UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

TESIS DOCTORAL

Quitridiomicosis en anfibios: Inmunidad, tratamiento y

mitigación en el medio natural

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR

Andrés Fernández Loras

Director

Jaime Bosch Pérez

Madrid, 2021

© Andrés Fernández Loras, 2021

 FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

Quitridiomicosis en anfibios: Inmunidad, tratamiento y mitigación en

el medio natural

ANDRÉS FERNÁNDEZ LORAS

TESIS DOCTORAL, 2021

DIRIGIDA POR: JAIME BOSCH PÉREZ

1
Director: Tutora:
Dr. JAIME BOSCH PÉREZ Dra. ELENA ARRIERO HIGUERAS
Dpto. de Biogeografía y Cambio Global Dpto. de Biodiversidad, Ecología y Evolución
Museo Nacional de Ciencias Naturales, Facultad de Ciencias Biológicas
(MNCN, CSIC) Universidad Complutense de Madrid
C/ José Gutierrez Abascal, 2 C/ José Antonio Novais, 12
28006, Madrid (España) 28040, Madrid (España)
bosch@[Link] [Link]@[Link]

2
 ACERCA DEL IDIOMA
La presente tesis doctoral ha sido redactada en dos idiomas: castellano e
inglés. Mientras que la Introducción, los Objetivos Principales, y la Discusión
Integradora han sido redactados en castellano, los Capítulos 2-6 están
redactados en inglés puesto que ese fue el idioma en el que se escribieron
originalmente para su posterior publicación en revistas científicas
internacionales. No obstante, se incluye un breve resumen en castellano al
inicio de cada capítulo. Tanto el Resumen/Abstract como las
Conclusiones/Conclusions, han sido redactadas en ambos idiomas.

FUENTES DE FINANCIACIÓN
Los estudios contenidos en esta tesis doctoral han sido en su mayoría
financiados por la Fundación General CSIC y el Banco Santander (Zero
Projects, IP: Jaime Bosch). Otras fuentes de financiación incluyen a la
Fundación BBVA, el Proyecto BiodivERsA “Risk Assessment of
Chytridiomycosis to European Amphibian Biodiversity” RACE (Ministerio de
Ciencia e Innovación de España – EU12008-03637, IP: Jaime Bosch), los
Fondos del Gobierno Vasco (IT951-16), el Leverhulme Trust RPG 2014-273, y
la NERC Standard Grant NE/N009967/1.

PERMISOS
Los permisos para la realización de los trabajos de campo han sido otorgados
por la Consejería de Agricultura, Ganadería y Medio Ambiente de Aragón, por
la Consejería de Fomento y Medio Ambiente de Castilla y León, por la
Consejería de Medio Ambiente, Ordenación del Territorio y Sostenibilidad de
Madrid (permisos: 10/032921.9/12 y 10/071126.9/13), y por la Conselleria de
Medi Ambient i Territori de Mallorca (permiso: CEP 43/2015).

4
 AGRADECIMIENTOS

“Ten siempre a Ítaca en tu mente. Llegar allí es tu destino. Mas no

apresures nunca el viaje. Mejor que dure muchos años y atracar, viejo ya, en la
isla, enriquecido de cuanto ganaste en el camino”. Estos versos del poema
“Ítaca” de Konstantinos Kavafis, bien pueden servir para ilustrar en parte este
largo y azaroso, pero sin duda enriquecedor viaje, que ha representado para mí
la realización de este proyecto de tesis doctoral.

Y todo viaje, por largo que éste sea, ha de comenzar por un primer paso.
En mi caso, creo que tendría que remontarme a una experiencia que tuve la
suerte de poder vivir mientras realizaba una estancia en la Durrell Wildlife
Conservation Trust, importante institución dedicada a la conservación de
especies animales de todo el mundo. El director del departamento de
herpetología, el Dr. Gerardo García, me invitó a hacer una visita nocturna
guiada a las instalaciones en las que se mantenían a los anfibios y reptiles. El
poder ver y disfrutar de la belleza de esos animales de manera tan cercana me
impactó profundamente, y despertó en mí una admiración por ellos que me
acompañaría ya siempre. Posteriormente llegaron el trabajo fin de Máster
acerca de parásitos y quitridiomicosis en sapo común en el que estuvieron
implicados tanto Gerardo como Javier López, mi estancia en la Estación
Biológica de Doñana y los trabajos con distintas especies de anfibios que allí
desarrollé bajo la supervisión de Carmen Díaz e Iván Gómez, o el proyecto de
conservación y lucha frente a la quitridiomicosis en Montserrat con una
especie de anfibio en peligro crítico de extinción, la Mountain Chicken
(Leptodactylus fallax). A todas y todos aquellos con los que coincidí en este
tiempo previo al comienzo de la tesis les doy las gracias. Seguramente no
hubiese llegado hasta este punto sin su ayuda, sus enseñanzas y su apoyo.

5
 Toda esa experiencia y conocimientos adquiridos me brindaron la
oportunidad de poder trabajar como parte del equipo del Dr. Jaime Bosch en
una de las más relevantes, sino la más, instituciones de investigación que
existen en España, el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) y
al mismo tiempo, me abrieron la puerta para que pudiera desarrollar este
proyecto de tesis doctoral trabajando en el Museo Nacional de Ciencias
Naturales (MNCN). Algo que para mí, ha significado un auténtico orgullo.

Jaime, eres sin duda alguna el principal artífice de que esto haya
finalmente podido salir adelante. Es complicado plasmar en tan sólo unas
pocas palabras todo lo que he podido aprender de ti. Han sido años de una
ingente cantidad de trabajo, de guía, implicación y supervisión por tu parte, de
incontables correos para corregir y mejorar los manuscritos que se han
convertido después en publicaciones, de momentos compartidos, de disfrutar
del frío aunque siempre precioso Maestrazgo turolense y de la agreste Serra de
Tramuntana mallorquina, de llamadas de atención cuando eran necesarias, y
de ofrecerme un soporte y respaldo cruciales que han hecho que sintiese la
confianza necesaria para terminar este gran proyecto. Tienes toda mi
admiración a nivel académico y para mí, ha sido todo un lujo trabajar a tu
lado. Pero también y sobre todo, a lo largo de todo este tiempo me has
demostrado tu enorme calidad a nivel personal. Creo que nunca podré
agradecerte lo suficiente el haber podido contar con todo tu apoyo y tu
comprensión cuando la vida, que desgraciadamente tiene estas cosas, me hizo
pasar por momentos tremendamente duros y complicados. Gracias, de
corazón.

Gracias también a Elena, por tu trabajo como tutora, por tus enseñanzas
en el campo de la inmunología, y por tu inestimable colaboración en uno de los
estudios que componen esta tesis doctoral.

6
 Al gran Equipo J, muchas gracias Saio y Püppy por todo lo compartido,
por vuestra acogida y por hacerme sentir siempre como en casa, por todas esas
horas de trabajo en el Centro de Cría, en el campo o en el laboratorio, por
tantos buenos momentos dentro y fuera del trabajo, por la compañía, por
vuestro apoyo y ayuda, por vuestra amistad, por las risas y por el buen
ambiente. Ha sido un verdadero privilegio haberos tenido como compañeras
de viaje. Tenéis gran parte de culpa de que haya llegado hasta aquí.
Muchísimas gracias Saio también, porque tu tesis ha sido una gran fuente de
inspiración y una gran ayuda a la hora de maquetar este trabajo.

Del mismo modo, “las aportaciones internacionales” al Equipo J han

contribuido en gran medida a ensanchar mis horizontes y aprender de otras
experiencias en el mundo de la ciencia y de la investigación. Gracias Dave,
Leyla, Dani y Jessica.

Gracias también a todas y todos los “pestuzos” con quien he tenido la

suerte de coincidir en el Museo. Gemma, Chechu, Rigo, Marcos, Ramón, Dani,
Jaime, Melinda, Diego, Laura, Octavio, Rafa, Jimena, Roger, Paloma, Roberto,
Marga, Carolina, Juan, Alex, Sergio, Miriam, Jose, Ponce, Chío, Mireia, Raúl,
Jorge. Cuánto he aprendido de todas vosotras y vosotros. Comunidad que ha
sido también fuente inagotable de inspiración, conocimiento y recursos. Todos
esos ratos compartidos en Jaquete, El Asador o entre pipetas, termocicladores
y análisis de laboratorio han merecido mucho la pena. El camino hubiera sido
muy distinto, más gris y aburrido, de no haber contado con vuestra compañía.

Me gustaría también darles las gracias a otras personas con las que he
coincidido a lo largo de todo este tiempo, que han conseguido gracias a su
trabajo y a la ayuda que me han prestado, que este proyecto de tesis doctoral se
convierta en una realidad. Gracias Annie, Iván y Yolanda por vuestra ayuda y
vuestros consejos técnicos en el laboratorio de Biología Molecular del
MNCN.

7
 Gracias también a Goyo y Michel, por hacer de ese laboratorio un lugar de
trabajo ameno y con buen ambiente. Aquí me gustaría hacer una mención
especial y darle las gracias a la que creo sinceramente es el alma de ese
laboratorio. Infatigable, incansable y, “siempre en la lucha” entre muestras,
placas y reactivos. Gracias Pilar. A todas y todos, perdón por “amenizaros” las
mañanas y las tardes con el “sutil susurro” del beadbeater.

Muchas gracias también al personal del Parque Nacional de la Sierra de

Guadarrama, y a todas las personas que trabajan en el Centro de Cría en
Cautividad de Anfibios Amenazados de la Sierra de Guadarrama. En especial a
Ana, Desi, Carmen, Jose y Virginia. Han sido muchas horas pudiendo disfrutar
de esos preciosos paisajes y de vuestra compañía, cuidando y estudiando a los
anfibios.

De igual manera, me gustaria agradecer a todas y todos los coautores de

las distintas publicaciones que conforman esta tesis doctoral, así como a Belén
Patiño de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Complutense de
Madrid (UCM) por su ayuda en el cultivo de Batrachochytrium dendrobatidis,
y a María Carmen Aceña de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de
Zaragoza (UZ), por permitirme utilizar las instalaciones de su departamento a
la hora de realizar los recuentos leucocitarios diferenciales. La colaboración y
las valiosas aportaciones de todas y todos ellos han sido imprescindibles para
poder avanzar y concluir los estudios de esta tesis doctoral.

Dentro de esta parte de los agradecimientos, me gustaría también

mencionar y agradecer a todos los Agentes para la Protección de la Naturaleza
del Servicio Provincial de Medio Ambiente de Teruel y muy especialmente a
Miguel Ángel, Jaime, Óscar, Fran y Antonio. Vuestro trabajo y vuestro grado
de implicación con el desarrollo y la implementación del estudio han sido
cruciales para que éste pudiese salir adelante. Muchas gracias por todo.

8
 En este viaje no hubiera sido posible llevar la embarcación de vuelta a
Ítaca estando solo. Para llegar al destino ha sido indispensable poder contar
con una tripulación curtida y experimentada, capaz de sacar indemne al más
pequeño de los botes de la más temible de las tormentas. Y yo me siento
tremendamente afortunado por saber que he contado y cuento con la mejor
tripulación que pueda existir:

A mis amigos. Por fin después de todo este tiempo, creo que la próxima
vez que me preguntéis por el tema mi respuesta va a poder ser diferente.
Pedro, Miguel, Carlos, Fernando, Íñigo. Mi pequeño-gran cónclave. Sergio,
Rubén, Gerardo, gracias por esos raticos juntos, y por enseñarme esos
rinconcicos especiales de Madrid. A todos, gracias por estar siempre ahí, por
vuestra paciencia, vuestro interés y vuestro apoyo incondicional. Sin vosotros
como inseparables compañeros de viaje, sé que esto no hubiese sido posible.

A mi Familia. Unas pocas líneas no van a ser capaces de transmitir lo

agradecido que me siento ni todo el cariño que os tengo. Le dais sentido a mi
vida. Papá, mi admiración, respeto y amor hacia tí son inabarcables. Gracias
por inculcarme estos valores y por hacerme mejor persona. Honestidad,
inteligencia y espíritu de trabajo infinitos. Un espejo en el que mirarse. Trataré
de seguir tu senda y de estar a la altura. Pablo, te quiero hermanito. Gracias
por estar siempre ahí y por ayudarme con la portada. Todo un artista del
diseño gráfico. MaÁngeles, gracias por cuidarme tanto y tan bien, y por
desvivirte para que yo pudiese tener ese ambiente ideal de tranquilidad y
sosiego que me permitiese centrarme en escribir esta tesis durante el tramo
final. Victor, Carlota, María, Raquel, Jesús, Lucky, cuántas cosas por celebrar y
compartir juntos. Carlota, Cristina, Nico, Javi y Iara. Ojalá algún o alguna
futura veterinaria o biólogo en la familia con quien seguir disfrutando de “los
bichos”. Tíos Adela y Javier. Diego, Ricardo, Celia, Asli, Marga, Guillermo,
Javier, Daniel y Adrián. Tíos Jesús, Ana, Marisa, Gloria, Vicen, Tim, Iñako. A
todas y todos, mil gracias por hacerme sentir siempre tan bien arropado. Sois
la mejor familia que cualquier persona podría tener.

9
A mi madre, la estrella que me ha guiado a lo largo de todo este gran viaje

10
11
“Las ciencias tienen las raíces amargas, pero muy dulces los frutos”

(Aristóteles, 384 AC – 322 AC. Filósofo griego)

12
13
 ÍNDICE DE CONTENIDOS

RESUMEN / ABSTRACT.........................................................................................................16

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN............................................................................................27

CONSIDERACIONES ACERCA DE LA EPIDEMIOLOGÍA, LA INMUNIDAD, LOS

TRATAMIENTOS Y LA MITIGACIÓN DE LA ENFERMEDAD

OBJETIVOS PRINCIPALES....................................................................................................74

CAPÍTULO 2..........................................................................................................................78

LA EXPOSICIÓN TEMPRANA A Batrachochytrium dendrobatidis CAUSA UNA PROFUNDA

INMUNOSUPRESIÓN EN ANFIBIOS

EARLY EXPOSURE TO Batrachochytrium dendrobatidis CAUSES PROFOUND

IMMUNOSUPPRESSION IN AMPHIBIANS

CAPÍTULO 3..........................................................................................................................96

EL ITRACONAZOL Y EL METIL TIOFANATO NO CONSIGUEN LIMPIAR LARVAS

NATURALMENTE INFECTADAS CON LA CEPA HIPERVIRULENTA DE Batrachochytrium
dendrobatidis

ITRACONAZOLE AND THIOPHANATE-METHYL FAIL TO CLEAR TADPOLES NATURALLY

INFECTED WITH THE HYPERVIRULENT LINEAGE OF Batrachochytrium dendrobatidis

14
CAPÍTULO 4.........................................................................................................................113

LA INFECCIÓN POR Batrachochytrium dendrobatidis DISMINUYE LA TOLERANCIA TÉRMICA

DE LOS HOSPEDADORES LARVARIOS, Y NO PUEDE SER ELIMINADA CON UNA BREVE
EXPOSICIÓN AL CTMAX

INFECTION WITH Batrachochytrium dendrobatidis LOWERS HEAT TOLERANCE OF

TADPOLE HOSTS AND CANNOT BE CLEARED BY BRIEF EXPOSURE TO CTMAX

CAPÍTULO 5.........................................................................................................................142

LA INTERVENCIÓN SEVERA IN SITU EN EL HÁBITAT DE CRÍA SÓLO CONSIGUE UN ÉXITO

TEMPORAL EN REDUCIR LA INFECCIÓN POR Batrachochytrium dendrobatidis

IN SITU SEVERE BREEDING HABITAT INTERVENTION ONLY ACHIEVES TEMPORARY

SUCCESS IN REDUCING Batrachochytrium dendrobatidis INFECTION

CAPÍTULO 6........................................................................................................................164

ELIMINACIÓN EXITOSA EN LA NATURALEZA DE UNA ENFERMEDAD INFECCIOSA LETAL

PARA LA VIDA SILVESTRE

SUCCESSFUL ELIMINATION OF A LETHAL WILDLIFE INFECTIOUS DISEASE IN NATURE

CAPÍTULO 7. DISCUSIÓN INTEGRADORA........................................................................179

CONCLUSIONES / CONCLUSIONS....................................................................................209

15
RESUMEN / ABSTRACT

16
17
 RESUMEN

La quitridiomicosis, una enfermedad causada por un agente patógeno

fúngico, se ha convertido en la enfermedad infecciosa emergente responsable
de la mayor pérdida de biodiversidad en la historia de nuestro planeta desde
que se tienen registros históricos. Dicha enfermedad, ha afectado ya a más de
1000 especies de anfibios, ha jugado un papel principal en el declive de al
menos 500 de esas especies, y ha convertido así a estos animales en la Clase de
vertebrados más amenazada de la Tierra.

Esta patología que afecta a la piel de los anfibios, está originada por el
hongo quitridio Batrachochytrium dendrobatidis (de aquí en adelante, Bd) y
afecta a multitud de especies principalmente de anuros. Hasta ahora Bd era el
único miembro del Filo Chytridiomycota capaz de causar una enfermedad en
vertebrados. No obstante, recientemente se ha descrito una nueva especie de
hongo quitridio, Batrachochytrium salamandrivorans (de aquí en adelante,
Bsal), que también muestra esta capacidad infectiva en vertebrados y que
afecta más directamente a anfibios urodelos como las salamandras.

La quitridiomicosis no es una enfermedad que afecte a todas las especies

de anfibios por igual. Existen marcadas diferencias entre especies respecto a la
sensibilidad mostrada frente al hongo. Así, mientras la rana de uñas africana
(Xenopus laevis) presenta un nivel de resistencia o tolerancia elevado frente al
agente patógeno, otras especies como las del género Alytes estudiadas dentro
del presente trabajo, el sapo partero común (Alytes obstetricans) y el sapo
partero balear (Alytes muletensis), han sufrido episodios de mortandad masiva
entre sus poblaciones, declives o extinciones.

18
 La capacidad de evasión de la respuesta inmune anfibia por parte de Bd
ha sido puesta de manifiesto por diversos estudios. Las hipótesis que se
manejan para explicar la diferente sensibilidad de las especies ante los efectos
del hongo giran en torno a lo demostrado por estas investigaciones, que
muestran que Bd podría inhibir la proliferación de linfocitos y provocar su
muerte celular, y sería también capaz de alterar la regulación de ciertos genes
necesarios para el buen funcionamiento del sistema inmune adquirido.

Muchos han sido los tratamientos que se han utilizado para tratar la
quitridiomicosis en anfibios mantenidos bajo condiciones controladas en
cautividad. Sin embargo, no todos ellos se han mostrado completamente
eficaces, e incluso algunos de ellos presentan efectos secundarios que pueden
poner en riesgo la salud tanto animal como humana. Todavía hoy en día se
sigue buscando un protocolo de tratamiento que sea totalmente eficaz, seguro,
y que pueda aplicarse fácilmente en todas las especies de anfibio y en todas las
formas de desarrollo (larvas, juveniles y adultos). El producto antifúngico más
extendido en su uso es el itraconazol, un triazol sistémico de primera
generación, que se aplica a través de baños a distintas concentraciones y del
que no obstante, se han detectado indicios de toxicidad cuando es utilizado
para tratar la enfermedad en el estadío larvario de algunas especies de anfibio.

La temperatura es un factor ambiental decisivo en el desarrollo de la

quitridiomicosis y en las dinámicas de transmisión de la enfermedad. Ejerce
una influencia directa sobre los niveles de prevalencia e intensidad de la
infección y sobre el resultado de las interacciones entre un patógeno como Bd,
cuyo crecimiento y supervivencia dependen en gran medida de las condiciones
ambientales, y un hospedador ectotermo como son los anfibios, cuya respuesta
inmune está íntimamente ligada a la temperatura, exhibiendo una mayor
eficacia conforme ésta aumenta. El actual escenario de cambio climático y
aumento generalizado de las temperaturas lleva también aparejada la
aparición cada vez más frecuente de eventos climáticos extremos, que se han

19
demostrado asociados al surgimiento de brotes de enfermedades infecciosas.
Esto se fundamentaría en que las variaciones bruscas de las condiciones
ambientales, en especial de la temperatura, hacen que los hospedadores
tengan que readaptarse a temperaturas que están fuera de su rango térmico
óptimo y en consecuencia, sufran un estrés térmico que los hace más
susceptibles a padecer los efectos de agentes patógenos. Además, bajo este
escenario de calentamiento global y de incremento de las temperaturas, los
seres vivos tienen que adaptarse a temperaturas que están cada vez más
próximas a su umbral térmico máximo (CTmax), punto en el que se produce
un desequilibrio homeostático que de prolongarse en el tiempo puede tener
consecuencias fatales.

El comercio ilegal de especies y la globalización han facilitado en gran

medida la dispersión del patógeno a nivel global. Por esta razón, es perentoria
la necesidad del diseño y el desarrollo de actuaciones destinadas a paliar los
efectos de la epizootía sobre poblaciones de anfibios en la naturaleza. A pesar
de todos los esfuerzos, existen todavía grandes carencias en nuestros
conocimientos, consistiendo el gran reto en encontrar un método de
mitigación de la enfermedad que sea seguro y sencillo en su aplicación,
eficiente, fiable, y que pueda ser transferido para tratar distintas especies y
poblaciones bajo condiciones ambientales diversas. En la presente tesis
doctoral se describirán dos de esas técnicas de mitigación que sí han permitido
obtener resultados esperanzadores. Una de ellas, se llevó a cabo en Mallorca y
constituye el primer ejemplo a nivel mundial de erradicación del hongo en el
medio natural.

Desde su descubrimiento, la comunidad científica internacional ha

intentado desentrañar el origen de la enfermedad, los factores que influyen en
su dinámica y su transmisión, la respuesta presentada por el hospedador
frente al agente patógeno, o los posibles tratamientos que pudieran ser
efectivos para tratar la infección. Así mismo, se han llevado a cabo estudios y

20
se han implementado sobre el terreno medidas destinadas a tratar de mitigar
los efectos de la enfermedad en el medio natural.

La presente tesis doctoral evidencia que sólo con el estudio

multidisciplinar y la comprensión de los muy heterogéneos factores que
influyen en la dinámica de esta terrible enfermedad, que está poniendo en
jaque la biodiversidad de nuestro planeta, lograremos combatirla eficazmente.

21
22
 ABSTRACT

Chytridiomycosis, a fungal driven disease, has become the emerging

infectious disease responsible for the greatest loss of biodiversity attributable
to a disease in recorded history. It has already affected more than 1000
amphibian species and played a key role in the decline of at least 500 of those
species, leading amphibians into becoming the most threatened vertebrate
Class of our planet.

This disease, which affects the amphibian skin mainly of Anuran species,
is originated by the chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis (here in
after, Bd). Until now Bd was the only example of a chytrid infecting
vertebrates. Recently though, a new chytrid fungus species has been described,
Batrachochytrium salamandrivorans (here in after, Bsal), which also has this
vertebrate infective capacity, mainly of Urodela species such as salamanders.

Chytridiomycosis is not however a disease that affects all the amphibian

species in the same way. There are big differences among species regarding
sensitivity to the fungus. Thus, whereas some species such as the African
clawed frog (Xenopus laevis) show a high resistance level against the
pathogen, others like the species belonging to the Genus Alytes studied here,
the common midwife toad (Alytes obstetricans) and the Mallorcan midwife
toad (Alytes muletensis), have suffered from mass mortality events, declines
and even extinctions.

Several studies have already demonstrated the strategy employed by Bd

consisting of evading host immunity. Some researchers have hypothesized the
different susceptibility to the fungus among the amphibian species lies in the
immune system avoidance capacity showed by Bd. The chytrid fungus would

23
be able to inhibit lymphocyte proliferation, and even dysregulate the gene
expression profiles of a number of genes involved in the acquired immune
response.

Many treatments have been used to treat amphibians maintained under

controlled captive conditions against chytridiomycosis. However, only a few of
them appear to be completely efficient and some of those treatment regimes
have been demonstrated to be toxic for both animal and human health. This is
the reason why we are still looking for an efficient, reliable, safe and easy-to-
use treatment protocol that could be applied to all the amphibian species and
life-stages. Itraconazole, a first generation triazole, is the most commonly used
antifungal drug. It is applied through baths in an itraconazole treatment
solution. A major disadvantage of this drug is its toxicity to larval stages and
some recently metamorphosed frogs.

Temperature is a paramount environmental factor that plays a crucial

role in chytridiomycosis development, transmission and dynamics. Taking into
account amphibians are ectothermic organisms with an immunity response
intimately linked to temperature, that becomes more efficient with its increase,
and Bd is a fungal pathogen which depends greatly on environmental
conditions for its growth and survival, temperature is a key driver of infection
that has a determinant influence on prevalence and infection intensity levels,
as well as on the outcome of host-pathogen interactions. The current climate
change scenario with steep increments of global temperatures, also increases
temperature variability and causes extreme weather events to be more
frequent, something which in turn is associated with the emergence of
infectious diseases outbreaks due to the thermal stress the hosts suffer when
they need to adapt themselves to temperatures out of their optimal thermal
range every time these sharp and sheer variations of the environmental
conditions take place. Moreover, under this global warming scenario all living
organisms have to adapt themselves to these increasing temperatures getting

24
close to their critical thermal maximum (CTmax), which represents the upper
limit of the ability of animals to counterbalance temperature increases and
also marks the loss of homeostasis.

Species illegal trade and globalization have intensified the chytrid fungus
and chytridiomycosis intercontinental dispersal until reaching a point of no
return where the disease is already globally widespread. That is the main
reason why there is an urgent need for designing and implementing different
field interventions able to mitigate the effects of the disease affecting wild
amphibian populations. The great challenge now is to find a safe, simple,
effective, reliable and transferable across host species and environments
mitigation strategy. Two of those mitigation techniques, which have been
tested and have provided a more hopeful outcome, will be described in this
thesis. One of them was carried out in Mallorca, and represents the first
successful attempt of the world to achieve eradication of Bd from a natural
setting.

Since its discovery, the scientific community has tried to unveil the
origins of this disease, unravel all the different factors that have an influence
on its dynamics and transmission, determine the host response against the
fungal pathogen, or design effective treatment regimes that could be used to
clear infection. There have also been some initiatives attempting to mitigate
the effects of the disease in the natural environment.

This thesis demonstrates that only through multidisciplinary research

and a thorough understanding of the multiple factors involved in the dynamics
of this catastrophic disease, which is posing a huge threat to global
biodiversity, will we be able to successfully fight it.

25
26
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN

CONSIDERACIONES ACERCA DE LA EPIDEMIOLOGÍA, LA

INMUNIDAD, LOS TRATAMIENTOS Y LA MITIGACIÓN DE LA
ENFERMEDAD

27
28
Introducción

INTRODUCCIÓN

FACTORES EPIDEMIOLÓGICOS DE LA ENFERMEDAD

En las últimas décadas estamos asistiendo a la aparición de un número

sin precedentes de enfermedades fúngicas con un tremendo impacto en
distintas especies tanto de plantas como de animales de vida silvestre. Sirvan
como ejemplo, el “síndrome de la nariz blanca” causado por el hongo
Pseudogymnoascus destructans, responsable de la muerte de millones de
murciélagos en EEUU y Canadá en los últimos años. O también la conocida
como “peste del cangrejo” o afanomicosis, patología causada por el hongo
Aphanomyces astaci, que llegó a la península ibérica gracias a la introducción
de una especie invasora como el cangrejo rojo (Procambarus clarkii)
originario de Norteamérica y portador de la enfermedad, que está diezmando
muy seriamente las poblaciones de cangrejo de río común (Austropotamobius
pallipes), especie autóctona que a diferencia del cangrejo rojo, es muy sensible
a los efectos del hongo (Fisher et al. 2012). Estas enfermedades demuestran
que los hongos pueden llegar a ser altamente letales para hospedadores que no
han estado antes en contacto con ellos, exhiben un amplio espectro de especies
a las que pueden afectar y, tienen un elevado potencial reproductivo. Todas
estas características hacen de los hongos unos patógenos capaces de llevar a la
extinción a poblaciones enteras de animales silvestres, y a representar una
seria amenaza para el conjunto de la biodiversidad (Fisher et al. 2012).

Dentro de estas enfermedades con origen fúngico, la quitridiomicosis,

causada por el hongo quitridio Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), descrito
por Longcore et al. (1999), y que pertenece al Filo Chytridiomycota, la Clase
Chytridiomycetes, y al Orden Chytridiales, ha sido señalada como la más

29
 Capítulo 1

devastadora y como aquella que afecta a un mayor número de especies. La

capacidad de Bd para causar declives severos en múltiples especies de anfibios
reside en su alta patogenicidad, el amplio rango de especies a las que es capaz
de afectar, en poseer una elevada transmisibilidad intra e interespecífica, y en
su habilidad para persistir en el medio aún cuando el hospedador afectado
haya desaparecido, o haya sufrido un fuerte declive con el consiguiente
descenso en abundancia. Esta última capacidad de persistencia en el medio
natural, que permite la aparición recurrente de reinfecciones en una misma
localización, Bd la logra gracias a su pervivencia en especies animales no
anfibias, o en larvas, postmetamorfos o adultos de otras especies de anfibios
que actúan como reservorios (Daszak et al. 1999; Kilpatrick et al. 2010;
Scheele et al. 2019; Bienentreu & Lesbarrères 2020).

La quitridiomicosis es quizá la más relevante de las diferentes amenazas a

las que tienen que enfrentarse las más de 7000 especies de anfibios descritas,
pero no es ni mucho menos la única. Además de esta enfermedad infecciosa
emergente de origen fúngico, existe otra enfermedad infecciosa, la ranavirosis,
causada por un virus perteneciente al género Ranavirus de la familia
Iridoviridae, que es la responsable de distintos episodios de mortandad
masiva que han afectado a poblaciones de anfibios de todo el planeta. Mas allá
de las amenazas representadas por los mencionados agentes patógenos, los
anfibios de todo el mundo deben también hacer frente a otras amenazas, todas
ellas con el denominador común de su origen antropogénico, entre las que
podemos enumerar: la pérdida de hábitat bien por su destrucción, bien por un
cambio en el uso del mismo por parte de la especie humana, y la
contaminación y el uso de pesticidas. Del mismo modo, pueden considerarse
amenazas el comercio ilegal de especies y la introducción de especies
invasoras, que compiten por los recursos con los anfibios, actúan como sus
depredadores, o son portadores de enfermedades como la que es el objetivo de
la presente tesis doctoral (Oficialdegui et al. 2019). Y por supuesto también el

30
Introducción

cambio climático, que sobre todo en los últimos años se está revelando como
una seria amenaza para el conjunto de la biodiversidad debido al
calentamiento global y a la aparición cada vez más frecuente de eventos
climáticos extremos (Daszak et al. 1999; Hof et al. 2011; Blaustein et al. 2012;
Scheele et al. 2019).

En toda enfermedad infecciosa los efectos que se producen a nivel

individual, poblacional o de comunidad, vienen determinados por las
interacciones entre lo que podríamos describir como los tres vértices de un
“triángulo epidemiológico” (Scholthof. 2007; Brannelly et al. 2020). En cada
uno de esos vértices situaríamos por un lado al hospedador y por otro, al
patógeno y al ambiente que rodea a ambos (Figura 1). De tal manera que en el
caso concreto de la quitridiomicosis, si quisiéramos establecer un pronóstico
respecto al desarrollo de la enfermedad en diferentes especies de anfibios, o
buscar las razones por las cuales esta enfermedad no afecta de igual manera a
todas las especies de anfibios, y encontramos diferencias significativas en
cuanto a la sensibilidad mostrada frente al patógeno, deberíamos tener en
cuenta esas interacciones entre hospedador, patógeno y medioambiente
(Scholthof. 2007). Factores como la respuesta inmune montada por el
hospedador, su condición corporal, la riqueza de especies presente en
determinada localización, o la capacidad de replicación y los mecanismos de
evasión del sistema inmune que posea el patógeno, influyen de manera
determinante en el resultado de la infección. Del mismo modo, y muy
especialmente en el caso de los anfibios puesto que son organismos
ectotérmicos, los factores ambientales juegan un rol preponderante en las
dinámicas de transmisión y en el desarrollo de esta enfermedad fúngica.
Factores como la altitud, la humedad y sobre todo la temperatura ambiental,
tienen una influencia directa sobre rasgos del ciclo vital de los anfibios, sobre
su comportamiento, y sobre la respuesta inmune que puedan montar los
anfibios frente al patógeno. También ejercen esa influencia sobre el

31
 Capítulo 1

crecimiento, el desarrollo y la abundancia del patógeno en el medio (Walker et

al. 2010; Searle et al. 2011; Blaustein et al. 2012; Fernández-Beaskoetxea et al.
2015; LaBumbard et al. 2020; Lambertini et al. 2020).

Figura 1. Triángulo Epidemiológico formado por el hospedador, el patógeno y el ambiente.

Pasemos ahora a describir brevemente alguno de los factores más

importantes que compondrían el citado “triángulo epidemiológico” en el caso
de la quitridiomicosis. Diversos estudios han probado ya que los efectos de Bd
en las poblaciones silvestres de anfibios varían según las diferentes cepas
existentes del hongo, o según las especies anfibias afectadas y al mismo
tiempo, se ven influenciados por las condiciones ambientales o distintos

32
Introducción

factores abióticos como la altitud, la temperatura, la humedad, y la presencia o

ausencia de puntos permanentes de agua (Skerratt et al. 2007; Fisher et al.
2009; Kilpatrick et al. 2010; Searle et al. 2011; Fernández-Beaskoetxea et al.
2015; LaBumbard et al. 2020; Lambertini et al. 2020). Así, vemos como las
especies que se han visto más seriamente afectadas y que han sufrido los más
significativos declives entre sus poblaciones, son aquellas cuyo hábitat se
encuentra a una altitud elevada y no tienen un rango de distribución
especialmente amplio que les permita adaptarse a otros entornos (Skerratt et
al. 2007; Searle et al. 2011). Walker et al. (2010) demostró que hay una
relación directa entre la altitud y la enfermedad. Altitudes elevadas se
corresponden con la aparición de la versión más letal de la enfermedad y los
declives más acusados. Las especies de anfibios sensibles a la enfermedad
presentes en zonas de montaña, tanto en regiones templadas como tropicales,
y asociadas de alguna manera a masas de agua permanentes, han visto sus
poblaciones esquilmadas y reducidas drásticamente. Esto es así, puesto que la
intensidad de la infección y la prevalencia del hongo son mayores en zonas
elevadas (Fisher et al. 2009; Kilpatrick et al. 2010). Además de la altitud, otro
factor con un papel crucial en el desarrollo de la enfermedad en el medio
natural es la temperatura. Y en este caso, estaríamos hablando de un doble
efecto ya que al tratarse de una enfermedad que afecta a vertebrados
poiquilotermos, la temperatura afecta al patógeno, pero también influye en el
hospedador. Investigaciones como las de Fernández-Beaskoetxea et al. (2015)
han comprobado que la quitridiomicosis es una enfermedad altamente
estacional, influenciada por los cambios de temperatura, e inversamente
asociada a la temperatura del agua. Bd es un patógeno asociado a las bajas
temperaturas, cuyo desarrollo y crecimiento depende de la temperatura
ambiental (Searle et al. 2011). Esto tiene como resultado, que las mayores
cargas fúngicas en el medio las podemos encontrar durante los meses más
fríos del año (Raffel et al. 2010; Fernández-Beaskoetxea et al. 2015), y dado
que las regiones templadas del planeta son las que están sujetas a una mayor

33
 Capítulo 1

estacionalidad y a unas mayores diferencias de temperatura entre los meses

cálidos y fríos del año, podemos concluir que los anfibios presentes en las
zonas templadas del planeta, estarían expuestos a un gran riesgo de sufrir
brotes letales de la enfermedad con episodios de mortalidades masivas entre
sus poblaciones (Cohen et al. 2020). Vemos así, como temperaturas por debajo
del rango óptimo de crecimiento y desarrollo del hongo, son las que conllevan
una mayor presencia del hongo en el medio, lo que se traduce en mayores
cargas infectivas soportadas por el hospedador. Esto se produce, porque esas
bajas temperaturas comprometen también de manera importante el
desempeño del sistema inmune de los anfibios, tanto de su sistema inmune
innato como del adquirido o adaptativo (Cooper et al. 1992; Fisher et al. 2009;
Ribas et al. 2009). Esta casi inhibición del sistema inmunitario anfibio durante
los meses fríos del año, deja a estos animales más vulnerables y expuestos, y
limita su capacidad de respuesta frente al hongo, que aún estando fuera de su
rango óptimo de temperatura, puede desarrollarse sin tener que enfrentarse a
las defensas del hospedador (Rollins-Smith. 2020).

A parte de factores abióticos como la altitud y la temperatura, que como

hemos visto, juegan un papel fundamental en la dinámica de la enfermedad,
ésta se ve también modulada por factores exclusivamente referidos bien al
patógeno, bien al hospedador. Son los llamados factores bióticos. Si nos
centramos en el hongo, veremos como la existencia de distintas cepas con
diferencias acusadas en cuanto a su virulencia y su capacidad patógena
determina, como no podía ser de otra manera, el resultado de la infección
dependiendo de la cepa fúngica que actúe (Berger et al. 2005b; Farrer et al.
2011). Además del origen asiático del patógeno fúngico que algunos estudios
sitúan en la península de Corea (O’Hanlon et al. 2018), actualmente se han
identificado cinco grandes linajes de Bd, siendo el hipervirulento Linaje
Panzoótico Global (BdGPL por sus siglas en inglés) el que está más extendido y
el que, gracias a la globalización y al comercio ilegal de especies, ha conseguido

34
Introducción

llegar a cinco continentes y afectar a los anfibios que en ellos habitan (Farrer et
al. 2011; Byrne et al. 2019). Este linaje hipervirulento y muy resistente es el
que desgraciadamente podemos encontrar tanto en la península ibérica, como
en el resto de Europa, donde también se ha detectado la presencia de otros
linajes como BdCAPE y BdAsia1. La existencia de distintos linajes en una
misma área abre la posibilidad a que se produzcan hibridaciones entre linajes
que den lugar a cepas recombinantes, que pueden llegar incluso a ser más
virulentas que sus antecesores (Byrne et al. 2019; Castro Monzon et al. 2020).
En lo referente al hospedador, dentro de estos factores bióticos, además de la
condición corporal, la estructura poblacional, los rasgos del ciclo vital de cada
especie, la presencia de una microbiota en la piel de los anfibios capaz de
producir sustancias que inhiben el crecimiento del hongo, la producción por
parte de glándulas existentes en la piel de los anfibios de un abanico de
péptidos antimicrobianos con efectos fungicidas, o los distintos elementos que
componen el sistema inmune innato y adquirido, aparece también otro factor
adicional que condiciona la evolución de la infección y es, la variabilidad en
cuanto a sensibilidad frente al patógeno que existe entre las distintas especies
de anfibios. Ha quedado ya probado por la comunidad científica, que no todas
las especies de anfibios responden de igual manera ante la infección por parte
del agente fúngico (Woodhams et al. 2007; Briggs et al. 2010; Tobler &
Schmidt 2010). Así, mientras especies como la rana toro americana
(Lithobates catesbeianus) o la rana de uñas africana (Xenopus laevis), aún
siendo infectadas por Bd se muestran completamente asintomáticas, y son
capaces de soportar cargas fúngicas muy elevadas sin que éstas tengan
consecuencias negativas para sus organismos (Garner et al. 2006; Ramsey et
al. 2010), otras especies como la rana de patas amarillas de montaña (Rana
muscosa), o el sapo partero común (Alytes obstetricans), sí que se muestran
especialmente sensibles (Figura 2) a los efectos del hongo (Bosch et al. 2001;
Vredenburg et al. 2010).

35
 Capítulo 1

Figura 2. Sapo partero común (A. obstetricans) muerto a causa de la quitridiomicosis. Foto: Jaime Bosch.

Estas diferencias en la sensibilidad las podemos encontrar ya no sólo

entre especies, sino también entre los distintos estadíos por los que transita un
anfibio durante su desarrollo. La enfermedad no afecta de la misma manera a
las larvas que a los recién metamorfoseados, los juveniles o los adultos. Debido
a que el hongo restringe su distribución a las células queratinizadas de los
anfibios, y en las larvas dichas células las podemos encontrar principalmente
formando parte de la boca, las repercusiones de la infección por Bd en las
larvas se basan en un crecimiento y una tasa de desarrollo reducidos, como
consecuencia de una menor eficiencia forrajera y una menor cantidad de
comida ingerida (Kilpatrick et al. 2010; Venesky et al. 2009). Estas afecciones
del hongo en los estadíos larvarios, aún siendo no letales por sí mismas, sí que

36
Introducción

pueden acarrear consecuencias muy serias y severas que comprometan el

adecuado desarrollo del sistema inmune del animal (Rollins-Smith. 1998), e
incluso la vida del mismo durante o justo después de la metamorfosis, dada la
importancia crítica que tiene el buen desarrollo larvario para la supervivencia
en la mayoría de especies de anfibios conocidas (Garner et al. 2009b; Venesky
et al. 2009). Los costes fisiológicos de la metamorfosis para los anfibios son ya
de por sí elevados, por lo que si a esto le añadimos los costes de hacer frente
durante el desarrollo larvario a una infección producida por un agente
patógeno, que además está afectando negativamente la capacidad de
crecimiento de las larvas y su capacidad de llegar con una condición corporal
adecuada a la metamorfosis, tendremos como resultado un aumento en las
tasas de mortalidad durante o posteriores a la metamorfosis, como se ha
podido observar en el caso del sapo común (Bufo spinosus) (Garner et al.
2009b). Y esto puede ocurrir incluso en aquellos animales que hayan
conseguido vencer a la infección y deshacerse de la presencia del hongo. En
ocasiones, los costes de la lucha frente a la infección, incluso si esa infección
fúngica no llega a ser letal, pueden acabar siendo muy altos y pueden conllevar
un deterioro en el estado físico de los organismos afectados, al obligarles a
detraer temporalmente recursos energéticos de procesos fisiológicos como la
reproducción, para destinarlos a otros procesos de mayor prioridad como
pueden ser los de tipo inmunitario, con el fin de poder hacer frente al patógeno
(Garner et al. 2009b; Campbell et al. 2019).

Hay también otro factor a tener en cuenta cuando las infectadas por el
hongo son aquellas larvas de determinadas especies de anfibios
eminentemente terrestres en su fase adulta, pero con un desarrollo larvario
muy largo, que incluso puede prolongarse durante varios años. Especies como
R. muscosa o A. obstetricans tienen un desarrollo larvario que puede
extenderse a lo largo de varios años en localizaciones de una elevada altitud,
donde el agua se mantiene a una baja temperatura durante todo el año (Bosch

37
 Capítulo 1

et al. 2001; Vredenburg et al. 2010). Precisamente como hemos visto, la

elevada altitud y la baja temperatura son las condiciones ambientales más
favorables para el desarrollo del hongo, y es en esas localizaciones en las que se
pueden encontrar las cargas fúngicas más altas. Las larvas invernantes de estas
especies pasan mucho tiempo desarrollándose en el agua en contacto con las
zoosporas infectivas del hongo (Bosch et al. 2001; Bosch et al. 2006; Walker et
al. 2010). Esto hace que en este tipo de larvas se puedan encontrar cargas de
Bd muy elevadas, y convierte a las larvas de estas especies en “súper-
diseminadores” y en los grandes reservorios de la enfermedad, capaces de
amplificar la transmisión y reinfectar año tras año a las larvas más pequeñas
que comparten con ellas el punto de agua y también, a los anfibios adultos que
entran en contacto con el agua en la época de cría (Briggs et al. 2010; Fisher et
al. 2012; Fernández-Beaskoetxea et al. 2016).

Por otra parte, los efectos del hongo sobre el organismo son distintos
cuando el agente fúngico infecta a un anfibio de una especie sensible que ya ha
completado la metamorfosis. Como se ha mencionado con anterioridad, el
hongo limita su rango de acción a las células queratinizadas. Durante la
metamorfosis, esas células que en los estadíos larvarios estaban presentes
solamente en la boca, se extienden por toda la piel de los anfibios, con lo que
también se aumenta de una manera significativa el rango de afección de Bd.
Esto conlleva cambios fisiopatológicos en la estructura del estrato granuloso y
del estrato córneo de la epidermis, los cuales se ven invadidos por las
zoosporas infectivas que después se transforman en esporangios. La piel de los
anfibios es única entre los vertebrados terrestres, ya que a través de ella se
produce un intercambio de gases, agua y electrolitos, que consigue que el
animal mantenga un equilibrio osmótico con el ambiente que le rodea. Las
alteraciones producidas por el hongo a nivel de la epidermis causan un
engrosamiento de la piel o hiperqueratosis, y ocasionan una disrupción de las
funciones cutáneas con la consiguiente inhibición del transporte de

38
Introducción

electrolitos, que en el caso del sodio y del potasio puede llegar a alcanzar
niveles de un 20% y de un 50% respectivamente (Voyles et al. 2009). Esto
acaba comprometiendo de forma severa la osmorregulación y la falta de
electrolitos, sobre todo de potasio, termina afectando a la función cardíaca.
Finalmente, el fallo del corazón lleva, en última instancia, a la muerte del
animal (Voyles et al. 2009). Nos encontramos así con la paradoja de que un
agente patógeno que limita su rango de afección a los estratos más
superficiales de la epidermis y no causa cambios patológicos en ningún órgano
interno, acaba siendo letal para los anfibios al provocar un paro cardíaco
(Voyles et al. 2009).

LA INMUNIDAD FRENTE AL PATÓGENO

El sistema inmune anfibio es muy parecido en su estructura, sus

componentes y su funcionamiento al que poseemos los mamíferos (Robert &
Ohta 2009; Rollins-Smith et al. 2009). Consiste por una parte en un sistema
inmune innato basado en una respuesta celular no específica, que al ser el
primero en activarse, actúa como la primera barrera ante una infección. Este
sistema inmune innato estaría compuesto eminentemente por macrófagos,
granulocitos como los neutrófilos, basófilos y eosinófilos y también, por las
células citolíticas naturales (células NK por sus siglas en inglés). Todos estos
tipos de células, se encargarían de hacer frente a una agresión externa por
medio de la fagocitosis, o directamente atacando a las células infectadas por
citotoxicidad (Rollins-Smith. 2001; Robert & Ohta 2009; Rollins-Smith et al.
2009). Al sistema innato anfibio también pertenecerían el conjunto de
bacterias simbiontes presentes en la piel de los anfibios, así como un amplio
abanico de péptidos antimicrobianos (AMPs por sus siglas en inglés), algunos
de ellos con actividad antifúngica, que están producidos por las glándulas
granulares de la piel, y varían en su composición y concentración según la

39
 Capítulo 1

especie que los produzca (Rollins-Smith & Conlon 2005; Conlon et al. 2009;
Grogan et al. 2018; Rollins-Smith. 2020). Finalmente, dentro del sistema
inmune innato estarían las células dendríticas que son células presentadoras
de antígenos, y los componentes del complemento. El sistema del
complemento inmunitario está formado por una serie de proteínas cuya
activación a través de tres diferentes vías lleva a la mejora de la respuesta
inflamatoria, a una opsonización del patógeno, y a una lisis celular a través de
la formación del complejo de ataque de membrana (Rodriguez & Voyles 2020).
El complemento es por lo tanto un elemento importante en la respuesta
inmune temprana, ya que hace que esa respuesta sea más robusta y eficiente, y
también actúa como un nexo de unión entre el sistema inmune innato y el
adquirido (Robert & Ohta 2009; Rollins-Smith et al. 2009; Rodriguez & Voyles
2020). La otra parte del sistema inmune anfibio sería el sistema inmune
adquirido o adaptativo, compuesto principalmente por un tipo de leucocitos,
los linfocitos tipo B y tipo T. Aunque los anfibios carecen del equivalente a lo
que en los mamíferos son los nódulos linfáticos, sí que poseen un timo, que es
el órgano donde se diferencian los linfocitos T y un bazo, que también actúa
como órgano linfoide en el que se acumulan los linfocitos T y B. Este sistema
adquirido está también formado por el complejo mayor de histocompatibilidad
(MHC por sus siglas en inglés), del cual hay dos clases. El MHC Clase-I se
encarga de presentar principalmente antígenos de origen intracelular,
mientras que el MHC Clase-II hace lo mismo con los antígenos de origen
extracelular (Rollins-Smith. 2001; Robert & Ohta 2009; Rollins-Smith et al.
2009). Su funcionamiento se basa en la competencia que poseen los péptidos
que forman el MHC para unirse a los antígenos y posteriormente
presentárselos a los linfocitos, que son entonces capaces de destruir las células
infectadas y de montar una respuesta humoral consistente en la producción de
inmunoglobulinas o anticuerpos específicos para esos antígenos (Figura 3).
Este proceso de presentación de antígenos y de respuesta humoral específica
es lo que hace que el sistema inmune adaptativo sea más lento y en teoría, lo

40
Introducción

convierte también en más eficiente, aunque como veremos ya hay diversos

estudios que cuestionan por su aparente ineficacia el papel que juega el
sistema inmune adquirido anfibio en la defensa contra la quitridiomicosis
(Savage et al. 2020). Conviene reseñar que la división que hacemos del sistema
inmune en estas dos partes es más académica que real, ya que cuando el
organismo se enfrenta a una infección, tanto el sistema innato como el
adquirido no funcionan como compartimentos estancos. Muy al contrario,
están en permanente contacto, se entrecruzan señales, y comparten
componentes para hacer frente de manera coordinada a cualquier amenaza
(Richmond et al. 2009).

Figura 3. Componentes del Sistema Inmune Innato y Sistema Inmune Adquirido de los anfibios.

A pesar del parecido que guarda el sistema inmune anfibio con el del
resto de vertebrados, hay sin embargo un proceso que atraviesan los anfibios

41
 Capítulo 1

en algún momento a lo largo de su ciclo vital, que los hace únicos y los
diferencia del resto de vertebrados del planeta. Es la metamorfosis. Este
proceso de transformación que supone un tránsito desde los estadíos larvarios
a la etapa adulta, tiene también un efecto muy importante en el sistema
inmune anfibio, ya que conlleva un profundo y radical cambio en la expresión
de proteínas, la población de linfocitos y por lo tanto, en el repertorio de los
anticuerpos que éstos producen (Hsu & DuPasquier 1992). Durante la
metamorfosis hay una reorganización total del sistema inmune. A lo largo del
desarrollo larvario, la población de linfocitos va expandiéndose. Las larvas, al
igual que los adultos, poseen inmunoglobulinas IgM y también IgY, aunque
éstas últimas en bastante menor cantidad que los adultos. Algo que también
diferencia el sistema inmune adulto del larvario, es la ausencia en este último
de MHC Clase-I (Du Pasquier et al. 1989; Rollins-Smith. 1998). La
metamorfosis acarrea grandes cambios a nivel tisular en todo el organismo y
por supuesto, estos cambios afectan también a los linfocitos que ven su
población disminuida drásticamente (Hsu & DuPasquier 1992). Durante el
clímax metamórfico, el número de linfocitos larvarios decrece hasta en un
40%. Este acuciado descenso está ocasionado por un aumento en la
producción de hormona liberadora de corticotropina (CRH por sus siglas en
inglés) por parte del hipotálamo. La CRH provoca a su vez, una elevación en la
producción por parte de la hipófisis de hormona adrenocorticotropa (ACTH) y
de hormona estimulante del tiroides (TSH). Finalmente, la cascada hormonal
se completa con un acusado incremento en los niveles de las hormonas
tiroideas y en los corticoesteroides circulantes en sangre. Estas hormonas
ayudan a acelerar la metamorfosis, pero los costicoesteroides, que se producen
también bajo situaciones de estrés, inducen además la muerte celular o
apoptosis de los linfocitos. Esta destrucción fisiológica de los linfocitos
larvarios se produce durante la metamorfosis para evitar que esos mismos
linfocitos reaccionen y ataquen al nuevo repertorio proteíco y linfocitario
específico de los anfibios adultos, que se forma tras la metamorfosis. Después

42
Introducción

de este proceso, la población de linfocitos, que formarán parte ya de los

linfocitos adultos, comienza a aumentar hasta alcanzar los niveles habituales
entre los 4-8 meses post-metamorfosis. No obstante, algunos linfocitos Tipo B
de memoria persisten a través de la metamorfosis, y contribuyen a construir el
repertorio de los anticuerpos adultos. Esta renovación y la consiguiente
pérdida temporal de linfocitos, deja a los anfibios durante la metamorfosis
más expuestos a la acción de agentes patógenos externos como puede ser Bd, y
provoca que, al menos temporalmente, los anfibios sufran un mayor riesgo de
contraer una infección causada por un agente patógeno (Rollins-Smith. 1998).
Nos encontramos así con un periodo, el que sigue inmediatamente después de
la metamorfosis, en el que los anfibios experimentan un descenso drástico de
sus defensas debido a la reducción linfocitaria precipitada por estos cambios
hormonales, que los hace especialmente vulnerables a los ataques por parte de
agentes patógenos. Este periodo coincide además, como ya se ha reseñado, con
el momento en el que las células queratinizadas, a las que afecta el hongo
quitridio, pasan de estar solamente localizadas en la boca de las larvas, a
extenderse por toda la piel del anfibio. Esto explicaría en parte el porqué los
efectos más devastadores de la enfermedad los sufren los animales recién
metamorfoseados, y los episodios de mortandad masiva producidos por Bd se
concentran principalmente en esta fase del ciclo vital anfibio.

Los organismos ectotermos están sujetos a que los cambios estacionales

de temperatura que se dan en zonas templadas, afecten su respuesta inmune a
varios niveles. En los anfibios, esta dependencia térmica de su sistema
inmunitario, hace que cuando la temperatura desciende por debajo del rango
térmico óptimo, el tiempo necesario para montar una respuesta inmune
aumenta, mientras que los niveles de linfocitos y de eosinófilos circulantes en
sangre, así como de anticuerpos producidos descienden (Wright & Cooper
1981; Raffel et al. 2006). También la actividad del complemento inmunitario
se ve afectada negativamente por las bajas temperaturas. La falta de

43
 Capítulo 1

proliferación de los linfocitos a bajas temperaturas, limita la capacidad del

animal de reconocer y responder a un antígeno, con lo que el sistema inmune
en general pierde robustez y eficiencia (Maniero & Carey 1997). Siendo
animales hibernantes, los anfibios de zonas templadas atraviesan este proceso
fisiológico de inmunosupresión invernal anualmente, durante el cual su
metabolismo basal se ve reducido con el fin de preservar energía mientras
están en ayuno (Rollins-Smith. 2020). No obstante, no se quedan
completamente desprotegidos durante este periodo, ya que ese descenso
fisiológico y estacional de la actividad del sistema inmune, no afecta al número
de neutrófilos ni a la actividad fagocítica, que aunque también descienden
inicialmente con la bajada de las temperaturas, vuelven a aumentar cuando el
anfibio se aclimata a las nuevas condiciones ambientales (Maniero & Carey
1997; Raffel et al. 2006). Esta adaptación evolutiva ha permitido a los anfibios
de zonas templadas como A. obstetricans, optimizar recursos y mantener un
nivel de defensa adecuado durante los meses invernales, con el fin de poder
hacer frente a los escasos patógenos que estaban adaptados a las bajas
temperaturas que se dan durante ese tiempo. Actualmente sin embargo, los
anfibios tienen que hacer frente a un patógeno como el hongo quitridio, que sí
es capaz de sobrevivir a esas bajas temperaturas, e incluso como ya hemos
visto, se ve favorecido e incrementa su prevalencia y su intensidad infectiva
durante ese periodo en el que los anfibios sufren de un aumento en su
susceptibilidad hacia agresiones externas (Raffel et al. 2006). Todo esto
ocasiona que los efectos más devastadores de Bd, se dejen notar en zonas
templadas especialmente durante los meses de invierno y primavera, cuando
los anfibios que logran sobrevivir a la hibernación están en un proceso de
aclimatación estacional, y sus niveles leucocitarios y de efectividad de la
respuesta inmune todavía no están desarrollados por completo, con lo que no
pueden hacer frente al patógeno fúngico.

Pero la temperatura también puede influir de manera positiva en la

evolución de la enfermedad. Al contrario de lo que sucede con el frío, el

44
Introducción

sistema inmune anfibio se ve potenciado en su capacidad de respuesta y de

contención de la infección cuando las condiciones ambientales le son más
favorables y las temperaturas son más cálidas. Se ha demostrado que los
hospedadores resisten mejor la infección por Bd a temperaturas elevadas,
aunque éstas se encuentren dentro del teórico rango óptimo de crecimiento del
hongo en condiciones de laboratorio (17-25ºC) (Andre et al. 2008). Algunas
especies de anfibio son incluso capaces de acabar con la infección por Bd si se
encuentran en unas condiciones de temperatura adecuadas. Y lo consiguen
más rápidamente si esas condiciones térmicas son óptimas para el
hospedador. Bajo esas condiciones óptimas, se produce una regulación
genética positiva, y un aumento en la capacidad de respuesta del sistema
inmune innato, en concreto en la producción de péptidos antimicrobianos
(AMPs) (Ribas et al. 2009). Este aumento de la tasa de supervivencia a
temperaturas elevadas, es debido principalmente a una mayor eficiencia de su
respuesta inmune (Murphy et al. 2011). Vemos así como, la temperatura se
convierte en un factor ambiental que juega un papel decisivo y crucial en el
desarrollo de la quitridiomicosis, ya que ejerce una influencia directa sobre la
respuesta inmune que los anfibios pueden desplegar para hacer frente al
hongo quitridio, Bd.

Ante cualquier infección, un organismo puede intentar defenderse

utilizando dos estrategias: O bien limita la carga infectiva del patógeno,
ofreciendo así resistencia a la infección, o bien limita el daño que dicho
patógeno le puede ocasionar, mostrando así tolerancia hacia la infección
(Searle et al. 2011; Brannelly et al. 2020). En el caso de la quitridiomicosis, los
anfibios ponen en marcha distintos mecanismos de defensa para intentar
hacer frente al patógeno. Entre ellos encontramos a las defensas de la piel,
formadas por péptidos antimicrobianos (AMPs), inmunoglobulinas presentes
en las secreciones dérmicas, así como también metabolitos antifúngicos
producidos por bacterias simbiontes localizadas en la superficie de la piel

45
 Capítulo 1

anfibia (Rollins-Smith et al. 2011; Grogan et al. 2018). Los AMPs son
normalmente de naturaleza catiónica e hidrofóbicos, y tienen una importante
capacidad de disrupción de las membranas celulares, lo que les confiere la
facultad de proteger a la piel de agresiones causadas por bacterias, virus,
protozoos y también hongos. Estos AMPs jugarían un papel crítico en la
prevención de la colonización de la piel por parte de Bd, limitando el grado de
infección. Se ha comprobado además que estos péptidos actúan
sinérgicamente para inhibir el crecimiento de las zoosporas y los esporangios
del hongo. Serían así una pieza fundamental en la resistencia contra los efectos
del patógeno (Rollins-Smith et al. 2009; Ramsey et al. 2010; Gervasi et al.
2014). Diversos estudios han evidenciado también su importancia a la hora de
luchar frente al hongo quitridio, ya que se ha demostrado que algunas especies
sensibles a Bd como el sapo boreal (Anaxyrus boreas) no poseen una mezcla
peptídica efectiva contra el patógeno (Rollins-Smith et al. 2009). Y viceversa,
aquellas especies de anfibios más resistentes a la enfermedad y que no han
sufrido declives, son aquellas capaces de secretar un abanico de péptidos que
sí muestran un alto grado de efectividad in vitro frente al hongo (Woodhams
et al. 2007). Existen así evidencias cada vez más sólidas, que nos llevan a
pensar que se podría predecir la supervivencia o el declive de una especie de
anfibio al enfrentarse a una infección por Bd en la naturaleza, según la clase y
la cantidad de péptidos antimicrobianos que dicha especie sea capaz de
producir (Rollins-Smith et al. 2011). Además de estas defensas dérmicas, otro
tipo de defensas, conformadas por el sistema inmune innato y el adquirido,
son movilizadas para tratar de contener la infección si el hongo tiene éxito a la
hora de colonizar la piel del anfibio. Entran en juego entonces las defensas
celulares y las humorales. Dentro de la respuesta celular, es de gran
importancia la actividad de los linfocitos T. De hecho, durante mucho tiempo
se ha otorgado a las células T un rol preponderante en la defensa frente a las
infecciones fúngicas (Blanco & García 2008). En el caso de la infección por el
hongo quitridio, se ha observado una proliferación de linfocitos T muy débil,

46
Introducción

incluso en animales que habían sido previamente inmunizados, lo que sugiere

como veremos más adelante, que Bd puede tener algún mecanismo que inhiba
la protección de la respuesta celular (Rollins-Smith et al. 2009). Otra
característica de la infección por este patógeno fúngico, es el aumento que se
observa en algunas especies infectadas de la ratio entre neutrófilos y linfocitos.
Signo éste que indica que los animales infectados por Bd sufren de un estrés
inducido por dicha infección (Gervasi et al. 2014). Finalmente en cuanto a la
respuesta humoral, algunos estudios han demostrado que en especies
tolerantes a la infección como la rana de uñas africana (Xenopus laevis), sí
existe un aumento en la producción de anticuerpos específicos
(inmunoglobulinas IgM e IgY) para enfrentarse a Bd (Rollins-Smith et al.
2009). Sin embargo, no hay todavía una evidencia probada del papel que
juegan los anticuerpos en la protección frente a las infecciones fúngicas
dérmicas, también llamadas dermatomicosis. Se especula con que su acción
podría estar relacionada con la activación del complemento inmunitario y con
la opsonización, o destrucción de las células infectadas (Blanco & García
2008). Con todo lo anteriormente expuesto, comprobamos que las defensas
desplegadas por los anfibios frente al hongo quitridio, aunque varían según la
especie de anfibio implicada, consisten en una combinación entre el sistema
inmune innato y el adquirido. Ambos sistemas actúan de manera coordinada
para hacer frente a la infección. No obstante, parece que el hecho de que no se
produzca una adecuada proliferación de linfocitos, y que la eficiencia de los
anticuerpos producidos frente a Bd tampoco esté probada, otorga al sistema
inmune innato y sobre todo a la actividad de los péptidos antimicrobianos
secretados en la piel, un papel destacado en la lucha contra la infección.

Un último elemento que es importante reseñar es la aparentemente

escasa reacción inflamatoria en la piel que se ha detectado en respuesta a una
infección fúngica que afecta de manera intensa y casi exclusiva a este área vital
del organismo anfibio (Berger et al. 2005a; Grogan et al. 2018). Las últimas

47
 Capítulo 1

hipótesis para intentar explicar este sorprendente hecho, apuntan a que Bd

lleva coevolucionando desde su origen junto con sus hospedadores anfibios
asiáticos al menos durante el último siglo (Fu & Waldman 2019). Fruto de esta
carrera evolutiva en la que tanto el patógeno como sus hospedadores han ido
desarrollando diferentes mecanismos de ataque, evasión o defensa, se cree que
el hongo quitridio habría sido capaz de evolucionar como un organismo
comensal de la piel anfibia e inducir la inmunosupresión local de la respuesta
celular inflamatoria, beneficiando así al hospedador al evitarle los
perjudiciales efectos que esa inflamación podría tener en un órgano vital para
la supervivencia anfibia como puede ser su piel (Rollins-Smith. 2020).

Sin duda, a pesar de todos los esfuerzos e investigaciones que se han

llevado a cabo para comprender en profundidad en qué consiste la respuesta
inmune anfibia frente a la quitridiomicosis, y los mecanismos de que dispone
el patógeno para evadirla, todavía nos falta mucho para llegar a encajar todos
los elementos y entender completamente cómo funcionan las interacciones
entre el hospedador anfibio y el agente patógeno fúngico.

TRATAMIENTO DE LA QUITRIDIOMICOSIS

Múltiples estudios a lo largo de los últimos años han ido dirigidos a

encontrar un protocolo de tratamiento que fuese efectivo y eficiente a bajas
dosis, con un amplio rango terapéutico, es decir, un amplio margen entre la
concentración mínima efectiva y la concentración mínima tóxica en el caso de
los productos antifúngicos, un tratamiento fiable, no costoso en la parte
económica, práctico, sin efectos secundarios contraproducentes, y aplicable
tanto en los diversos estadíos anfibios (larvas, metamorfos y adultos), como en
diferentes condiciones de cautividad o incluso en la naturaleza. Por desgracia a

48
Introducción

día de hoy, a pesar de los muchos avances, todavía no se ha encontrado un

tratamiento que cumpla todos y cada uno de estos requisitos.

Sin duda, el fármaco que se usa de una forma más generalizada y el que
mejores resultados ha dado hasta el momento, sobre todo al tratar anfibios
juveniles y adultos infectados con Bd, es el itraconazol (Nichols & Lamirande
2001). Este triazol sistémico de primera generación, altera la permeabilidad de
membrana y las funciones del hongo (Loyau et al. 2016), y ha sido utilizado
con éxito en distintos centros de investigación y en programas de cría en
cautividad (Forzán et al. 2008; Garner et al. 2009a; Jones et al. 2012).

Pero no sólo se ha utilizado este triazol, el itraconazol, para tratar la

enfermedad. Desde que se describió la quitridiomicosis y se supo el agente
fúngico que la causaba, son varios los fármacos que se han probado con
diferentes resultados. Uno de ellos es el verde de malaquita, que ha sido usado
con éxito en combinación con el formaldehído para tratar a individuos adultos
de S. tropicalis infectados con Bd (Parker et al. 2002). No obstante, el uso de
este fármaco está completamente desaconsejado debido a sus efectos
potencialmente teratogénicos, mutagénicos y carcinogénicos, su capacidad
para afectar directamente al ADN, y la citotoxicidad que manifiesta en
mamíferos (Culp & Beland 1996; Sudova et al. 2007; Pessier & Mendelson
2010). Otro producto que ha demostrado tener actividad antifúngica frente a
Bd, y que también se ha utilizado con éxito para tratar la enfermedad es el
cloranfenicol. Este antibiótico bacteriostático de amplio espectro actúa
interfiriendo en la síntesis proteica del patógeno. Se ha conseguido usar
satisfactoriamente contra la enfermedad en individuos adultos de la rana de
Archey (Leiopelma archeyi) y de la rana arborícola verde australiana (Litoria
caerulea), sin que se haya observado efecto secundario alguno (Bishop et al.
2009; Young et al. 2012). Sin embargo tampoco se aconseja su uso, debido a
que se ha asociado a la aparición de una anemia aplásica con afección de la
médula ósea en humanos (Smick et al. 1964). Se ha documentado también,

49
 Capítulo 1

que el uso de cloranfenicol causa un amplio impacto a nivel hematopoyético en

adultos del sapo africano común (Sclerophrys regularis), llegando a producir
cambios ultraestructurales en los leucocitos que se corresponderían con los
observados en procesos leucémicos (El-Mofty et al. 2000). Por último el
cloranfenicol, por su acción bacteriostática, tendría también efectos
inhibitorios significativos en las bacterias simbiontes de la piel anfibia si se
administra por vía tópica. Un estudió demostró su capacidad para alterar
dramáticamente el microbioma protector existente de forma natural en la piel
de la rana leopardo sureña (Lithobates sphenocephalus), afectando así a las
defensas innatas dérmicas de esta especie (Holden et al. 2014). Otro producto
que se ha utilizado en el tratamiento de la quitridiomicosis es el cloruro de
benzalconio. Este desinfectante de amplio espectro se utilizó con aparente
éxito en forma de solución acuosa para tratar una infección por Bd en
individuos de la rana de junco pintada (Hyperolius marmoratus) (Barrows et
al. 2010). Sin embargo, también ha habido algún caso en el que no se
obtuvieron unos resultados satisfactorios utilizándolo. A pesar de que el
tratamiento con cloruro de benzalconio que se aplicó prolongó
significativamente la vida de los anfibios, no evitó que la mortalidad en
juveniles de L. caerulea infectados experimentalmente con Bd alcanzara el
100% (Berger et al. 2009).

La urgencia de encontrar un tratamiento efectivo, adecuado, y tolerado

por todas las especies y los distintos estadíos anfibios, ha hecho que
recientemente se hayan acometido avances en el estudio de otros fármacos,
como por ejemplo la nikomicina Z. Este antibiótico actúa inhibiendo la síntesis
de quitina, sustancia fundamental para la estructura y la estabilidad de la
pared celular de Bd y que por lo tanto, es vital para la supervivencia del hongo.
Adicionalmente, la nikomicina Z no tendría ningún efecto pernicioso sobre la
producción o la acción de los péptidos antimicrobianos (AMPs). Muy al
contrario, se ha demostrado que podría cooperar con las defensas naturales
presentes en la piel de los anfibios, al interferir con la síntesis de la pared

50
Introducción

celular fúngica y hacer que el hongo pase a ser más susceptible a las
propiedades disruptivas de los péptidos (Holden et al. 2014).

El escenario de cambio climático que estamos viviendo hoy en día, trae

consigo múltiples consecuencias que afectan de diversas maneras a todos los
organismos vivos que habitamos el planeta. Por un lado, las temperaturas han
ido en aumento durante las últimas décadas, y siguen incrementándose de
forma generalizada por causas que principalmente tienen un origen
antropogénico. Este calentamiento global es capaz de provocar cambios
significativos en la distribución de las especies, en la estructura y
funcionamiento de los ecosistemas, y en el ritmo al que se producen distintos
procesos o ciclos biológicos (Duarte et al. 2012). Por otro lado, el cambio
climático ocasionará cambios en la incidencia, transmisión, estacionalidad, y
áreas de impacto geográfico de distintas enfermedades infecciosas, sobre todo
de aquellas transmitidas por vectores, como la malaria, el dengue, la fiebre
amarilla, o la borreliosis, entre otras (McMichael et al. 2006). Y por supuesto,
también afectará a las dinámicas infectivas y de transmisión de la
quitridiomicosis, al estar ésta y el patógeno fúngico que la produce,
enormemente influenciados por la temperatura y las condiciones ambientales
(Murray et al. 2013). Por último, el cambio climático es el principal causante
del aumento de la variabilidad térmica, de exacerbar la fuerza de fenómenos
climáticos como El Niño, y de la aparición cada vez con una mayor frecuencia
de eventos climáticos extremos como lluvias torrenciales, inundaciones, largos
periodos de sequía o intensas tormentas (McMichael et al. 2006; Rohr & Raffel
2010). Todo esto dibuja un panorama nada halagüeño para la biodiversidad
del planeta, los seres vivos en general y los anfibios en particular, ya que
algunas de las que previsiblemente serán las regiones más afectadas por el
cambio climático, coinciden en muchas ocasiones con zonas en las que los
anfibios se enfrentan a otras amenazas como la destrucción de su hábitat o las
enfermedades infecciosas y son a su vez, “puntos calientes” en lo que a

51
 Capítulo 1

diversidad anfibia se refiere (Hof et al. 2011). Los eventos climáticos extremos
y la variabilidad térmica, serán los causantes de que múltiples especies del
planeta sufran de un estrés térmico al sacar a los organismos fuera de su zona
térmica de confort, lo que llevará a un aumento de las tasas de mortalidad
(McMichael et al. 2006). Estos cambios bruscos y rápidos pueden hacer
también que aquellas especies anfibias que evolutivamente ya habían
optimizado su sistema inmune para enfrentarse a patógenos bajo unas
condiciones ambientales específicas, vean afectada su capacidad para
desplegar una respuesta inmune robusta o adecuada al cambiar dichas
condiciones (Fisher et al. 2007). Vemos así como la variabilidad térmica
podría afectar a las defensas de los hospedadores ectotérmicos (Rohr & Raffel
2010; Cohen et al. 2020). La hipótesis del desequilibrio térmico (Cohen et al.
2017), se basa en que los rangos fisiológicos térmicos son diferentes entre
patógenos y hospedadores. Normalmente los patógenos tienen rangos más
amplios, lo que les permite aclimatarse mejor y de una forma más rápida que
sus hospedadores a la variabilidad térmica y a las condiciones ambientales
cambiantes (Cohen et al. 2020). Nos encontraremos así con que los
hospedadores serán más vulnerables a los efectos de los patógenos cuanto mas
difieran las temperaturas de aquellas a las que están adaptados (Cohen et al.
2017; Neely et al. 2020). Para cualquier organismo además, montar una
respuesta inmune eficaz es costoso a nivel energético. Así, las especies de
anfibios amenazadas por patógenos como Bd y sujetas a unas condiciones
ambientales que les exigen optimizar muy bien sus recursos, haciéndoles
funcionar habitualmente manteniendo un delicado equilibrio muy cerca de sus
límites fisiológicos, como aquellas que habitan en zonas de montaña, pueden
encontrarse con que estos cambios bruscos en las condiciones ambientales les
fuercen, con el fin de hacer frente al patógeno fúngico, a destinar recursos a su
sistema inmune de los que quizá carezcan o, que tengan que detraer de otras
funciones orgánicas (Fisher et al. 2009). El hecho de que hospedadores que
habitan zonas de montaña sean por lo tanto menos capaces que aquellos que

52
Introducción

pueblan zonas poco elevadas de hacer frente al mismo tiempo a la infección

fúngica y a cambios térmicos, unido a la vulnerabilidad que según la hipótesis
del desequilibrio térmico causa la variabilidad térmica en los hospedadores,
explicaría en parte el porqué los anfibios de zonas de montaña están más
expuestos a los efectos de la quitridiomicosis que otras especies que habitan
regiones más bajas (Cohen et al. 2019).

El calentamiento global consecuencia del cambio climático pondrá a

prueba la capacidad de adaptación de los organismos. Aquellos organismos
que carezcan de la habilidad para adaptarse a los nuevos regímenes térmicos
sufrirán un estrés causado por este incremento térmico, lo que podrá
provocarles una depresión metabólica, y colocarles en una situación de riesgo
con una mayor tendencia a la desaparición (Bernardo & Spotila 2006). Se
prevé que este aumento de las temperaturas sea más acusado en zonas de
interior de las regiones templadas del planeta (McMichael et al. 2006; Rohr &
Raffel 2010). Esto último situaría a los anfibios que habitan zonas de montaña
en esas regiones templadas en una posición de susceptibilidad a sufrir brotes
de enfermedades infecciosas, y de vulnerabilidad frente a los efectos de
patógenos como Bd, ya que las temperaturas fluctuarían hacia el rango térmico
óptimo del hongo quitridio en el que su tasa de crecimiento y reproducción es
mayor y además, es más complicada la adaptación a climas cálidos por parte
de animales ya especializados a microclimas fríos que viceversa (Bernardo &
Spotila 2006; Pounds et al. 2006; Cohen et al. 2017). La hipótesis de la
variabilidad climática postulada recientemente podría corroborar esto último.
Según esta hipótesis, mientras que cambios de temperatura que impliquen un
tránsito desde temperaturas frías a otras más cálidas aumentarían la
sensibilidad anfibia frente a los patógenos, los cambios de temperatura que
impliquen pasar desde temperaturas cálidas a otras más frías, harían que esa
sensibilidad descendiese. Esto se produciría porque las defensas del
hospedador anfibio siempre tardarían más que el hongo quitridio en

53
 Capítulo 1

aclimatarse y en alcanzar su óptimo (Bradley et al. 2019). Este estudio llevado

a cabo con larvas de la rana norteña de patas rojas (Rana aurora), y del sapo
boreal (Anaxyrus boreas) también confirma que, ante la ausencia de cambios
térmicos, las temperaturas bajas constantes favorecen tanto el crecimiento de
Bd como el incremento en la mortalidad que el hongo produce (Bradley et al.
2019).

En definitiva, podemos comprobar como el cambio climático está ya

afectando de múltiples formas a todos los seres vivos que habitan el planeta.
Su influencia directa sobre hospedadores, patógenos y dinámicas infectivas de
las enfermedades, continuará dejándose notar en el futuro y constituye una
importante amenaza capaz de ejercer un efecto erosivo sobre la biodiversidad.

MITIGACIÓN EN EL MEDIO NATURAL

A pesar de los importantes avances que se han hecho en el estudio y

tratamiento de la quitridiomicosis, hoy en día carecemos aún de las
herramientas adecuadas que nos permitan frenar el avance o mitigar los
efectos de la enfermedad en la naturaleza. Se van dando sin embargo pequeños
pasos, para intentar encontrar una solución con la que abordar con éxito el
manejo sanitario de las poblaciones de anfibios afectadas por el hongo
quitridio en condiciones naturales. Algunas de las estrategias que se han
puesto en práctica hasta el momento se basan en la translocación o en la cría
en cautividad y reintroducción de individuos (Fellers et al. 2007), en la
bioaumentación del microbioma presente en la piel de los anfibios con
probióticos (Bletz et al. 2013), en el tratamiento con antifúngicos siguiendo la
técnica de captura-tratamiento-liberación (Geiger et al. 2017), o en una
combinación entre tratamientos antifúngicos y la aplicación de desinfectantes
químicos en el medio natural (Bosch et al. 2015). Los resultados sin embargo,

54
Introducción

no han sido todo lo satisfactorios que cabía esperar, obteniendo en el mejor de

los casos un éxito parcial. Esto parece indicar que solamente a través de una
combinación de diferentes métodos de mitigación, será posible conseguir el
objetivo de alcanzar la erradicación completa y definitiva del patógeno del
medio (Garner et al. 2016).

Las condiciones ambientales y los cambios en el hábitat serían dos de los

factores que tienen una influencia directa en las dinámicas de la patología, así
como también importantes efectos sobre las interacciones hospedador-
patógeno. Algo que hace que haya que tomarlos en consideración a la hora de
diseñar cualquier estrategia de mitigación de la enfermedad (Daskin et al.
2011; Becker et al. 2012). Como hemos visto, la temperatura del agua tiene un
efecto inversamente proporcional en la probabilidad y la intensidad de la
infección por Bd. Por lo que un método de mitigación de la enfermedad podría
ser intentar aumentar la temperatura del agua (Heard et al. 2014). Hay
claramente una relación directa y significativa entre las condiciones climáticas
locales, y más concretamente entre la temperatura y la aparición o el resultado
de la infección (Bosch et al. 2006). Asimismo, un incremento de los regímenes
térmicos, favorece el funcionamiento del sistema inmune anfibio al mismo
tiempo que dificulta el desarrollo y el crecimiento del hongo quitridio,
posibilitando así una reducción en la prevalencia y la intensidad de la infección
(Daskin et al. 2011; Forrest & Schlaepfer 2011). Para lograr ese aumento de la
temperatura ambiental, algunos autores han propuesto la implementación de
medidas en el medio que supongan una modificación del hábitat con la cual
poder influir en el desarrollo de la enfermedad (Scheele et al. 2014). Defienden
estos autores que la manipulación y modificación del entorno puede ayudar a
reducir las tasas y las cargas de infección y por lo tanto, a mejorar la
supervivencia del hospedador, sin la necesidad de utilizar desinfectantes
químicos en el medio que podrían tener algún tipo de repercusión sobre la
flora y la fauna del hábitat en el que se actúe (Scheele et al. 2014). Argumentan
que una de las actuaciones sobre el hábitat más plausibles y con mayores

55
 Capítulo 1

posibilidades de deparar unos buenos resultados, sería la reducción de la

densidad del dosel arbóreo para aumentar la insolación, y proporcionar a los
anfibios refugios térmicos frente a la enfermedad (Raffel et al. 2010;
Puschendorf et al. 2011; Becker et al. 2012; Scheele et al. 2014). Siendo
animales ectotérmicos, los anfibios dependen de su entorno para
termoregularse. Se ha observado que en situaciones en las que su salud está
comprometida, los anfibios permanecen más tiempo soleándose o buscan
lugares más expuestos al sol, más cálidos, con el fin de aumentar su
temperatura corporal y optimizar así el funcionamiento de sus defensas. Este
comportamiento se denomina fiebre comportamental (Richards-Zawacki.
2010; Daskin et al. 2011; Forrest & Schlaepfer 2011; Murphy et al. 2011; Becker
et al. 2012; Evans et al. 2015). La fiebre en sí es un mecanismo de defensa que
proporciona ciertas ventajas al hospedador frente al patógeno, como estimular
el sistema inmune e incrementar la susceptibilidad y la capacidad de detección
del patógeno, que ve reducida su facultad de replicación (Evans et al. 2015). De
esta manera, al disminuir la densidad del dosel arbóreo, estaríamos facilitando
el uso por parte de los anfibios de estos “puntos cálidos”, y estaríamos
ayudando a potenciar sus defensas para hacer frente a Bd.

Pero sin duda, para encontrar un método de mitigación efectivo, seguro, y

con una capacidad de transferencia que permita su aplicación en distintas
especies, en diversos hábitats y bajo diferentes condiciones ambientales, es
absolutamente necesario entender previamente la manera en la que los
diferentes factores afectan a la ecología de la enfermedad y a las dinámicas
infectivas del patógeno, conocer los rasgos del ciclo vital de la especie o
especies de anfibio con las que se va a trabajar, así como comprender las
interacciones que se dan entre estos elementos (Fisher et al. 2012; Scheele et
al. 2014). En este sentido, en el caso de las especies del género Alytes, habría
que tener especialmente en cuenta que su desarrollo larvario puede llegar a ser
extremadamente prolongado, lo que convierte a las larvas invernantes de estas

56
Introducción

especies en amplificadores naturales de la infección al ser capaces de producir,

en ocasiones durante años, un elevado número de zoosporas (Briggs et al.
2010; Fisher et al. 2012; Fernández-Beaskoetxea et al. 2016; Hite et al. 2016).
Hecho éste, que coloca a estas larvas como objetivo prioritario sobre el que
dirigir cualquier acción de mitigación que tenga como fin controlar la
diseminación de la quitridiomicosis en estas especies (Garner et al. 2016).

En definitiva, ante el reciente auge de las enfermedades infecciosas de

origen fúngico en general, y de la quitridiomicosis en particular, es prioritario
el diseño y la implementación sobre el terreno de mecanismos de mitigación.
Dentro de las escasas, hasta el momento, estrategias de mitigación que se han
puesto en marcha, encontramos dos que se desarrollarán en el presente
trabajo, y cuyos resultados podremos ver y analizar. La primera de ellas,
consistente en disminuir la densidad poblacional del hospedador y modificar
el hábitat para intentar así eliminar al hongo del medio (Capítulo 5). Y la
segunda, basada en una combinación de tratamientos antifúngicos de los
anfibios junto con la aplicación de desinfectantes en el medio natural (Capítulo
6). Los métodos de mitigación mencionados son un signo de que, aunque
lentamente, se van produciendo avances, pero todavía queda mucho por
recorrer hasta alcanzar nuestro objetivo y conseguir paliar los devastadores
efectos que esta otra pandemia está teniendo en las poblaciones de anfibios de
todo el planeta.

A lo largo de los años 1997, 1998 y 1999 se detectaron en el Parque

Nacional de la Sierra de Guadarrama (Madrid-Segovia. España), episodios de
mortandad masiva que afectaron a A. obstetricans, y que llevaron a su
desaparición en más de un 80% de las localizaciones en las que estaba
presente dentro del citado Parque Nacional. Se trataba del primer brote de la
enfermedad descrito en Europa (Bosch et al. 2001). A lo largo de estos años, se
han puesto en marcha diferentes iniciativas para intentar paliar los efectos que
Bd tiene sobre las poblaciones de A. obstetricans tanto de la Sierra de

57
 Capítulo 1

Guadarrama, como del resto de la península ibérica. Programas de cría en

cautividad y reintroducción, análisis acerca de la estructura genética de las
poblaciones de sapo partero común y otras, como los trabajos que componen
esta tesis doctoral, consistentes en estudiar su respuesta inmune frente al
agente patógeno, la eficacia de distintos productos antifúngicos con los que
tratar la enfermedad, o la viabilidad de actuaciones de mitigación sobre el
terreno.

58
Introducción

INTRODUCCIÓN: REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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72
73
OBJETIVOS PRINCIPALES

74
 OBJETIVOS PRINCIPALES

La presente tesis doctoral se centra en examinar la respuesta inmune de

la que dispone una especie sensible a los efectos del hongo, como es A.
obstetricans, para hacer frente a la infección. Del mismo modo, entre los
objetivos de la presente tesis está el analizar la eficacia de algunos de los
tratamientos que se utilizan para tratar la enfermedad en condiciones de
cautividad. En este sentido, se expondrán los resultados obtenidos con
diferentes tratamientos experimentales basados en el uso de antifúngicos. De
igual manera, se detallarán los efectos que un aumento de la temperatura
hasta el umbral térmico máximo (CTmax) tolerado por A. obstetricans pudiese
tener tanto sobre el hospedador, como sobre el patógeno. En la última parte de
esta tesis se expondrán y se discutirá acerca de dos intervenciones diferentes,
puestas en marcha directamente in situ, con el fin de hacer frente a la
enfermedad y mitigar sus efectos sobre el terreno.

Expongo a continuación de una manera más concreta cuáles son los

objetivos principales de la presente tesis doctoral:

1. Analizar las posibles razones que hacen de A. obstetricans la especie de

anfibio más sensible de Europa a la enfermedad, a través del estudio de la respuesta
inmune presentada por este hospedador cuando es infectado experimentalmente
con el hongo durante su desarrollo larvario. Intentando determinar así, si hay algún
tipo de alteración en el sistema inmune adquirido de A. obstetricans que pudiera
estar relacionada con el elevado nivel de sensibilidad que presenta esta especie
frente al patógeno.

2. Diseñar y desarrollar distintos protocolos de tratamiento experimentales

frente a la enfermedad, utilizando diferentes concentraciones de itraconazol bien en

75
solitario, bien en combinación con otro producto antifúngico llamado metil
tiofanato, para tratar larvas de A. obstetricans infectadas de forma natural con una
cepa hipervirulenta y muy resistente de Bd. Evaluar el grado de eficacia de dichos
tratamientos determinando su capacidad para limpiar completamente a las larvas
de la infección, y si presentan efectos secundarios potencialmente peligrosos.

3. Valorar cómo influye la temperatura en la interacción hospedador-patógeno,

midiendo los valores de CTmax alcanzados por larvas y juveniles de A. obstetricans
infectados y no infectados con Bd. Analizar también si la exposición, aunque sea
durante un muy breve espacio de tiempo a temperaturas en el límite máximo de
tolerancia de la especie, es suficiente para eliminar la presencia del hongo y limpiar
al hospedador de la infección.

4. Comprobar si la combinación de una reducción de la densidad poblacional

del hospedador (A. obstetricans), junto con la implementación in situ de distintas
estrategias de modificación del hábitat, es suficiente para afectar las dinámicas de la
enfermedad en la naturaleza, reducir la carga fúngica en el entorno natural, e
incluso eliminar a Bd del medio. Comparando al mismo tiempo diferentes
estrategias de modificación del hábitat, para ver cuál de ellas obtiene mejores
resultados a la hora de reducir la carga y la prevalencia del patógeno en el medio
natural.

5. Implementar una estrategia de mitigación de la enfermedad sobre el

terreno, consistente en combinar los tratamientos antifúngicos en las larvas con la
aplicación de desinfectantes químicos en el medio, y verificar la eficacia de esta
combinación a la hora de eliminar la infección por Bd de un sistema isleño habitado
por un único hospedador anfibio (A. muletensis).

76
77
CAPÍTULO 2

LA EXPOSICIÓN TEMPRANA A Batrachochytrium

dendrobatidis CAUSA UNA PROFUNDA INMUNOSUPRESIÓN
EN ANFIBIOS

EARLY EXPOSURE TO Batrachochytrium dendrobatidis CAUSES

PROFOUND IMMUNOSUPPRESSION IN AMPHIBIANS

Andrés Fernández-Loras1, Saioa Fernández-Beaskoetxea1, Elena Arriero2, Matthew

C. Fisher3, Jaime Bosch1,4

1
Museo Nacional de Ciencias Naturales-CSIC, José Gutiérrez Abascal, 2, 28006 Madrid, Spain.
2
Department of Zoology and Physical Anthropology, University Complutense of Madrid, Madrid,
Spain.
3
Department of Infectious Disease Epidemiology, Imperial College, London W2 1PG, UK.
4
Centro de Investigación, Seguimiento y Evaluación, Parque Nacional de la Sierra de Guadarrama,
Cta. M-604, Km. 27,6, 28740 Rascafría, Spain.

Fernández-Loras et al. (2017). European Journal of Wildlife Research.

DOI: [Link]

78
79
Exposición temprana a Bd causa inmunosupresión en anfibios

LA EXPOSICIÓN TEMPRANA A Batrachochytrium

dendrobatidis CAUSA UNA PROFUNDA
INMUNOSUPRESIÓN EN ANFIBIOS

RESUMEN

Los patógenos fúngicos han desarrollado evolutivamente un amplio abanico de

estrategias para evadir la respuesta inmune del hospedador. Anfibios de todo
el planeta están infectados con el hongo quitridio Batrachochytrium
dendrobatidis (Bd), y a pesar de que se ha podido ya documentar la acción de
defensas inmunes de tipo innato contra el patógeno, las evidencias de la
existencia de una respuesta inmune adquirida son bastante escasas. Se
determina en este estudio la respuesta inmune desplegada por el sapo partero
común al ser enfrentado a Bd durante su fase larvaria. Se describe la función
inmunitaria de tipo celular y humoral cuando el anfibio es enfrentado al
patógeno durante su desarrollo larvario. Mientras que no se encontraron
diferencias significativas entre animales infectados y no infectados respecto a
la ratio neutrófilos/linfocitos, la exposición temprana de las larvas a Bd
disminuyó significativamente los niveles de inmunoglobulinas (IgM e IgY)
circulantes en la sangre de los juveniles, una vez que las larvas infectadas
completaron la metamorfosis. Estos resultados muestran la capacidad de Bd
para inmunosuprimir a los anfibios cuando éstos son infectados durante su
desarrollo larvario, algo que confiere al patógeno el potencial para remodelar
el sistema inmune anfibio durante la metamorfosis.

80
 Fernández-Loras et al. (2017). Capítulo 2

EARLY EXPOSURE TO Batrachochytrium dendrobatidis

CAUSES PROFOUND IMMUNOSUPPRESSION IN
AMPHIBIANS

ABSTRACT

Fungal pathogens have evolved a broad suite of strategies aiming at evading the
host immune response. Amphibians are globally infected by the panzootic chytrid
fungus Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) and, while robust innate immune
defences have been characterised, there is little evidence for the existence of
effective adaptive immunity. We determine the immune response of the common
midwife toad following challenge by Bd as larvae. Immune function was described
for both the cell-mediated and antibody-mediated immune responses following
infectious challenge as larval amphibians. While there were no significant
differences in the ratio of neutrophils/lymphocytes between infected and
uninfected individuals, early exposure of tadpoles to Bd significantly dampened
the levels of circulating immunoglobulins (IgM and IgY) in the serum of juveniles
after metamorphosis. Our results show that Bd immunosuppresses amphibians
when infection occurs as larvae with potentially broad effects on the remodelling of
immunity during metamorphosis.

81
Exposición temprana a Bd causa inmunosupresión en anfibios

INTRODUCTION

The vertebrate immune system comprises both an innate and an adaptive

component that interact with each other to protect organisms against infections.
This functional division is found in amphibians which have an immune system
similar to that of mammals (Rollins-Smith. 2001; Robert & Ohta 2009). The
amphibian innate immune system consists of granulocytic leukocytes, phagocytic
cells, natural killer cells, complement proteins, and antimicrobial peptides, and
serves as the rapid first line of defence against challenge by pathogens (Robert &
Ohta 2009; Rollins-Smith & Woodhams 2012). Conversely, the amphibian
adaptive immune system consists of antigen-presenting cells, the major
histocompatibility complex (MHC), T- and B-lymphocytes, and immunoglobulins,
however is slower in its response to pathogen assault (Robert & Ohta 2009;
Rollins-Smith & Woodhams 2012).

An important trait of the amphibian immune system is that it develops in two

different phases that are separated by metamorphosis (Rollins-Smith. 1998, 2001).
During metamorphosis, amphibian larvae undergo a series of physiological
processes, which entail the complete remodelling of their immune system and of
all its components (Rollins-Smith. 1998, 2001).

The main organ responsible for the immune changes during amphibian
metamorphosis is the hypothalamus-pituitary-interrenal (HPI) axis that acts by
increasing levels of plasma corticosteroids (Rollins-Smith. 1998, 2001; Gervasi &
Foufopoulos 2008; Kindermann et al. 2012). This sharp increase in corticosteroid
levels, however, results in a transient immune impairment during metamorphosis
(Flajnik et al. 1987; Rollins-Smith 1998, 2001). While this is a physiological
process, the lymphocyte breakdown and temporary immunosuppression that
happens during the metamorphosis climax, leaves amphibians more prone to

82
 Fernández-Loras et al. (2017). Capítulo 2

infections caused by pathogens such as the chytrid fungus Batrachochytrium

dendrobatidis (hereafter, Bd) (Rollins-Smith. 2001; Gervasi & Foufopoulos 2008).
Infection by Bd is also known to directly influence circulating levels of
glucocorticoids and may reinforce temporary immunosuppression during
metamorphosis. For instance, in some amphibians, levels of corticosteroids are
dictated by the intensity of their infection (Kindermann et al. 2012, Gabor et al.
2013), suggesting that infection by Bd may indirectly immunosuppress amphibian
hosts by stimulating the HPI axis. However, there are very few studies that
examine the role of the adaptive (lymphocyte-mediated) components of the
immune system on host resistance to Bd.

In this study, we determine the immune response of the common midwife

toad (Alytes obstetricans) following challenge by Bd as larvae. Cell-mediated
response mounted by A. obstetricans tadpoles and juveniles was described
through differential white blood cells counts, and the humoral immune response
was assessed by measuring circulating levels of immunoglobulins (IgM and IgY)
present in the serum of juveniles after being exposed to Bd during their larval
development.

MATERIALS AND METHODS

Tadpoles were wild caught from infected and non-infected populations of the
Provinces of Teruel and Zamora (north and central Spain). A. obstetricans is an
amphibian species highly susceptible to Bd with an extremely long larval stage
characterised by high prevalences and fungal loads upon metamorphic climax
(Fernández-Beaskoetxea et al. 2015). To determine the leukocyte profiles, tadpoles
were raised in captivity until metamorphosis and blood samples were obtained by
heart puncture from tadpoles and juveniles prior to terminal anaesthesia. Animals
were swabbed immediately after taking blood samples (the oral disc for larvae and

83
Exposición temprana a Bd causa inmunosupresión en anfibios

the lower ventral surface and hind-limbs of juveniles) with sterile rayon-tipped
swabs (MW100-100; Medical Wire & Equipment Co., Corsham, UK), then DNA
was extracted with PrepMan Ultra and quantitative PCR analyses were carried out
following Boyle et al. (2004).

Standard blood smears were made on clean microscope slides that were air-
dried, fixed with pure alcohol, and stained with the Diff-Quick staining technique.
Haematological smears were read under ×40 magnification using a compound
microscope. Cell counts were performed until at least 100 leukocytes were
enumerated. White blood cells were identified and the proportion of each cell type
was afterwards determined.

To determine humoral immune response to Bd, overwintering (OW) and

non-overwintering (NOW) tadpoles were captured for performing the following
experiment. A subsample of tadpoles (n = 20) of every capture session was
analysed by quantitative PCR as described before to determine their infection
status. NOW tadpoles tested negative for Bd even when the whole oral disc was
used for DNA extractions. One hundred eighty NOW experimental larvae were
singly housed with either one OW Bd-negative or one OW Bd-positive tadpole
(early contact phase). After 50 days, NOW experimental tadpoles were removed
and treated with either the antifungal itraconazole (a first generation systemic
triazole antifungal drug) at 0.01% for 7 days (Forzán et al. 2008) or with elevated
temperature (30 °C) for 10 days (Geiger et al. 2011) (intermediate treatment
phase). Finally, every NOW experimental tadpole was rehoused for 50 days with
one Bd+ or Bd− OW tadpole (late contact phase). Not every possible combination
of levels across temporal phases was used, resulting in nine different experimental
groups with 20 replicates each (Figure 1). OW tadpoles were tested before each
contact phase to confirm their infection status.

84
 Fernández-Loras et al. (2017). Capítulo 2

NOW tadpoles were allowed to complete metamorphosis. Singly housed and

surviving animals (n = 77) were sampled to obtain blood samples through heart
puncture and then euthanized with an overdose of MS222 (Sigma-Aldrich, Saint
Louis, MO, USA). Indirect enzyme-linked immunosorbent assays were carried out
in order to determine circulating levels of immunoglobulins. Bd antigen-coated
plates were prepared (96-well; Nunc Maxisorp, Rochester, NY) by adding 5 × 10 4
cells at 50 μL/well as Bd zoospores alone or as mixtures of zoospores and
sporangia. These cells were fixed by the addition of a fixing solution (amphibian
phosphate buffered saline (APBS) + 0.25% glutaraldehyde) then plates centrifuged
(200×g) and stored overnight at 4 °C. Following removal of the fixative, a blocking
buffer was added and the plates were stored for 2 hours at 37 °C. Subsequently, the
plates were washed with a washing solution (APBS + 0.05% Tween20) and the A.
obstetricans serum samples diluted 1/1000 in ABT (APBS + 0.5% bovine serum
albumin (BSA) + 0.1% Tween20) were added to the wells. Bd-specific antibodies
were detected using antiXenopus monoclonal antibodies specific for IgM(10A9)
and for IgY (11D5), at a concentration of 1/1000, followed by horseradish
peroxidase-conjugated goat antimouse antibodies (Invitrogen Corporation,
Camarillo, California). The reactions were visualised with 3,3′,5,5′-
tetramethylbenzidine (TMB) substrate (Sigma). Reactions were stopped after 60
min by adding 2 M H2SO4 and plates were read at 450 nm (OD450).

We used a general linear model to determine whether there was an

association between the ratio of neutrophils/lymphocytes and Bd infection load of
tadpoles, with mass and Gosner stage included as covariates. Another general
linear model was used to look for differences on IgM and IgY levels across groups
of tadpoles in the experiment. For this second analysis, three different fixed factors
were considered: early contact with Bd (yes/no), type of Bd treatment (none,
itraconazole, elevated temperature), and late contact with Bd (yes/no). Days to
metamorphosis was included into the model as a covariate to control for any biases
related to differences in development rates among animals. Only the interaction

85
Exposición temprana a Bd causa inmunosupresión en anfibios

between the first and the third factor was considered because not every level of the
Bd treatment factor was replicated across the other two factors. For statistical
analyses, variables were transformed using Box-Cox or Johnson normalizing
transformations, and residuals of general linear models did not deviate from the
canonical assumptions.

All animal experiments were conducted in compliance of the Directive

2010/63/EU for the protection of animals used for scientific purposes in facilities
of the regional government and under permit of the competent authorities
(permits 10/032921.9/12 and 10/071126.9/13, Consejería de Medio Ambiente of
Madrid).

RESULTS

The ratio of neutrophils/lymphocytes was not related to Bd infection load in

tadpoles after controlling for mass and Gosner stage (F3,29 = 0.6427, p = 0.5945).
The infection intensity of tadpoles ranged between 270 and 8690 Bd genome
equivalents, which is in accordance with values found in previous studies
(Fernández-Beaskoetxea et al. 2015). Also, the proportion of monocytes,
eosinophils, and basophils were very similar in infected and non-infected animals
(Table 1), suggesting that prior infection by Bd does not observably impact cell
populations that are involved in cell-mediated immunity.

86
 Fernández-Loras et al. (2017). Capítulo 2

Gosner stage No. Neutrophils Lymphocytes Monocytes Eosinophils Basophils

Bd-infected tadpoles
26-30 16 23.2 74.8 1.8 0.1 0.1
31-34 6 17.0 79.7 3.3 0.0 0.0
35-40 1 8.0 92.0 0.0 0.0 0.0
41-42 3 17.7 79.3 2.3 0.7 0.0
- Averaged 20.5 77.1 2.1 0.2 0.1
Non-infected tadpoles
26-30 3 15.3 82.1 1.3 0.0 1.3
35-40 1 10.0 85.0 0.0 0.0 5.0
- Averaged 14.0 82.7 1.0 0.0 2.3
Juveniles (non-infected)
- 15 31.2 64.8 2.5 0.3 1.2

Table 1. Average percentages for each cell type in each development group

Levels of IgM did not differ across Bd treatments (F2,70 = 0.905, p = 0.409),
among animals being in contact or not with Bd during the late contact phase of the
experiment (F1,70 = 0.238, p = 0.626), nor of the interaction between Bd contact
during the early and the late phases (F1,70 = 0.630, p = 0.430; Figure 1). On the
other hand, there was a strong effect upon levels of IgM following contact with Bd
during the first contact phase (F1,70 = 321.67, p = 0.0001). Similar results were
obtained for IgY, showing a very significant effect of being in contact with Bd
during the early contact phase of the experiment (F1,70 = 308.47, p = 0.0001).

87
Exposición temprana a Bd causa inmunosupresión en anfibios

Figure 1. Humoral immune response (IgM and IgY OD levels) of experimental larvae on nine different
experimental groups (A–I) belonging three consecutive phases. (1) Early contact phase: non overwintering
(NOW) experimental larvae being in contact with Bd− (groups A–E) or Bd+ (groups F–I) overwintering larvae
(OW); (2) intermediate treatment phase: NOW experimental larvae were treated with itraconazole (ITZ;
groups B, D, F, and H), elevated temperature (temp; groups C, E, G, and I), or not treated (NA; group A); and
(3) late contact phase: NOW experimental larvae being in contact again with Bd− (groups A–C and F–G) or
Bd+ (groups D–E, and H–I) OW larvae. Sample size of each experimental group at the end of the experiment
was, respectively, 8, 10, 6, 7, 10, 10, 8, 7, and 11.

DISCUSSION

Our results show that humoral immunity of Bd-infected A. obstetricans

tadpoles was highly affected, with levels of circulating IgM and IgY antibodies

88
 Fernández-Loras et al. (2017). Capítulo 2

being profoundly downregulated. Further, we found no significant effects on the

cell-mediated immunity for leukocyte profiles or the neutrophil/lymphocyte ratio,
although the small sample size of non-infected tadpoles (n = 4) may compromise
the strength of this observation. However, we caution that our work did not take
into account the skin microbial community, which many authors have identified as
part of the amphibian innate immune system (Harris et al. 2009) and may
increase the effectiveness of the innate defences against Bd (Woodhams et al.
2007).

Bd appears to be capable of inhibiting the normal development of an adaptive

immune response, and perhaps even evading the amphibian immune response
(Rollins-Smith. 2001; Rosenblum et al. 2009). The work by Ribas et al. (2009)
showed a generalised downregulation in spleen markers of adaptive immunity in
Silurana tropicalis frogs infected with Bd, even when housed at host-optimal
temperatures (26 °C). The mechanism by which Bd evades host immune response
may include soluble toxic factors from cell wall components that inhibit
lymphocyte proliferation and induce apoptosis, perhaps explaining in part why Bd
can be lethal to species lacking a robust innate immune defence (Rollins-Smith et
al. 2009; Fites et al. 2013). Thus, when it comes to amphibians fighting against
challenge by Bd, it appears that survival of infected amphibians is more correlated
with the host innate immune response rather than being associated with the
adaptive immunity (Ribas et al. 2009; Stice & Briggs 2010; Savage et al. 2016).

Studies have attempted to determine how repeated exposures to Bd influence

survival rates, immunity, or infection intensities. Wood frogs (Osteopilus
septentrionalis) are able to increase cellular immunity (spleen lymphocytes) after
a number of repeated cycles of exposure to Bd and clearance of their infection
through heat (McMahon et al. 2014). In Shaw et al. (2010), a few individuals of
Archey’s frog (Leiopelma archeyi) showed low Bd infection intensities when

89
Exposición temprana a Bd causa inmunosupresión en anfibios

reinfected, with some animals eventually clearing their infection. Yet another
study showed that boreal toads (Anaxyrus boreas) that were previously exposed to
Bd lived for a longer period of time after reinfection and suffered from a lower
infection intensity than Bd-naïve individuals (Murphy et al. 2011). Together, these
studies may suggest the possible presence of a Bd-specific acquired immune
response. On the other hand, effects of previous immunisation with heat-killed Bd
have also been studied in the highly susceptible species Rana muscosa (Stice &
Briggs 2010). In this case, no significant differences between control and
immunised individuals in the infection’s proportion, fungal loads, and mortality
were observed. Cashins et al. (2013) also showed that prior infection and
treatment was ineffective in increasing protective immunity in Litoria
booroolongensis.

Clearly, these contradicting studies show that the relationship infection by Bd

and the generation of adaptive immunity are not straightforward, and more
research is needed to determine why amphibian species vary in their ability to
generate a humoral immune response. Amphibian immunological memory is
known to occur (Du Pasquier & Haimovich 1976; Rollins-Smith 1998), but we do
not know how this persists through the metamorphic period when combined with
an infectious challenge by Bd. Many aspects of the immunological response of
amphibians when facing Bd remain unresolved, and further work on the levels of
antibodies expressed by the larval stages, as well as the humoral immune response
in adults previously exposed as tadpoles, is needed.

90
 Fernández-Loras et al. (2017). Capítulo 2

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94
95
CAPÍTULO 3

EL ITRACONAZOL Y EL METIL TIOFANATO NO CONSIGUEN

LIMPIAR LARVAS NATURALMENTE INFECTADAS CON LA
CEPA HIPERVIRULENTA DE Batrachochytrium dendrobatidis

ITRACONAZOLE AND THIOPHANATE-METHYL FAIL TO

CLEAR TADPOLES NATURALLY INFECTED WITH THE
HYPERVIRULENT LINEAGE OF Batrachochytrium
dendrobatidis

Andrés Fernández-Loras1, Bárbara Martín-Beyer1, Trenton W.J. Garner2,3, Jaime

Bosch1,4

1
Museo Nacional de Ciencias Naturales-CSIC, 28006 Madrid, Spain.
2
Institute of Zoology, Zoological Society of London, Regent’s Park, London NW1 4RY, UK.
3
Unit for Environmental Research and Management, North-West University, Potchefstroom 2520,
South Africa.
4
Centro de Investigación, Seguimiento y Evaluación, Parque Nacional de la Sierra de Guadarrama,
28740 Rascafría, Spain.

Fernández-Loras et al. (2018). Diseases of Aquatic Organisms.

DOI: [Link]

96
97
ITZ y MT no limpian larvas infectadas con Bd

EL ITRACONAZOL Y EL METIL TIOFANATO NO

CONSIGUEN LIMPIAR LARVAS NATURALMENTE
INFECTADAS CON LA CEPA HIPERVIRULENTA DE
Batrachochytrium dendrobatidis

RESUMEN

La quitridiomicosis, enfermedad infecciosa emergente causada por el hongo

Batrachochytrium dendrobatidis, es una de las mayores responsables de
llevar a muchas especies de anfibios al borde de su extinción. Gracias a
sustanciales esfuerzos, se han alcanzado éxitos notables en el desarrollo de
protocolos terapéuticos basados en el uso de productos antifúngicos. En este
estudio se utilizan el itraconazol y el metil tiofanato, tanto individualmente
como en combinación, para tratar larvas de sapo partero común (Alytes
obstetricans) naturalmente infectadas con la cepa hipervirulenta de B.
dendrobatidis. A pesar del exitoso uso del itraconazol en una especie de
anfibio estrechamente relacionada (Alytes muletensis), nuestros resultados
muestran que estos tratamientos antifúngicos no son siempre efectivos, y que
la completa erradicación del patógeno no puede ser asegurada después de su
aplicación.

98
 Fernández-Loras et al. (2018). Capítulo 3

ITRACONAZOLE AND THIOPHANATE-METHYL FAIL TO

CLEAR TADPOLES NATURALLY INFECTED WITH THE
HYPERVIRULENT LINEAGE OF Batrachochytrium
dendrobatidis

ABSTRACT

The emerging infectious disease chytridiomycosis, caused by the fungus

Batrachochytrium dendrobatidis, is a major driver pushing many amphibian
species to the brink of extinction. Substantial efforts to develop effective protocols
that use antifungal drugs have had notable success. Here, we used the antifungal
agents itraconazole and thiophanate-methyl, singly and in combination, in an
attempt to treat common midwife toad (Alytes obstetricans) larvae naturally
infected with the globalized hypervirulent lineage of B. dendrobatidis. Despite the
successful use of itraconazole in a closely related species (A. muletensis), our
results show that these anti-fungal treatments are not always effective and that full
clearance of animals cannot be assumed following treatment.

99
ITZ y MT no limpian larvas infectadas con Bd

INTRODUCTION

Amphibians are the most threatened and rapidly declining vertebrate class,
and the emerging infectious disease chytridiomycosis, caused by the fungus
Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), is responsible for globally widespread
declines (Stuart et al. 2004). The widespread and hypervirulent global panzootic
lineage (BdGPL) is responsible for most cases of lethal chytridiomycosis (Farrer et
al. 2011).

The link between the international trade in amphibians and transmission of

chytridiomycosis has spurred efforts to develop methods for eliminating infections
in captive settings, not all of which have involved the use of chemical substances.
For example, in vitro Bd growth trials have illustrated how temperatures above
30°C can kill the cultured pathogen, and in vivo trials have extended this to viable
infections (Woodhams et al. 2003). Unfortunately, most abiotic environments that
are likely to be hostile to Bd are also likely to be hostile to the majority of host
species and may compromise their health and welfare (Garner et al. 2016).

Parallel efforts to develop treatments for Bd infections have examined the

efficacy of antifungal drugs already in use by the veterinary community. Successful
applications of chloramphenicol and malachite green combined with formalin have
been reported (Bishop et al. 2009; Young et al. 2012). However, their potential
side effects, risks to human and animal health and legal restrictions likely preclude
a more general, international application of these substances (Holden et al. 2014).
Benzalkonium chloride (F10©) has also been used successfully (Barrows et al.
2010), but other studies have questioned both the efficacy and general applicability
of this disinfectant (Berger et al. 2009; de Jong et al. 2018).

100
 Fernández-Loras et al. (2018). Capítulo 3

Several encouraging studies have focussed on 2 other substances:

thiophanate-methyl (TM), predominantly applied environmentally as a pesticide,
and itraconazole (ITZ), a common veterinary and medical antifungal. Hanlon et al.
(2012) showed that TM cleared infection and increased amphibian growth metrics,
suggesting its transferability to other host species and habitat settings. ITZ is a
first-generation systemic triazole antifungal drug widely used in zoos and other ex
situ captive breeding conservation programmes to treat chytridiomycosis. In vivo
application of weak concentrations of ITZ have been used repeatedly and
successfully to clear infections in several species (Forzán et al. 2008; Garner et al.
2009; Tobler & Schmidt 2010; Brannelly et al. 2012; Jones et al. 2012). These
results are encouraging, not least because the only successful eradication of Bd in
the wild to date (Bosch et al. 2015) applied a combination of ITZ and
environmental disinfection, while other strategies have not had similar success
(Berger et al. 2010; Woodhams et al. 2012; Baitchman & Pessier 2013). However,
these findings need to be put into context. While ITZ can be used for short periods
of time (7−11 d) on a daily basis (5−10 min baths) and is considered low risk to
humans, the commercially available aqueous solution contains hydrochloric acid
and is extremely acidic. A recent study has highlighted mortality effects associated
with ITZ exposure experienced by toads subsequently subjected to cold stress
(Loyau et al. 2016), and others have raised the possibility that ITZ may impair
amphibian health (Garner et al. 2009). While no such data for amphibians exist
for TM, it is classified as a moderate ecotoxicological risk to fish and invertebrates
(pesticide properties database of the University of Hertfordshire).

Here we used different concentrations and durations of ITZ and TM to treat

common midwife toad (Alytes obstetricans) tadpoles suffering from natural
infections with BdGPL. Ours aims were to test survival after the treatments as well
as the effectiveness of the antifungals in reducing or completely clearing infections.

101
ITZ y MT no limpian larvas infectadas con Bd

MATERIALS AND METHODS

A. obstetricans larvae were collected from different locations throughout

Spain (Teruel, Zamora, Peñalara Massif and Ibón Acherito) and housed
individually in boxes containing 750 ml of water in a temperature-controlled room.
Tadpoles were fed twice per week and water was changed every 3 d. Before
treatments, oral swabs (MW 100−100, Medical Wire & Equipment) were taken
and tadpoles were weighed.

We used different ITZ concentrations (Itrafungol, except for experiment

ITZ.3, in which Canadiol was used; both from ESTEVE) in daily baths of 5 or 10
min (Table 1). For TM experiments, we also modified the number of days the
treatment was given throughout the different experiments. In ITZ experiments,
water was replaced every day after baths, while in TM experiments, water was
replaced every 3 d and then the antifungal agent was re-applied. For each
antifungal agent, treatments sharing a number code shared the same control group
of 20 animals. After 15 d, surviving animals in each treatment group were
euthanized with an overdose of tricaine methanesulfonate buffered with NaHCO 3,
and whole tadpoles’ mouths were analysed. We used a CFX96 qPCR thermocycler
(Bio-Rad) for Bd detection and DNA quantification. Each plate included samples, a
negative control and 4 different standards ranging from 100 to 0.1 Bd genome
equivalents in duplicate. Samples were scored as positives when both replicates
were ≥0.1 and the amplification curves had a sigmoidal shape.

When possible, infection loads and prevalence of infection were compared

between pre- and post-treatment stages in experimental animals using the
Wilcoxon-Mann-Whitney and Pearson tests. We used Fisher’s exact tests to test for
differences in survival between control and treatment groups. All animal
experiments were conducted in compliance with the Directive 2010/63/EU for the

102
 Fernández-Loras et al. (2018). Capítulo 3

protection of animals used for scientific purposes in facilities of the regional

government and with permission from the relevant and competent authorities.

Experimental Temp. Antifungal agent Days of treatment n Status Gosner stage Weight
group ID (concentration) (exposure time)

ITZ.1 18
ITZ.1A ITZ (0.0001) 7 (5 min) 18 OW 30–36 na

ITZ.1B ITZ (0.001) 7 (5 min) 18 OW 30–36 na

ITZ.1C ITZ (0.01) 7 (5 min) 20 OW 30–36 na

ITZ.2 12.5
ITZ (0.001) 7 (5 min) 15 OW < 26 0.6
ITZ.2A

ITZ.2B ITZ (0.01) 7 (5 min) 15 OW < 26 0.6

ITZ.3 17
ITZ (0.05) 7 (10 min) 30 NOW < 26 0.2
ITZ.3A

ITZ.3B ITZ (0.05) 7 (10 min) 30 NOW < 26 0.2

ITZ.4 17 ITZ (0.03) 3 (10 min) 15 NOW < 26 0.2

ITZ.5 17 ITZ (0.025) 7 (10 min) 15 NOW < 26 0.2

ITZ.6 17 ITZ (0.025) 3d-3dNO-3d (10 min) 15 NOW < 26 0.2

ITZ.7 7.7 ITZ (0.1) 7 (5 min) 20 NOW < 26 0.48

ITZ.8 18.6
ITZ (0.025) 3 (10 min) 40 OW 26–30 1.15
ITZ.8A

ITZ.8B ITZ (0.015) 3 (10 min) 40 OW 26–30 1.18

TM.1 18.6 TM (0.6) 9 (9 d) 40 OW 26–30 0.92

TM.2 15.9 TM (1.2) 9 (9 d) 20 OW 26–30 1.59

TM.3 20.7 TM (6) 9 (9 d) 15 OW 26–37 1.66

TM.4 13.5 TM (6) 15 (15 d) 15 OW 26–34 0.95

TM.5 7.2
TM (9) 15 (15 d) 15 OW 26–34 na
TM.5A

TM.5B TM (12) 15 (15 d) 15 OW 26–34 na

103
ITZ y MT no limpian larvas infectadas con Bd

TM-ITZ.1 7.8
TM (6) + ITZ (0.0001) 6dTM + 3d/10minITZ 15 OW 26–32 0.89
TM-ITZ.1A

TM-ITZ.1B TM (6) + ITZ (0.002) 7dTM + 7d/10minITZ 15 OW 28–35 1.00

−1
Table 1. Average temperature (°C) during the experiments, Antifungal agent concentration (% for ITZ, mg l for TM),
days of treatment and exposure time, number of replicates of experimental groups and overwintering status (NOW: non-
overwintering; OW: overwintering), larval developmental (Gosner) stage and average weight (g) of A. obstetricans
tadpoles for 14 different experiments with itraconazole (ITZ), thiophanate-methyl (TM) and a combination of both (TM
+ ITZ). ‘3d-3dNO-3d’ means treatment was applied over 3 consecutive days, was stopped for 3 d and resumed for 3 more
consecutive days. na: not available.

RESULTS

No ITZ-only treatment achieved complete Bd-clearance (Figure 1). High tadpole

survival rates were obtained in some, but not all of the experiments (ITZ.1−2), but full
clearance combined with high survival was never achieved in any of the ITZ-only
experiments (ITZ.1−6). However, statistically significant decreases in prevalence of
infection and average infection loads after treatments were detected in several of the
ITZ-only treatments (prevalence: ITZ.1A: χ 2 = 32.211, p < 0.0001; ITZ.1B: χ 2 = 13.298, p
= 0.0003; ITZ.1C: χ2 = 28.558, p < 0.0001; ITZ.2A: χ 2 = 9.642, p = 0.0019; ITZ.2B: χ2 =
9.642, p = 0.0019; ITZ.8B: χ2 = 9.975, p = 0.0016; infection load: ITZ.1A: Z = 5.401, p <
0.0001; ITZ.1B: Z = 4.516, p < 0.0001; ITZ.1C: Z = 5.518, p < 0.0001; ITZ.2A: Z = 3.646,
p = 0.0003; ITZ.2B: Z = 3.677, p = 0.0002; ITZ.8B: Z = 1.488, p = 0.1368). TM on its
own also failed to fully clear Bd infections. Nonetheless, we detected a statistically
significant decrease in prevalence and average infection loads in almost all TM-only
treatment trials (prevalence: TM.1: χ 2 = 28.972, p < 0.0001; TM.3: χ 2 = 10.909, p =
0.0010; TM.4: χ2 = 14.227, p = 0.0002; infection load: TM.1: Z = 5.396, p < 0.0001;
TM.2: Z = 4.815, p < 0.0001; TM.3: Z = 4.690, p < 0.001; TM.4: Z = 3.787, p = 0.0002).
Combined treatments reduced infection loads (TM-ITZ.1A: Z = 2.595, p = 0.0095; TM-

104
 Fernández-Loras et al. (2018). Capítulo 3

ITZ.1B: Z = 2.212, p = 0.0269) but without a concurrent reduction in prevalence (TM-

ITZ.1A: χ2 = 1.667, p = 0.1967; TM-ITZ.1B: χ2 = 1.236, p = 0.2662).

Survival was inconsistent across experiments. In ITZ experiments where

concentrations exceeded 0.01%, we detected significantly increased mortality
(experiments ITZ.3-5, ITZ.7-8: p < 0.0001; ITZ.6: p < 0.05). This was not the case for
experiments where we exposed animals to increasing concentrations of TM, although
we did detect significantly decreased survival in the experiment involving the weakest
solution of TM (TM.1: p < 0.05). All significant tests remained significant after
Bonferroni sequential correction except TM-ITZ.1B for infection load and ITZ.6 and
TM.1 for survival.

105
ITZ y MT no limpian larvas infectadas con Bd

Figure 1. (A) Average infection loads (mean ± 95% by the bias-corrected and accelerated bootstrap interval method with
2000 bootstrap replications) and prevalence (mean ± 95% Clopper-Pearson CI) before (white columns) and after (black
columns) treatments of A. obstetricans tadpoles with different concentrations and regimens of itraconazole (8
experiments), thiophanate-methyl (5 experiments) or a combination of both (1 experiment). Experimental groups are
arranged according to the antifungal agent concentrations used, in ascending order (see Table 1 for details). (B) Survival
(%) of control (black columns) and experimental (grey columns) animals for the same treatment groups. GE: genomic
equivalents; na: data not available when there were no surviving animals at the end of the experiment.

106
 Fernández-Loras et al. (2018). Capítulo 3

DISCUSSION

This study shows that serial treatments of naturally BdGPL-infected A.

obstetricans larvae with concentrations of antifungals comparable to those that cleared
infections in other species were ineffective. ITZ appeared to be more effective at
reducing loads in ITZ-only experiments but not in combined treatments (Figure 1).
Further, concentrations of ITZ previously used to comprehensively eliminate infections
in a congener were in effective at achieving clearance in wild-captured common midwife
toads (Garner et al. 2009, Bosch et al. 2015). We cannot say why this is so, but failure to
clear infections is unlikely related to developmental stage, as a previous study of ITZ
using post-metamorphic A. obstetricans also failed to achieve comprehensive clearance
(Loyau et al. 2016). Irrespective of the antifungal agent and species of Alytes, ex situ
application of antifungals offers transient effects at best in this genus (Geiger et al.
2017), which is mirrored in field trials of ITZ in other species (Hudson et al. 2016). More
importantly, while ITZ has sometimes proven to be an effective clinical treatment in
captive settings (Forzán et al. 2008, Garner et al. 2009, Tobler & Schmidt 2010,
Brannelly et al. 2012, Jones et al. 2012), our study illustrates how efficacy in some cases
does not always transfer to others.

The failure of TM and mixed treatments to clear infection further highlights this
lack of transferability, although Hanlon et al. (2012) press-applied TM continuously for
up to 60 d, at least 4 times longer than our treatments. Increasing the length of
application may yield better results than the limited reduction of prevalence and load
we observed in our shorter exposure periods (Figure 1).

We did observe a significant effect with increased concentration of ITZ on post-

treatment survival, and once concentrations exceeded 0.01%, tadpole survival dropped
to zero. The short-term and low concentration impacts we report here likely represent
one of the most severe outcomes for the application of ITZ, but we cannot attribute

107
ITZ y MT no limpian larvas infectadas con Bd

impacts to the drug, as the commercial solution also contains other potentially
hazardous components that increased in concentration along with the ITZ.
Furthermore, the impacts may be cumulative rather than direct: exposure to Bd can
immunosuppress common midwife tadpoles and otherwise compromise their health
(Fernández-Loras et al. 2017). These types of costs can result in increased mortality in
their own right, and may very well increase the likelihood of mortality associated with
exposure to any further stressor like treatment with an antifungal or exposure to an
acidic solution. Whatever the mechanism behind the effect on survival, our results do
indicate that application of ITZ solutions exceeding 0.01% should be avoided for
treatment of Bd infections in larval amphibians.

Our study adds to the growing literature examining field and captive applications
of chemical treatments to control the impacts of Bd in amphibians (e.g. Martel et al.
2011). Unfortunately, our findings do more to illustrate the limitations of these
approaches rather than provide more tools that can be applied toward mitigation of
chytridiomycosis. While this message appears to be anything but optimistic, it does
draw much needed attention to the fact that any approach developed for combating
chytridiomycosis is unlikely to be widely transferable across amphibian species, and
possibly across populations of the same species (Garner et al. 2016). Unfortunately,
research on approaches for controlling the disease lags far behind the efforts to
understand the ecology and evolution of the pathogen and how it interacts with hosts.
This has to change.

108
 Fernández-Loras et al. (2018). Capítulo 3

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111
112
CAPÍTULO 4

LA INFECCIÓN POR Batrachochytrium dendrobatidis

DISMINUYE LA TOLERANCIA TÉRMICA DE LOS
HOSPEDADORES LARVARIOS, Y NO PUEDE SER ELIMINADA
CON UNA BREVE EXPOSICIÓN AL CTMAX

INFECTION WITH Batrachochytrium dendrobatidis LOWERS

HEAT TOLERANCE OF TADPOLE HOSTS AND CANNOT BE
CLEARED BY BRIEF EXPOSURE TO CTMAX

Andrés Fernández-Loras1, Luz Boyero2,3, Francisco Correa-Araneda4,5, Miguel

Tejedo6, Attila Hettyey7,8, Jaime Bosch1,9,10

1
Museo Nacional de Ciencias Naturales-CSIC, Madrid, Spain.
2
Department of Plant Biology and Ecology, Faculty of Science and Technology, University of the
Basque Country (UPV/EHU), Leioa, Spain.
3
IKERBASQUE, Basque Foundation for Science, Bilbao, Spain.
4
Unidad de Cambio Climático y Medio Ambiente, Instituto de Estudios del Hábitat (IEH),
Universidad Autónoma de Chile, Temuco, Chile.
5
Núcleo del Estudio en Ciencias Ambientales (NEA) y Departamento de Ciencias Ambientales,
Universidad Católica de Temuco, Temuco, Chile.
6
Department of Evolutionary Ecology, Estación Biológica de Doñana-CSIC, Américo Vespucio s/n,
Sevilla, Spain.
7
Lendület Evolutionary Ecology Research Group, Plant Protection Institute, Centre for Agricultural
Research, Hungarian Academy of Sciences, Budapest, Hungary.
8
Department of Ecology, Institute for Biology, University of Veterinary Medicine, Budapest, Hungary.

113
9
Centro de Investigación, Seguimiento y Evaluación, Parque Nacional de la Sierra de Guadarrama,
Rascafría. Spain.
10
Research Unit of Biodiversity (CSIC, UO, PA), Oviedo University-Campus Mieres, Spain.

Fernández-Loras et al. (2019). PLoS ONE.

DOI: [Link]

114
115
Infección por Bd disminuye tolerancia térmica en larvas

LA INFECCIÓN POR Batrachochytrium dendrobatidis

DISMINUYE LA TOLERANCIA TÉRMICA DE LOS
HOSPEDADORES LARVARIOS, Y NO PUEDE SER
ELIMINADA CON UNA BREVE EXPOSICIÓN AL CTMAX

RESUMEN

El cambio climático y la enfermedad infecciosa producida por el hongo

quitridio Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) están llevando a la extinción
de los anfibios, pero las interacciones existentes entre estos dos factores
todavía no se entienden en su totalidad. Se sabe que la temperatura tiene
influencia sobre (1) la infectividad, patogenicidad y virulencia de Bd; (2) las
dinámicas hospedador-patógeno, especialmente cuando ambos son
organismos ectotérmicos que comparten o no, las mismas sensibilidades
térmicas y (3), la vulnerabilidad anfibia frente a la extinción dependiente de
una tolerancia térmica que puede disminuir con la infección. De esta manera,
en un escenario de calentamiento global, con aumento de las temperaturas y
eventos climáticos extremos más frecuentes, podría esperarse que los anfibios
infectados por Bd estuviesen sujetos a una mayor vulnerabilidad conforme las
temperaturas se acerquen a su umbral térmico máximo (CTmax). Sin
embargo, es también posible que las altas temperaturas ayuden a los anfibios a
eliminar la infección, favoreciendo así su supervivencia. Comprobamos la
verosimilitud de estas hipótesis, midiendo los valores de CTmax tanto en
larvas infectadas y no infectadas por Bd, como en juveniles del sapo partero
común (Alytes obstetricans), y analizando también si la exposición a
temperaturas dentro de ese CTmax es capaz de limpiar a los anfibios de la
infección. Se demuestra que (1) Bd tiene un amplio rango de tolerancia termal;

116
 Fernández-Loras et al. (2019). Capítulo 4

(2) Bd es capaz de alterar la fisiología térmica de A. obstetricans, que depende

del estadío en el que éste se encuentre, disminuyendo los valores de CTmax en
larvas aunque no en juveniles y (3), la infección por Bd no puede ser eliminada
sometiendo a las larvas o juveniles a su umbral térmico máximo (CTmax). El
escenario actual de cambio climático y aumento generalizado de las
temperaturas, los efectos de la infección fúngica pueden acabar por desnivelar
la balanza y llevar a unas comunidades anfibias, ya de por sí amenazadas, a su
extinción.

117
Infección por Bd disminuye tolerancia térmica en larvas

INFECTION WITH Batrachochytrium dendrobatidis

LOWERS HEAT TOLERANCE OF TADPOLE HOSTS AND
CANNOT BE CLEARED BY BRIEF EXPOSURE TO CTMAX

ABSTRACT

Climate change and infectious disease by the chytrid fungus Batrachochytrium

dendrobatidis (Bd) are major drivers of amphibian extinctions, but the potential
interactions of these two factors are not fully understood. Temperature is known to
influence (1) the infectivity, pathogenicity and virulence of Bd; (2) host-parasite
dynamics, especially when both hosts and parasites are ectothermic organisms
exhibiting thermal sensitivities that may or may not differ; and (3) amphibian
vulnerability to extinction depending on their heat tolerance, which may decrease
with infection. Thus, in a global warming scenario, with rising temperatures and
more frequent and extreme weather events, amphibians infected by Bd could be
expected to be more vulnerable if temperatures approach their critical thermal
maximum (CTmax). However, it is also possible that predicted high temperatures
could clear the Bd infection, thus enhancing amphibian survival. We tested these
hypotheses by measuring CTmax values of Bd-infected and Bd-free aquatic
tadpoles and terrestrial toadlets/juveniles of the common midwife toad (Alytes
obstetricans) and examining whether exposure of A. obstetricans individuals to
peak temperatures reaching their CTmax clears them from Bd infection. We show
that (1) Bd has a wide thermal tolerance range; (2) Bd is capable of altering the
thermal physiology of A. obstetricans, which is stage-dependent, lowering CTmax
in tadpoles but not in toadlets; and (3) Bd infection is not cleared after exposure of
tadpoles or toadlets to CTmax. Living under climatic change with rising

118
 Fernández-Loras et al. (2019). Capítulo 4

temperatures, the effect of Bd infection might tip the balance and lead some
already threatened amphibian communities towards extinction.

119
Infección por Bd disminuye tolerancia térmica en larvas

INTRODUCTION

Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), a pathogenic chytrid fungus causing

chytridiomycosis in many amphibians, is considered the most deadly invasive
species on the planet (Rohr et al. 2008) and a main driver behind amphibian
species extinctions globally (Stuart et al. 2004; Kilpatrick et al. 2010), with
profound effects on communities and ecosystems (Fisher et al. 2009).
Environmental conditions can have a large influence on Bd host-parasite dynamics
(Altizer et al. 2006; Forrest & Schlaepfer 2011), temperature being a major factor
influencing its prevalence (i.e., the proportion of infected animals) and virulence
(Woodhams et al. 2008). Growth and reproductive characteristics of Bd are known
to highly depend on temperature (Piotrowski et al. 2004; Stevenson et al. 2013;
Cohen et al. 2017), and there is a negative correlation between temperature and Bd
prevalence or pathogen load, chytrid infections often being more severe in winter
or in colder areas (Forrest & Schlaepfer 2011; Fernández-Beaskoetxea et al. 2015;
Sonn et al. 2017).

Temperature can influence amphibian population dynamics through its

effects on physiology of both the host and the fungal pathogen (Doddington et al.
2013). Amphibians being ectothermic, their immune system and its responses
against pathogens are influenced by environmental temperature (Lin & Rowlands
1973; Wright & Cooper 1981; Maniero & Carey 1997; Raffel et al. 2006). Fever, a
crucial response to infection that has evolved both in endotherms and ectotherms,
can confer a survival advantage upon infection by stimulating the immune system
(Evans et al. 2015). Infected ectotherms have been shown to raise their body
temperature by seeking warmer sites and spending more time in those sites than
uninfected individuals, a phenomenon called behavioral fever (Kluger. 1977;
Sherman. 2008; Rakus et al. 2017). Also, several studies have reported on the

120
 Fernández-Loras et al. (2019). Capítulo 4

utility of using elevated temperatures as a method of Bd elimination (Woodhams

et al. 2003; Chatfield & Richards-Zawacki 2011; Geiger et al. 2011).

The recently proposed thermal mismatch hypothesis suggests that infection

risk will decrease as the difference in thermal tolerance of host and pathogen
(tolerance mismatch) increases (Nowakowski et al. 2016). A refinement of the
hypothesis suggests that infectious disease outbreaks are most likely to occur at
temperatures where the performance gap between pathogen and host is greatest in
favor of the pathogen (Cohen et al. 2017). Because parasites are thermal
generalists, which often have broader thermal performance breadths than their
hosts, and assuming that both hosts and parasites are locally adapted to climatic
conditions in their ranges, this hypothesis posits that hosts adapted to cooler
climates should be especially susceptible to disease under unusually warm
conditions, whereas warm adapted hosts are more prone to infection under cooler
conditions (Figure 1 in Cohen et al. 2017).

Extreme weather events have increased in intensity, frequency and

unpredictability (Coumou & Rahmstorf 2012; Field et al. 2012; Du et al. 2013;
Stocker et al. 2013; Loikith & Broccoli 2014), and temperature extremes have
undergone systematic and significant changes over the last decades (Alexander et
al. 2006). These forms of global climate change are predicted to be more severe at
higher latitudes and altitudes and over land, where they are especially likely to
cause a series of malign effects, including thermal stress in many species
(McMichael et al. 2006) and an increase in the frequency of infectious disease
outbreaks (Cohen et al. 2017), leading to profound changes in ecosystem structure
and function (Smith. 2011), and ultimately threatening the integrity of ecosystems
(García et al. 2018). Ectotherms are considered especially vulnerable to climate
change due to the direct dependence of their fitness on temperature (Hoffmann.
2010; Somero. 2010), and because new daily, seasonal, or intermittent

121
Infección por Bd disminuye tolerancia térmica en larvas

temperature cycles will most likely be shifted away from their optimum and closer
to lethal extremes (Bernardo & Spotila 2006; Fisher 2007).

Estimating potential risks of species and populations posed by climate

change includes the assessment of the heat tolerance, such as the critical thermal
maximum (CTmax). CTmax is usually quantified under controlled conditions
using the Hutchison´s dynamic method, (Luttershmidt & Hutchison 1997) in
which organisms are exposed to a constant heating rate until an end-point is
attained. This end-point represents the upper limit of the ability of animals to
counterbalance temperature increase and marks the loss of homeostasis.
According to Huey et al. (2012), vulnerability of a species to rising environmental
temperature depends on several factors including the species’ sensitivity to
temperature change, its capacity to adapt to such change, its resilience, and its
exposure level. Some studies have proposed that tropical ectotherms will be more
susceptible to warming-induced extinctions than their temperate counterparts,
since their CTmax is only slightly higher than the highest ambient temperatures
they already experience, which leaves these species with an extremely low warming
tolerance (Duarte et al. 2012; Huey et al. 2012). Importantly, infection with Bd
may result in reduced CTmax, as shown for the tropical anuran Litoria spenceri at
the adult stage (Greenspan et al. 2017). Previous studies indicated that Bd
infection correlates with cooler temperatures in the field (Fernández-Beaskoetxea
et al. 2015), and laboratory experiments have demonstrated that Bd ceases growth
at temperatures above 28˚C (Piotrowski et al. 2004). Then, the predicted increase
in temperatures may indirectly determine a protection of amphibians from Bd and
an experimental heating of hosts may clear themselves of the pathogen.

Within this context, we conducted a thermal ramping experiment

(Terblanche et al. 2007) in both aquatic tadpoles and recently metamorphosed,
terrestrial toadlets of two contrasting altitude populations of Alytes obstetricans,

122
 Fernández-Loras et al. (2019). Capítulo 4

an anuran species from temperate Europe which has been hit hard by
chytridiomycosis (Bosch et al. 2001; Walker et al. 2010). Our goals were (1) to
determine if gradually and briefly elevating environmental temperature close to
the CTmax of individuals can be used to clear Bd infection from both host stages–
an experimental heating procedure similar to heating pulses employed to trigger
cleaning Bd from amphibian hosts (Greenspan et al. 2017)–and (2) to assess
whether infection with Bd lowers upper thermal tolerance limits of tadpoles or
toadlets in this species (as suggested by Greenspan et al. 2017).

MATERIALS AND METHODS

We collected a total of 121 A. obstetricans specimens, both larval (80) and

recently metamorphosed, toadlets (41) from two localities: Toro, at mid-altitude
population (Zamora, Central Spain, geographic coordinates: 41.37 N, 5.44 W;
altitude: 740 m above sea level; 80 tadpoles and 21 toadlets collected) and
Acherito, a montane population (Huesca, Northern Spain, geographic coordinates:
42.88 N, 0.71 W; altitude: 1875 m above sea level; 18 tadpoles and 20 toadlets
collected). Prevalence of Bd infection in larval stages is known to approach 100%
during colder months at both localities (Walker et al. 2010; Fernández-
Beaskoetxea et al. 2015). Animals were collected in November 2012 and May 2013
at Toro and in August 2013 at Acherito.

Prior to the heating experiment, we assessed the developmental stage of

tadpoles and measured body mass of tadpoles and toadlets. Tadpoles originating
from Toro were between developmental stage 26 and 37 (Gosner. 1960) and
weighed 1.05 ± 0.03 g (mean ± SE), while those originating from Acherito were
between stage 34 and 40 and weighed 1.56 ± 0.07 g. Toadlets collected from Toro
weighed 0.65 ± 0.03 g and those collected from Acherito weighed 1.96 ± 0.07 g.
We acclimated animals for 2 days in 1-L individual containers at 18˚C and a

123
Infección por Bd disminuye tolerancia térmica en larvas

light:dark cycle of 12:12. Containers were filled with dechlorinated tap water in the
case of tadpoles, while containers with toadlets were lined with sterilized paper
towels moistened with dechlorinated tap water. Every 72 hours we changed water
and replaced the wet paper towels, and subsequently fed tadpoles and toadlets ad
libitum with commercial food for amphibian tadpoles or with baby crickets,
respectively.

In order to determine the CTmax (˚C) of tadpoles and toadlets, we

individually placed animals within a new plastic container and subjected them to a
thermostated bath (HUBER K15-cc-NR). Initial temperature was 20˚C in the case
of tadpoles and 19.8˚C for toadlets. Following Hutchinson’s dynamic method for
determination of CTmax (Hutchinson. 1961), we increased water temperature at a
constant rate of 0.8˚C min-1 and observed tadpoles and toadlets continuously until
they reached the endpoint. We defined the endpoint as the point at which tested
individuals become motionless and fail to respond to external stimuli by prodding
10 consecutive hits applied each 2 s with a wooden stick (Gutiérrez-Pesquera et al.
2016). We established a humane endpoint when animals did not recover motion
after 30 min of reaching their CTmax. If so, animals should be euthanized with an
overdose of tricaine methanesulfonate (MS222, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO,
USA) buffered with NaHCO3 (no animal reached the humane endpoint criteria).
Twenty tadpoles and five toadlets were assigned to the control groups and were
subjected to the bath but not to heating.

In order to examine whether heating to CTmax of the host promotes a

cleaning of Bd infection, immediately before assays, the keratinized mouthparts of
tadpoles and the lower ventral surface and hind limbs of toadlets were swabbed
using sterile cotton-tipped swabs (MW100-100; Medical Wire & Equipment Co,
Corsham, UK). After heating experiments, tadpoles and toadlets were individually
kept for an additional 15-day period in new 1-L containers with dechlorinated tap

124
 Fernández-Loras et al. (2019). Capítulo 4

water or sterilized moistened paper lining, respectively, to allow enough time for
Bd DNA from dead chytrid cells to degrade. Tadpoles were then euthanized with
an overdose of tricaine methanesulfonate buffered with NaHCO 3, and whole
tadpole mouthparts were collected and fixed. Surviving toadlets were swabbed on
day 15 and released at the exact point of capture, whereas animals found dead
upon daily screenings were toe-clipped immediately. Tissue samples were stored
in 70% ethanol and swabs were stored dry at 4˚C until processing.

The experiments here performed were carried out in accordance with all
current European directives and Spanish laws, and approved by the competent
authorities of the Consejería de Medio Ambiente from Junta de Andalucía (Ref.
12_44). Procedures conformed to the recommended guidelines or use of live
amphibians and reptiles in laboratory research (ASIH 2004). All experimental
protocols were approved by the ‘Comité de Ética de Experimentación Animal
CEEA-EBD’. All researchers implied in the experiments (AFL, JB, MT) have the
competent accreditation (Category C) according to the EU Directive 2010/63/EU
Article 23.2 accredited by the Federation of European Laboratory Animal Science
Associations (FELASA).

We extracted Bd-DNA using PrepMan Ultra Reagent Protocol as described by

Boyle et al. (2004). Extracted DNA was stored at -20˚C until further processing.
We assessed the burden of infection using the quantitative PCR (qPCR) protocol
described by Boyle et al. (2004) with a CFX96 thermocycler (Bio-Rad). Each plate
included samples, a negative control and four standards ranging in concentration
from 100 to 0.1 Bd zoospores ml-1 genome equivalents (GE), all in duplicate
(isolate IA042 from Acherito). Samples were scored positive when both replicates
received GE-estimates ≥ 0.1 and amplification curves had the typical sigmoidal
shape.

125
Infección por Bd disminuye tolerancia térmica en larvas

Infection loads for tadpoles and toadlets before and after thermal treatments
were compared using linear mixed models, with individuals as a random factor,
and time (before/after), population, treatment (control/heated), and the
interactions time x population and time x treatment as fixed factors. Infection load
was transformed (log10) to reach normality but also to reduce differences between
values obtained by swabbing the oral discs (initial) and by using the whole oral
disc (final). We analysed variation in Box-Cox transformed values of CTmax of
tadpoles and toadlets separately using general linear models (GLM) because all
tadpoles collected from Acherito and no toadlets collected from Toro were
infected. We entered population origin as a fixed factor and Bd infection load and
body mass as covariates. JMP Pro 12 (SAS Institute Inc., NC, USA) was used for all
statistical analyses.

RESULTS

Initial prevalence and infection load

Initial prevalence of infection in tadpoles originating from Toro was 50% (n =

80) whereas it was 100% (n = 18) in tadpoles taken from the Acherito population.
Similarly, none of the 21 toadlets collected at Toro were infected, while most
toadlets collected at Acherito were infected (prevalence: 90%, n = 20). Bd loads of
infected tadpoles from Toro assigned to the experimental group ranged from 960
to 12970 GE (average 3846 GE), whereas infected tadpoles assigned to the control
group ranged from 930 to 1440 GE (average 4419 GE). Tadpoles from Acherito
presented an averaged Bd load of 511 GE, ranging from 6 to 2330 GE. Infected
toadlets from Acherito assigned to the experimental group ranged from 1 to 2690
GE (average 472 GE), while infected ones assigned to the control group ranged
from 7 to 71 GE (average 115 GE).

126
 Fernández-Loras et al. (2019). Capítulo 4

Effect of host heating to CTmax on Bd prevalence and infection

load

All tested tadpoles (78) and toadlets (36) recovered after reaching their
CTmax. Averaged CTmax values were very high and extremely similar for both
tadpoles (37.3˚C) and toadlets (37.7˚C; Figure 1). Heating to CTmax did not clear
Bd infection. None of the 20 tadpoles collected from Toro, neither the 18 tadpoles
from Acherito that tested positive for Bd at the start, changed their infection score.
Similarly, all 20 control tadpoles maintained their infection status after completing
the experiment.

Larval populations differed in Bd loads (F1,103 = 23.699, p < 0.001), which

were higher in Acherito. Although no significant differences were found between
initial and final larval Bd loads (F1,80 = 0.970, p = 0.328) or between control and
heated tadpoles (F1,80 = 0.001, p = 0.973), the interaction between these two
factors was significant (F1,80 = 8.837, p = 0.004), indicating that heated tadpoles,
but not control tadpoles, increased their infection load after the experiment
(Figure 2).

All toadlets from Toro survived until completion of the experiment, 15 days
after exposure to CTmax. On the other hand, only four of the 20 toadlets collected
at Acherito survived until the end of the experiment. From those four toadlets, two
were Bd-free and the other two had low Bd loads (9 and 27 Bd zoospore GE,
respectively) at the beginning of the experiment. Most toadlets died 6 days (13
animals) after the beginning of the experiment, the rest died on day 9 (3 animals).
Toadlets that died on days 6 and 9 did not differ in Bd loads at the beginning of the
experiment or on the day of death (Student’s t-tests; t<0.8, p<0.43 in both cases).

127
Infección por Bd disminuye tolerancia térmica en larvas

None of the 14 Acherito toadlets that were initially Bd-infected lost their infection
after going through the CTmax experiment.

Toadlets showed no significant differences between initial and final Bd loads

(F1,15 = 0.454, p = 0.511) or between heated and control animals (F 1,15 = 1.764, p =
0.204), and the interaction between these two factors was not significant (F 1,15 =
0.004, p = 0.951).

Effect of Bd infection load on thermal tolerance limits

The linear model used to analyse differences in CTmax of tadpoles was highly
significant (R2 = 0.63, F3,76 = 41.359, p < 0.001). We observed a significant
difference in CTmax between the two studied populations (F1,76 = 61.28, p <
0.0001), with CTmax being higher in tadpoles collected from Acherito than those
obtained from Toro (mean ± SE: 38.238 ± 0.075 vs. 36.975 ± 0.061˚C). Most
importantly, a significant negative relationship between Bd infection load and
CTmax was found (F1,76 = 5.77, p = 0.0189), with a slightly lower CTmax in infected
(37.046 ± 0.083˚C) than non-infected tadpoles (37.500 ± 0.127˚C). The effect of
larval body mass had a marginally non-significant influence on CTmax (F 1,76 =
3.45, p = 0.0673). In the case of toadlets, neither population origin nor body mass
or Bd infection status had a significant effect on CTmax values (R2 = 0.03, F3,35 =
0.3238, p = 0.8081).

128
 Fernández-Loras et al. (2019). Capítulo 4

Figure 1. CTmax (˚C) in both tadpoles and toadlets from the two studied localities, Acherito and Toro.
Uninfected animals appear in blue and Bd-infected animals are in red. Numbers above each box-plot are
sample sizes. Horizontal lines depict medians, boxes represent interquartile ranges, whiskers extend to
minima-maxima, dots show potential outliers.

129
Infección por Bd disminuye tolerancia térmica en larvas

Figure 2. Bd loads (GE, log10 transformed) in both groups of tadpoles (control and heated) at the initial and
final time. Horizontal lines depict medians, boxes represent interquartile ranges, whiskers extend to minima-
maxima.

130
 Fernández-Loras et al. (2019). Capítulo 4

DISCUSSION

Our main observation that CTmax values obtained for Bd-infected tadpoles
were significantly lower than those of uninfected ones supports similar results
reported for the adult stage of the Australian frog Litoria spenceri (Greenspan et
al. 2017). Therefore, this fungal pathogen may be capable of altering the thermal
physiology of the hosts it infects, or, in a narrower sense, to lower their ability to
withstand high temperatures. In a global warming scenario this could have serious
conservation implications for many amphibian species, especially for tropical
species, which often live close to their thermal limits (Duarte et al. 2012;
Gutiérrez-Pesquera et al. 2016). On the other hand, temperate amphibian species
may be relatively secure from similar impacts of warming, since their warming
tolerance (the difference between their CTmax and environmental temperatures)
is higher in most cases (Duarte et al. 2012). Because permanent ponds are in
general deeper and cooler than shallow ephemeral water bodies, A. obstetricans
and many other species using permanent ponds as their larval habitat could be on
the safe side in this respect, while species spawning and developing in temporary
water bodies may be exposed to higher risk. Nonetheless, amphibians of the
temperate zone may also be highly vulnerable to climate change, because
temperatures are predicted to rise more steeply in these regions (Williams et al.
2007), and, coupled with the observation of Bd-infection lowering CTmax, the
presence of the chytrid fungus may push local populations towards extinction.
However, we have to note that the decrease in CTmax accountable to Bd-infection
was less than 0.5˚C for tadpoles and a similar effect could not be detected in
toadlets, while CTmax was still higher than 37˚C in infected tadpoles and even
higher in toadlets. Thus, our results indicate that Bd-infection may lower upper
thermal tolerance limits of amphibians, but this decrease is minimal in A.

131
Infección por Bd disminuye tolerancia térmica en larvas

obstetricans and will have to be assessed in a variety of other species before we can
determine the importance of this effect.

It is generally believed that temperature tolerance of Bd ranges from 4 to

25˚C, with its thermal optimum for growth and reproduction falling between 17–
25˚C (Piotrowski et al. 2004; Stevenson et al. 2013; Cohen et al. 2017). However,
A. obstetricans optimum thermal breadth (TB80) for larval growth was much
warmer, ranging between 21–28˚C (M. Tejedo, P. Pintanel, unpublished results),
thus suggesting the prediction of thermal mismatch hypothesis (Cohen et al. 2017).
In our experiment, where we exposed infected tadpoles and toadlets to elevated
temperatures, we did not observe clearance of infection even though the CTmax,
and thereby the highest ambient temperatures reached around 37.5˚C, which is
almost 10˚C higher than the CTmax of Bd. An in vitro study (Johnson & Speare
2003) showed Bd-wipeout in all cultures after only 4 hours of exposure to 37˚C.
We know of only two studies that exposed amphibians to similarly high
temperatures in order to clear Bd-infection: Woodhams and colleagues
(Woodhams et al. 2003) exposed juvenile frogs to 37˚C for 8 hours on two
consecutive days, which resulted in clearance of infection in all individuals; in the
other study, exposure to 35˚C for one day, preceded by 30˚C for 12 hours, was
ineffective in clearing Bd from adult frogs (Woodhams et al. 2012). In our
experiment, we elevated temperature from 20˚C to around 37.5˚C at a rate of
0.8˚C min-1, meaning that infected animals spent ca. 12 min at temperatures
beyond 28˚C, the upper thermal limit of Bd, and 4 min at temperatures beyond
35˚C, which is likely too brief to kill Bd or alternatively, triggering host immunity
(Berger et al. 2004). From these studies it appears that even temperatures close to
the thermal maximum that amphibians can withstand without lasting damage
have to be maintained for more than just a few minutes. The effective
combinations of elevated temperatures and duration of application/exposure of
thermal stress in order to clear Bd-infection or at least to largely suppress infection
loads remain to be determined.

132
 Fernández-Loras et al. (2019). Capítulo 4

To conclude, our study shows that besides other malign effects on its
amphibian hosts, Bd can also reduce their critical thermal maximum (CTmax), at
least for tadpoles. A reduction in thermal tolerance can have serious consequences
for the persistence of amphibian populations at many localities worldwide,
especially under the ongoing process of global climate change. At the same time,
our results and those of previous studies suggest that short spikes in peak
temperatures are unlikely to clear Bd-infection from amphibian hosts. Finally, our
study draws attention to the importance of determining effective combinations of
time and temperature parameters in order to deploy optimized and safely
applicable disinfection treatments against this deadly disease.

133
Infección por Bd disminuye tolerancia térmica en larvas

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140
141
CAPÍTULO 5

LA INTERVENCIÓN SEVERA IN SITU EN EL HÁBITAT DE

CRÍA SÓLO CONSIGUE UN ÉXITO TEMPORAL EN REDUCIR
LA INFECCIÓN POR Batrachochytrium dendrobatidis

IN SITU SEVERE BREEDING HABITAT INTERVENTION ONLY

ACHIEVES TEMPORARY SUCCESS IN REDUCING
Batrachochytrium dendrobatidis INFECTION

Andrés Fernández-Loras1, Luz Boyero2,3, Jaime Bosch1,4

1
Museo Nacional de Ciencias Naturales-CSIC, José Gutiérrez Abascal, 2, 28006 Madrid, Spain.
2
Faculty of Science and Technology, University of the Basque Country (UPV/EHU), Vizcaya,
Spain.
3
IKERBASQUE, Basque Foundation for Science, Bilbao, Spain.
4
Research Unit of Biodiversity (CSIC, UO, PA), Oviedo University, Mieres, Spain.

Fernández-Loras et al. (2020). Amphibia-Reptilia.

DOI: [Link]

142
143
Intervención en hábitat consigue éxito temporal reduciendo niveles de Bd

LA INTERVENCIÓN SEVERA IN SITU EN EL HÁBITAT DE

CRÍA SÓLO CONSIGUE UN ÉXITO TEMPORAL EN
REDUCIR LA INFECCIÓN POR Batrachochytrium
dendrobatidis

RESUMEN

La quitridiomicosis, una enfermedad infecciosa causada por el hongo

Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), está causando acusados declives en
poblaciones de anfibios de todo el planeta. Se ha llevado a cabo un
considerable esfuerzo investigador para estudiar la enfermedad, incluyendo
los tratamientos frente a Bd, pero la mayoría de los protocolos terapéuticos
que se han diseñado se han aplicado solamente en cautividad. El objetivo de
este estudio es eliminar del medio una cepa de Bd que afecta a varias
poblaciones de sapo partero común (Alytes obstetricans). Para ello se sacaron
de sus localizaciones de cría naturales (abrevaderos de ganado) a todas las
larvas de dichas poblaciones, y se llevaron a cabo dos tipos diferentes de
manipulación severa del hábitat de cría, como son el secado completo o el
vallado de los puntos de agua durante la época de cría. Los resultados
obtenidos a través del secado completo fueron parcialmente satisfactorios,
puesto que se consiguió eliminar el hongo del medio aunque sólo
temporalmente. Puesto que los adultos de A. obstetricans son eminentemente
terrestres, viven lejos del agua y por ello rara vez están infectados, nuestros
resultados sugieren que aún en hábitats sencillos y fácilmente manipulables,
en los que es posible implementar medidas de manipulación del hábitat
extremas, la eliminación total de Bd no es posible sin controlar otros
reservorios potenciales del hongo en los alrededores de los lugares de cría.

144
 Fernández-Loras et al. (2020). Capítulo 5

IN SITU SEVERE BREEDING HABITAT INTERVENTION

ONLY ACHIEVES TEMPORARY SUCCESS IN REDUCING
Batrachochytrium dendrobatidis INFECTION

ABSTRACT

Chytridiomycosis, an emerging infectious disease caused by the fungus

Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), is causing sharp declines in amphibian
populations around the globe. A substantial research effort has been made to study
the disease, including treatments against Bd, but most treatments have been
applied to captive amphibians only. We report a study aimed at clearing wild
populations of the Common Midwife toad (Alytes obstetricans). We removed all
larvae from natural breeding sites (cattle troughs) and conducted two types of
severe breeding habitat manipulation (complete drying and fencing for the whole
breeding season). While larval removal followed by drying was a successful
method of Bd elimination, the effect was only temporary. Since terrestrial habits of
adult A. obstetricans prevent them from infection, our findings suggest that, even
in simple breeding habitats where all aquatic amphibian stages can be handled and
extreme habitat intervention is possible, Bd cannot be eliminated without
controlling other potential Bd reservoirs in the surroundings of breeding sites.

145
Intervención en hábitat consigue éxito temporal reduciendo niveles de Bd

INTRODUCTION

Emerging infectious diseases represent a major threat to global

biodiversity, as they can cause severe declines or extinctions of local populations
(Daszak et al. 1999; Kilpatrick et al. 2009). Some well-known examples in animals
are the White Nose Syndrome in bats, caused by the fungus Geomyces
destructans; the highly deleterious crayfish plague driven by the fungus
Aphanomyces astaci; and the Chytridiomycosis, caused by the pathogenic
chytridiomycete fungus Batrachochytrium dendrobatidis (hereafter Bd), which
has been linked to extinctions and dramatic declines of hundreds of amphibian
species worldwide (Scheele et al. 2019). Batrachochytrium dendrobatidis is listed
as one of the top 100 world’s worst invasive alien species and has been identified
as the main culprit of the greatest loss of vertebrate biodiversity attributable to
disease in recorded history (Skerratt et al. 2007).

Disease ecology depends on interactions between hosts, pathogens and their

environment, the three elements being key determinants of disease transmission
and persistence, host susceptibility and pathological effects. Thus, besides direct
interventions towards the pathogen, the vector or the host, environmental
management could also be potentially used to control disease, even if results may
take longer to be measurable (Delahay et al. 2009). For example, habitat
manipulation has been used to decrease infection rates and influence of water-
borne disease development (Wobeser. 1994). Some studies suggest that air
temperature, water temperature, soil moisture and even the action of microscopic
aquatic predators, could be important extrinsic risk factors driving Bd infection
dynamics (Raffel et al. 2010; Forrest & Schlaepfer 2011; Heard et al. 2014;
Schmeller et al. 2014; Fernández-Beaskoetxea et al. 2015), and others advocate for
habitat manipulation as a possible strategy to minimize the impact of the disease
on amphibian populations (Raffel et al. 2010; Daskin et al. 2011; Geiger et al. 2011;

146
 Fernández-Loras et al. (2020). Capítulo 5

Puschendorf et al. 2011; Becker et al. 2012; Heard et al. 2014; Scheele et al. 2014).
Given that Bd growth, reproduction and infection prevalence and intensity are
negatively affected by high air and water temperature (Piotrowski et al. 2004;
Stevenson et al. 2013), some studies propose reducing canopy cover to increase
solar insolation and thus warm patches where temperature would be above Bd
upper optimal threshold, acting as amphibian thermal refuges in the water (Raffel
et al. 2010; Geiger et al. 2011; Becker et al. 2012; Heard et al. 2014) or ground
(Daskin et al. 2011; Puschendorf et al. 2011).

There has been great investment in studying the biology and dynamics of
chytridiomycosis and implementing treatments to clear amphibian populations
from the pathogen. However, the vast majority of treatments have consisted of
applying high temperatures (Woodhams et al. 2003; Chatfield & Richards-Zawacki
2011; Geiger et al. 2011) or antifungal products, such as itraconazole (Garner et al.
2009; Tobler & Schmidt 2010; Brannelly et al. 2012; Jones et al. 2012),
chloramphenicol (Bishop et al. 2009), thiophanate-methyl (Hanlon et al. 2012) or
voriconazole (Martel et al. 2011), to captive amphibian collections under
monitored conditions. While the treatment of captive amphibians has been
successful, translating this knowledge into safe, reliable, transferable, cost-
effective and long-term solutions to manage chytridiomycosis in the wild remains
a challenge.

Four different strategies have been used to try mitigate the impacts of the
disease in natural habitats (Garner et al. 2016), with no or partial success: (1)
translocations or reintroductions; (2) bioaugmentation of the host microbiome; (3)
treatment of individuals with antifungals; and (4) the combination of antifungal
treatments with environmental disinfection using chemicals. Other potential
mitigation strategies, such as obtaining resistant amphibians through genetic
manipulation and selective breeding, remain untested. Here we report a

147
Intervención en hábitat consigue éxito temporal reduciendo niveles de Bd

management study aimed at mitigating the effects of chytridiomycosis on a wild

population of the common midwife toad (Alytes obstetricans). A distinctive
natural history trait of this species is its extremely long larval stage (up to several
years), which is associated with the persistence and transmission of the disease
(Bosch et al. 2001). We used a combination of two methods, avoiding the use of
chemicals in the environment: (1) the removal of overwintering larvae, which are
responsible for maintaining and producing large amounts of fungal infective
zoospores (Fernández-Beaskoetxea et al. 2016); and (2) habitat intervention,
which consisted of either drying or fencing the breeding sites to avoid the entrance
of metamorphosed individuals.

MATERIALS AND METHODS

We conducted the study in twelve cattle troughs located in a forested

mountain area (mean altitude of 1550 m.a.s.l.) in the Teruel province (Aragón,
Spain). These cattle troughs, which are used as natural breeding sites by A.
obstetricans, were selected following three years of sample collection (2010-2012)
from a wide range of breeding sites, which showed high variation in Bd loads
(Figure 1).

148
 Fernández-Loras et al. (2020). Capítulo 5

Figure 1. Box plots of Bd load (log10 x+1 transformed) of overwintering A. obstetricans larvae at different
breeding sites sampled in 2010, 2011 and 2012 before habitat intervention.

Each site was randomly assigned to one of the following experimental groups,
comprised of three sites each: control (Blanca, Juan and Milano sites); removal
only (Jorcas, Reguero and Torreta sites); removal and fencing (Blandina, Cuerda
and Molino sites); and removal and drying (Abrevador, Cebo and Gil sites). All
larvae were removed from the sites in all cases; in the control group, larvae were
immediately returned to their original sites; in the fencing group, larvae were
removed and then the site was isolated using a fence that was left there during the
whole breeding season (45 days), to avoid the entrance of metamorphosed
individuals; in the drying group, larvae were removed and then the site was
completely dried out and kept it dry for at least 20 days, during which no rain
occurred and no other persisting sources of moisture were present. Habitat

149
Intervención en hábitat consigue éxito temporal reduciendo niveles de Bd

interventions were conducted in May 2012, immediately after the collection of

larvae, which were taken to a close captive facility and used in other studies, except
for larvae from the control group.

We collected twenty samples per site before habitat intervention and ten
samples per site annually for three consecutive years after intervention. We took
samples from the mouthparts of overwintering (OW) larvae using cotton swabs
(MW100-100; Medical Wire & Equipment Co., Corsham, UK), extracted the DNA
with PrepMan Ultra, and amplified the DNA using a BIO-RAD CFX96 Real-Time
PCR Detection System following Boyle et al. (2004). Each 96-well assay plate
included a negative control and four different standards containing DNA from 100,
10, 1 and 0.1 Bd genome equivalents (GE). We tested all the samples, as well as the
negative control and the standards, in duplicate. We considered samples with
greater than 0.1 GE in both replicates, and the expected sigmoidal shaped curve,
positive for Bd. We transformed Bd loads to the log10(x+1) to reach normality and
used a general linear model to analyse variation before and after intervention. We
considered treatment and year as fixed factors and site as fixed factor nested
within treatment, and used post-hoc Tukey’s honest significance tests to compare
pairs of Bd load means for the treatment by year interaction (Table 1).

150
 Fernández-Loras et al. (2020). Capítulo 5

Table 1. Tukey’s post-hoc tests comparing pairs of means of Bd loads for the treatment by year interaction.
Letters not connected by the same letter are significantly different.

RESULTS

The Bd loads varied across treatments, sites within treatments and years
(Figures 2, 3), and the treatment by year interaction was also significant (p < 0.05
in all cases), explaining the model 54% of the observed variation. While complete

151
Intervención en hábitat consigue éxito temporal reduciendo niveles de Bd

clearance of Bd was not achieved in any of the experimental groups (Figures 2, 3),
the drying group remained Bd-clean for two years. In the control group, infection
levels remained constant at Blanca and decreased at Milano in 2013 and 2104; we
found no larvae at Juan in 2013 and 2014, or in any control site in 2015. In the
removal group, we found less than 10 larvae in 2013 and 2014, and no larvae in
2015 at Jorcas (which prevented comparisons), and Bd loads remained similar or
increased after habitat intervention at Reguero and Torreta. Similar results were
found in the fencing group, with increased Bd loads at Blandina in 2014 and 2015,
and no larvae in 2013 and 2015 at Cuerda and in 2014 at Molino. In contrast, Bd
loads were null at all sites in the drying group for two years (2013 and 2014),
although infected larvae were collected again in 2015 at Cebo (with extremely low
Bd loads) and Gil; Abrevador did not present overwintering larvae in 2015, but ten
non-overwintering larvae resulted Bd-negative (data not shown).

Figure 2. Box plots of Bd load (log10 x+1 transformed) of overwintering A. obstetricans larvae at the twelve
study sites immediately before (2012) and after habitat intervention (2013-2015). NA: no overwintering larvae
present.

152
 Fernández-Loras et al. (2020). Capítulo 5

Figure 3. Bd load (logarithmic scale) and prevalence of infection (mean ± 95% CI) across the four
experimental groups (control, before (2012) and after habitat intervention (2013-2105). There is no data from
the control group in 2015 because no overwintering larvae were found.

153
Intervención en hábitat consigue éxito temporal reduciendo niveles de Bd

DISCUSSION

This study shows how some types of habitat intervention, but not others, are
able to affect the dynamics of chytridiomycosis in natural habitats by reducing Bd
loads. In particular, we achieved the elimination of Bd after removing larvae of A.
obstetricans from their natural breeding sites, and then completely drying out the
sites and keeping them dry for at least 20 days. As a result of this intervention, Bd
remained absent for at least two years (three in one site), which contrasted with
other interventions (i.e., larval removal only, or larval removal plus site fencing),
which rendered no significant or consistent effects on Bd loads. Other authors had
suggested that drying out the natural habitat could be a viable way of suppressing
Bd in the wild, given the high sensitivity of Bd zoospores to desiccation as shown in
laboratory conditions (Woodhams et al. 2011). However, Bosch et al. (2015) failed
to eradicate Bd in wild populations of Alytes muletensis populations after
completely drying out the aquatic habitat until a chemical was applied. Our study
supports those results and emphasizes the need of using chemicals to completely
and permanently eradicate Bd from the environment.

Mitigation strategies (including direct mitigation actions) have proven

ineffective in order to obtain long-term control of chytridiomycosis in the wild. The
only exception is Bosch et al. (2015), who successfully eradicate Bd in 2013, with
no reappearance to date (JB, unpublished results). For example, the use of
antifungals for in situ treatment of amphibian adults (Hudson et al. 2016) or
larvae, using a capture-treat-release approach (Geiger et al. 2017), has only
obtained short-term success, similar to the one described here. Still, in situ
antifungal treatments have been shown to reduce disease prevalence, infection
loads and mortality of post-metamorphic juveniles, which is helpful when coping
with an epidemic wave of chytridiomycosis (Garner et al. 2016; Hudson et al. 2016;
Geiger et al. 2017) but not for critically endangered species with reduced

154
 Fernández-Loras et al. (2020). Capítulo 5

distributions. Reducing Bd loads and preventing critical infection thresholds can

avoid mass mortality episodes and extinctions (Vredenburg et al. 2010), allowing
some individuals to persist and populations to overcome the epidemic (Briggs et
al. 2010). Drastic population reductions are never desirable for amphibians, which
are critically affected by many other anthropogenic factors. Even when some
studies have shown that Bd has no negative effects on populations of vulnerable
species when it reaches an enzootic stage (Tobler et al. 2012; Spitzen-van der Sluij
et al. 2014; Kieran et al. 2018), long surveying programs have indicated that other
populations are not able to recover even decades after the outbreak disease (Bosch
et al. 2018). Within this context, our results demonstrate that even drastic habitat
interventions (i.e., drying out natural breeding sites) can reduce Bd infection loads
but cannot be considered an eradication method.

There are two possible ways of reinfection of dried habitats that may have
occurred in our study, namely the arrival of infected amphibians and the existence
of potential reservoirs in the surroundings of breeding sites. Data are insufficient
to completely discard the arrival of infected individuals, even when A. obstetricans
is the only amphibian species present in the area. The persistence of infection in
postmetamorphic A. obstetricans could explain why water bodies were reinfected
after two complete years being utterly cleared of Bd. However, this explanation
could also be deemed unlikely, since A. obstetricans adults are fully terrestrial and
generally live far away from the water, being rarely infected by the chytrid fungus
(Allain & Goodman 2018; JB, unpublished results; but see Spitzen-van der Sluij et
al. 2014). Thus the existence of terrestrial Bd reservoirs in the surroundings of
breeding sites could be considered as a more plausible explanation for habitat
reinfection. If such environmental reservoirs of Bd were confirmed by field studies,
then the use of chemicals in the surroundings of water bodies could be one of the
best methods, already proved as efficient, in order to remove the chytrid fungus
from the environment (Bosch et al. 2015). Obviously, environmental disinfectant
application would need to be coupled with appropriate management of adult

155
Intervención en hábitat consigue éxito temporal reduciendo niveles de Bd

recolonization for those species with aquatic or semiaquatic adults. The use of
chemicals in natural habitats has been criticized for its potential damage to aquatic
organisms and ecosystems, but this mostly applies to the massive use of pesticides
in agriculture (Köhler & Triebskorn 2013). In contrast, using biocides for specific
conservation purposes often has more advantages than disadvantages (Martín-
Sánchez et al. 2012; Peay et al. 2019), and should be considered as a viable option
to eradicate the chytrid fungus from natural habitats.

156
 Fernández-Loras et al. (2020). Capítulo 5

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162
163
CAPÍTULO 6

ELIMINACIÓN EXITOSA EN LA NATURALEZA DE UNA

ENFERMEDAD INFECCIOSA LETAL PARA LA VIDA
SILVESTRE

SUCCESSFUL ELIMINATION OF A LETHAL WILDLIFE

INFECTIOUS DISEASE IN NATURE

Jaime Bosch1, Eva Sanchez-Tomé1, Andrés Fernández-Loras1, Joan A. Oliver2,

Matthew C. Fisher3, Trenton W.J. Garner4

1
Museo Nacional de Ciencias Naturales-CSIC, José Gutiérrez Abascal, 2, 28006 Madrid, Spain.
2
Conselleria de Medi Ambient i Mobilitat, Govern de les Illes Balears, Gremi Corredors, 10,
Polígon Son Rossinyol, 07009 Palma, Spain.
3
Department of Infectious Disease Epidemiology, Imperial College London, St Mary’s Hospital,
Norfolk Place, London W2 1PG, UK.
4
Institute of Zoology, Regent’s Park, London NW1 4RY, UK.

Bosch et al. (2015). Biology Letters.

DOI: [Link]

164
165
Eliminación exitosa de Bd en la naturaleza

ELIMINACIÓN EXITOSA EN LA NATURALEZA DE UNA

ENFERMEDAD INFECCIOSA LETAL PARA LA VIDA
SILVESTRE

RESUMEN

Se necesitan urgentemente métodos que puedan mitigar los impactos de las

enfermedades infecciosas emergentes que están afectando a la vida silvestre y
combatir la pérdida de biodiversidad. Sin embargo, raramente se ha llevado a
cabo de manera exitosa una mitigación in situ de algún patógeno que afecte a
la vida silvestre. De hecho, muchas de las estrategias existentes para combatir
este tipo de enfermedades permanecen en el plano teórico, a pesar de la gran
cantidad de información disponible para luchar frente a las infecciones del
ganado o los cultivos. En este estudio, mostramos el resultado de un esfuerzo
de cinco años de duración para eliminar la infección por Batrachochytrium
dendrobatidis (Bd) de un sistema isleño habitado por un único hospedador
anfibio. Nuestros esfuerzos iniciales para eliminar la infección de los
reservorios larvarios, a través de la aplicación directa de un tratamiento
antifúngico ex situ obtuvieron resultados positivos, aunque la infección
retornó a sus niveles previos cuando las larvas libres de la infección fueron
devueltas a sus localizaciones de origen. En consecuencia, se combinaron los
tratamientos antifúngicos en las larvas con la aplicación de desinfectantes
químicos en el medio. En cuatro de los cinco puntos de agua en los que se
había detectado previamente, la infección fue erradicada. Y permaneció así
durante los dos años siguientes a la intervención.

166
 Bosch et al. (2015). Capítulo 6

SUCCESSFUL ELIMINATION OF A LETHAL WILDLIFE

INFECTIOUS DISEASE IN NATURE

ABSTRACT

Methods to mitigate the impacts of emerging infectious diseases affecting

wildlife are urgently needed to combat loss of biodiversity. However, the successful
mitigation of wildlife pathogens in situ has rarely occurred. Indeed, most strategies
for combating wildlife diseases remain theoretical, despite the wealth of
information available for combating infections in livestock and crops. Here, we
report the outcome of a 5-year effort to eliminate infection with Batrachochytrium
dendrobatidis (Bd) affecting an island system with a single amphibian host. Our
initial efforts to eliminate infection in the larval reservoir using a direct application
of an antifungal were successful ex situ but infection returned to previous levels
when tadpoles with cleared infections were returned to their natal sites. We
subsequently combined antifungal treatment of tadpoles with environmental
chemical disinfection. Infection at four of the five pools where infection had
previously been recorded was eradicated, and remained so for 2 years post-
application.

167
Eliminación exitosa de Bd en la naturaleza

INTRODUCTION

Emerging infections are on the increase, incurring extraordinary

economic and health costs and globally degrading our natural capital. In
response, several efforts to eradicate animal pathogens are underway, however
with few successes reported (Wobeser. 2002; Mariner et al. 2012). Research on
livestock pathogens predominates and provides insight as to how pure wildlife
pathogens may be combated for host conservation purposes (Wobeser. 2002;
Mariner et al. 2012). Delivery of an efficient and practical intervention is a
cornerstone of any scheme to eliminate infectious diseases, and the direct
application of antimicrobials to infected hosts or immunization can be used
effectively to control pathogen replication within a host and to reduce the
likelihood of transmission to susceptible individuals (Rosatte et al. 1992).
However, for these types of interventions to be effective, control of environmental
reservoirs of (re)infection must also be achieved. Local control of pathogens
through the use of environmental chemical treatments has been effectively used to
disinfect areas where environmental transmission of parasites can occur, but the
impact of chemical treatment on transmission and maintenance of infection in
concert with antimicrobial treatments has rarely been examined (Skrjabin. 1970).

Amphibian chytridiomycosis, a disease predominantly caused by the aquatic

chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) has driven population
declines, local extirpations and species extinctions across five continents (Fisher et
al. 2009). The pathogen is an extreme generalist, infecting over 700 amphibian
species ([Link] Strategies developed to ameliorate the impacts
of chytridiomycosis are predominantly geared towards disease-free maintenance
of captive assurance colonies, and multiple methods have been developed to treat
captive amphibians against infection with Bd (Garner et al. 2009; Martel et al.
2011; Scheele et al. 2014); however, most attempts at immunization have failed

168
 Bosch et al. (2015). Capítulo 6

(Stice & Briggs 2010). The remaining approaches that hold promise for in situ
control include bioaugmentation with bacteria, direct application of antifungal
drugs and environmental application of anti-Bd chemicals. Although not without
promise, research on the application of bioaugmentation so far describes complex
interactions between host, beneficial bacteria, the broader microbiota and
pathogen that are strongly dependent upon environmental context and amphibian
community structure (Kueneman et al. 2014; Michaels et al. 2014). For this
reason, bioaugmentation strategies are unlikely to converge on an intervention
that can be generalized across amphibian communities and ecosystems. The
immediacy of the epizootic of chytridiomycosis calls for an intervention that can be
applied across systems, so we chose to explore direct application of antifungal
drugs to infected hosts and environmental application of chemicals as strategies to
eliminate Bd from a simple, single host system (Walker et al. 2008).

MATERIALS AND METHODS

Biannual surveys at five permanent ponds (3 x Torrent des Ferrerets, 2 x

Cocó de sa Bova; Mallorca, Spain) were undertaken from 2008 and are ongoing.
We sampled Mallorcan midwife toad (Alytes muletensis) tadpoles, as terrestrial
stages are rarely captured as they take refuge in inaccessible locations. Tadpoles of
this and other Alytes sp. are recognized as reservoirs of infection (Walker et al.
2010; Baláz et al. 2014). To sample, we swabbed tadpole mouthparts following
established protocols (Walker et al. 2008; Walker et al. 2010). All ponds affected
by chytridiomycosis on the island were included in the study and none was left as
untreated controls owing to conservation requirements. However, chemical
disinfection efforts at Torrent de Ferrerets preceded those at Cocó de sa Bova,
affording us the opportunity to compare across sites.

169
Eliminación exitosa de Bd en la naturaleza

Swabs were processed according to standard extraction and quantitative PCR

(qPCR) methods (Boyle et al. 2004) in duplicate and run against negative controls
and positive controls (0.1, 1, 10 and 100 zoospore genomic equivalents, GE).

For antifungal treatments, tadpoles were collected and transported in plastic

bottles containing pond water. We used air pumps and tubes with aeration stones
to ensure tadpole survival during the outward hikes. Tadpoles were then
transported to the laboratory and kept in several cooled, glass aquaria. All tadpoles
were bathed daily for 7 days in aged tapwater containing 1.0 mg l -1 itraconazole
(Sporanox, Janssen-Cilag Inc.) and returned to aquaria after each treatment.
Aquaria water was replaced every day during the 7 days treatment. After
treatment, tadpoles were returned to the collection sites by helicopter, either
immediately if ponds were not drained or after ponds were refilled by autumn rain.
In these cases, subsets of 40 tadpoles from each aquarium were swab-sampled 15
days post-treatment.

Environmental disinfection was done using Virkon S (DuPont Inc.) at 1%

final concentration and a single application applied ad libitum to the environment.
The disinfectant was liberally applied to all rock, gravel, crevice and vegetated
areas that surrounded the immediate environs of each breeding site.

RESULTS

We initially attempted mitigation by treating in 2009 A. muletensis tadpoles

inhabiting two permanent pond sites in one of the two infected drainages, Cocó de
sa Bova, with the antifungal itraconazole. We used a treatment protocol previously
shown to eliminate infection in tadpoles (Garner et al. 2009). Treatments were
applied ex situ, and prior to post-treatment release the two ponds were completely

170
 Bosch et al. (2015). Capítulo 6

drained of water and naturally dried by the arid environment that typifies
Mallorca. We had previously determined that Bd is absent from the other two
ephemeral water bodies in this drainage, and environmental Bd is not thought to
persist during periods of drying (Johnson et al. 2003). The two ponds naturally
refilled during the autumn rainy season. At no point during this prolonged period
of captivity did we detect any evidence of infection in the treated tadpoles. The
following spring, qPCR analysis showed that all treated animals had contracted
infections not significantly different from what had been recorded at the location
before treatment (Lubick. 2010) (Figure 1). Repeating the protocol in the spring of
2012, this time without draining the breeding sites, and with tadpole release only 7
days after treatment, was again not associated with reduction in the prevalence of
infection or reduced burdens of infection in the following spring (Figure 1).

In contrast, at three breeding sites used by the species in the second

drainage, Torrent des Ferrerets, we could not detect infection in any animals
sampled in 2013 after treatment of tadpoles and whatever terrestrial A. muletensis
life stages we could capture with itraconazole, draining the sites and then treating
the environment with Virkon S. Replication of this protocol at Cocó de sa Bova in
2013 and application of Virkon S solution to the rock crevices located around the
ponds where metamorphosed A. muletensis reside again cleared infection in the
larger population of tadpoles resident in the larger pond at this location. Residual
infection was detected in tadpoles occupying the smaller permanent pond site.
Data from samples taken at Torrent des Ferrerets 2 years after chemical
disinfection showed that the effect of environmental application of Virkon S
twinned with itraconazole treatment of tadpoles carried over across years, as again
no evidence of infection was detected in 2014 (Figure 1).

171
Eliminación exitosa de Bd en la naturaleza

Figure 1. Infection intensity (left panels; mean ±95% CI by the bias-corrected and accelerated BCa method
with 2000 bootstrap replications) and prevalence (on the right; mean ±95% Clopper–Pearson CI) over two
pond sites at the Cocó de sa Bova (combined in top panels) and three at the Torrent des Ferrerets (combined
in bottom panels), over the course of the study. Blue (light colour) shows values derived from spring sampling,
green (darker colour) for summer. Pairwise comparisons (Wilcoxon signed-rank tests for infection intensities
and Fisher exact tests for prevalence) are represented by dashed lines and significant differences represented
with asterisks (*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001) after a sequential Bonferroni adjustment. Sample sizes
are shown in left panels. Dashed vertical lines in right panels indicate when treatments were implemented.

DISCUSSION

We cannot say with certainty why direct treatment of tadpoles with

antifungals without environmental disinfection failed to resolve infection at Cocó

172
 Bosch et al. (2015). Capítulo 6

de sa Bova, but the most likely explanation is that infection reinvaded tadpoles
from post-metamorphic animals that we could not access in their terrestrial
refuges. We do occasionally discover corpses of juveniles exhibiting a strong
molecular signal of infection. Like other amphibian species, Alytes spp. tadpoles
scavenge from corpses, and this process is presumed to be a factor in transmission
of Bd from corpses to tadpoles in another species (Peaman et al. 2004; Bielby et al.
2009). Irrespective of this, our application of Virkon S at Torrent des Ferrerets
provided proof-of-principle that environmental application of fungicides and other
chemical treatments may be a better approach when combined with antimicrobial
treatment of infected hosts. This initial conclusion was reinforced when we
recapitulated our result by clearing infection in Cocó de sa Bova the following year.
In our case, combining chemical disinfection twinned with antifungal treatment of
tadpoles proved the better strategy, eliminating infection and preventing spill-back
over the short term at four of the five pools where we attempted mitigation.

The development of disinfection strategies alone cannot eliminate the threat

of chytridiomycosis, as evidence continues to accumulate that lethal amphibian-
associated chytrid fungi are frequently being introduced into Europe and beyond
(Walker et al. 2008; Martel et al. 2014). Clearing site-level infection is no
guarantee against pathogen reintroduction or the introduction of novel pathogens.
However, to cope with the existing, recurring and future threats of
chytridiomycosis, rapid response strategies require cheap, simple and transferable
methods for mitigating infection that can be employed as soon as the threat has
been identified. We acknowledge that Virkon S is a controversial chemical to use
environmentally and our use of it was driven by the urgency of midwife decline on
Mallorca (Doddington et al. 2013). Virkon S is only one of several chemical
treatments known to have antifungal properties against chytrid fungi (Schmidt et
al. 2009; Hanlon et al. 2012) and antifungal treatments do not require extensive
investment in time and effort. We argue that research informing efforts to combat
chytridiomycosis should include in-depth investigations of the impact of

173
Eliminación exitosa de Bd en la naturaleza

antifungals and anti-Bd chemicals on amphibian health without discarding

attempts to develop immunization and other methods of disease control. Research
on the application of these chemicals for control of wildlife diseases must also
include investigation of the potential impacts of chemical application to other
biodiversity, the environment and associated ecosystem services.

174
 Bosch et al. (2015). Capítulo 6

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Wobeser G. (2002). Disease management strategies for wildlife. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz,
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177
178
CAPÍTULO 7. DISCUSIÓN INTEGRADORA

179
 Capítulo 7

DISCUSIÓN INTEGRADORA

En la quitridiomicosis, como en cualquier otra enfermedad, se producen

una serie de interacciones entre el agente patógeno y el hospedador. De este
modo, ante las defensas desplegadas por este último, el patógeno también
pone en marcha una serie de mecanismos que facilitan su ataque, dificultan su
detección, y consiguen evitar las acciones preventivas del sistema inmune. En
el caso de Bd, se ha demostrado que el agente fúngico secreta enzimas
proteolíticas (proteasas) y lipasas que causan una rápida disrupción de las
uniones intercelulares en la piel, lo que lleva a la muerte celular o apoptosis de
esas células (Brutyn et al. 2012). Además de facilitarle así la colonización de la
piel del anfibio afectado, enzimas como las metaloproteasas podrían contribuir
a la virulencia mostrada por el hongo quitridio y al mismo tiempo, podrían
ayudarle a la hora de evadir la respuesta inmune, como ya se ha observado que
ocurre en el caso de otros patógenos fúngicos como Coccidioides posadasii
(Hung et al. 2005).

Otro mecanismo que alteraría las funciones inmunitarias y causaría

efectos perniciosos inmunosupresores sería la situación de estrés crónico que
produce en los anfibios la infección por Bd (Grogan et al. 2018). Los
glucocorticoides juegan un papel esencial en la regulación del sistema inmune
anfibio, ya que determinan el número de leucocitos circulantes en sangre. El
principal glucocorticoide anfibio, la corticosterona, ve incrementados sus
niveles en situaciones de estrés o como consecuencia de sufrir una infección o
padecer una enfermedad. La respuesta inmune anfibia ante una infección está
modulada por el eje hipotalámico-hipofisario-interrenal (HHI), muy similar al
eje hipotalámico-hipofisario-adrenal (HHA) de los mamíferos. Cuando el eje
HHI es activado y las glándulas interrenales son estimuladas, los niveles de
glucocorticoides en sangre aumentan. Esta liberación inicial de corticosterona,
ocasiona cambios fisiológicos, metabólicos y de comportamiento que preparan

180
Discusión Integradora

al organismo para responder de una manera más adecuada frente al estrés o la

acción de un patógeno, al activar el sistema inmunitario anfibio. Sin embargo,
si la situación de estrés se prolonga o la enfermedad se vuelve crónica, el efecto
de tener unos elevados niveles de corticosterona durante un largo periodo de
tiempo se vuelve contraproducente y negativo para el sistema inmune,
provocándose un estado de inmunosupresión. Es precisamente esto último lo
que sucede con la infección por Bd. La quitridiomicosis produce un aumento
crónico en los niveles de corticosterona y ésta a su vez, modula la respuesta
inmune y altera el perfil leucocitario del hospedador. Produce también efectos
subclínicos en los individuos infectados, que provocan un incremento
adicional del estrés. En varias especies como la rana toro americana
(Lithobates catesbeianus), la rana de Wilcox (Litoria wilcoxii) o la rana
arborícola verde australiana (Litoria caerulea), se ha observado que esa
alteración leucocitaria se traduce en un aumento de la ratio neutrófilos-
linfocitos. Es decir, se incrementan los neutrófilos circulantes mientras
desciende el número de linfocitos (Davis et al. 2010; Kindermann et al. 2012;
Peterson et al. 2013). Otro estudio ha demostrado la existencia de una
asociación positiva entre el aumento en los niveles de corticosterona y la
intensidad de la infección, dependiendo de la cepa del hongo quitridio que
actúe. Gabor et al. (2013) mostraron que esa asociación se daba sólo en
individuos de sapo partero común (A. obstetricans) infectados por la cepa
hipervirulenta (BdGPL), pero no en individuos de sapo partero balear (Alytes
muletensis) infectados por una cepa menos virulenta como es BdCAPE.
Determinaron así, que los diferentes linajes del hongo quitridio causan
distintos niveles de estrés en los anfibios que infectan.

Pero quizá el mecanismo de evasión puesto en marcha por el patógeno

fúngico que tiene un efecto más directo sobre el sistema inmune del
hospedador anfibio, consiste en la inhibición de la proliferación linfocitaria en
células del bazo de distintas especies, y en su capacidad de alterar la regulación
de la expresión de ciertos genes relacionados con la respuesta inmune. En su

181
 Capítulo 7

estudio, Fites et al. (2013) pusieron de manifiesto que Bd es capaz de provocar

la inhibición de funciones inmunitarias críticas, como la proliferación
linfocitaria. El patógeno fúngico podría llegar a impedir la proliferación de
linfocitos de forma dosis-dependiente en los esplenocitos (células del bazo). La
causa detrás de esta inhibición a la proliferación linfocitaria podría ser la
liberación por parte de Bd de factores solubles tóxicos, que se especula podrían
provenir de su pared celular, y que impedirían la proliferación, conseguirían
que los linfocitos no pudiesen desarrollar su función, e incluso causarían su
muerte celular o apoptosis (Fites et al. 2013). En contraposición a este efecto
sobre los linfocitos, se ha visto que las funciones de reconocimiento y
fagocitosis de macrófagos o neutrófilos, componentes del sistema inmune
innato, no se ven afectadas por la infección. Además de esta inhibición en la
proliferación linfocitaria, otros estudios han demostrado la capacidad del
hongo quitridio para alterar la expresión génica. En la rana de uñas tropical
(Silurana tropicalis), una especie sensible a los efectos del hongo, se han
observado tanto una regulación negativa de algunos marcadores del sistema
inmune adquirido, como una regulación positiva de genes del sistema inmune
innato después de una infección por Bd. La citada regulación positiva afecta a
genes de péptidos antimicrobianos que operan en la piel anfibia, mientras que
la regulación negativa acontece, aún encontrándose el hospedador dentro de
su rango óptimo de temperatura, a nivel de marcadores genéticos en el bazo de
linfocitos T y B, así como de factores del complemento (Ribas et al. 2009). En
la misma línea, otro estudio detectó un efecto negativo en la expresión genética
que afectaba también a genes de células hepáticas relacionados con el
complemento inmunitario en S. tropicalis, así como también una regulación
positiva en los genes que regulan el complejo mayor de histocompatibilidad
(MHC por sus siglas en inglés) (Rosenblum et al. 2009). Algo, esto último, que
iría en consonancia con lo observado en un reciente estudio llevado a cabo con
una especie sensible a la quitridiomicosis como es la rana de Yavapai (Rana
yavapaiensis), en el que también se reveló la existencia de un aumento en la

182
Discusión Integradora

expresión de los genes relativos al MHC Clase-II en especies sensibles, y no

solo eso, sino que se estableció una correlación negativa entre ese aumento en
la expresión de los marcadores genéticos del MHC Clase-II y la probabilidad
de supervivencia anfibia al afrontar la infección por Bd. Algo que podría
indicar que no siempre una regulación positiva de genes inmunitarios tiene
efectos beneficiosos y que por el contrario, el incremento en la regulación
génica de ciertos genes específicos del sistema inmune adquirido en las
especies anfibias susceptibles a la enfermedad, puede llegar a producir efectos
dañinos al hospedador (Savage et al. 2020). Todo esto, corrobora los hallazgos
de otro estudio que concordaría con las investigaciones anteriormente
reseñadas en que Bd provocaría una inmunosupresión a través de una
regulación genética negativa en genes de células esplénicas que codifican la
producción, diferenciación y maduración de linfocitos o del complemento
inmunitario, y al mismo tiempo sería capaz de provocar un aumento
generalizado en la expresión genética de genes en células de la piel anfibia, que
regulan desde la producción de inmunoglobulinas o linfocitos T y B, al
complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), o la producción de algunas
enzimas como la quitinasa, con un rol fundamental en la degradación de la
pared celular fúngica (Ellison et al. 2014). Este incremento en las células
dérmicas de la expresión génica, confirmado en una especie altamente sensible
al hongo quitridio como es la rana dorada de Panamá (Atelopus zeteki),
indicaría que algunas especies de anfibio, aún siendo sensibles al hongo, al ser
infectadas por Bd son capaces de desplegar una respuesta inmune para tratar
de hacer frente al patógeno (Ellison et al. 2014).

Como acabamos de reseñar, estas publicaciones parecen indicar que la

respuesta inmune adquirida carece de eficacia, no se produce en cantidad
suficiente para frenar la infección, y está afectada negativamente por el hongo
quitridio (Ellison et al. 2014; Savage et al. 2020). Al mismo tiempo, el
importante papel que podrían desempeñar los péptidos antimicrobianos
(AMPs) para evitar la colonización dérmica por parte del hongo quitridio, o el

183
 Capítulo 7

aumento en la regulación génica en las células de la piel donde se produce la

infección fúngica (Ribas et al. 2009; Ellison et al. 2014), son elementos que
parecen resaltar la importancia de la respuesta inmune innata, sobre todo si es
una respuesta temprana. Estas investigaciones podrían explicar porqué este
patógeno fúngico, dada su aparente capacidad para inhibir al sistema inmune
adquirido, puede llegar a ser tan letal para aquellas especies de anfibio que, al
carecer de un sistema innato robusto, eficiente y capaz de hacer frente al
hongo, mostrarán una mayor susceptibilidad a la infección fúngica (Fites et al.
2013; Grogan et al.2018). Esto concordaría con los resultados obtenidos en la
presente tesis, que muestra en su Capítulo 2 como la exposición a Bd de larvas
pertenecientes a una especie sensible como A. obstetricans, influye en el
normal desarrollo de su sistema inmune adquirido, y conlleva una
disminución significativa en los niveles circulantes en sangre de
inmunoglobulinas (IgM e IgY) una vez que esas larvas han superado la
metamorfosis y se han convertido en juveniles.

A lo largo de estos años de investigación se han utilizado, bajo

condiciones controladas de cautividad, tratamientos que son efectivos contra
la enfermedad, como pueden ser productos farmacológicos que gracias a sus
efectos antifúngicos se han empleado para intentar eliminar al hongo
quitridio. Dentro de esta categoría encontramos al itraconazol, el antifúngico
que se ha utilizado más frecuentemente dadas las múltiples ventajas que
presenta. Entre ellas, estaría el poco tiempo necesario para dispensar el
tratamiento a través de baños diarios de pocos minutos con soluciones del
producto a diferentes concentraciones. Otras ventajas giran en torno a su
tolerancia, pues parece ser bien tolerado por la mayoría de especies en las que
se ha utilizado, y no presenta grandes riesgos para la salud humana a la hora
de su manejo para la aplicación. Una posible ventaja más es que, al menos en
mamíferos, se ha documentado que el itraconazol se acumula y persiste en las
células queratinizadas de los tejidos. Esto último todavía no se ha probado en

184
Discusión Integradora

anfibios, pero podría ser de gran ayuda para tratar una enfermedad como la
quitridiomicosis, que está causada por un hongo quitridio que precisamente se
localiza exclusivamente en este tipo de células (Pessier & Mendelson 2010). Se
han detectado sin embargo también, inconvenientes que desaconsejan su uso
para tratar según qué cepas de Bd, sobre todo en los estadíos larvarios. Existen
ya casos en los que el uso de itraconazol para tratar la enfermedad en larvas y
en animales recién metamorfoseados, utilizando concentraciones seguras en
adultos, ha resultado en episodios de toxicidad e incluso mortalidad (Pessier &
Mendelson 2010; Baitchman & Pessier 2013). La solución oral del fármaco que
se comercializa, además de tener un alto coste económico, es muy ácida
(pH=2), ya que contiene ácido clorhídrico (Nichols & Lamirande 2001). Dado
que el producto se administra a través de baños diarios en una solución con
una concentración determinada, esta acidez puede llegar a ocasionar irritación
cutánea en los anfibios y también, una disfunción osmótica en animales que
como ya hemos visto, debido a la fisiopatología de la enfermedad que padecen,
tienen de hecho esa función osmótica comprometida (Pessier & Mendelson
2010). Pero sus efectos secundarios no terminan ahí. En mamíferos, son varios
los estudios que han detectado un descenso en los niveles de potasio en sangre
(hipopotasemia o hipokalemia), y una hepatotoxicidad en humanos que
reciben tratamientos crónicos, que ocasiona un aumento de las enzimas
hepáticas (Tucker et al. 1990; Collazos et al. 1995). En roedores, se observaron
extensos daños a nivel hepático como pueden ser necrosis hepatocelular,
degeneración, hiperplasia del conducto biliar y cirrosis biliar causados por un
tratamiento prolongado con itraconazol (Somchit et al. 2004). Estas
afecciones hepáticas se han encontrado también en el caso de anfibios tratados
con este fármaco. En el transcurso de un tratamiento experimental frente a Bd
realizado con larvas de sapo partero balear (A. muletensis), se observó una
depigmentación en los renacuajos tratados. Esta pérdida de pigmento puede
ser indicativa de un fallo en la producción de melanina y de toxicidad a nivel
hepático, ya que la melanina se produce entre otras, en las células de Kupffer

185
 Capítulo 7

localizadas en el hígado de los anfibios (Garner et al. 2009). También en

anfibios, otro estudio ha revelado que el uso de itraconazol en metamorfos
puede llegar a ocasionar inmunosupresión, y a aumentar las probabilidades de
muerte de los individuos tratados si posteriormente al tratamiento se les
somete a un estrés térmico. El itraconazol podría tener así efectos secundarios
que se mostrarían sólo en caso de estar sometidos los individuos a unas
condiciones estresantes. Este estudio pone de manifiesto además, que el
itraconazol quizá no debería ser el fármaco de elección para el tratamiento de
la quitridiomicosis en anfibios dentro de programas de cría en cautividad y
reintroducción, o en aquellos que intentan mitigar los efectos de la
enfermedad, ya que al causar una inmunosupresión, estaría favoreciendo y
aumentando las probabilidades de reinfección de los animales por parte del
hongo quitridio (Loyau et al. 2016).

Debido a estos problemas de toxicidad y todos los efectos secundarios

presentados por el itraconazol, se ha comenzado a utilizar de forma más
reciente otro fármaco perteneciente a la familia de los triazoles, el voriconazol.
Este antifúngico es un triazol sistémico de segunda generación que, de acuerdo
a los estudios que se han realizado hasta el momento, parece ser efectivo a la
hora de eliminar la infección por Bd y no originar ninguno de los efectos
adversos del itraconazol en los estadíos larvarios anfibios (Martel et al. 2011).
Igualmente, en cuanto a productos antifúngicos se refiere, se ha utilizado
también el metil tiofanato. Este fungicida es un pesticida utilizado
mayoritariamente contra los hongos micorrícicos. Un estudio demostró su
eficacia a la hora de tratar la quitridiomicosis en larvas de L. sphenocephalus
sin que se detectara ningún tipo de toxicidad o de efecto secundario adverso.
Es más, se observó un aumento en la masa y el tamaño de las larvas tratadas
(Hanlon et al. 2012). Como hemos visto, han sido diferentes los productos que
se han probado y que podrían hacer frente a la quitridiomicosis sirviendo
como tratamiento de la misma. Aunque en la actualidad, a pesar de la
toxicidad y los efectos secundarios nocivos mostrados por el itraconazol, éste

186
Discusión Integradora

sigue siendo el fármaco antifúngico de elección debido a su exitoso historial

clínico.

Un factor muy importante a tener en cuenta es que la efectividad de los

tratamientos depende en gran medida de la cepa del hongo quitridio que se
esté enfrentando, así como de la intensidad de la infección y la carga fúngica
que esté soportando el hospedador. De esta manera, nos encontramos con que,
tal y como ilustra el estudio presentado en el Capítulo 3 de esta tesis doctoral,
el tratamiento con itraconazol de larvas de sapo partero común (A.
obstetricans) infectadas naturalmente con la cepa hipervirulenta del hongo
quitridio (BdGPL), no sólo no es efectivo, sino que puede tener consecuencias
fatales para las larvas tratadas. De hecho, la utilización de concentraciones de
itraconazol por encima de un determinado nivel para intentar limpiar
completamente a las larvas, tiene efectos negativos muy significativos en la
propia supervivencia post-tratamiento de esas mismas larvas.

Es por esa razón, que también en el Capítulo 3 de la presente tesis, se

tratan de explorar nuevas vías de tratamiento utilizando fármacos ya
conocidos. Nuevas posibilidades que podrían permitir, gracias a la sinergia
entre fármacos antifúngicos y a su combinación, eliminar las cepas más
virulentas y resistentes del patógeno fúngico utilizando para ello
concentraciones más reducidas, disminuyendo así la aparición en los anfibios
de efectos contraproducentes durante los tratamientos contra la enfermedad
(Kirkpatrick et al. 2002; Baitchman & Pessier 2013). Lamentablemente, como
se constata al analizar los resultados del estudio, la combinación de dos
productos como son el itraconazol y el metil tiofanato no obtiene tampoco los
resultados esperados, y no es efectiva a la hora de tratar los estadíos larvarios
de A. obstetricans frente a BdGPL.

La susceptibilidad del hongo quitridio a un incremento de las

temperaturas ha sido ya puesta de manifiesto. En cultivos laboratoriales, se ha

187
 Capítulo 7

visto que Bd es capaz de crecer, aunque lentamente, a temperaturas por debajo

de su rango térmico óptimo. Del mismo modo se ha observado que su tasa
reproductiva es mínima por encima de los 25ºC, y que su crecimiento se
paraliza a los 29ºC (Stevenson et al. 2013). Se ha comprobado también,
siempre en condiciones de laboratorio, que temperaturas por encima de los
30ºC provocan su muerte (Piotrowski et al. 2004). Respecto al rango térmico
óptimo del patógeno hay ciertas discordancias, puesto que mientras algunos
autores lo sitúan entre los 17-25ºC (Piotrowski et al. 2004), hay otros que fijan
ese rango a menor temperatura, entre los 13-15ºC (Stevenson et al. 2013).
Estas variaciones no obstante, podrían deberse a la capacidad exhibida por Bd
de ofrecer respuestas adaptativas locales a diferentes regímenes térmicos
(Stevenson et al. 2013). La sensibilidad, en condiciones de laboratorio,
mostrada por el hongo quitridio a un incremento térmico unido a que, como ya
hemos visto, la temperatura posee una gran influencia sobre el sistema
inmune anfibio, potenciándolo a medida que aumenta (Fisher et al. 2007;
Murphy et al. 2011), ha precipitado el desarrollo de tratamientos que no
precisan del uso de ningún antifúngico, sino que están basados exclusivamente
en un aumento de este factor ambiental (Figura 1). De esta manera, se ha
conseguido limpiar completamente de la infección a juveniles de la rana
arborícola de ojos rojos australiana (Litoria chloris), sometiéndolos a una
acusada elevación de la temperatura hasta los 37ºC durante 16 horas
(Woodhams et al. 2003). Siguiendo esta misma línea, se consiguió un éxito por
encima del 95% en el tratamiento de individuos adultos de rana toro
americana (Lithobates catesbeianus) y de rana grillo norteña (Acris
crepitans), al mantenerlos durante diez días a temperaturas de 30ºC
(Chatfield & Richards-Zawacki 2011). La temperatura se ha utilizado también
con funciones terapéuticas en larvas de sapo partero común (A. obstetricans).
Geiger et al. (2011) no consiguieron la eliminación completa de la cepa
hipovirulenta suiza del hongo (BdCH), pero sí que un elevado porcentaje de

188
Discusión Integradora

hasta un 90% de animales, perdieran la infección tras un tratamiento

consistente en exponer a las larvas a una media de 29,7ºC durante 59 horas.

Figura 1. Centro de Cría en Cautividad de Anfibios Amenazados de la Sierra de Guadarrama (izda).

Tratamiento con temperatura aplicado a larvas de A. obstetricans (dcha) como parte de un
estudio de esta Tesis Doctoral (Capítulo 2).

Una importante consecuencia del calentamiento global que podríamos

reseñar, es el hecho de que un aumento generalizado de las temperaturas hará
que los organismos tengan que soportar situaciones térmicas cada vez más
cercanas a su umbral térmico máximo (CTmax), punto térmico en el cual se
alcanzan unas temperaturas críticas máximas que provocan un desequilibrio
en el animal con consecuencias letales si se mantienen en el tiempo. Se define

189
 Capítulo 7

tolerancia térmica de una especie a la diferencia existente entre su umbral

térmico máximo (CTmax) y la temperatura ambiental máxima (Tmax) (Duarte
et al. 2012; Greenspan et al. 2017). Así, las especies anfibias de regiones
tropicales presentan una tolerancia térmica reducida, debido a que la
temperatura ambiental está ya muy cerca de sus límites térmicos máximos,
haciendo que estas especies estén sujetas a declives o extinciones locales si las
temperaturas aumentan por encima de ese umbral térmico máximo (CTmax).
Esta delicada situación, se vería acentuada en aquellas especies anfibias
tropicales de montaña adaptadas a regímenes térmicos bajos, que además del
calentamiento global sufrieran los efectos de la quitridiomicosis, ya que se ha
comprobado que estas dos amenazas podrían actuar de manera sinérgica
(Neely et al. 2020). Por otra parte, las especies anfibias de zonas templadas
estarían relativamente seguras frente a los impactos ocasionados por el
aumento global de las temperaturas, ya que su tolerancia térmica es mayor. No
obstante, la previsión ya mencionada de que las tasas de calentamiento vayan
a ser mayores en las regiones templadas, hace que la vulnerabilidad de las
especies anfibias que habitan estas zonas frente al calentamiento global se vea
incrementada (Duarte et al. 2012). Adicionalmente, se ha comprobado que Bd
podría llegar a conseguir alterar la fisiología térmica de su hospedador y
reducir su umbral térmico máximo (CTmax) hasta en 4ºC (Greenspan et al.
2017). Este aumento en la sensibilidad a las altas temperaturas que se da en
los anfibios infectados, puede hacer que el hospedador no sea tan proclive a
seguir comportamientos protectores que incrementen su temperatura corporal
(fiebre comportamental), lo que acaba favoreciendo al patógeno. Y al mismo
tiempo, reduciría significativamente los rangos de seguridad térmicos de las
especies, dejando a los individuos y poblaciones más expuestos a sufrir los
efectos del calentamiento global (Greenspan et al. 2017). Los resultados
obtenidos con larvas de A. obstetricans infectadas por Bd y presentados dentro
de esta tesis doctoral (Capítulo 4), corroborarían este fenómeno originado por

190
Discusión Integradora

el hongo quitridio de alteración de la fisiología térmica de su hospedador y

reducción de las temperaturas máximas toleradas.

El citado estudio desarrollado en el Capítulo 4 de la presente tesis

demuestra como Bd, al ser capaz de alterar la fisiología térmica de las larvas de
A. obstetricans y disminuir su umbral térmico máximo (CTmax), posee el
potencial de dejar a esta especie anfibia más expuesta a sufrir declives en el
escenario de calentamiento global actual. El estudio también muestra como la
capacidad de resistencia del hongo a las altas temperaturas aumenta en el
medio natural cuando infecta a su hospedador objetivo, ya que temperaturas
muy por encima de los 30ºC no consiguen limpiar a A. obstetricans de la
infección.

El mundo globalizado en el que vivimos ha supuesto un significativo

aumento en el tránsito tanto de bienes como de personas. El transporte y el
comercio, en muchas ocasiones ilegal, de especies animales, está
intensificando la dispersión de patógenos. Esto implica también un aumento
en la dificultad a la hora de controlar o prevenir la transmisión de
enfermedades (Fisher et al 2012; Hudson et al. 2016). Más tarde o más
temprano patógenos como Bd acaban llegando a localizaciones en las que
entran en contacto con hospedadores por vez primera, y dan lugar a brotes
epidémicos causando graves daños y marcados declives en las poblaciones
afectadas.

En los dos últimos capítulos de la presente tesis doctoral, se han descrito

dos de los escasos métodos de mitigación que se han puesto hasta el momento
en marcha directamente en el medio natural, con el objetivo de reducir la
presencia o eliminar completamente al hongo quitridio del entorno, y
conseguir así la desaparición a su vez de los efectos que éste produce sobre los
anfibios.

191
 Capítulo 7

El primero de estos ejemplos se basa en la manipulación y en la

implementación de cambios en las condiciones del entorno para intentar
conseguir deshacernos de la presencia del patógeno fúngico en el medio. Es la
estrategia de mitigación que se llevó a cabo en Teruel como parte de una serie
de tratamientos de mitigación experimentales in situ, aplicados en distintas
poblaciones de sapo partero común (A. obstetricans) infectadas con la cepa
hipervirulenta BdGPL. El estudio y los resultados obtenidos, que son descritos
en el Capítulo 5 de la presente tesis doctoral, muestran como, evitando el uso
de desinfectantes químicos y combinando una disminución en la densidad
poblacional del hospedador, junto con una modificación del hábitat
consistente en el completo secado de los puntos de agua durante al menos 20
días (Figura 2), se consigue reducir significativamente la presencia del
patógeno e incluso se llega a eliminar, no de forma permanente pero sí por un
periodo prolongado de dos o tres años, a Bd del medio. A pesar de que estudios
recientes han comprobado que una reducción en la abundancia del
hospedador solamente consigue impactar de forma muy leve en las cargas
infectivas del hongo (Bosch et al. 2020), en el estudio aquí presentado sí se
observa que la combinación de la reducción poblacional del hospedador, junto
con el secado prolongado de los puntos de agua sí obtiene resultados positivos.
El no poseer una pared celular, hace que las zoosporas, formas infectivas de
Bd, sean sensibles a la desecación en condiciones de laboratorio (Johnson et
al. 2003). Sin embargo, la reinfección de las poblaciones de A. obstetricans
que se observó en el referido estudio al cabo del tiempo, sugiere que una vez
está en la naturaleza el patógeno muestra cierta resistencia, y podría llegar a
sobrevivir en condiciones extremas como el secado. De hecho, este tipo de
resistencia ya se ha documentado en el caso de Batrachochytrium
salamandrivorans (Bsal), la otra especie de hongo quitridio descrita,
endémica en Asia, que ha llegado a Europa a través del comercio de especies,
afecta no tanto a anuros sino principalmente a urodelos, y que a diferencia de
Bd, sí es capaz de fabricar unas esporas enquistadas con pared celular que le

192
Discusión Integradora

confieren resistencia tanto en ambientes acuáticos como en el sustrato

terrestre, y dificultan mucho su erradicación del medio (Stegen et al. 2017;
Thomas et al. 2019).

Figura 2. Actuaciones implementadas en el medio natural para la mitigación de la enfermedad. Vallado

(izda) y Secado (dcha) de los puntos de agua.

Diversos autores han planteado la posibilidad de que los efectos letales de

la quitridiomicosis sólo se dejen notar en el hospedador, cuando la carga
infectiva del patógeno rebase un límite máximo que se ha dado en llamar el
umbral de carga fúngica letal, por encima del cual las funciones fisiológicas se
ven totalmente rebasadas y se producen los episodios de mortandad en masa y
el declive de las poblaciones (Briggs et al. 2010; Vredenburg et al. 2010;
Puschendorf et al. 2011; Searle et al. 2011). Este límite crítico de carga sería

193
 Capítulo 7

diferente según la especie de anfibio afectada, siendo las especies más

tolerantes las que lo tendrían en niveles más elevados. Esto podría significar
que se estaría en disposición de frenar una ola epidémica de la enfermedad o
hacer que sus efectos negativos sobre los anfibios fuesen menores, si se
pudiesen implementar medidas de mitigación que aunque no consiguiesen la
erradicación total y permanente de Bd del medio, sí fueran capaces de reducir
significativamente la presencia del patógeno fúngico, y de mantener su carga
infectiva por debajo de esos límites críticos (Vredenburg et al. 2010). El éxito
alcanzado con la estrategia de mitigación descrita en el Capítulo 5, aún sin ser
permanente ni definitivo sí nos hace albergar cierta esperanza, ya que a través
de la combinación entre el secado de los puntos de agua y la reducción de la
densidad poblacional, se consiguieron disminuir significativamente la
prevalencia y las cargas infectivas del hongo en el medio. Podría ser por lo
tanto, una solución a aplicar si se dan las circunstancias adecuadas para ello,
con el fin de favorecer la supervivencia de poblaciones de anfibios afectadas
por el hongo quitridio.

Como ya se ha comprobado, los posibles resultados exitosos que se

alcanzan sólo con el tratamiento in situ a través de la aplicación de
antifúngicos bien en animales adultos (Hudson et al. 2016), bien en los
estadíos larvarios (Geiger et al. 2017), no son suficientes sino únicamente
transitorios, y sólo representan una mejoría a corto plazo. Esta circunstancia
pone de manifiesto el hecho de que el uso de productos antifúngicos para
tratar a anfibios infectados por Bd en el medio, puede servir para reducir de
forma sólo temporal la prevalencia y la carga infectiva del hongo, o frenar la
ola epidémica de la enfermedad por un breve espacio de tiempo, durante el
cual poder implementar otro tipo de medidas de conservación. Y también,
enfatiza la importancia de combinar estos tratamientos junto con la aplicación
de desinfectantes en el medio, si se quiere conseguir alargar los plazos en lo
que a erradicación de Bd del medio se refiere. Es precisamente esta última

194
Discusión Integradora

estrategia de mitigación, la combinación de tratamientos antifúngicos con la

aplicación de desinfectantes directamente en el medio natural, la segunda de
las técnicas de mitigación descritas en la presente tesis doctoral (Capítulo 6), y
la que se llevó a cabo con éxito en Mallorca, representando el primer caso de
erradicación del hongo en el medio natural a nivel mundial (Bosch et al. 2015).
El conjunto del estudio y la implementación en Mallorca de esta metodología
de mitigación en concreto, retrata además varios aspectos de la enfermedad
que creo conviene remarcar. Es primero un claro ejemplo de diseminación
involuntaria del patógeno por parte del hombre, ya que el hongo quitridio fue
inadvertidamente introducido en la isla a través de un programa de
reintroducción del sapo partero balear (A. muletensis), puesto en marcha por
la Durrell Wildlife Conservation Trust (DWCT), una importante entidad
dedicada a la conservación de especies animales en todo el mundo. En el
transcurso de dicho programa de reintroducción, se introdujeron A.
muletensis (Figura 3) en Mallorca contaminados con una cepa hipovirulenta
del hongo proveniente de Sudáfrica (BdCAPE), al haber estado previamente en
contacto en las instalaciones de la DWCT con ejemplares de Xenopus gilli
infectados (Walker et al. 2008).

195
 Capítulo 7

Figura 3. Sapo partero balear (A. muletensis). Foto: Jaime Bosch.

En segundo lugar, muestra claramente como las respuestas frente a la

quitridiomicosis a nivel poblacional dentro de una misma especie pueden ser
diferentes, y están fuertemente influenciadas por las condiciones ambientales
a las que estén expuestas esas poblaciones (Puschendorf et al. 2011;
Doddington et al. 2013). Y también, como los microhábitats cálidos y secos
favorecen la supervivencia de los anfibios infectados con Bd (Puschendorf et
al. 2011). Dos de las poblaciones de A. muletensis infectadas de la isla, Cocó de
sa Bova y Torrent des Ferrerets, difieren únicamente en su grado de exposición
al sol, pero esto hace que la temperatura alcanzada por el agua en una y otra
localización sea muy distinta y en consecuencia, mientras que la población de
Torrent des Ferrerets, donde las temperaturas rondan los 20ºC, se ha visto
reducida y ha sufrido un declive desde que Bd fue introducido en la isla, la
población de Cocó de sa Bova, en la que la exposición al sol es máxima y se
alcanzan temperaturas superiores a 25ºC, ha ido en aumento y no parece

196
Discusión Integradora

sufrir tanto los efectos del patógeno fúngico (Doddington et al. 2013).
Finalmente en tercer lugar, este estudio refleja las grandes diferencias
existentes a la hora de tratar cepas más o menos virulentas y resistentes del
hongo quitridio. Si bien el tratamiento que se realizó a las larvas de A.
muletensis infectadas con la cepa hipovirulenta BdCAPE fue un éxito, y
consiguió limpiarlas del hongo utilizando una pequeña concentración de
itraconazol (Bosch et al. 2015), como ya ha sido expuesto en el estudio que
conforma el Capítulo 3 de esta tesis, y reseñado anteriormente en esta
discusión, esas mismas concentraciones de itraconazol no son efectivas cuando
se tratan larvas infectadas naturalmente con la cepa BdGPL. Esta última cepa,
hipervirulenta y mucho más resistente, requiere de concentraciones de
antifúngico mucho más elevadas para ser eliminada y esto, genera la aparición
de efectos secundarios nocivos y no deseados como una alta toxicidad, que
puede llevar a la muerte de las larvas tratadas.

Debido a que, como hemos podido comprobar con la pandemia

producida por el SARS-CoV-2 y sus terribles consecuencias, frenar el avance o
la dispersión de enfermedades en este mundo global en el que vivimos es una
tarea prácticamente imposible, es necesario diseñar y desarrollar estrategias
que nos permitan hacer frente a esas enfermedades sobre el terreno, una vez
que han llegado a una zona y afectan a los organismos presentes en ella. En el
caso de la quitridiomicosis, eso se traduce en el diseño y la implementación de
estrategias de mitigación que nos permitan paliar los efectos causados por el
patógeno fúngico en las poblaciones de anfibios de todo el planeta. Sin
embargo, encontrar una estrategia de mitigación que sea segura, viable,
efectiva, duradera, fiable, fácil de ser implementada, que no conlleve un
desembolso económico elevado y sobre todo, que pueda ser aplicada en
distintas especies, poblaciones y condiciones ambientales, es a buen seguro un
reto de difícil consecución, ya que trabajar directamente en el medio natural
implica la presencia de múltiples factores que escapan a nuestro control.

197
 Capítulo 7

Existen además, como hemos visto a lo largo de los diferentes capítulos del
presente trabajo, otros elementos que componen el llamado “triángulo
epidemiológico”, que vienen determinados tanto por el patógeno, como por el
hospedador y por el hábitat, que van a intervenir o influir directamente en el
diseño y la implementación de cualquier tipo de actuación de mitigación de la
enfermedad en el entorno natural. En este sentido, factores como la cepa del
hongo quitridio a la cual nos estemos enfrentando, la especie de anfibio
tratada, sus rasgos ecológicos, la sensibilidad o la respuesta inmune que
presente frente al patógeno, los estadíos predominantes en la población sobre
la cual queramos intervenir, o también la altitud y la temperatura en las que
implementaremos nuestras medidas, van a condicionar de una manera
significativa la forma de actuar y la estrategia de mitigación a emplear en cada
caso, complicando exponencialmente nuestra capacidad para encontrar un
método de mitigación que se pueda aplicar de manera global o universal, y
haciendo necesario estudiar cada situación de manera individualizada con el
fin de aplicar las medidas correctoras más adecuadas.

No obstante, a la hora de aplicar las distintas estrategias de mitigación si

podríamos quizá distinguir entre unos medios simples, habitados por una sola
especie de anfibio y en los que se tiene acceso a todos los individuos de la
población, como puede ser el caso del estudio descrito en el Capítulo 6 llevado
a cabo en Mallorca, y otro tipo de medios o entornos más complejos, con
condiciones ambientales cambiantes, con características geográficas que hagan
complicada la implementación y uniformidad de acción de las medidas, o
habitados por distintas especies con diferentes respuestas frente al patógeno o
ante los tratamientos que se puedan utilizar. En ambos casos, como se ha
tratado de exponer a lo largo de esta tesis doctoral y muy especialmente en sus
dos últimos capítulos, las estrategias a implementar diferirán tanto en el grado
de complejidad, como en las probabilidades de éxito y su durabilidad o
permanencia.

198
Discusión Integradora

Para este tipo de entornos más complejos, existen líneas de investigación

actualmente en progreso enfocadas a hacer frente a esta patología sobre el
terreno, y que potencialmente podrían aportar soluciones más o menos
perdurables en el tiempo. Uno de estos estudios, se centra en investigar
diferencias genéticas entre poblaciones que puedan explicar la variedad
existente en la respuesta o susceptibilidad ante Bd. Al mismo tiempo, plantea
la posibilidad de implantar programas de cría en los que a través de selección
genética se podrían conseguir individuos resistentes al hongo quitridio que
posteriormente podrían ser devueltos a la naturaleza (Kosch et al. 2018). El
segundo de ellos, propone la utilización de focos de calor en el medio acuático
y también terrestre, con los que proveer a los anfibios de refugios térmicos que
les ayudarían a luchar contra la enfermedad en condiciones óptimas de
temperatura (Hettyey et al. 2019). La tercera de estas líneas de investigación
estaría enfocada en el uso del tebuconazol, un fungicida sistémico de la familia
de los triazoles utilizado frecuentemente en el sector agrario para el
tratamiento de distintas enfermedades causadas por hongos que afectan a
cultivos como la vid (Vitis vinifera). En este momento hay diferentes procesos
experimentales en desarrollo con el fin de determinar si el uso en el medio
natural de concentraciones muy bajas de este producto antifúngico, siempre
controlando sus niveles de bioacumulación, puede llegar a eliminar a Bd del
medio, limpiando así a las poblaciones de anfibios presentes en un
determinado hábitat sin alterar las relaciones interespecíficas o el correcto
funcionamiento de los ecosistemas. De estas tres líneas de investigación, la
relacionada con el uso del tebuconazol está, hoy en día, siendo testada en el
medio natural ofreciendo unos resultados muy esperanzadores (J. Bosch pers.
comun). Con lo que, aún faltando todavía por conocer algunos aspectos de
diversa índole que afectarían a su implementación como tratamiento de la
enfermedad en el medio, podría llegar a formar parte de nuevas medidas de
mitigación de la quitridiomicosis en un futuro no muy lejano.

199
 Capítulo 7

La presente tesis doctoral representa una pequeña aportación al ingente

trabajo científico desarrollado por múltiples equipos de investigación a lo largo
de las últimas décadas, que ha logrado gracias a la inversión de una gran
cantidad de recursos, tiempo y esfuerzo, revelar elementos hasta hace poco
desconocidos de la quitridiomicosis, como el agente patógeno causante de la
enfermedad, los efectos que tiene sobre los hospedadores anfibios y sus
defensas, o los factores tanto bióticos como abióticos que influyen en su
transmisión y su fisiopatología. Queda no obstante un largo camino por
recorrer y muchas incógnitas por desvelar que atañen a la inmunidad que
presentan las distintas especies de anfibios frente al hongo quitridio, a nuevos
tratamientos más efectivos y seguros, y sobre todo, al desarrollo y la
implementación de medidas de mitigación sobre el terreno que sean realmente
transferibles, y ofrezcan resultados duraderos o incluso permanentes. Estas
serán sin duda, algunas de las lineas de investigación en las que habrá que
ahondar en el futuro.

200
Discusión Integradora

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Discusión Integradora

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 Capítulo 7

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Discusión Integradora

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 Capítulo 7

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Discusión Integradora

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207
208
CONCLUSIONES / CONCLUSIONS

209
 CONCLUSIONES

1. El hongo quitridio Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) es capaz de influir

negativamente en el sistema inmune adquirido de sus hospedadores anfibios. Los
inmunosuprime al infectarlos durante su desarrollo larvario y, reduce los niveles de
inmunoglobulinas (IgM e IgY) circulantes en sangre, una vez que éstos han
completado la metamorfosis. Esta supresión del sistema inmune adaptativo, podría
explicar en parte la variable susceptibilidad de las distintas especies de anfibio
frente a la acción del patógeno fúngico. Las especies de anfibios que carezcan de un
sistema inmune innato robusto y eficiente, podrían sufrir más los efectos de Bd.

2. La eficacia del tratamiento de la enfermedad difiere según el estado de

desarrollo del hospedador a tratar, y la cepa del hongo quitridio frente a la que se
esté aplicando el tratamiento. La cepa hipervirulenta BdGPL, extendida globalmente
y que afecta a la mayoría de especies de anfibios del planeta, es también la más
resistente ante los tratamientos antifúngicos.

3. El uso del metil tiofanato, y sobre todo del itraconazol, para tratar la
enfermedad en los estadíos larvarios está desaconsejado, debido a los altos niveles
de toxicidad que presentan, y a su baja efectividad a la hora de eliminar al patógeno,
bien sea en solitario o combinando ambos productos. Es necesario continuar con la
búsqueda de protocolos terapéuticos seguros, eficaces, y que puedan ser aplicados
en todas las diferentes fases de desarrollo anfibio.

4. El hongo quitridio Bd posee la capacidad de alterar la fisiología térmica de

su hospedador reduciendo su umbral térmico máximo (CTmax). Esta reducción del
CTmax anfibio puede resultar en una mayor vulnerabilidad de las especies de
anfibios ante el actual escenario de cambio climático. Algo que dejaría a los anfibios

210
más expuestos a sufrir estrés térmico y en consecuencia, aumentaría su
susceptibilidad a padecer diversas enfermedades.

5. Debido a la imparable diseminación del patógeno, es absolutamente

imprescindible diseñar y poner en práctica estrategias de sencilla aplicación,
económicas, seguras, con capacidad de ser implementadas bajo condiciones
ambientales diversas y transferibles entre distintas especies, que consigan mitigar a
largo plazo los efectos de la enfermedad en el medio natural.

6. La acción combinada de una reducción poblacional del hospedador, y la

manipulación del hábitat a través del secado, sin el uso de desinfectantes, consigue
sólo un éxito temporal de varios años en la eliminación del patógeno del medio, y
una disminución significativa de la prevalencia y la carga fúngicas.

7. Alcanzar la completa y permanente erradicación del patógeno fúngico del

medio es un reto de muy difícil consecución. Si esto no fuese posible, se debe fijar
como objetivo reducir la abundancia de Bd por debajo de su umbral de carga letal, a
partir del cual aumenta exponencialmente la tasa de mortalidad que produce. Con
ello se mantendría a la enfermedad en niveles enzoóticos, y se ganaría tiempo para
implementar diferentes medidas de conservación con las que tratar de salvar a las
especies amenazadas.

8. La combinación de métodos de mitigación como pueden ser el tratamiento

con itraconazol de las formas larvarias, el vaciado de los puntos de agua, y la
desinfección del medio con productos químicos (Virkon S), logra la erradicación de
Bd del medio natural a largo plazo en medios de baja humedad ambiental y
comunidades de anfibios simples.

211
212
 CONCLUSIONS

1. The chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) has a

negative influence on the acquired immune system of its amphibian hosts.
This immunosuppression occurs once it infects them during their larval
development, by reducing the blood circulating levels of the amphibian host’s
immunoglobulins (IgM and IgY) after they have completed metamorphosis.
This acquired immune system immunosuppression could partially explain the
different susceptibility shown by amphibian species against the fungal
pathogen. Those species lacking an efficient and robust innate immune system
would be more prone to suffer the negative effects of Bd.

2. The efficiency of treatment against the disease differs depending on

the developmental stage of the host and the fungal strain you are dealing with.
The hypervirulent BdGPL, which is widespread globally and affects the vast
majority of amphibian species, is also more resistant to antifungal treatments.

3. The use of thiophanate-methyl and specially itraconazole, is not

recommended for disease treatment in larval stages, due to their high toxicity
levels and their low efficacy in cleaning the host from the pathogen, both in
single or in combined application. A search for safe and efficient treatment
protocols that could be applied in all the different amphibian developmental
stages is still needed.

4. The chytrid fungus Bd is able to alter the thermal physiology of its

hosts, reducing their critical thermal maximum (CTmax). This reduction of the
amphibian CTmax could render amphibian species more vulnerable to the
current climate change scenario. Something that would leave amphibians

213
more exposed to suffer from thermal stress, and increase their susceptibility to
different infectious diseases.

5. The unstoppable spread of the pathogen has conferred a crucial

importance to the design and in situ application of feasible, cost-effective, safe,
and transferable between different species and conditions mitigation
strategies, in order to achieve long-term environmental pathogen eradication.

6. Reduction in host population density and severe habitat manipulation

such as drying amphibian natural breeding points achieved only temporal
success. Through the combination of these two mitigation strategies, without
using chemical disinfectants, the pathogen was eradicated for years from the
natural environment and its prevalence and fungal loads were significantly
reduced.

7. Complete and permanent eradication of the pathogen from the natural

environment is a truly difficult challenge. Providing this is not possible, we
should aim at reducing Bd abundance below its lethal threshold, a point from
which amphibian mortality rate experiences a sheer increase. Thus,
maintaining the disease in its enzootic stage and gaining some extra time to
implement other conservation measures in order to try to save threatened
amphibian species.

8. Combination of mitigation methods such as larval itraconazole

antifungal treatments, emptying breeding ponds and environmental chemical
disinfection with Virkon S, achieves long-term eradication of Bd from the
natural environment in low humidity conditions and single amphibian host
systems.

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 Foto: Andrés Fernández Loras

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