Módulo 2.
Análisis de
restricción y electroforesis de
ADN
Herd Mentality
The teacher will mention a category or statement.
Each team has to write an answer.
The objective is to choose an answer that as
many teams as possible chose. You should be part
of the herd
Teams with the most represented answer get a
point.
If one team choses an answer by themselves,
they are the “cow”
Whoever makes more points by week 7, get help
in the Benchling exercise (One tip during the
exercise). Whoever is the cow at the end of the
game cannot win.
Bioseparación
de ADN
Glosario
Bases nitrogenadas
Procariota
Eucariota
ADN
ARN
Dogma Central
Formas del ADN
Actividad 1. Diferencias entre ADN procariota
y eucariota
• En 10 minutos y en equipos
• Crear una tabla comparativa entre el ADN procariota y eucariota
ADN procariota
• Se encuentra libremente en el citoplasma
• Esta desnudo (no tiene proteínas y no forma cromatina)
• Genomas compactos (pocas repeticiones y sin intrones)
• Pueden tener ADN extra cromosómico en plásmidos
• Forma circular
ADN eucariota
• Se encuentra en el núcleo
• Se encuentra unido a histonas
• El genoma tiene secciones repetidas y existen intrones
• No contiene plásmidos (generalmente)
• De forma lineal
¿Cómo descubrimos que el ADN tiene la
información genética?
Características generales del ADN
¿Por qué son ácidos los ácidos nucleicos?
5’->3’
Semiconservativa
Complementariedad
De la imagen, elige ¿cuál de las siguientes aseveraciones es más adecuada?
Puentes de hidrógeno fuertes unen al fosfato
con el azúcar para formar cada cadena
Puentes de hidrógeno débiles unen al fosfato
con el azúcar para formar cada cadena
Puentes de hidrógeno débiles unen las dos
cadenas
Enlaces covalentes fuertes unen las dos cadenas
De los dos fragmentos de ADN, cual aseveración es correcta?
Los cadenas en el fragmento A se
separarán a temperaturas superiores
que en el fragmento B
El fragmento A tiene mayor masa
molecular
Las cadenas en el fragmento A se
separan a temperaturas inferiores que
en el fragmento B
Actividad 2. ADN vs ARN
• Dividiremos el grupo en 6 equipos
• La mitad de los equipos serán ADN y la otra mitad serán ARN
• Durante 10 min, tienen que hacer un listado de sus caracterísitcas, así
como encontrar 5 argumentos por los cuales ustedes (ADN o ARN)
son más importante que el otro.
• Tendremos una pequeña discusión sobre que molécula es más
importante. El profesor moderará y pasará la palabra entre equipos.
Extracción de ADN
Glosario anterior
Bases nitrogenadas
Procariota
Eucariota
ADN
ARN
Dogma Central
Glosario
Electroforesis
Lisis celular
Precipitación
DNA cromósomico
Espectrofotómetro
Fluorómetro
ADNcs
ADNdc
Extracción de ADN
Recuerda los siguientes pasos:
Discutir.
Lisis celular
El DNA tiene que ser liberado por la células
Es importante romper la célula
Se peude romper usando detergente
Se peuden usar medios físicos también
Limpieza
Proteinasa K
Degrada proteínas presentes
Precipitación
El DNA queda en una solución acuosa
Se agrega Na+ para que se una con el ADN
Se agrega alcohol helado para precipitarlo
Purificación
Extracción de ADN plasmídico (MiniPrep)
https://bitesizebio.com/1660/plasmid-v-genomic-dna-extractionthe-dif
ference/
Listado de Diferencias entre extracción de ADN genómico y MiniPREP
Cuantificación de ADN
Espectrofotómetro
Fluorómetro
Pureza del ADN
Relación 260:280
Para identificar contaminación por
proteínas
Relación 260:230
Para identificar presencia de
carbohidratos y fenoles
Electroforesis
Cálculos
Una muestra de ADNdc fue diluido 50X. La muestra diluida dió una lectura de
0.65 en el espectrofotómetro en una OD260 (Densidad óptica a 260nm). Para
determinar la concentración de ADN en la muestra original, se tiene que
realizar el siguiente cálculo:
● Concentración de ADNdc = 50 μg/mL × OD260 × factor de dilución
● Concentración de ADNdc = 50 μg/mL × 0.65 × 50
● Concentración de ADNdc = 1.63 mg/mL
Ejercicio
Una muestra de ADNdc fue diluido 10X. La muestra diluida dió una lectura de
1.23 en el espectrofotómetro en una OD260 (Densidad óptica a 260nm). ¿Cuál
sería la concentración final?
Ejercicios de cuantificación y pureza
¿Qué se puede hacer en caso de que los datos de purificación sean
deficientes?
Electroforesis
Glosario anterior
Electroforesis
Lisis celular
Precipitación
DNA cromósomico
Espectrofotómetro
Fluorómetro
ADNcs
ADNdc
Glosario
Cámara de electroforesis
Escalera de peso molecular
Agarosa
Gel
Porcentaje de agarosa
Buffer de carga
Electroforesis capilar
Electroforesis de proteínas
DNA fingerprinting
Electroforesis
Electroforesis
Significa “llevar con electricidad”
Proceso mediante el cual moléculas cargadas migran por la presencia
de una carga eléctrica
Electroforesis de ADN
Electroforesis
• La migración depende de varios aspectos y del tipo de
electroforesis:
• Peso de la molécula
• Forma de la molécula
• Potencia de la carga
• Fuerza iónica
• Viscosidad
• Temperatura
• En el caso de ADN, muchas de las características se mantienen
estables.
• Migra dependiendo del tamaño de la molécula
Agarosa
• Polisacárido de alta pureza obtenido de algas
• Genera una matriz que permite el movimiento de moléculas
• Se puede alterar el tamaño de los poros cambiando la proporción de
agarosa
Buffer (TAE o TBE)
• Debe ser capaz de pasar corriente
• Evitar cambios de pH con temperatura
• Capaz de solubilizar un gel con matriz molecular
• Debe distribuir una carga eléctrica de manera uniforme
• No debe interactuar químicamente con la muestra
• Debe evitar calentarse demasiado
• Investigar cuándo conviene usar cada buffer.
Actividad. Preparación de un gel
Se quiere correr en un gel un fragmento de 548 pb.
Elige la proporción de agarosa a usar y que buffer es preferible.
Si quieres preparar un gel de 20 ml, ¿cuánta agarosa necesitarías?
¿Qué otros componentes necesitarías para hacer tu gel?
Crear un diagrama de flujo del proceso para la elaboración de un gel.
Buffer de carga
Tiene dos razones:
• Provee una tinción para observar la migración de tus muestras
• Posee glicerol que aumenta la densidad de la muestra permitiendo
que se precipite en el pozo.
Escalera molecular
Preguntas.
Si tienes dos bandas con un tamaño muy similar, ¿qué puedes hacer
para distinguirlas?
A la hora de derretir la agarosa, se recomienda agregar un 10% extra de
buffer. ¿Por qué crees que es esto?
¿Cual de las siguientes es correcta en relación al gel en la imagen?
La muestra 1 tiene las moléculas más
pequeñas
La muestra 3 tiene las moléculas más
pequeñas
La muestra dos tienen las moléculas más
negativamente cargadas
La muestra uno tiene la mayor cantidad de
cargas positivas
Un gel de agarosa es preparado. Es claro que cada muestra se mueve a distintas
velocidades. ¿Cual de las siguientes aseveraciones describe mejor la razón?
La velocidad de las muestras es relativa al campo eléctrico
La velocidad de las muestras es relativa a la masa molecular
de cada muestra
Tienen diferente velocidad por la fuerza eléctrica aplicada al
gel
La solución en la que están disueltas las muestras permite
que se muevan a diferentes velocidades
Electroforesis capilar
Electroforesis de proteínas
DNA profiling
Enzimas de Restricción y
Ligasa
Glosario anterior
Cámara de electroforesis
Escalera de peso molecular
Agarosa
Gel
Porcentaje de agarosa
Buffer de carga
Electroforesis capilar
Electroforesis de proteínas
DNA finergprinting
Glosario
Endonucleasas de restricción (enzimas de restricción)
Bacteriófagos
Sitios de restricción
Extremo cohesivo
Extremo romo
Mapas de restricción
Buffer de restricción
Ligasa
Clonación molecular
Endonucleasas de restricción
Enzimas que cortan el ADN reconociendo sitios específicos.
Puede ser en el sitio o cerca del sitio
Tijeras moleculares
Se encuentran en bacterias
Los sitios que reconocen se llaman sitios de restricción
Secuencias palindrómicas
Historia
Descubiertas por Werner Arber - Premio Nobel de Fisiología de 1978
Sistema de defensa de bacterias contra bacteriófagos
Hipótesis: Solo los bacteriófagos que hayan entrado en contacto con
una cepa bacteriana son capaces de sobrevivir a otro encuentro por la
modificación de su secuencia.
Tipos de enzimas de restricción
Nomenclatura
Los nombres se originan en la bacteria de la cual fueron aisladas.
Actualmente la mayoría se expresan en E. coli
Pregunta.
¿Cómo se llamará la primer enzima aislada de Bacyllus
amyloliquefaciens cepa H?
¿Cómo se llama la tercer enzima de restricción aislada de la bacteria
Haemophillus influenzae cepa Rd?
Extremos Cohesivos y Romo
Ejercicio 1
Usando el mapa del plásmido pGEN101 (tamaño total 20 kb) como
guía, escribe el número de fragmentos de restricción con su respectivo
tamaño que resultaría de la digestión con las enzimas EcoRI, BamHI y
EcoRI + BamH1
Problema 2.
Dos estudiantes aislaron un plásmido, el cual fue digerido con las
siguientes enzimas: HpaI y HindIII. Obtuvieron los siguientes
fragmentos de las restricciones:
• HpaI: 26kb
• HindIII: 13kb, 6kb, 4kb, 3kb
• HpaI + HindIII: 7kb, 6kb (2), 4kb, 3kb
Dibuja el mapa del plásmido.
Buffers
¿Qué buffer
usarían para
cortar con BamHI
y AluI?
¿Qué puedes
hacer si cortan a
diferente
temperatura?
Mapas de Restricción
• Son mapas de ADN con
sitios de restricción
conocidos
• Antes eran muy
importantes
• Ahora la secuenciación los
ha vuelto triviales
Ejercicio
Dado el mapa de restricción para pBR607 de las
enzimas EcoRI, BamHI y PstI, muestra como
quedaría un gel de agarosa donde se corren las
siguientes digestiones?
¿Qué buffer
usarían para la
tercera digestión?
Busquen en
Promega por favor.
Ligasa
Cuando dos extremos tienen extremos complementarios, pueden ser
unidos por la enzima Ligasa
UTiliza ATP para generar enlaces fosfodiéster
Extremos Romo también pueden ser ligados, pero es más complicado.
Clonación Molecular
Consideraciones
Actividad. Simulación
https://www.labxchange.org/library/items/lb:LabXchange:783397ff:lx_
simulation:1
10 min
Problema. Mapas de Restricción
El sitio de restricción de la enzima Sau3AI es GATC (vea la Figure 17-1 a
continuación); en el sitio de restricción de BamHI -GGATCC- las cuatro
bases internas son idénticas a la secuencia de Sau3AI. Las secuencias
de los extremos cohesivos de cadena sencilla creados por ambas
enzimas son idénticos. Supón que estás clonando un vector que
contiene un sitio de restricción de BamHI y además tienes ADN
exógeno cortado con Sau3AI.
Problema.
a) ¿Se puede ligar el ADN
exógeno en el sitio BamHI del
vector?, ¿por qué?
b) ¿Se puede cortar el segmento
de ADN clonado en este sitio
con Sau3AI? ¿con BamHI?
¿Qué problema pueden surgir
con el uso de BamHI?
Glosario anterior
Endonucleasas de restricción (enzimas de restricción)
Bacteriófagos
Sitios de restricción
Extremo cohesivo
Extremo romo
Mapas de restricción
Buffer de restricción
Ligasa
Clonación molecular
