
α β ??
PKA +
GCs GTP
ARNm α
ARNm β
AMPc

ARNm β

ARNm α
 Discusión 171

Efecto tóxico del YC-1 por tratamientos prolongados de las células

Los resultados de este estudio demostraron que exposiciones prolongadas a YC-1
causan toxicidad en dos tipos de preparaciones celulares, endoteliales y cromafines
de medula adrenal bovina, siendo este efecto independiente de la activación de la
GCs.
El YC-1 fué capaz de incrementar los niveles de GMPc en ambos tipos celulares.
Además, tal como ha sido descrito con anterioridad para otros tipos celulares, este
compuesto presenta un efecto sinergístico con el NO (Friebe et al., 1998; Mülsch et
al., 1997; Friebe & Koesling, 1997). En cualquier caso, la eficacia para incrementar
los niveles de GMPc fue muy distinta en los dos tipos de preparaciones celulares.
Los incrementos de GMPc registrados en células cromafines fueron muy superior a
los obtenidos por estimulación de las células endoteliales a la respuesta celular
obtenida. En las células endoteliales, el incremento no fue tan elevado y la magnitud
de los niveles de GMPc alcanzados cuatro veces menor que la obtenida en células
cromafines. Estos resultados pueden indicar una sensibilidad celular diferente a YC-
1, pero también pueden revelar una expresión diferente de GCs, como se ha descrito
para explicar la falta de efecto del YC-1 en cardiomiocitos aislados (Wegener et al.,
1997).
En nuestro estudio se ha introducido el DEA/NO a la dosis que inducía el incremento
máximo de los niveles de GMPc en los dos tipos celulares. Este agente donador de
NO ha demostrado ser 16 veces más potente en células cromafines que en
endoteliales, indicando que estas diferencias podrían ser atribuidas a la existencia de
diferentes niveles de GCs en los dos tipos celulares o una diferente actividad de la
enzima. En cualquier caso, otros factores como la mayor producción de especies
reactivas de oxígeno en células confluentes endotelilales (Moldovan et al., 2000), las
cuales inhiben la activación de GCs bien por NO o por el YC-1 (Mülsch et al., 1997;
Davis et al., 1997), también pueden explicar las diferencias entre los incrementos de
GMPc inducidos por estimulación en los dos tipos celulares.
Dado que se ha descrito la falta de efecto del ODQ para inhibir la GCs en
cardiomiocitos ventriculares de rata (Wegener et al., 1999), probamos la capacidad
de prevenir los incrementos de GMPc inducidos por el YC-1 tanto en células
cromafines como endoteliales, encontrándose un efecto inhibitorio comparable entre
ellas.
Como ya se ha dicho, el objetivo de nuestro trabajo era el mecanismo de regulación
de la vía del GMPc a largo plazo. Por ello se pretendió utilizar el YC-1 como
compuesto activador de la GCs de forma independiente de NO. Este compuesto
además ha emergido en los últimos años como la gran esperanza de los tratamientos
cardiovasculares con agentes vasodilatadores, debido, entre otros motivos, a la
capacidad que ha demostrado de potenciar la acción del NO. Sin embargo, hasta el
momento, se han llevado a cabo muy pocos estudios sobre el efecto de incubaciones
prolongadas con YC-1.
172 Discusión

El principal descubrimiento obtenido fue la identificación de un nuevo efecto del

YC-1, que parece ser mediado por un mecanismo independiente de su capacidad para
incrementar el GMPc. La exposición prolongada de las células cromafines y
endoteliales a YC-1 indujo citotoxicidad en las células. El tratamiento con YC-1
durante 48 ó 24 horas, indujo desorganización del citoesqueleto y cambios de
morfología celular. Las células se redondeaban y perdían adhesión a las superficies
de cultivo, con la consecuente pérdida de células. Además, aquellas que permanecían
adheridas, también mostraron signos de toxicidad celular.
Al someter a las células a tratamientos más cortos, de 16 horas, hemos observado la
aparición de fragmentación del DNA, indicando que la muerte celular era debida, al
menos en parte, a un proceso apoptótico. Taimor et al (Taimor et al., 2000) han
demostrado que el YC-1 induce apoptosis en cardiomiocitos mediante un mecanismo
dependiente de GMPc. Sin embargo, diversas líneas de evidencia demuestran que en
este caso los efectos observados son independientes de la producción de GMPc. En
primer lugar, aunque el ODQ fue capaz de inhibir de manera efectiva los
incrementos de GMPc inducidos por YC-1, no fue capaz de prevenir la apoptosis y
sus alteraciones asociadas. En segundo lugar, el YC-1 fue capaz de inducir apoptosis
a concentraciones a las que apenas si producían incrementos en la actividad de GCs.
Es más, en los casos en que se introdujo ODQ junto con el YC-1, la presencia del
primero parecía potenciar el efecto tóxico del YC-1, indicando que podría existir un
mecanismo dependiente de GMPc que ejerciera un efecto protector. Los datos
presentados en la medida de actividad de caspasas conjuntamente con la
fragmentación del ADN nuclear, son pruebas inequívocas de la existencia de un
proceso apoptótico desencadenado por tratamiento con YC-1. Además, estos efectos
tampoco fueron prevenidos por la inhibición de guanilato ciclasa soluble. Estos
resultados se correlacionan bien con descubrimientos anteriores en los que se
encontró un mecanismo protector de la apoptosis dependiente de GMPc en diferentes
tipos celulares (Genaro et al., 1995; Kim et al., 1997). Aunque el mecanismo
molecular por el cual el GMPc suprime la señal apoptótica aun no ha sido
determinado, podría implicar la activación de la PKG (Rodríguez-Pascual et al.,
1996; Rodríguez-Pascual et al., 1999), la disminución del Ca2+ intracelular
(Rodríguez-Pascual et al., 1995; Cornwell et al., 1989) y la inhibición de la actividad
de caspasas (Genaro et al., 1995; Kim et al., 1997; Kim et al., 1999).
Algunos de los estudios en que se introducía el YC-1 en tratamientos largos, han
descrito un efecto antiproliferativo en células A10 de músculo liso vascular por Yu et
al (Yu et al., 1995), pero en este estudio los autores no detectaron toxicidad y además
los efectos antiproliferativos descritos eran dependientes de los incrementos en los
niveles de GMPc. Los efectos del YC-1 sobre células cromafines y endoteliales no se
pueden explicar de esta manera, ya que las primeras no proliferan, y aunque las
células endoteliales si lo hacen, los experimentos en este caso se realizaron con
células confluentes, lo cual garantiza que las células se encontraban en estado
quiescente. Puede ser que el YC-1 tuviera los dos efectos en células endoteliales,
 Discusión 173

porque la reducción en el número de células fue mayor cuando el YC-1 se añadió a

células preconfluentes, pero, como se ha visto en los resultados, este efecto fue
independiente de la síntesis de GMPc.
Las alteraciones en la morfología celular están relacionadas con la modificación del
citoesqueleto y la adhesión celular (Ingber et al., 1993). Existen varias observaciones
indicando que el NO afecta tanto a la migración como a la proliferación de diferentes
tipos celulares (Hassid et al., 1999; Brown et al., 1999). En células de músculo liso
de ahorta, el NO altera la adhesión celular y la motilidad a través de la vía de
señalización del GMPc por activación de una proteína tirosina fosfatasa 1B (Hassid
et al., 1999). En cualquier caso, hemos observado una desorganización del
citoesqueleto de actina inducida por YC-1 que podría ser explicado por estos
mecanismos porque, como se ha dicho anteriormente, los efectos observados fueron
independientes de GMPc.
Los resultados muestran que aunque el YC-1 es un buen activador de GCs, este
compuesto tiene otros efectos que son dependientes de la activación de GCs y
pueden representar una señal de inducción de muerte celular.
 Conclusiones 175

Las conclusiones de este trabajo de investigación son:

1.- Existen grandes diferencias entre los distintos donadores de NO estudiados, tanto
en cuanto a la velocidad de liberación de NO como a la cantidad del mismo
producido.
-Existe una buena correlación entre la producción de NO y su capacidad para
activar a la guanilato ciclasa soluble en el caso de los NONOatos, DEA/NO y
SPER/NO.
-La velocidad de descomposición del SNAP es muy lenta en nuestras
condiciones experimentales y se incrementa notablemente por la presencia de
glutation en el medio.
-En el análisis de la capacidad del SNAP de estimular la producción de
GMPc se observa un comportamiento bifásico. Observamos una inhibición de la
guanilato ciclasa soluble a elevadas concentraciones de SNAP.
- Las concentraciones efectivas de cada donador de NO van a venir
determinadas por su naturaleza química o por la composición del medio. Por tanto
siempre será necesaria la determinación de la concentración de NO en cada sistema
para asegurarse del empleo de concentraciones fisiológicas.
2.- La guanilato ciclasa soluble está sujeta a un mecanismo de regulación por
fosforilación/defosforilación.
- La subunidad β de la guanilato ciclasa soluble se encuentra fosforilada en
condiciones basales. El grado de fosforilación disminuye tras una estimulación de la
vía GMPc/PKG.
- La defosforilación de la enzima conlleva una inhibición de la misma,
aunque no se afecta a la afinidad por el NO.
- El mecanismo de regulación propuesto es que la proteína quinasa G activa
una proteína fosfatasa, previsiblemente una PP2A, y ésta defosforila e inactiva la
guanilato ciclasa soluble.
3.- El tratamiento prolongado con NO produce una disminución de la actividad
guanilato ciclasa soluble.
- Aunque el tratamiento con NO se traduce en una reducción de los niveles de
los ARNm que codifican para las dos subunidades (α y β), sólo se observa una
reducción del nivel de la subunidad β, indicando que la subunidad a es mucho más
estable, y que el reciclamiento de la subunidad β es más rápido.
-El mecanismo de regulación de los niveles de los ARNm que codifican para
las subunidades α y β por NO es común para ambas, sugiriendo pueda existir una
regulación coordinada de ambos genes.
176 Conclusiones

-La desestabilización de la subunidad β1 puede deberse a la oxidación de

diferentes grupos de la proteína y que esta modificación la haga más vulnerable a la
proteolísis. Ya que la presencia de agentes oxidantes reduce significativamente la
vida media de la proteína.
4.- El activador de la guanilato ciclasa soluble, YC-1, es tóxico para las células.
- El efecto citotóxico no se debe a la capacidad del YC-1 de estimular a la
GCs.
- El tratamiento con YC-1 desencadena un proceso apoptótico. Se ha podido
determinar activación de caspasa 3, fragmentación de ADN nuclear, cambios
morfológicos acompañados de alteraciones en el citoesqueleto y disminución de la
viabilidad y funcionalidad celulares.
- Estos efectos ponen en entredicho su posible uso terapeútico en
enfermedades cardiovasculares.
 Bibliografía 177

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