Universitas Odontológica

ISSN: 0120-4319
revistascientificasjaveriana@[Link]
Pontificia Universidad Javeriana
Colombia

Olávez, Daniela; Salmen, Siham; Padrón, Karla; Lobo, Carmine; Díaz, Nancy; Berrueta,
Lisbeth; Solórzano, Eduvigis
Aislamiento y cultivo de células madre posnatales de dientes primarios
Universitas Odontológica, vol. 33, núm. 70, enero-junio, 2014, pp. 187-193
Pontificia Universidad Javeriana
Bogotá, Colombia

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 Aislamiento y cultivo de células madre
posnatales de dientes primarios
Isolation and Culture of Postnatal Stem Cells from Deciduous Teeth
187

CIENCIAS BÁSICAS, BIOTECNOLOGÍA Y BIOINFORMÁTICA

Univ Odontol. 2014 Ene-Jun; 33(70): 187-193. ISSN 0120-4319
Daniela Olávez RESUMEN
Odontóloga, profesora asistente, Antecedentes: Las enfermedades degenerativas representan en la actualidad un problema
Cátedra de Histología, Facultad de de salud pública; de ahí que el desarrollo y aplicación de estrategias que permitan restituir
Odontología, Universidad de Los parcial o totalmente los tejidos afectados tenga un especial interés en el campo biomédico.
Andes, Mérida, Venezuela. Una de las estrategias terapéuticas se basa en el uso de células madre estromales, en
particular las provenientes de la pulpa dental. Propósito: Desarrollar un cultivo de células
Siham Salmen madre estromales a partir de pulpa dental de dientes primarios. Métodos: Se incluyó el
Médico, magíster en Ciencias, aislamiento de células madre estromales de la pulpa dental de dos caninos deciduos ex-
PhD, profesor titular, Instituto de traídos con indicaciones terapéuticas y cultivo en medio D-MEM con SFB al 20 % a 37oC, y
Inmunología Clínica, Facultad de 5% CO2, realizando cambios de medio de cultivo cada 3 días y observando cada 7 días. La
Medicina, Universidad de Los Andes, confluencia del 80-90 % se logró luego de tres semanas. Se realizó la tinción con DAPI y
Mérida, Venezuela. STRO-1 y análisis mediante citometría de flujo y microscopia de fluorescencia. Resultados:
Los análisis muestran células adherentes purificadas con morfología fusiforme similar a
Karla Padrón fibroblastos y aparición de conglomerados semejantes a unidades formadoras de colonias
Odontóloga, profesora asistente, (UFC). El total de la población mostró un 17 % de positividad al STRO-1, mientras que la
Cátedra de Histología, Facultad de población de mayor tamaño y más compleja mostró una positividad del 26 %. Asimismo,
Odontología, Universidad de Los STRO-1 se localizó preferencialmente en las UFC. Conclusiones: Con el protocolo descri-
Andes, Mérida, Venezuela. to se logró un cultivo de células madre estromales extraídas de pulpa dental en dientes
primarios, como punto de partida para futuros ensayos terapéuticos y su aplicación en la
Carmine Lobo regeneración tisular.
Odontólogo, Cátedra de Ortodoncia,
Facultad de Odontología, Universidad PALABRAS CLAVE
de Los Andes, Mérida, Venezuela. células cultivadas; células madre; diente primario

Nancy Díaz ÁREAS TEMÁTICAS

Odontóloga, magistra en Ciencias. ingeniería de los tejidos; cultivo de células
PhD, Universidad Autónoma de
Barcelona, España. Profesora titular, ABSTRACT
cátedra de Anatomía Humana, Background: Currently, degenerative diseases represent a public health problem; therefore,
Facultad de Odontología, Universidad the development and implementation of strategies to fully or partially recover of dama-
de Los Andes, Mérida, Venezuela. ged tissues has a special interest in the biomedical field. Therapeutic strategies based
on mesenchymal stem cells transplantation from dental pulp have been proposed as an
Lisbeth Berrueta alternative. Purpose: To develop a mesenchymal stem cells culture isolated from dental
Médica, magistra en Ciencias, pulp of deciduous teeth. Methods: The mesenchymal stem cells isolation was performed
PhD, profesora titular, Instituto de from dental pulp of two deciduous canines, freshly extracted with therapeutic indication.
Inmunología Clínica, Facultad de Specimens were cultured in D-MEM medium with 20% FBS at 37 °C and 5% CO2. The medium
Medicina, Universidad de Los Andes, was changed every three days. 80-90% confluence was achieved after three weeks. Cells
Mérida, Venezuela. were stained with DAPI and STRO-1 and analyzed through flow cytometry and fluorescence
microscopy. Results: The analysis showed that adherent cells had a fusiform fibroblast-like
Eduvigis Solórzano morphology and colony forming units (CFUs) were observed. 17% of the whole population
Odontóloga, magistra en Ciencias. was STRO-1+ and 26% of the larger and more complex population was positive to this
PhD, Universidad Autónoma de antigen. Additionally, STRO-1+ cells were localized preferential in UFCs. Conclusions: The
Barcelona, España. Profesora titular, protocol described here could be used to enriching mesenchymal stem cells from dental
cátedra de Histología, Facultad de pulp extracted from deciduous teeth and as a starting point for future therapeutic trials and
Odontología, Universidad de Los their application in tissue regeneration.
Andes, Mérida, Venezuela.
KEYWORDS
cultured cells; stem cells; deciduous teeth

THEMATIC FIELDS
cell culture; tissue engineering
doi:10.11144/[Link]

CÓMO CITAR ESTE ARTÍCULO

Olávez D, Salmen S, Padrón K, Lobo C, Díaz N,
Berrueta L, Solórzano E. Aislamiento y cultivo de
células madre posnatales de dientes primarios.
Univ Odontol. 2014 Ene-Jun; 33(70): 187-193.
[Link]
accm

Recibido para publicación: 15/07/2013

Aceptado para publicación: 30/01/2014

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universitasodontologica
 INTRODUCCIÓN Las MSC posnatales provenientes de la pulpa dental
se consideran actualmente las células de mayor
Son muchos los esfuerzos que se han realizado en el plasticidad y capacidad reproductiva. Por ello, exis-
ámbito científico para constatar el beneficio que las te gran interés en aislarlas y caracterizarlas (9).
células madre pueden tener en los procedimientos Estas células son adherentes, fusiformes y morfo-
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de regeneración de tejidos lesionados, con el fin de lógicamente similares a los fibroblastos y se carac-
aplicarlas en el tratamiento de patologías incurables. terizan fenotípicamente por expresar cualquiera de
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En el caso específico de las enfermedades degenera- los marcadores CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 y
tivas, usualmente asociadas con lesiones traumáticas, STRO-1 (10,11).
envejecimiento, defectos génicos e incluso estilos de
vida, y que en la actualidad representan un problema El STRO-1 ha sido utilizado en varios estudios para
de salud pública, la utilización de células madre ha identificar MSC in vitro de pulpa dental (12,13). Se
generado esperanzas tanto en quienes se dedican a describe como un antígeno de superficie que se
su manejo como en aquellos que la padecen. Gracias expresa inicialmente con mayor intensidad en las
a los recientes avances tecnológicos de la biología unidades formadoras de colonias (UFC) o nichos
molecular y celular, aunado a los nuevos enfoques (13) que, por lo general, se presenta en los pasajes
terapéuticos de la medicina regenerativa y los proce- iniciales. Incluso, se ha determinado que el STRO-1 se
dimientos de bioingeniería tisular, han cambiado los expresa en mayor proporción en cultivos de células
protocolos de tratamiento para un número importante de pulpa dental de dientes deciduos en presencia de
de entidades patológicas y han aumentado la espe- UFC y su expresión disminuye en cultivos de varios
ranza de vida de muchas personas (1). pasajes (14).

Una célula madre es aquella que aun no teniendo Las MSC provenientes de la pulpa dental han mos-
ninguna morfología de tejido específico, se renueva trado la capacidad de diferenciarse en osteoblastos,
durante largos periodos por división celular (2). Al di- adipocitos y células neuronales (12), así como mio-
ferenciarse, puede desarrollar funciones especializa- cardiocitos (15). Ello indica su uso potencial en el
das que constituyen un enorme potencial terapéutico tratamiento de diversas enfermedades degenerativas
por sus aplicaciones en la regeneración de tejidos da- (12,16-18), tanto bucales como sistémicas. Sobre la
ñados y en el restablecimiento fisiológico. Las células base de lo expuesto, en este trabajo se muestra un
madre son, por lo tanto, células indiferenciadas, in- protocolo para aislar y cultivar MSC posnatales a par-
maduras, autorrenovables y competentes para gene- tir de pulpa dental de dientes deciduos para su uso
rar uno o más tipos de líneas celulares diferenciadas potencial en terapias regenerativas.
(3). Las células madre estromales o MSC (por su sigla
en inglés Mesenchymal Stem Cells o Mesenchymal
Stromal Cells) son células de tipo pluripotenciales MATERIALES Y MÉTODOS
que tienen la capacidad de diferenciarse en diversos
tipos de células, tanto in vivo como in vitro y, desde En este estudio experimental se utilizó una muestra
el punto de vista embrionario, se originan de la capa proveniente de tejido pulpar de dos caninos deciduos
germinal mesodérmica (4). sanos con ápices cerrados, extraídos por razones
ortodónticas a una paciente de 9 años de edad. Los
Así, las MSC aisladas de la pulpa dental (5-7) pueden, especímenes se obtuvieron previa autorización por
bajo diferentes condiciones, diferenciarse para formar parte de la paciente y su acudiente por medio de la
tejido mineral equivalente a la dentina u otros tejidos firma de un consentimiento informado, para lo cual se
mineralizados como hueso y cemento radicular. La siguieron los lineamentos descritos en la Declaración
gran capacidad de diferenciación y regeneración de de Helsinki de 2008. El trabajo de laboratorio para la
estas células ha llamado la atención de muchos in- obtención y cultivo de las células se basó en los pro-
vestigadores, ya que su obtención no genera ningún tocolos de Magallanes y colaboradores (6) y Padrón y
perjuicio al paciente donante (8), como es el caso de colaboradores (19), que se ajustaron para permitir su
la pulpa sana de terceros molares incluidos o dientes estandarización.
primarios. El uso de estas fuentes de MSC posnatales
respetan principios bioéticos de investigación y cui- Obtención de la muestra y separación celular
dado de la salud. Inmediatamente después de las exodoncias, los ca-
ninos se lavaron con solución fisiológica y se colo-
caron en un tubo estéril de 15 ml que contenía medio ylindol (DAPI) (Molecular Probes). Para ello, las células
de cultivo Eagle modificado por Dulbeco (D-MEM). crecidas en las laminillas cubreobjetos se fijaron con
Bajo cámara de flujo laminar y empleando una pieza metanol a –20 ºC durante 10 min, se lavaron una vez
de mano de baja velocidad y un disco con borde de con solución amortiguadora de fosfato (PBS) y 3 veces
diamante (20), se realizó un corte transversal a ±2 con PBS gelatina, para luego incubarlas con anti-STRO-
189
mm del ápice, con la finalidad de acceder a los con- 1-PE, diluido (1:10) en cámara húmeda durante 30 min
ductos radiculares y extraer en una sola intención los en total oscuridad. Las células se lavaron 3 veces con

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filetes pulpares completos por medio de una sonda PBS gelatina y se les agregó DAPI (1 μg/ml) para teñir
barbada estéril N.º 20. Los filetes pulpares recién ex- los núcleos celulares. Se montaron las laminillas en
traídos se colocaron en una caja de Petri estéril con presencia de glicerol, se sellaron y se observaron al
medio D-MEM suplementado con aminoácidos no microscopio de fluorescencia (Leica® modelo DMR).
esenciales, piruvato de sodio, vitaminas, penicilina y Las observaciones se documentaron y analizaron
estreptomicina y enriquecido con suero fetal bovino mediante el programa ImageJ (National Institutes of
(SFB) al 20 %. Se cortó luego el tejido en pequeñas Health, Estados Unidos).
porciones de aproximadamente 2 mm2 con un bisturí
hoja N.º 12 y se homogeneizó empleando el émbolo De igual manera, se evaluaron las MSC de acuerdo
de una jeringa. con su tamaño, complejidad de su estructura interna
y porcentaje de expresión del antígeno STRO-1-PE,
Acto seguido, se resuspendió el tejido en un tubo de mediante citometría de flujo. Para ello se colocaron
15 ml con medio D-MEM y se centrifugó a 2000 rpm 500 × 105 cel/ml de la suspensión celular en tres
durante 5 min a 4 oC, para luego descartar el sobre- tubos estériles de 15 ml para fijarlo con paraformal-
nadante y lograr la disgregación celular mediante el dehido (PAF) al 3 % a temperatura ambiente durante
tratamiento con 2 ml de tripsina/EDTA durante 10 min 10 min. Acto seguido, se centrifugaron los tubos durante
a 37 oC. Luego de 3 lavados, las células se resuspendie- 5 min a 2000 rpm. Una de las muestras fue sometida
ron en D-MEM suplementado con SFB al 20 %. La via- a permeabilización, con el fin de detectar la expresión
bilidad celular se determinó inmediatamente después intra y extracelular, con saponina al 0,1 % por 20 min.
de obtener el cultivo diluyendo la suspensión celular Las muestras se centrifugaron y se marcaron con el
1:100 con azul de tripán, y evaluadas mediante el uso anticuerpo monoclonal STRO-1-PE (1:10), se incuba-
de una cámara de Neubauer para contabilizar a través ron durante 30 min y se lavaron 3 veces. Se marcó un
de la observación al microscopio de luz. tercer tubo con isotipo de IgG como control negati-
vo. Finalmente, las muestras se llevaron al citómetro
Cultivo celular FacSortBecton Dickinson® para su captura y análisis
La suspensión celular se llevó a una placa de cultivo mediante el programa CellQuest (B&D, CA).
e incubación en estufa Nuaire ®
a 37 C con humedad
o

relativa al 5 % de CO2. Se realizaban cambios de medio

cada 3 días para garantizar el crecimiento celular y se RESULTADOS
valoraban semanalmente la confluencia y la ausencia
de contaminación bacteriana o fúngica por medio de Los filetes pulpares aislados pasaron por proceso de
microscopio de fase invertida. Pasadas 3 semanas, disgregación enzimática para ser llevados a las placas
luego de alcanzar la confluencia de la placa de cultivo, de cultivo. La viabilidad celular, realizada mediante el
se sembraron las células sobre láminas cubreobje- ensayo con la coloración supravital con azul de tripán
tos previamente esterilizadas con luz ultravioleta, las fue del 95 % y el conteo total de células aisladas fue
cuales se colocaron en la placa con medio D-MEM y de 5 × 105 cel/ml. Las células fueron sembradas
se llevaron nuevamente a la incubadora para su alma- en un pozo de fondo plano de 75 cm² de superficie
cenamiento; esto, con el fin de hacer una evaluación y se evaluaron mediante un microscopio óptico de
mediante inmunofluorescencia. fase invertida con una magnificación de 10X. En la
figura 1a se evidencian elementos celulares aislados
redondeados, con bordes irregulares y de pequeño
Inmunofluorescencia tamaño al día 0 de cultivo. Posteriormente, a los 3
En la quinta semana de cultivo se realizó el marcaje días de cultivo, se comenzaron a visualizar cambios
celular por medio de un anticuerpo específico para morfológicos en los que se notaron elementos celu-
MSC humanas acoplado a ficoeritrina (STRO-1-PE) lares fusiformes, alargados, mononucleados similares
(Santa Cruz Biotechnology) y 4’,6-diamidino-2-phen- a fibroblastos (figura 1b). Luego de 14 días de incu-
 Figura 1.
Microfotografía al microscopio óptico de fase invertida de la cinética de crecimiento del cultivo celular.
1a: aspecto inicial de las células en cultivo donde se observan elementos celulares redondeados (flechas).
1b: cultivo celular después de 3 días donde se observan células con morfología fusiforme (flechas).
1c: cultivo celular después de 14 días donde se muestran las células distribuidas en monocapa.
190
1d: cultivo celular después de 21 días donde se evidencian las unidades formadoras de colonias (flechas)
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bación, tiempo durante el cual se cambió el medio 18 % para las permeabilizadas. Asimismo, se obtuvo
regularmente, fue posible separar células adherentes una media de intensidad de fluorescencia (MIF) de 546
de las no adherentes y de esta manera se logró un para las células no permeabilizadas y de 642 para las
cultivo en monocapa de células adherentes (figura 1c), permeabilizadas (figuras 2a-2d). Se detectó, además,
que se hicieron 80 % confluentes a partir del día 21; que una población de mayor tamaño y discretamente
en algunos campos también se evidenciaron cúmulos más compleja expresó mayor porcentaje de STRO-1
celulares semejantes a UFC (figura 1d). (26 %) (figuras 2e-2h).

Una vez alcanzada la confluencia del 80 %, se trataron En la figura 3 se observa la tinción y distribución del
las células con tripsina/EDTA, con el fin de sembrarlas antígeno STRO-1. La figura 3a muestra el isotipo para
en laminillas cubreobjeto y teñirlas en suspensión, STRO-1 como control negativo. Las figuras 3b y 3c
para su análisis por microscopia de fluorescencia y ejemplifican las células marcadas con el anticuerpo
citometría de flujo, respectivamente. Ambos análisis STRO-1. Las figuras 3d y 3f muestran las células teñi-
se realizaron a la quinta semana después de su pu- das con DAPI y las figuras 3g y 3i evidencian, luego de
rificación. Para ello, se utilizó el marcador específico realizar el solapamiento de los fluorocromos STRO-1
STRO-1PE para evaluar el porcentaje de MSC positivas y DAPI, cómo las células positivas para STRO-1 se
a este marcador presentes en cultivo. El análisis por ubican preferencialmente cerca de los acúmulos ce-
citometría de flujo evidencia que el porcentaje del lulares UFC.
total de la población estudiada positiva a STRO-1 fue
del 16,59 % para las células no permeabilizadas, y del
 Figura 2
Análisis por citometría de flujo

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Figura 3
Microfotografía al microscopio óptico de fluorescencia de la distribución y tinción del antígeno STRO-1
y DAPI. 3a: isotipo para STRO-1; 3b y 3c: células marcadas con STRO-1. 3d-3f: células teñidas con DAPI.
3g-3i: colocalización de los 2 fluorocromos
 DISCUSIÓN latinoamericanos. Una de las modificaciones que se
consideraron fue utilizar SFB al 20 %. En la literatura
El desarrollo de la medicina regenerativa enfocada se puede observar como norma que con mayores
en la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas, concentraciones de SFB, hasta incluso al 50 %, se in-
para el manejo de enfermedades degenerativas, ha crementa la eficiencia del crecimiento celular (23). No
192
contribuido al desarrollo de técnicas de biología ce- obstante, la mayoría de las células de la muestra, al
lular dirigidas al cultivo in vitro de diferentes linajes utilizar SFB al 20 %, exhibieron una morfología similar
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celulares que preservan al máximo sus propiedades a la de los fibroblastos con capacidad de proliferación
fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Ello tiene como y generaron pequeñas colonias o UFC, comporta-
finalidad estudiar los procesos intra y extracelulares, miento que es similar a reportes previos que utilizan
para su aplicación terapéutica. Por esto, es de gran otras concentraciones del suero (24).
interés para la comunidad científica obtener, cultivar
y trasplantar MSC adultas (4), con el fin de que pue- Las MSC expresan varios marcadores que las identifi-
dan diferenciarse con alta probabilidad de regenerar can. Dentro de ellos se destacan CD90, CD44 y STRO-1
aquellas células o tejidos perdidos y sin los conflictos (25). En el caso de STRO-1 (24,26,27), la literatura indi-
éticos que ha generado el uso de las células madre ca que está presente en las células frescas aisladas de
embrionarias. la pulpa, pero también queda claro que se va perdiendo
tras los pases a los que se someten estas células en
Un tejido de interés odontológico rico en células madre cultivo in vitro. En este caso se utilizó el STRO-1, que se
estromales adultas es la pulpa dental. En la literatura evidenció en aproximadamente el 20 % de la población,
se han definido diversos protocolos para su obtención que se considera representativo y que es incluso mayor
y cultivos in vitro, a partir de tejido pulpar de terceros a lo reportado por otros autores (27). Asimismo, la
molares impactados y de dientes deciduos (2,12). Las distribución del marcador predominó en las áreas don-
células obtenidas de esta última fuente (dientes de- de se observaron acúmulos celulares similares a UFC
ciduos) son más accesibles, altamente proliferativas (13,14). Se ha comprobado que las células positivas de
y fáciles de aislar y preservar (12). Además, debido STRO-1 muestran una elevada capacidad de generar
a su origen embrionario de la cresta neural craneal, UFC (11), lo que apoya nuestros hallazgos.
son capaces de expresar marcadores en su superficie
que les permiten no solo diferenciarse en células de la
pulpa dental, hueso y dentina, sino también en células CONCLUSIONES
musculares, nerviosas y adipocitos (5,21-23).
El protocolo utilizado en este estudio mostró un culti-
Por eso, en este trabajo se propuso obtener células vo in vitro de células confluentes y viables que expre-
indiferenciadas a partir de pulpa de dientes primarios san en su superficie el marcador de MSC STRO-1, de
sanos con indicación de extracción controlada con particular localización en las UFC generadas durante
fines ortodónticos. Esta condición es considerada in- su crecimiento, obtenidas a partir de pulpa de dientes
dispensable, ya que se requieren más de dos tercios primarios sanos. Dadas las limitaciones expuestas
de raíz para obtener suficiente tejido pulpar. En este en esta investigación (de infraestructura, económi-
sentido, se aplicó una técnica similar a la apicectomía cas y disponibilidad para adquirir otros anticuerpos
para obtenerlo. Se cortaron 2 mm de la porción apical específicos), se sugiere reproducirlo utilizando otros
radicular con el uso de un disco de borde diamantado marcadores de superficie.
y una pieza de mano de baja velocidad y se introdujo
una sonda barbada desde el ápice para extraer en una
sola acción los filetes pulpares. Se evitaban así lacera- AGRADECIMIENTOS
ciones y —quizás lo más importante— contaminación
por parte del operador. Al Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico, Tec-
nológico y de las Artes (CDCHTA) de la Universidad
El protocolo de cultivo que se propone aquí se basó en de Los Andes, Mérida-Venezuela, por el financiamiento
los descritos anteriormente por otros autores (6,19) otorgado bajo el código O-266-11-07-C.
e incluye ciertas modificaciones que permitieron es-
tandarizar un procedimiento sencillo y adaptado a
las condiciones de infraestructura y económicas en
las cuales se hace investigación en muchos países
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