PCR
Son las siglas en inglés de
"Polymerase Chain Reaction"
o Reacción en Cadena de la
Polimerasa.
TÉCNICA DE SÍNTESIS
MÚLTIPLE DE UN
PEDAZO O FRAGMENTO
DE ADN IN VITRO,
UTILIZANDO UNA
POLIMERASA QUE
TOLERA ALTAS
TEMPERATURAS.
PROVIENE DE LA
BACTERIA: THERMUS
AQUATICUS.
VIVE: A 79°C A 85°C.
Nombre comercial más
conocido:
Taq polimerasa.
Algunos usos de los PCR
Detectar presencia de ADN/ARN de un patógeno
determinado – uso más común.
Detectar la presencia de genes de virulencia.
Serotipar un patógeno por genes específicos (ADN/ARN) - varían entre
serotipos.
ETAPAS DE LA PCR
DESNATURALIZACIÓN DEL ADN:
ELEVACIÓN DE LA TEMPERATURA
ROMPIMIENTO DE LOS ENLACES DE LA DOBLE HELICE O CADENA DE ADN
ALINEACIóN
BAJA LA TEMPERATURA
LOS FRAGMENTOS DE ADN SE EMPAREJAN CON LOS
PRAIMER O INICIADORES BASE
POLIMERIZACIÓN
ELEVA LA TEMPERATURA
ENZIMA ADN LAS NUEVAS CADENAS SE AMPLIEN
Control positivo
CONTROL NEGATIVO
Es fundamental que el fragmento de ADN
utilizado como control positivo del se utiliza para comprobar errores en el diseño de
patógeno sea absolutamente específico secuencias de control positivo y/o Oligos, pueden
para emparejamiento del Primer. traducirse en consecuencias fatales por mal
diagnosticadas.
Importancia de los controles
QUÉ SE NECESITA PARA HACER UN PCR
ADN molde
fragmento de ADN que se quiere
amplificar mediante la PCR.
Desoxirribonucleótidos-trifosfato
Adenina, guanina, citosina y timina.
Cebadores (primers)
Oligonucleótidos: Son dos secuencias cortas de ADN que se unen al ADN molde.
Sirven como punto de inicio de la síntesis de ADN.
Cada es uno complementario a una cadena del ADN que buscamos
amplificar.
Determinan la región del ADN a amplificar.
ADN polimerasas
Se pueden utilizar diferentes
ADN polimerasas, obtenidas
de varios organismos.
Termorecicladores
El termociclador eleva y baja la temperatura del bloque.
De un termociclador a otro puede haber variaciones.
Modelos antiguos:
Tienen menor precisión.
Los tubos que utilizan son de plástico grueso
Temperatura a la que trabajan no es exacta.
Son muy lentos.
Iones divalentes de magnesio
Iones de carga positiva como cofactores de la polimerasa.
Normalmente se añade cloruro de magnesio para que al disociarse se libere magnesio ( con
carga +2).
Solución tampón
Disolución reguladora del pH. Los cambios en el pH de la
disolución pueden alterar los resultados de nuestra PCR
o evitar que se produzca.
PASOS
Se colocan los tubos en el termoreciclador, el cual, los enfria o calienta a
temperaturas precisas.
AMPLIFICACIÓN DE LOS FRAGMENTOS
El termociclador calienta o enfría los tubos a tres temperaturas
distintas, que se repiten una y otra vez en ciclos de reacción.
DESNATURALIZACIÓN
Las dobles cadenas del ADN se abren o desnaturalizan,
1°r a Tem per atu ra : quedando en forma de cadenas sencillas.
En tr e 94 y 96 °C
TEMPERATURA DE ALINEAMIENTO
El Termociclador ajusta la temperatura en un intervalo entre 40° y
60°C.
Se forman y se rompen constantemente los puentes de hidrógeno
entre los oligonucleótidos y el ADN.
LAS UNIONES MÁS ESTABLES O COMPLEMENTARIAS DURAN UN MAYOR TIEMPO.
los oligonucleótidos forman una región de doble cadena Y
La polimerasa se une a este pedazo de ADN y comienza a
copiar en sentido 5’ a 3’.
Al agregar más bases, se forman puentes de hidrógeno
entre ellas y estabilizan más la unión.
el oligonucleótido permanece en este sitio.
EXTENSIÓN
La temperatura sube a 72°C, misma que, la polimerasa alcanza su
máxima actividad, y continúa la síntesis de los fragmentos de ADN a
partir de los oligonucleótidos que ya se habían alineado.
EXTENSIÓN FINAL (OPCIONAL)
Asegura que los fragmentos incompletos se terminen de
A 7 2 ° C p o r 1 0 m in . sintetizar.
AL FINAL SE PROGRAMA LA MÁQUINA PARA QUE CONSERVE LOS
TUBOS A 4°C.
evita que la polimerasa sintetice fragmentos
inespecíficos.
TIPOS DE TÉCNICAS
ANIDADA:
variante de la PCR básica.
Se utiliza dos pares de cebadores.
amplifica fragmentos muy específicos del genoma.
EN TIEMPO REAL O CUANTITATIVA:
PERMITE MEDIR EN TIEMPO REAL LA CANTIDAD DE FRAGMENTOS QUE SE VAN PRODUCIENDO.
SE UTILIZA A MENUDO PARA ANALIZAR LA EXPRESIÓN DE LOS GENES.
IN SITU:
SE REALIZA EN CÉLULAS O TEJIDOS. SE UTILIZA PARA DETECTAR SECUENCIAS DE ADN EN
EL INTERIOR DE LAS CÉLULAS QUE NO SON DETECTABLES MEDIANTE OTRAS TÉCNICAS.
Se amplifican regiones no conocidas, como zonas hipervariables del genoma
DIGITAL:
ES UNA DE LAS ÚLTIMAS GENERACIONES EN TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN DE ADN. ESTÁ BASADA EN LA SEPARACIÓN DE CADA
MUESTRA EN MÚLTIPLES PARTICIONES (MICROGOTAS), DE FORMA QUE LA REACCIÓN DE AMPLIFICACIÓN SE PRODUCE DE FORMA
INDEPENDIENTE CADA UNA DE ELLAS.
MÚLTIPLE:
Busca amplificar simultáneamente en un único
tubo distintas secuencias específicas.
ESPECIFICIDAD DE LA REACCIÓN
DE PCR
Esta depende de:
la temperatura empleada en la fase de hibridación.
la cantidad de iones divalentes que se incorporan a la
reacción.
la secuencia de los cebadores.
CONTAMINACIÓN
Esta es muy frecuente. Para monitorearlo,
siempre hay que trabajar con un control
negativo.
ALMACENAMIENTO
Los componentes de la PCR se almacenan a -20°C a una
concentración superior a la que luego se utilizaran en
la reacción.
MÉTODOS DE VISUALIZACIÓN DE PCR
Son el análisis del o los fragmentos obtenidos en el
PCR y la electroforesis.
MEDIANTE GELES DE:
AGAROSA PERMITEN SEPARAR LOS FRAGMENTOS
ACRILAMIDA, DE ACUERDO AL TAMAÑO DE CADA UNO.
Deposito del ADN en los
pozos del gel
debe mezclarse con un buffer de carga
ESTE PERMITE:
1) aumentar la densidad de la muestra para depositarse en el fondo del pozo
2) teñir la muestra para facilitar su carga dentro del gel
3) identificar la distancia recorrida por las muestras.
ELECTROFORESIS EN GEL
Es la aplicación de corriente a través de
un gel que contiene las moléculas de
interés.
Con base en su tamaño y carga, las moléculas se desplazarán
por el gel en diferentes direcciones o a distintas
velocidades, con lo que se separan unas de otras.
MÉTODOS PARA GELES DE AGAROSA
Cámara de electroforesis.
Equipo: Fuente de poder.
transiluminador de luz UV.
una cámara polaroid.
un filtro para luz UV. PARA GUARDAR
LA IMAGEN DEL
un cono adaptado a la cámara. GEL
Hay que preparar el buffer de corrida, el cual tendrá el pH
requerido y los iones necesarios para que fluya la corriente y
pueda migrar el ADN.
Se disuelve en el mismo buffer para la corrida, y se calienta hasta
ebullir, para disolver el polvo.
El buffer más común es el TBE (Tris Boratos EDTA), también se utiliza
el TAE (Tris Acetatos EDTA), este es menos estable y tiende a ionizarse
más rápido,
CARGAN DEL GEL
Con una pipeta, cada muestra se vierte en un pozo, mezclada
previamente con 1 ó 2 microlitros de colorante de corrida.
los colorantes de corrida llevan alguna sustancia espesa,
como glicerol o sacarosa, que permite que la muestra
caiga hacia el fondo del pozo.
Los colorantes como el xilencianol o azul de bromofenol
nos dan una idea de cómo van migrando los fragmentos.
TINCIÓN DEL GEL
Lo más común es utilizar bromuro de etidio, que es un
mutágeno y es altamente tóxico, por lo cual es
necesario utilizar guantes y bata para su manejo.
Es recomendable apartar un área del
laboratorio y material exclusivo para su
uso.
