INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ÓRGANICA
QUÍMICO BACTERIOLÓLOGO PARASITÓLOGO

PRÁCTICA N° 5
CROMATOGRAFÍA
GRUPO: 2QM2 EQUIPO: 5

Alumnos: Profesores:
Díaz Tapia Mauricio Betán González Fernando
Rodríguez Cruz Alondra Itay De La Rosa Ibañéz Alberta
Tenorio Díaz Claudia Jazmín Estudiante Negrete Fabiola Edith
Quevo Venteño Mayra Lizhet Vázquez Dávila Filiberto 1
 ÍNDICE
Objetivos ................................................................3
Antecedentes..........................................................4
Introducción............................................................5
Aplicaciones...........................................................11
Propiedades fisicoquímicas de los reactivos.....35
Procedimiento experimental...............................42
Resultados esperados...........................................54
Bibliografía.............................................................55

2
Objetivos:
Conocer la técnica de cromatografía y los factores
experimentales que la afectan.
Aplicar y comparar los métodos cromatográficos de
capa fina y columna, para separar, identificar y
purificar compuestos orgánicos.
Determinar los valores de Rf, como un parámetro en
la identificación de los compuestos separados.

3
 Antecendentes
Reconocieron el fenómeno de Realizó la primera cromatografía Sintetizaron resinas
intercambio iónico en de columna con sulfato de calcio para cromatografía de
sólidos. intercambio iónico

Way y Thompson Ruso Tswett Holmes y Adam

1848 1850 1906 1931 1935

Runge, Schoenbein, Kuhn, Lederer,
Goeppelsroeder Winterstein

Estudiaron el análisis por Separaron pigmentos

capilaridad en papel de zanahoria con
con diferentes diluciones métodos analíticos
4
Javiera. (2023). Historia de la cromatografía. Del Carpio. [Link]
 Antecendentes
Utiliza en forma Premio nobel por
circular el papel Uso de cromatografía en desarrollar la
capa fina cromatografia

Broeh Martin y Synge

1935 1938 1940 1952 1952

Reichtein Martin y James
Se utilizaba columnas de
vidrio y los compuestos
eran visibles Columna cerrada
Cromatografía líquida
Separar gases volatiles

Javiera. (2023). Historia de la cromatografía. Del Carpio. [Link] 5

 Antecendentes

1964 1970-1980 2001-2003 Actualmente

6
Javiera. (2023). Historia de la cromatografía. Del Carpio. [Link]
 Cromatografía
Metodo físico de separación, mediante el cual los componentes de una mezcla se separan por
distribucion entre dos fases una estacionaria y una móvil.

de gases
en capa fina

en columna

Artedinamico. (s. f.). CROMATOGRAFÍA. Equipos y laboratorio de Colombia. en papel 7

[Link]
Fase estacionaria
Material que permanece fijo dentro de
la columna cromatográfica durante la
cromatografía y que retiene
componentes de la muestra.

Fluido usado como portador de la

mezcla y que se hace pasar a través de
la columna cromatográfica y la fase
Fase móvil estacionaria.
8
Durst, H. P. (s. f.). Química orgánica experimental. Reverte.
 Diferencia entre
Absorción Adsorción
Fenómeno en el que los átomos, iones o Fenómeno el cual átomos, iones o moléculas de gases,
moléculas de gases, líquidos o sólidos se líquidos o sólidos disueltos son retenidos en una
disuelven en otra sustancia. superficie de una sustancia sólida o líquida.

9
 Polaridad
Propiedad de las moléculas que representa la separación de las cargas eléctricas dentro de la molécula, según el
número y tipo de enlaces que posea.

El enlace covalente entre dos átomos puede ser

polar o apolar.
Si los átomos son iguales, el enlace será apolar (ya
que ningún átomo atrae con más fuerza los
electrones).
Si los átomos son diferentes, el enlace estará
polarizado hacia el átomo más electronegativo.

10
Mc Murry, J. , (2008) Enlaces covalentes: ácidos y bases. En J. Mc Murry (7a. Ed). Química Orgánica (pp. 35-38). Cengage
 Dr. JESÚS MORALES. (2020, 24 noviembre).
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA y EN
COLUMNA FASE NORMAL [Vídeo]. YouTube.
[Link]
v=GKXQXNOezt0

11
 Usos de la cromatografia
Pruebas en la escena del crimen (análisis de muestras de
sangre o tela).
Verificación de incendios provocados (identificación de
los químicos responsables).
Pruebas de sangre después de la muerte para
determinar los niveles de alcohol, drogas o sustancias
venenosas en el cuerpo.
Pruebas de dopaje o drogas que mejoran el rendimiento
en los atletas.
Para separar compuestos de origen biológico.
Productos como el perfume para separar aceites
esenciales.

12
Ltd, Z. A. T. C. (1899, 31 diciembre). 5 usos de la cromatografía en la vida cotidiana - Noticias - Zhejiang ALWSCI Technologies Co., Ltd. ALWSCI. Recuperado 10 de
octubre de 2023, de [Link]
Clasificaión de las técnicas de cromatografía

13
Cromatografía en placa fina

Separación de las sustancias que

componen una mezcla cuando migran
de una capa de adsorbente
depositados sobre una placa
cromatográfica al ser arrastradas sobre
un eluyente.

Esta separación se logra por exposición

de las mismas a un sistema bifásico
que se deja llegar al equilibrio.

14
Durst, H. P. (s. f.). Química orgánica experimental. Reverte.
 Orden de en el que Es inverso a su
se eluyen los compuestos polaridad
Las sustancias menos polares, tenderan a
moverse en la parte superior de la placa

Las sustancias mas polares, con frecuencia

aparecerán en la parte baja de la placa

15
Durst, H. P. (s. f.). Química orgánica experimental. Reverte.
 Parámetros Cromatográficos
● Frente del disolvente (fd).
● Centro del soluto (fs)
● Relación de frentes (Rf): Cociente de la división fs/fd. Se utiliza con fines de
identificación de compuestos cuando se tienen patrones de referencia.

● Diferencia de Rfs: Medida cuantitativa del grado de separación.

Parámetros, Retención en Cromatografía en columna | Sociedad Española de Cromatografía y Técnicas Afines. (s. f.). 16
[Link]
 Factor de retención (k)
Medida del tiempo que un compuesto permanece en la fase estacionaria, en relación con el tiempo que permanece en
la fase móvil.
Matemáticamente, es la relación entre el volumen (tiempo) de retención ajustado y el volumen (tiempo) básico.

k = V / VM = t / tM

Parámetros, Retención en Cromatografía en columna | Sociedad Española de Cromatografía y Técnicas Afines. (s. f.).
[Link]
17
 FD: Frente del disolvente. Distancia
Frente del disolvente recorrida por la fase móvil a partir de
la línea de aplicación.

Frente del del soluto FS: Frente del soluto. Distancia

recorrida por el soluto a partir de la
línea de aplicación.
Orígen del compuesto

Durst, H. P. (s. f.). Química orgánica experimental. Reverte.

18
 Cálculo de Rf (Relación de frentes)

Frente del soluto (FS)

RF:
Frente del disolvente (FD)

Durst, H. P. (s. f.). Química orgánica experimental. Reverte.

19
 Se traza una una
Elección del eluyente
línea horizontal
en la placa
cromatográfica
Marcar varios puntos
de aplicación
separados por al
menos 1 cm

Sobre cada
punto aplicar
una pequeña
cantidad de
muestra
En cada muestra
aplicar un tipo de
eluyente entre los
que se desean
Rf=0.3-0.5.
probar.
20
Durst, H. P. (s. f.). Química orgánica experimental. Reverte.
 Agentes Reveladores

Físicos Quimicos
KMgO4 Cámara de Yodo Ácido nítrico
Luz UV (454nm)

21
Cromatografía en
columna.

22
 Principio de separación
La sílica gel es una estructura compleja
formada principalmente por enlaces
silil-éter y silanoles por lo cual es muy
polar.

Por lo cual los componentes más

polares serán retenidos por la silica gel
mientras que los componentes no
polares serán arrastrados por el
eluyente ya que este también es no
polar
Durst, H. P. (s. f.). Química orgánica experimental. Reverte.
Dr. JESÚS MORALES. (2020, 24 noviembre). CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA y EN COLUMNA FASE NORMAL 23
[Vídeo]. YouTube. [Link]
 Principio de separación
Al agregar continuamente más fase móvil, los analitos se distribuirán
entre las dos fases y terminarán por ser eluidos, y si la distribución es lo
suficientemente distinta para las diversas sustancias, terminarán por
separarse.

Durst, H. P. (s. f.). Química orgánica experimental. Reverte. 24

 La naturaleza de las fases
involucradas son del tipo
sólido-líquido
Basada en la absorción y
solubilidad que constituyen un
equilibrio.

Técnica para separar una mezcla

de dos o más compuestos de
polaridad diferente
Por distribución del soluto entre
dos fases; una estacionaria
(adsorbente) y la otra móvil
(eluyente)

25
Durst, H. P. (s. f.). Química orgánica experimental. Reverte.
 Los adsorbentes más comunes (ambas
son polares):
Lúmina
Gel de sílice
Se depositan en forma de capa
delgada sobre una placa o lámina
inerte
En la etiqueta de las placas se ve:
Tipo de adsorbente
Nombre
Espesor
Tipo de partícula
Presencia de agentes fluorescentes
para la visualización de las placas
con luz ultravioleta

Durst, H. P. (s. f.). Química orgánica experimental. Reverte. 26

 Fuerzas intermoleculares

Se presentarán entre moléculas polares que carezcan de enlaces O-H. N-H o H-F

Amigos de la Química. (2017, December 11). QUÍMICA. Fuerzas intermoleculares. Van der Waals, London y enlaces de hidrógeno [Video]. YouTube. [Link] 27
 Fuerzas intermoleculares

puentes de hidrógeno sólo se presentarán entre moléculas en cuya estructura existan

enlaces O-H, N-H y F-H

Amigos de la Química. (2017, December 11). QUÍMICA. Fuerzas intermoleculares. Van der Waals, London y enlaces de hidrógeno [Video]. YouTube. [Link] 28
 29
AnaliQuim. (2020, May 27). HPLC Fundamentos (Fase normal y Fase reversa) [Video]. YouTube. [Link]
 Adsorción
Las moléculas no polares
interaccionan débilmente
con el adsorbente mediante
las fuerzas de Van de Waals

Las interacciones más fuertes

se manifiestan en moléculas
polares que van de
dipolo-dipolo

Durst, H. P. (s. f.). Química orgánica experimental. Reverte.

30
 Cromatografía de gases
La fase móvil es un gas y la estacionaria puede ser un líquido
o un sólido

Cromatografía sólido-gas (CSG)

Cromatografía líquido-gas (CLG)
Durst, H. P. (s. f.). Química orgánica experimental. Reverte.
31
 Cromatografía de líquidos.
En está, la fase móvil es un líquido y la estacionaria puede ser un líquido o un sólido

Cromatografía sólido-líquido (CSL)

Cromatografía líquido-líquido (CLL)
Durst, H. P. (s. f.). Química orgánica experimental. Reverte.
32
Durst, H. P. (s. f.). Química orgánica experimental. Reverte.
33
Durst, H. P. (s. f.). Química orgánica experimental. Reverte.
34
Propiedades fisicoquímicas de los reactivos

35
Hexano
Punto de fusión / de congelación: -96°C (-140°F)
Punto / intervalo de ebullición: 69°C (156°F)
Tasa de evaporación: N/D
Punto de inflamación: -30°C (-22°F) - c.c.
Límites de inflamabilidad: 1,2% - 7,5%
Presión de vapor (15,8°C): 100 mmHg
Densidad (20°C): 0,66 g/cm³
Solubilidad (20°C): Despreciable en agua.

Toxicidad aguda: oral (rata): > 2000 mg/kg

inh. (rata, 24hrs): > 10 mg/l

Facultad de Química, UNAM. (2016,diciembre).HOJA DE SEGURIDAD XIII HEXANO. Departamento de Protección Civil.[Link] 36
content/uploads/2016/12/[Link]
Benceno
Punto de fusión / de congelación: 5.5°C
Punto / intervalo de ebullición: 80.1°C
Tasa de evaporación: N/D
Punto de inflamación: -11°C
Límites de inflamabilidad: 1,4%
Presión de vapor: N/D
Densidad: 0,88 g/cm³
Solubilidad: 1.88 g/L. Miscible en ácido acético,
cloroformo, cloruro de carbono, acetona

Toxicidad aguda: oral (rata): 5.970mg/kg

inh. (rata, 4hrs): 43.7 mg/l
Facultad de Química, UNAM. (2016,diciembre).HOJA DE SEGURIDAD XIII BENCENO Departamento de Protección Civil.[Link] 37
content/uploads/2016/12/[Link]
Acetona
Punto de fusión / de congelación: -94°C
Punto / intervalo de ebullición: 56°C
Tasa de evaporación: N/D
Punto de inflamación: -20°C
Límites de inflamabilidad: 2,6%
Presión de vapor: N/D
Densidad: 0,80 g/cm³
Solubilidad: Miscible en cualquier proporción de agua

Toxicidad aguda: oral (rata): 5.800 mg/kg

inh. (rata, 4hrs): 76 mg/l
38
Facultad de Química, UNAM. (2016,diciembre). HOJA DE SEGURIDAD IV ACETONA. Departamento de Protección Civil.[Link]
 Silica gel
Punto de fusión / de congelación: N/D
Punto / intervalo de ebullición: N/D
Tasa de evaporación: N/D
Punto de inflamación: N/D
Límites de inflamabilidad: N/A
Presión de vapor: N/D
Densidad: N/D
Solubilidad: Insoluble en agua

Toxicidad aguda: oral (rata): N/A

Oral (Producto) (rata): 22,500 mg/kg
39
Acetato de etilo
Punto de fusión / de congelación: -84°C
Punto / intervalo de ebullición: 76.5 - 77.5 °C 169.7 - 171.5 °F
Tasa de evaporación: N/D
Punto de inflamación: -4°C
Límites de inflamabilidad: N/A
Presión de vapor: N/D
Densidad: 0,90 g/cm³
Solubilidad: Miscible agua

Toxicidad aguda: oral (rata): 5,620 mg/kg

Facultad de Química, UNAM. (2016,diciembre).HOJA DE SEGURIDAD VIII ACETATO DE ETILO. Departamento de Protección Civil.[Link] 40
content/uploads/2016/12/[Link]
Metanol
Punto de fusión / de congelación: -97.8°C
Punto / intervalo de ebullición: 64°C
Tasa de evaporación: N/D
Punto de inflamación: 11-12°C
Límites de inflamabilidad:6%
Presión de vapor: 19.6 k/pa
Densidad: 0,8 g/cm³
Solubilidad: Miscible en cualquier proporción de agua

Toxicidad aguda: oral (rata): 5.628 mg/kg

inh. (rata, 4hrs): 64,000 ppm
Facultad de Química, UNAM. (2016,diciembre).HOJA DE SEGURIDAD IX METANOL. Departamento de Protección Civil.[Link] 41
 Procedimiento experimental:

Cromatografía en la placa fina

42
 Separación de carotenos:
Aplicar la muestra de carotenos
En una cromatoplaca de
5x2.5 cm, trazar con un
lápiz de punta suave la cantidad de muestra aplicada
una línea a 0.5 cm de depende de la concentración de la
muestra original
distancia del borde
inferior.

Desarrollar el cromatograma en una Dejar secar el

mezcla hexano:acetatona 6:1(v/v) cromatograma
No debe rebasar los
puntos de aplicacion
No eluya hasta 0.5 cm
antes del borde superior
de la placa
43
Procedimiento experimental:
marcar el centro de cada
Retirar de la cámara
mancha observada
cromatográfica

44
Carontenos

luteina
Violaxantina

Clorofilas

45
Identificación de aceites esenciales por cromatografía
en placa fina
Realizar el procedimiento anterior,
empleando aceites esenciales,
utilizando benceno como fase móvil.

Emplear un agente
revelador
Dejar secar

Sumergir las placas en una disolución de

permanganato de potasio (KMnO4 ) al 10% 46
Procedimiento experimental:
Calcular el Rf

47
Resultados esperados (cromatografía en placa
fina):
Ver el recorrido de los diferentes compuestos en la placa fina, por la diferencia de
polaridad. Y calcular la relación de frentes con la fórmula previamente vista.

48
 Procedimiento experimental:

Cromatografía en columna

49
Separación de carotenos por cromatografia en columna
De tal manera que la silica no
se salga al introducir en la
columna
No debe ser mucho algodón

Introducir por medio de un agitador, un

trozo de algodón hasta la base de esta

Adicionar silica gel Colocar una columna para

cromatograifa
Adicionar por la parte
superior una suspension de 4
g de silica gel en una mezcla
de hexano:acetona 1:1
50
 Separacion de carotenos por cromatografia en columna
La compactacion de la silica Dejar gotear el disolvente ,hasta la
debe ser homogenea fase estacionaria
No se deben formar burbujas
No se debe agrietar la silica
empaquetada

La llave de la columna deberá

permanecer abierta durante todo el
proceso
Agregar Cloruro de sodio, hasta
Adicionar 10 gotas de espinaca formar una capa de
aproximadamente 1 cm
No permitir que el nivel Ayudate de una pipeta pasteur
del disolvente baje más Cuidar de no derramarlo por las
allá de la superficie de la paredes de la columna ni que se
capa ya que la columna se mezcle con la fase móvil.
puede secar o agrietar.
51
 Separacion de carotenos por cromatografia en columna
Correr la columna cromatografica
observando la separacion de
Debe mantenerse
diferentes comparaciones
constante el
volumen de eluyente
Una vez los pigmentos penetraron en la
sílica, llenar lentamente la columna
con la mezcla de hexano-acetona 1:1

Recoger la primera fraccion colorida

Cambiar el eluyente a acetato de en tubos de ensayo enumerados y
etilo:metanol 1:1 cubiertos con papel aluminio

Recoger la siguiente fraccion en

tubos de ensayo numerados 52
Demostración
del recorrido
en columna

53
 Separacion de carotenos por cromatografia en columna

Identificar los pigmentos separados de

cada fracción

E Clorofilas α y β
L
U
Una vez recolectadas todas las fracciones,
en un baño de agua caliente,evaporar la
Y
E
Violaxantina
mayor cantidad posible de disolvente N
T
E
Luteina

Carotenos α y β

54
 Separación de licopenos
Realizar en la misma forma en que se efectuo
para el estracto de espinaca

Hacer la cromatografia en placa fina del

extracto de jitomate para la separacion de
licotenos

55
Resultados esperados (cromatografía en columna):
1. Se recolectará en las primera tres fracciones (1 a 3) carotenos alfa y
beta con eluyente:hexano.
2. En las siguientes dos fracciones (4 y 5) se recolectará luteína con
eluyente hexano:acetato de etilo
3. En las siguientes dos fracciones (6 y 7) se recolectará la violeteína
con eluyente: hexano:acetato de etilo
4. En las siguiente fracción (8) recolectar la clorofila “A” eluyente:
hexano:acetona
5. En las últimas fracciones (9 y10) se recolectará la clorofila “B”
eluyente: hexano:acetona

56
 Bibliografías
Abbott, D y Andrews, R. S. 1970.“Introducción a la Cromatografía”. Ed. Alhambra, S.
A. Madrid.[2] Barajas, N. (2011).
Admin. (2021). Teoría detrás de la cromatografía en capa delgada (TLC).
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Browning, D. R. 1971.”Cromatografía”, Toray-Masson, S.A. Barcelona.[5] Buzzo, I.
(2011).Implementación y Validación de un método analítico para la cuantificación de
Astaxantina mediante la técnica de HPLC. Tesis de licenciatura, Unidad Profesional
Interdisciplinaria de Biotecnología, Instituto Politécnico Nacional, Ciudad de México,
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Brown, T., Eugene, H., & [Link]. (2013).Química, La Ciencia Central([Link].). Pearson
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De Química. (2021, 26 noviembre). Cromatografía de capa fina (CCF) | De Química. De
Química: [Link]

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Manzo, R. A. (2016, 24 noviembre). Cromatografía. Slideshare:
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Karenvanegas. (2013, 18 septiembre). Cromatografía en Placa [Link]:

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Fundamentos (Fase normal y Fase reversa) Analim quimi HPLC - Isocratic vs Gradient
Elution - Animated Mrs simple science

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 Bibliografías
Facultad de Química, UNAM. (2016,diciembre).HOJA DE SEGURIDAD IX METANOL. Departamento de
Protección Civil.[Link]
Facultad de Química, UNAM. (2016,diciembre).HOJA DE SEGURIDAD XII ETANOL. Departamento de
Protección Civil.[Link]
Facultad de Química, UNAM. (2016,diciembre).HOJA DE SEGURIDAD XIII HEXANO. Departamento de
Protección Civil.[Link]
Facultad de Química, UNAM. (2016,diciembre).HOJA DE SEGURIDAD VIII ACETATO DE ETILO.
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Facultad de Química, UNAM. (2016,diciembre). HOJA DE SEGURIDAD IV ACETONA. Departamento de
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Serie Académicos CBS. Cromatografía de gases y de líquidos de alta resolución México [Link].215-231 255-305.
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Sthal, E. 1969. “Thin-Layer Chromatoraphy” – A Laboratory [Link]-Verlag,Heidelberg.
Weisz, P. B.; Keogh, R, N. 1987.“La Ciencia de la Biología”.Ediciones Omega S.A. Barcelona.
Wilcox, Jr.; Charles F. 1995. “Experimental Organic Chemistry”.Second [Link]-Hall, Inc.

59