Enzimología clínica.

Definición.

Las manos del metabolismo, como se ha denominado a las enzimas, son

catalizadores biológicos de naturaleza protéica (polímeros de aminoácidos,
aa) con un peso molecular que oscila entre 1300 y 500 000 dalton, D. (Un
D equivale a la 1/12 parte de la masa de un átomo de carbono-12).

Se conocen cientos de enzimas, se dice que unas 8000, de las más

diversas naturalezas y ubicaciones. Así, pueden estar:

1. Adheridas a paredes y membranas celulares.

2. En fase líquida, en el citoplasma celular o en el líquido extracelular
(LEC)
3. Secuestradas intranuclearmente o en otros orgánulos celulares como
mitocondrias y lisosomas.

Identificar el incremento de la actividad de una o varias enzimas es, muy

frecuentemente, indicador de daño tisular, refiriéndonos al origen de dichas
enzimas en los mismos. En estos tejidos (fuentes de la enzima), están
separadas del LEC por las membranas, fenómeno conocido como
compartimentalización. Esta garantiza que las variantes de la enzima
operen, fundamentalmente, dentro del tejido fuente pero con presencia de
actividad plasmática mínima.

La cantidad de las enzimas en el plasma es siempre pequeña y no se

conoce con exactitud qué papel que juegan estas proteínas en dicho lugar.
Parecen jugar alguna función específica, pero la mayoría, está probado,
cataliza alguna reacción intracelular o es vertida por glándulas especiales a
la luz de ciertos órganos en forma inactiva dónde son activadas bajo ciertas
condiciones, como el caso de las enzimas digestivas.

Estructura y composición enzimática.

Como las demás proteínas, están compuestas por aminoácidos

polimerizados entre mediante el enlace peptídico, de lo cual se deduce que
los elementos presentes sean C, H, O, N y otros más escasos como S, Fe,
etc. De esto se deduce que la hidrólisis con ácidos fuertes rinde aminoácidos
libres y péptidos diversos.

Las propiedades catalíticas de las enzimas dependen de los niveles de

organización de una proteína y del grado de complejidad que estos
alcancen. Recordemos que cualquier polímero prótido debe tener estructura
primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria.

Los cambios en la secuencia aminoacídica de una enzima en particular

originan modificaciones en la estructura secundaria y subsiguientes

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produciendo un nivel de organización superior que afectará la actividad
catalítica llegando a disminuirla o abolirla.

Estructura general de las enzimas.

Toda la enzima se denomina holoenzima, con dos partes: una protéica,

apoenzima y otra no protéica, grupo prostético o cofactor.

Cuando la parte no protéica no es imprescindible para el despliegue de la

actividad catalítica se le denomina cofactor. Este puede estar vinculado a la
enzima de forma laxa o de forma estrecha o estricta.

Cofactores laxos. Coenzimas y activadores.

Pueden separarse de la enzima mediantes diálisis, son materiales de

naturaleza orgánica y no protéicos como el dinucleótido fosfato de
nicotinamina (NADP+) y el fosfato de piridoxal. Se les denomina
coenzimas.

Pueden ser de naturaleza iónica como el Cl - y Mg 2+

. Entonces se los
denomina activadores.

El término coenzima es ampliamente usado cuando el producto participa en

la reacción como uno de los reactantes imprescindibles, dadores o aceptores
de equivalentes de reducción, como lo que ocurre en la reacción de la LDH
(o LD) que convierte al lactato en piruvato (y viceversa) en proporciones
equimolares. Se ha sugerido denominarles segundo subtrato o co-
substrato.

Cuando los cofactores de este tipo poder ser retirados del sistema sin que
desaparezca totalmente la actividad enzimática suelen ser llamados
apoenzima.

Cofactores estrictos o unidos.

Son sustancias que forman parte de la estructura protéica pero no son

proteínas o péptidos en sí mismas. Se conocen como grupos protéticos.

Un ejemplo muy conocido es el grupo hem de las peroxidasas (carbonato

deshidratasa). En las metaloenzimas, iones como el Cu ++ (ferroxidasa) o el
Zn++ de la anhidrasa carbónica.

En los ensayos enzimáticos in vitro, las mezclas o tampones de trabajo

deberán contener los activadores y cofactores en exceso con el simple
propósito de garantizar que la actividad medida sea la actividad
holoenzimática.

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Catalizadores.

Son sustancias que aceleran la velocidad de una reacción. Eso es lo que

hacen las enzimas en las reacciones específicas en las que participan sin
consumirse en el proceso.

Sustrato.

El sustrato es el objeto de la reacción enzimática (S). Este sí es modificado

por la acción de la enzima después de unirse brevemente a su estructura
en un complejo conocido como complejo enzima-sustrato (ES). Luego de
un tiempo, que varía según la reacción, los integrantes del complejo ES se
separan en sus integrantes, regenerándose la enzima y el S convertido en
productos, P.

Las reacciones de esta naturaleza son generalmente reversibles y progresan

en un sentido o en otro según la ley de acción de las masas o hasta
alcanzar el estado de equilibrio. In vitro, se pueden modificar las
condiciones para que la reacción se detenga cuando el sustrato ha rendido
el producto. Esto es usado para estimar la cantidad de la enzima presente
en la muestra según su actividad en el sistema (actividad enzimática).

Propiedades de las enzimas.

Son catalizadores biológicos, fáciles de destruir. Son efectivos en pequeñas

concentraciones, no cambian durante la reacción, aceleran la velocidad de
la reacción, poseen un elevado grado de especificidad catalítica y, al
alcanzar el estado de equilibrio de la reacción, no modifican las
concentraciones de los reactantes o de los productos.

De estas propiedades, la elevada especificidad convierte a las enzimas en

herramientas invaluables en diversos ámbitos, especialmente desde el
punto de vista del diagnóstico clínico. Sus infinitésimas concentraciones
propician el uso de la actividad de las enzimas como analitos de buena
sensibilidad para vigilar cambios patológicos en los tejidos fuente.

Sitio activo.

La función de la enzima es disminuir la energía de activación de los

reactantes para que puedan convertirse en productos. De otra manera la
reacción puede transcurrir pero de forma muy lenta.

El cambio de energía libre (ΔG) es una medida de la cantidad de trabajo

producido en cualquier reacción química. Todas ellas evolucionan de modo
tal que los productos se generan con un cambio neto de energía libre
negativo (-ΔG). Pero los reactantes deben absorber energía para para a un
estado activado o de transición y así llegar a ser productos. Sin la presencia
de enzimas, este cambio es inapreciable, aun cuando los productos posean
una ΔG menor que la de los sustratos. Los reactantes deben obtener E para

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sobrepasar la barrera de la energía de activación y entrar en el estado de
transición para pasar a ser productos. De otro modo será necesario añadir
calor suficiente o energía de activación al sistema. El papel de las enzimas
es reducir la energía de activación para que los reactantes sobrepasen la
barrera de una elevada energía de activación en las condiciones del
protoplasma.

El fenómeno catalítico ocurre en un número limitado de sitios de la

superficie de la molécula enzimática, los sitios activos (SA). Estos incluyen
unos 5 a 10 aminoácidos donde se ancla el sustrato y se rompen o arman
nuevos enlaces. Este debilitamiento de enlaces es lo que posibilita la
disminución de la energía de activación para que la reacción transcurra y se
formen los nuevos enlaces del compuesto producto. Para entonces la
afinidad de este ya no es la misma que en el momento de la formación del
complejo ES y se desprende de la enzima nativa.

Se piensa que los SA contienen aminoácidos portadores de cadenas

laterales reactivas con abundantes grupos amino y carboxilo cargados. Son
abundantes en tales cadenas aa como el aspartato, glutamato, arginina e
histidina. Otras porciones no cargadas participan con grupos hidroxilos y
sulfidrilos comunes en la serina, tirosina y cisteína. Pueden, además, poseer
anillos nitrogenados en la estructura, como el caso de la histidina.

Se cree que estos aminoácidos se unen a las partes interesadas del sustrato
mediante puentes de hidrógeno o enlaces iónicos.

El SA puede estar ubicado en la superficie de la molécula pero también

puede hallarse en lugares menos accesibles como pliegues y bolsillos
moleculares lo cual hace rechazar la rígida idea de la enzima interactuando
con el sustrato según el modelo la llave y la cerradura pues ya se sabe que,
de ser necesario, el SA se adapta a la forma del sustrato.

Sitios alostéricos.

El enzimas de elevada complejidad, las formadas por varias subunidades,

por ejemplo, existen sitios alejados de la secuencia primaria del sitio activo
y ellos afectan la actividad de la molécula en gran medida. Se conocen
como sitios alostéricos (SA) o reguladores. Son afectados por diversas
sustancias que son conocidas por su capacidad de inhibir la actividad los

Una característica de los sitios de unión (SU) es que la unión con el sustrato
se realiza con una determinada orientación de tal modo que es un enlace
particular el que es sometido a la acción o ataque enzimático. Durante la
unión ES se produce interacción entre grupos funcionales específicos de las
cadenas laterales de la enzima y los grupos funcionales del sustrato. Esto
ocurre de modo tal que algunos de sus enlaces covalentes se debilitan y eso
disminuye las necesidades energéticas de la reacción. El enlace debilitado
se rompe y se forma uno nuevo. Habiendo cambiado las cualidades físico-

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químicas del sistema, el producto no mantiene su afinidad original por el
sitio de unión y se desprende del complejo ES en forma de productos.

Cualquier cambio de la secuencia aminoacídica original de la estructura

primaria produce una enzima funcionalmente diferente, con SA y SU
diferentes. También puede producirse una proteína similar sin propiedades
catalíticas. Estos cambios son generados por mutaciones genéticas, causa
común de los errores congénitos del metabolismo y enfermedades genéticas
afines.

Factores que afectan los sitios activos.

 Secuencia aminoacídica primaria.

 Presencia de metales pesados.
 Detergentes.
 Otras áreas reactivas propias de la enzima.
 Agitación o cambios mecánicos.
 Cambios de tensión superficial.

Los mencionados factores alteran las relaciones de los aa reactivos y evitan

que se verifique la reacción originariamente codificada por el código
genético.

Especificidad de la reacción enzimática.

Esta propiedad de las enzimas está relacionada con las propiedades del sitio
activo y, de modo general, puede ser:

 Especificidad amplia.
 Especificidad para enlaces.
 Especificidad estereoisomérica.
 Enzimas muy específicas.

Enzimas de especificidad amplia son las que actúan sobre compuestos

relacionados químicamente como las fosfatasas. Otras han restringido este
espectro ancho como las peptidasas, que hidrolizan el enlace peptídico. Sin
son intracatenarios, son endopeptidasas (Pepsina A) y si están en los
extremos carboxiloterminal son exopeptidasas como la carboxipeptidasa,
que se mueve su acción desde el extremo carboxiloterminal hacia el centro
de la cadena. Las exopeptidasas son enzimas cuyo espectro de sustratos es
amplio.

Enzimas muy especifícas pueden tener un único sustrato como la

piruvatoquinasa, que actúa sobre el fosfoenolpiruvato aunque una acción
parcial puede ser evidente con algunos nucleósidos difosfatados y ADP.

Una enzima de especificidad intermedia puede ser la hexoquinasa que

actúa sobre la dextrosa, D-manosa, D-glucosamina y algunos nucleótidos
trifosfatados.

Estructura enzimática por subunidades.

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 Varios tipos de enzimas estructuralmente diferentes catalizan una misma
reacción. Tienen variaciones en su estructura protéica y glucídica y se
denominan isoenzimas. Ellas poseen diversas subunidades unidas entre sí.
Por si solas estas subunidades carecen de actividad catalítica pero si se
reasocian, dicha actividad reaparece. Habitualmente se encuentran en
órganos y tejidos específicos. En ocasiones son idénticas desde el punto de
visto protéico pero las distinguen sus componentes glucídicos.

Se clasifican según su movilidad electroforética. La que más rápidamente

migra hacia el ánodo es la isoenzima 1 (Iso 1). Ejemplos de enzimas con
Iso son CPK, LDH, ALP etc.

Las subunidades pueden ser A, B etc. Si son dos, A y B pueden asociarse

AB, AA y BB. Este es el caso de la CK o creatin-fosfo-quinasa cuyas
subunidades se denominan M y B según su origen. Sus permutaciones
originan las iso CK-MM, CK-BB y CK-MB. Generalmente una de ellas
predomina en el suero por proceder de una fuente más abundante, la CK-
MM en el ejemplo, que se origina en el músculo esquelético.

La utilidad clínica de las isonzimas se basa en el hecho de que esta

compartimentalización en ciertos tejidos ayuda a reconocer el tejido dañado
una vez que se identifica el aumento de la isoenzima específica.

Isoenzimas.

Estas pueden ser citoplasmáticas y mitocondriales y difieren entre si en

numerosos aspectos. Los más importantes son la estructura aminoacídica,
modificaciones posteriores a su síntesis, como la glicosilación o por acción
de proteasas séricas (isoformas). Estas diferencias les confieren variaciones
en la velocidad de la reacción que catalizan, afinidad de sustrato y
especificidad.

Síntesis y degradación.

Cuantificación de las enzimas. Actividad enzimática.

La dosificación de las enzimas no se utiliza en los mismos términos en los

que se cuantifican las globulinas, C3, albúmina u otra proteína en particular.
La pequeña concentración de las moléculas y la heterogeneidad estructural
y funcional de estas moléculas dificultan el procedimiento enfocado en
cantidad de sustancia o concentración de masa. Existen métodos para
determinar las enzimas por inmunoensayo o electroforesis pero los
resultados de esta metodología no son equivalentes entre sí por diversas
razones. Por ejemplo, la cantidad de la proteína puede ser normal pero la
actividad puede estas diezmada por la presencia de inhibidores, la acción de
las proteasas circulantes o debido a mutaciones puntuales por lo cual los

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mencionados métodos pueden arrojar resultados normales y dispares con
los de actividad.

Por ello es dosifica la actividad de las mismas. De ahí que es necesario

definir la Unidad Internacional (UI) de actividad enzimática que no es otra
cosa que la cantidad enzima que cataliza la conversión de un μmol de
sustrato en sus productos por minuto bajo condiciones del ensayo.
De ahí se asume que una cantidad de una enzima (un peso o masa de esta
enzima) posee un número fijo de unidades de actividad.

En base a las unidades internacionales utilizadas se creó la unidad katal

(kat) que es la cantidad de enzima que cataliza la conversión del sustrato
por segundo en las condiciones del análisis. Una UI es igual a 16.7 nkat.

A pesar de todo, en la práctica, medir la actividad enzimática es medir

concentración de sus moléculas. Pero hasta el momento no se ha logrado el
uno del kat debido a la falta de estandarización de muchas variables
involucradas en el asunto.

Síntesis y degradación.

Las enzimas se sintetizan siguiendo las mismas pautas de la síntesis de

cualquier proteína. El sitio primordial de esta síntesis es el interior de la
célula de los tejidos fuentes de dichas proteínas. De ellos estas pasan al LEC
como ocurre con las proteasas y los factores de la coagulación fabricados en
el hígado.

Debido a la complejidad estructural de las enzimas son muy lábiles, fáciles

de destruir y son numerosos los factores que atentan contra la integridad
molecular de dichos catalizadores. Ejemplos son los cambios de pH,
concentración de sales, temperatura y otros. Muchos de estos factores son
significativos in vitro pero también en el protoplasma mismo pueden
deteriorar la actividad de las enzimas. El subrayamiento de este punto es
importante, fundamentalmente, desde el punto de vista analítico, en
particular, en la fase preanalítica de la realización de cualquier prueba de
laboratorio que implique la determinación de actividad enzimática en
cualquier muestra.

Existen dos formas básicas de pérdida de la actividad de una enzima:

 Reversible y temporal.
 Irreversible o permanente.

Irreversible.

Desnaturalización por

1. Calor.

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 2. Ácidos o álcalis fuertes.
3. Altas presiones.
4. Luz ultravioleta.
5. Congelación y descongelación rápida.
6. Detergentes.
7. Solventes orgánicos.
8. Elevadas concentraciones de guanidina o urea.
9. Acción de metales pesados.
10. Competidor muy ávido por el sitio activo.

Reversible.

En este caso el proceso se denomina inactivación y, en general, se

refiere a procesos que acontecen in vitro cuando la enzima experimenta
exposición a temperatura ambiente por largos períodos de tiempo y pierde
parcialmente su actividad.

La inactivación se debe a la inestabilidad de los puentes de hidrógeno a

causa del calor o por la oxidación de grupos sulfidrilos. En este último caso
pude llegar a perderse la forma natural de la estructura enzimática.

Factores que afectan la actividad plasmática de las enzimas.

1. Lisis o necrosis tisular en las fuentes de la enzima.

Independientemente de la causa, el fenómeno genera actividad de
fosfolipasas, las cuales crean agujeros en las membranas celulares y
esto propicia el vertido del contenido enzimático en la sangre. En
ocasiones solo basta la isquemia para que se produzca un fenómeno
similar.
2. Recambio celular. Este fenómeno es el que crea el nivel de fondo de
la actividad enzimática en la sangre.
3. Aumento de la síntesis de la enzima, como pasa en la hipertrofia
muscular por ejercicio (CPK) y en la hiperactividad osteoblástica
después de una fractura (Fosfatasa alcalina).
4. Estimulación de la actividad microsomal hepática, ejemplo de lo cual
es la elevación de la GGT a causa de acciones medicamentosas
(etanol y antiepilépticos).
5. Ingestión de alimentos. La actividad fisiológica intestinal puede
propiciar una oleada de la isoenzima intestinal de la fosfatasa
alcalina, la cual pasa de los tejidos a los linfáticos y estos le drenan
en la sangre. Se trata de un aumento transitorio.
6. Aumento de la concentración de las sales biliares en los cuadros
obstructivos del árbol biliares puede generar desprendimiento de
fragmentos membranales con acción enzimática o solubilizar la
misma. Esto ocurre con la FA, GGT, leucínaminopeptidasa y 5NT.
7. Disminución del aclaramiento de la enzima de la circulación como
pasa con el fallo renal o la macroamilasemia o las macroenzimas por

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 complejos Ag-Ac contra isoenzimas en el curso de infecciones
bacterianas (FAL) o Ac cruzados como Ac anti LDH por generación de
Ac antiestreptoquinasa.
8. Aumentos por oleadas por reperfusión tisular, como ocurre en el uso
de terapia trombolítica en el infarto agudo del miocardio y la
actividad de CPK-MB.

Numerosos factores afectan la velocidad de la reacción enzimática.

Pueden verificarse in vivo e in vitro y estar relacionados con la pérdida
de la actividad enzimática o no.

Uno de los factores más notables in vivo es la saturación del sitio

activo.

Rango normal de actividad enzimática.

Como se ha enfatizado, las enzimas no se cuantifican hablando en

términos de cantidad de sustancia o concentración de masa sino que se
investiga su actividad catalítica bajo los términos de actividad enzimática
vistos anteriormente.

Recientemente se ha comenzado a determinar la masa de ciertas

isoenzimas, como el caso de la isoenzima MB de la CPK. En este caso los
resultados son acerca de la masa enzimática circulante y esto se conoce
como CK masa.

La diversidad de métodos hace que el rango normal varíe con los mismos
por lo que solo se hacen especificaciones cuando un método en particular es
usado en lugar de otros.

Dualidad de las enzimas en el bioanálisis clínico.

Las enzimas son, además de analitos de extrema importancia en el

diagnóstico clínico, instrumentos de trabajo usados cotidianamente en
diversos procedimientos de laboratorio. Basta con citar el uso de
combinaciones de enzimas en las reacciones para determinar las
concentraciones de otros analitos en los líquidos biológicos como la glucosa,
urea y otros muchos.

Enzimas de uso clínico.

Aminotransferasas (ASAT/TGP, ALAT/TGO).

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Fosfatasa alcalina (ALP).
Lactato deshidrogenasa (LDH o LH).
Fosfatasa ácida.
Creatinquinasa o creatinfosfoquinasa (CK o CPK).
Gamma-glutamil-transpeptidasa (GGT).
Lipasa.
Amilasa.
Aldolasa.
Colinesterasa.

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