Química Analítica – Química Orgánica Apunte Cromatografía

Cromatografía
Entre las distintas técnicas empleadas en la Química Analítica actual, posiblemente
ninguna haya alcanzado en los últimos 25 años un desarrollo tan espectacular como la
cromatografía en sus distintas variantes.
Su difusión se debe a su aplicación en análisis de tipo orgánico, toxicológico,
estructurales, bioquímico, etc. ya que presenta notables ventajas:
a) Constituye una técnica sencilla y rápida que, en muchos casos, no requiere aparatos
complicados.
b) Se puede utilizar desde la escala microanalítica (del orden del µg) hasta la industrial.
c) Se puede obtener un registro permanente del análisis (cromatograma).
d) Es una técnica poco o nada destructiva que puede aplicarse a sustancias lábiles.
El primer trabajo realizado fue en 1906 por Tswett, que separó varios pigmentos
(clorofila y carotenos) de las hojas verdes, haciendo pasar un extracto de las hojas en éter
de petróleo a través de una columna de CaCO3 en polvo. Los distintos componentes
coloreados quedaron retenidos (adsorbidos) en bandas que ocupaban distintas posiciones
en la columna.
Los componentes separados se recuperaron sacando de la columna el adsorbente
cortándolo en secciones y extrayendo de cada uno, los compuestos adsorbidos. Recién
en 1930 esta técnica comenzó a cobrar importancia.
En 1941 Martin y Singer idearon una nueva teoría de cromatografía que implica un
reparto entre dos líquidos más que adsorción de un líquido por un sólido. Su trabajo se
hizo en columnas de gel de sílice, con agua como fase estacionaria.
En 1944, Gordon, Consden y Martin describieron un nuevo método, llamado
cromatografía de reparto sobre papel. El éxito de esta cromatografía los llevó a pensar en
la posibilidad de separar pequeñísimas cantidades de sustancias desplazándolos sobre
una fase estacionaria de papel que se iba saturando de agua a medida que se movía el
frente de disolvente saturado de agua. Este método permite analizar, localizar e identificar
g de sustancias y aislarlas.
En 1952 James y Martin publicaron sus trabajos de cromatografía de reparto de
fase gaseosa; que consistía en el reparto entre un gas inerte portador y un líquido
mantenido sobre un soporte no adsorbente, dentro de una columna. Simultáneamente se
desarrollaba la cromatografía de adsorción en fase gaseosa pero su aplicación no ha
llegado a ser tan amplia.
La cromatografía es un procedimiento fisicoquímico que permite separar los
componentes o sustancias integrantes de una mezcla en movimiento por adsorción o
separación diferencial de estos componentes sobre una fase estacionaria.
Otro avance, concerniente principalmente a la cromatografía de adsorción, se
alcanzó con la introducción de la cromatografía en capa fina.
La cromatografía abarca una gran variedad de técnicas de separación sumamente
efectivas. La característica común de todas ellas es que los componentes de la muestra
se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria mientras que la otra filtra
a través de los intersticios o sobre la superficie de la fase fija. El desplazamiento de la
fase móvil se manifiesta en una migración diferencial de los componentes de la muestra.
La fase estacionaria puede ser sólida o líquida, y la fase móvil líquida o gaseosa.
Por consiguiente, hay varias combinaciones posibles, solo dos no lo son y es: gas-gas y
sólido-sólido.
No hay restricciones al mecanismo de distribución de los componentes de la
muestra en las dos fases. En la cromatografía líquida-sólida generalmente es de
adsorción sobre la superficie de un sólido o una reacción reversible que resulta del
intercambio de iones o la formación de complejos u otros adsorbentes. En la
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cromatografía gas-sólido normalmente el mecanismo es por adsorción, pero puede ser

también capturada dentro de la estructura microscópica del sólido o una reacción química
reversible con el sólido. En cambio, en la cromatografía líquido-líquido es partición del
soluto, definido por su solubilidad relativa en los dos líquidos. En la cromatografía líquido-
gas es partición del soluto definida por la presión de vapor parcial del soluto en solución.
A menudo dos o más mecanismos pueden operar a la vez, como en la electroforesis, en
donde se aplica una fuerza eléctrica a la migración de las especies iónicas.

Clasificación de los métodos cromatográficos

Se los puede clasificar atendiendo al estado físico de las fases, al mecanismo de

separación y al tipo de soporte o equipo utilizado.
En cuanto al estado físico de las fases, la móvil puede ser un gas o un líquido y la
estacionaria un líquido o un sólido, pudiendo en este sentido establecerse cuatro tipos de
cromatografía: gas-líquido, líquido-líquido, gas-sólido y líquido-sólido.
En lo que se refiere al tipo de soporte o equipo utilizado la cromatografía utiliza columna
donde la fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo angosto y la fase móvil es
forzada a pasar a través del tubo bajo presión o por gravedad. En la cromatografía planar,
la fase estacionaria está sostenida por una placa plana o en los poros de un papel. En
este caso, la fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria por acción capilar o
bajo la influencia de la gravedad.
En el cuadro se muestra la clasificación en tres categorías basadas en la naturaleza de la
fase móvil.

Otra clasificación es la referente a los mecanismos por los que los diferentes
componentes son separados en un proceso cromatográfico, estos son variados y a veces
no suficientemente conocidos. Los principales mecanismos que intervienen en la

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separaciones cromatográficas son: adsorción, partición, de filtración con geles (o tamices
moleculares) y de intercambio iónico.
Existen también varias técnicas que se aplican a algunos de los tipos mencionados:
Cromatografía en capa delgada, cromatografía en capa preparativa, cromatografía en
columna, cromatografía en papel, [Link] técnica de capa delgada (C.C.D) es para uso
analítico y la de columna es siempre separativa. En cambio, la técnica de papel se la
puede utilizar como recurso analítico o separativo.

MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO CROMATOGRAFICO

✓ Adsorción
✓ Reparto

✓ ADSORCIÓN: La separación se basa principalmente en la diferente afinidad

en términos de adsorción de los componentes de la muestra sobre la
superficie de un sólido activo.
Gases o líquidos contenidos en la fase móvil son retenidos por una adsorción selectiva en
la superficie del sólido que constituye la fase estacionaria. En la interfase sólido-fase móvil
hay un aumento de concentración respecto a la del seno de la fase móvil. Es el
mecanismo que controla las cromatografías gas-sólido y líquido-sólido. FIG.1

FIG 1: movimiento del analito en el proceso cromatográfico por adsorción

El fenómeno de adsorción ocurre en la superficie del gránulo de la fase fija,
fundamentándose en la atracción entre el soluto y el adsorbente por formaciones de
uniones dipolo y formación de puentes hidrógeno. Este tipo de cromatografía depende de:
a) el equilibrio establecido en la interfase entre el sólido adsorbido y la solución
aplicada como fase móvil
b) la solubilidad relativa del soluto en la fase móvil.
El soluto es adsorbido en la superficie del adsorbente y luego desorbido por el
solvente que corresponde a la fase móvil.
Si se trata de una mezcla de solutos, el más fuertemente atraído por el adsorbente, será
el más difícil de eluir y será el que se desplaza menos.
Este tipo de cromatografía se utiliza en tres de las técnicas anteriormente mencionadas:
C.C.D., preparativa y columna.

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FIG 2. Proceso cromatográfico por adsorción en placa

En la fig 2 puede visualizarse desarrollo del proceso cromatográfico que consta de

distintas etapas: siembra de la muestra y el patrón de interés, y las etapas b, c y d que
corresponden al desarrollo de este por acción del solvente. Como puede observarse el
soluto más retenido es el cuadrado blanco y el menos retenido es el que se representa
como el rombo negro. Esto se debe a la competencia entre las fuerzas de adsorción y
desorción de las moléculas del solvente con la del analito. Aquellas en donde el analito es
adsorbido más débilmente será más fácil de desorber, de esta forma el solvente de
desarrollo lo remueve, arrastrándolo, a medida que avanza sobre la fase estacionaria. Las
fuerzas con que los solutos se fijan al adsorbente resultan de la polaridad de estos. Un
solvente de desarrollo que es muy polar tiene una fuerza de elución grande. La
cromatografía de adsorción es una técnica particularmente útil para separar compuestos
de polaridad baja o media. La separación de compuestos muy polares mediante
cromatografía de adsorción requiere, debido a la gran retención que ofrecen, la utilización
de adsorbentes muy poco activos, o bien, tratamientos químicos previos a fin de reducir
su polaridad

Interpretación de los resultados

La velocidad con que una sustancia se desplaza puede establecerse mediante el
parámetro denominado Rf, factor de desplazamiento o índice de retención, que se define
como la relación entre la distancia de desplazamiento del soluto y la del disolvente fase
móvil.
Cuando el desplazamiento del soluto es muy pequeño respecto al del disolvente es
necesario pasar mucha fase móvil para que se desarrolle el cromatograma, siendo
preferible medir la distancia recorrida por el soluto frente a otra sustancia tomada como
referencia; en este caso el factor se denomina Rx. Los valores de Rf y Rx, para una
determinada especie, en un sistema cromatográfico dado es constante. FIG 3

Rf = Distancia recorrida por el soluto

Distancia recorrida por el disolvente

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Fig 3. Cromatograma: Rf, Rx

A mayor distancia recorrida por el solvente, mejor será la resolución lograda, puesto que
existen más cantidades de equilibrios adsorción-desorción.
La elección de un solvente o mezcla será aquél que produzca un Rf de 0,5 para el
compuesto único, o que separe el mayor número de componentes de la muestra. Valores
de Rf :
0,7-0,9, pueden estar indicando que el solvente es muy polar y no pudo desorberlo
selectivamente a los componentes
0,2-0,3; en este caso el solvente elegido resultó poco polar, con el consecuente
inconveniente de que pueden encontrarse manchas superpuesta debido a impurezas, no
habiéndose alcanzado la desorsión selectiva.

El Rf expresa la movilidad de un compuesto en el proceso cromatográfico, el cual se

ve influenciado por distintas variables, las cuales afectan la movilidad del analito:
polaridad donde tiene importancia el adsorbente, la estructura del soluto y el solvente de
desarrollo; por otra parte, también influyen otros factores como temperatura y saturación
de la cuba.
a) adsorbente se debe tener en cuenta:
La actividad o poder adsorbente de la fase estacionaria. Los adsorbentes más
comunes son: alúmina, silicatos de aluminio, óxido, carbonato de magnesio, óxidos,
carbonato y fosfato de calcio, como inorgánicos; y carbón, almidón y azúcares
como orgánicos.
La inercia química, este factor es fundamental al momento de su elección por
probables reacciones químicas entre los compuestos y el adsorbente. Ej. La
alúmina puede tener propiedades básicas y si el analito tiene algún componente
ácido podría quedar demasiado retenido debido a una interacción eléctrica por
formación de sales. Además, puede haber reacciones, como hidrólisis de ésteres, o
pueden deshidratar grupos funcionales lábiles de la muestra y consecuentemente,
modificar su estructura
El tamaño del gránulo del adsorbente es importante, porque una gran superficie
implica una mayor adsorción, y esto se traduce en una mejor resolución. Cuando
se utiliza el adsorbente de grano más fino el espacio entre gránulos es pequeño,
por lo que el equilibrio adsorción-desorción se establece rápido. Si el tamaño del
gránulo es grande, tal equilibrio será por lo tanto lento, debido a la lejanía entre
sitios activos de los sucesivos gránulos de adsorbente. Esto implica que el soluto
necesita estar solubilizado un cierto tiempo en el solvente de desarrollo, hasta
encontrar el siguiente sitio activo, esto se traduce en una difusión del analito
generando las manchas que se observan en la corrida cromatográfica.

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El empaquetamiento es fundamental en el desplazamiento del soluto para que
este se realice en forma pareja, rápida y homogénea.

b) estructura del soluto, la habilidad del soluto para ser adsorbido depende de su
polarizabilidad temporaria o permanente y de su capacidad para formar puentes
hidrógeno. En general, el poder de ser adsorbido aumenta con el incremento de
grupos funcionales unido a la misma molécula, pero existen casos en los cuales
dos grupos funcionales presentes pueden formar puente hidrógeno
intramoleculares y así adsorberse menos.
La fuerza con que se adsorbe cada grupo funcional sobre el adsorbente depende de su
habilidad para formar los siguientes tipos de uniones: tabla 1 y fig. 4

Tabla 1. Grupo funcional y tipo de unión al adsorbente

Grupo funcional Fuerza de unión al adsorbente

Soluto donante de H o ácidos de Lewis Uniones fuertes.

Soluto aceptor de H o bases de Lewis (Puente H; interacción entre dipolos permanentes)

Soluto con grupos funcionales polares Uniones más débiles (interacciones entre dipolos
o polarizables permanentes y transitorios y entre dipolos
transitorios)

Fig 4. tipos de interacciones sobre silica gel.

c) solvente de desarrollo, la elección correcta del solvente es vital para el éxito
separativo, este no debe reaccionar ni con el adsorbente ni con el analito, su
función es solo facilitar la separación en componentes que conforman el analito. Es
aconsejable usar solventes totalmente anhidros. La elección del solvente se realiza
teniendo en cuenta dos factores fundamentales: índice de polaridad del solvente y
fuerza del disolvente, este término significa el grado en que el solvente disminuye o
aumenta la retención del soluto.
El poder de elusión depende de la naturaleza del adsorbente y el compuesto a
eluir.
Sin embargo, el orden indica que un disolvente polar generalmente eluirá un
compuesto más rápido que un disolvente menos polar. De esto resulta que un
disolvente polar sea más efectivo que un disolvente no polar ya que puede
desplazar un compuesto de su sitio de absorción y ocupar estos sitios de
adsorción. Escoger el disolvente de elusión depende de cuan fuerte la mezcla se
mantiene unida al adsorbente. Si la mezcla solo se une débilmente, entonces será
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necesario un disolvente con poco poder eluyente, la mezcla eluiria demasiado
rápido y la separación sería muy poca; al contrario, si la mezcla se une fuertemente
al adsorbente, entonces es necesario un disolvente con un gran poder de elusión
para prevenir que la mezcla eluya demasiado lenta o no eluya.
En la figura se observa como eluye o no los analitos en función a la polaridad de
los mismos, el adsorbente y el solvente. Fig 5

Fig.5 analitos-solvente-adsorbente

d) Temperatura del desarrollo cromatográfica. esta debe ser controlada durante todo
el proceso cromatográfico, ya que afecta volatilidades y solubilidades, de esta
forma puede ser reproducible el ensayo. Puede evaporarse el solvente provocando
una CÁMARA MAL SATURADA o saturación insuficiente provoca evaporación de
la fase eluyente Fig. 6

Fig. 6 cuba mal saturada y controlada la temperatura

Saturación de la cuba: es aconsejable tener presente que antes de poner a

desarrollar el cromatograma la cuba se encuentre en una atmósfera del solvente,
permitiendo así ascender por capilaridad continuamente sin evaporarse, de no ser
así tenderá a evaporarse de la capa de adsorbente, para equilibrar al líquido con su
presión de vapor, lo que implica en un ascenso no homogéneo.

e) Distancia de desarrollo de la fase móvil. Fig. 7

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f) Relación masa/superficie de la placa. demasiada muestra sembrada genera colas.

Muestra mal seca genera anillos. Fig.8

Fig.8. relación masa/superficie de la placa

g) SIEMBRA DEMASIADO BAJA/ EXCESO DE H°: estas manchas la dan cuando el

nivel del solvente se encuentra por encima de siembra. La mancha que eluyó,
muestra cuando tanto el solvente como la placa no se encuentran totalmente libre
de agua. En ambos casos la muestra difunde. Fig. 9

Fig. 9. Siembra debajo baja o exceso de humedad

✓ REPARTO: Los componentes de la fase móvil, gases o líquidos, son

retenidos por la fase estacionaria, líquida, en función de su solubilidad en
ella. Si las dos fases son líquidas se tiene realmente un proceso de
extracción en continuo.
Algunos ejemplos de este tipo de cromatografía son las cromatografías sobre papel, sílice
hidratada y fase inversa en la cromatografía líquida de alta eficacia.
La mayor o menor migración de un componente en este tipo de cromatografía será
función del coeficiente de reparto de éste entre la fase estacionaria y la fase móvil:

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Este tipo de cromatografía es comúnmente de papel, en donde el agua del papel es la

fase fija, la cual tiene un poder de disolución distinto que el agua pura frente a los solutos.
Por esto es posible una partición entre el “agua” de la fase estacionaria y otros solventes
inmiscible o no que inclusive, puede ser agua pura.
Este proceso implica la distribución diferencial de un soluto o sustancia adsorbible entre
dos fases, una de las cuales está inmóvil (adsorbente o papel) y la otra móvil (disolventes
o portadores). FIG. 10

FIG. 10 distribución diferencial de un soluto entre dos fases

En cierta forma, lo anterior corresponde al paso sucesivo a contracorriente de un soluto
entre numerosísimos embudos de separación unidos secuencialmente. Así la fase móvil
se pone en equilibrio con una porción de la fase estacionaria y luego fluye hacia la
siguiente porción, donde vuelve a ponerse en equilibrio, y a continuación fluye hacia la
tercera fase estacionaria y así sucesivamente, alcanzando el equilibrio de reparto en cada
uno de ellos.
Supongamos el siguiente ejemplo: se considera la separación de una mezcla de dos
compuestos A y B cuyos coeficientes de reparto
K = (Cfase estacionaria/Cfase móvil)
KA = 2 para el compuesto A (•) y
KB = 1/2 para el compuesto B (x),
Como puede observarse en la Fig 11., donde la fase estacionaria es el agua que contiene
la celulosa de una tira de papel en el cual se desarrolla el proceso cromatográfico.
Cuando el disolvente penetra en la célula de papel, las dos sustancias se reparten según
la ley de reparto KA=2 y KB=1/2; se suceden las siguientes secuencias:
✓ En la fase estacionaria hay 9 (•) y 9 (X).
✓ En el primer reparto KA= (6/3) y KB= (3/6).
✓ El disolvente se mueve hacia la siguiente celda que contiene solo agua y, por otra
parte, el disolvente puro se pone en contacto con la primera celda.
Tiene lugar un nuevo reparto según la ley de distribución anterior.
Se observa la distribución de los componentes conforme se avanza en el desarrollo
cromatográfico hasta la separación total.

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FIG 11 distribución de los componentes conforme se avanza en el desarrollo cromatográfico

hasta la separación total.
Se utiliza el criterio de Rf para medir la relación de frente del analito, pero estos valores
dependen del coeficiente de partición y de las cantidades relativas de las dos fases en
contacto.
De igual modo que lo visto para la cromatografía de adsorción, el solvente de desarrollo y
la naturaleza de los grupos funcionales presentes en los solutos, son las variables más
importantes que determinan las movilidades relativas entre ellos.
Como la fase móvil es un solvente orgánico saturado en agua, la polaridad de esta fase,
será siempre menor que la de la fase fija (agua). Resultarán por lo tanto más retenidas las
sustancias más polares, y más desplazadas, de la zona de siembra, las sustancias menos
polares.
Como se planteará anteriormente este proceso de separación se da sobre papel y se
utiliza frente a analitos de polaridad media y alta; pero existe una variante a este método,
ya que sustancias que son escasamente solubles en agua no se podrían separar por esta
técnica, porque la sustancia avanzaría con el frente del disolvente, es por ello que la
modificación planteada consiste en secar el papel e impregnándolo con aceite de oliva,
silicona, parafina o goma latex. El papel así impregnado, se lo utiliza procediendo primero
a la siembra de los componentes y a continuación el desarrollo cromatográfico

OTROS MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA SEPARACION

CROMATOGRAFICAS

• Intercambio iónico
La separación se basa principalmente en la diferente afinidad para el intercambio de iones
de los componentes de la muestra Fig 12
La fase estacionaria está constituida por un sólido que puede intercambiar iones
propios con iones contenidos en la fase móvil, líquida. El intercambio de iones sólidos-

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solución está regulado por la afinidad química de los iones con ambas fases y por sus
respectivas concentraciones.

FIG 12 Esquema del proceso de separación por cromatografía de intercambio iónico.

La carga de la matriz de la columna, así como la carga de las moléculas dependerá del
pH del disolvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). Según
determinadas condiciones serán retenidas en la columna las moléculas o especies que
tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las moléculas cargadas
negativamente serán retenidas por una matriz cargada positivamente), siendo eluidas las
restantes. Para eluir las moléculas retenidas se puede variar la carga iónica del disolvente
o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la moléculas o especies de
interés o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las moléculas
en la columna.

• Tamaño molecular
La separación se basa principalmente en efectos de exclusión, tales como las diferencias
de tamaño molecular o de forma, o las diferencias de carga. Se puede denominar también
cromatografía de exclusión por tamaños, SEC, cuando la separación se basa en el
tamaño molecular. Anteriormente se usaban los términos siguientes: filtración en gel y
cromatografía de permeación en gel (GPC), cuando la fase estacionaria es un gel
hinchado. El término cromatografía de exclusión de iones se usa específicamente para
la separación de iones en una fase acuosa
En este tipo de cromatografía la fase estacionaria está formada por un gel
hidrofílico altamente poroso que retiene las moléculas de tamaño inferior al de los poros,
que difunden dentro de los mismos. Las moléculas de tamaño superior sólo son
retardadas en su paso por pequeñas fuerzas de adsorción de la superficie externa del gel,
por lo que son rápidamente excluidas de la fase estacionaria. FIG 13
En esta cromatografía se eluyen primero las macromoléculas mayores, y en segundo
lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y
el volumen de esta. Columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad.
Empleando patrones de macromoléculas de masa molecular conocida se pueden
construir curvas de calibrado que posteriormente permitan la determinación de la masa
molecular de macromoléculas de tamaño desconocido. El rango de trabajo de las fases
estacionarias se define como el intervalo de masas moleculares que pueden ser
separadas. Otro parámetro que caracteriza a este tipo de fases es su límite de exclusión
que se define como la masa molecular a partir de la cual los compuestos pasarán a través
del lecho estacionario sin experimentar retención.
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FIG 13.- Esquema del proceso de separación por cromatografía de exclusión por tamaños.

TECNICAS UTILIZADAS
1) cromatografía columna:
A) de adsorción
La fase estacionaria está constituida por un sólido adsorbente que se empaqueta
en una columna, normalmente de vidrio.
Son muchos los sólidos que se han utilizado como fase estacionaria en
cromatografía de adsorción.
En la fase móvil generalmente se utiliza agua, alcoholes, cetonas, ésteres,
cloroformo, tetracloruro de carbono, etc. Su capacidad de elución depende de su
polaridad, del adsorbente y de las especies a eluir.
Los componentes a separar se añaden en forma soluble por la parte superior de la
columna, quedando retenidos en la misma; luego con el agregado de la fase móvil se
desplazan, pero depende de la adsorción selectiva de cada uno de los componentes en la
fase estacionaria. El desplazamiento se produce a distintas velocidades.
El adsorbente más utilizado es aquél cuyo tamaño de gránulo oscila entre 600 y
200 micrones. Esto implica una resolución separativa menor en la columna, que en la
placa. Si se utiliza adsorbentes de granulo más fino (10 y 40 micrones, igual a utilizado en
capa delgada) se obtendrá un empacado muy denso, siendo el pasaje del solvente
extremadamente lento, para mejorar se hace necesario forzar el flujo con presión.
Es aconsejable cuando se trabaja con columna el solvente a utilizar sea a modo
gradiente de polaridades, permitiendo de este modo separar los componentes por
polaridades.
Al momento de elegir el largo del relleno de la columna, para de este modo mejorar
la resolución, es necesario saber si este paso no implica inconvenientes en el tiempo de
elusión grande, difusión importantes y posibles alteración de muestras lábiles.
B) de reparto
Esta técnica es semejante a la anterior en lo que respecta a modo operativo y al
equipo utilizado; la diferencia reside en que la fase estacionaria utilizada es un líquido,
poco miscible con la fase móvil, dónde los solutos se distribuyen entre las dos fases
dependiendo de su solubilidad en cada una de ellas (según su coeficiente de reparto).
El líquido, fase estacionaria debe ser en la medida de lo posible inerte frente a las
especies a separar. Los sólidos soportes más utilizados son el silicagel, el polvo de
celulosa y tierras diatomeas. FIG 14

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FIG 14 interior de una columna de reparto

velocidad de elución esta variable es tenida en cuenta cuando se realiza cromatografía

en columna y debiéndose manejarse de manera tal que permita que se puedan alcanzar
los equilibrios de adsorción-desorción, lográndose bandas netas y una correcta
separación de los componentes del analito.

C) geles porosos
El fundamento de este tipo de cromatografía consiste que al hincharse el gel queda
una cadena muy abierta con grupos terminales generalmente polares que son capaces de
adsorber agua u otros disolventes polares. Según el número de ligaduras entre las
grandes cadenas existe un tamaño crítico de la molécula que puede entrar en el interior
del gel, mientras que las moléculas de mayor tamaño pasarán a través del mismo,
originándose la separación de las moléculas de acuerdo a los diferentes tamaños.
Existen diversos geles uno de ellos es Sephadex, otro es Biogel; se usan también
geles hidrofílicos a base de agar-agar, agarosa, etc.
En la figura 15 se representan cuatro etapas de separación; los puntos gruesos significan
moléculas mayores; las pequeñas moléculas menores y los círculos blancos partículas de
gel.

FIG 15 se representan etapas de separación

2) Cromatografía sobre capa delgada (TLC)

En este tipo de cromatografía la separación de las sustancias de una mezcla es por

migración diferencial sobre una capa delgada de un adsorbente o gel, con o sin
aglutinante, sobre un soporte rígido o flexible.
Cuando se trabaja con placa se tienen en cuenta los conceptos vertidos
anteriormente con la salvedad que el soporte es inerte y parejo, cosa que le permite al
soluto correr en forma más pareja y sin reaccionar con el soporte

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3) Cromatografías en papel
En la cromatografía sobre papel, este actúa de soporte cromatográfico, y el agua
retenida sobre las fibras de celulosa, se comporta como fase fija. El paso de la fase móvil
por estos canales (provocado por las fibras de celulosa) cuyo diámetro es variable
continuamente, le proporciona a dicha fase el gradiente de energía libre necesario para
que continúe desplazándose a lo largo de las fibras celulósicas. Mientras esto ocurre, los
solutos son retenidos selectivamente. La distancia recorrida por una sustancia particular,
en un tiempo fijo y en condiciones específicas, es función de la resultante de la fuerza
impulsora y de la fuerza que la retiene.
A parte de saber que el proceso de separación se funda en el concepto de partición
(reparto), es clave la característica de la fase móvil.
Si se eluye con un disolvente acuoso (cromatografía simple) los componentes son
arrastrados por dicho disolvente que normalmente se desplaza por capilaridad (a veces
también a favor o en contra de la gravedad) y son retenidas fundamentalmente por
adsorción en el papel, participando también en el mecanismo de retención, fenómenos de
intercambio iónico debido a grupos carboxilos residuales que presenta la celulosa.
Cuando se eluye con un disolvente no polar hay que tener en cuenta que la celulosa del
papel contiene agua retenida por adsorción. En este caso el mecanismo fundamental de
la separación es el reparto de los componentes entre la fase móvil no polar y la fase
estacionaria acuosa, aunque también participan fenómenos de adsorción y de
intercambio.

REVELADORES:
Una vez que el eluyente sobre la placa se ha secado se ha de proceder a la visualización
del cromatograma. En determinados casos, si los compuestos son coloreados esto puede
realizarse de forma directa. Sin embargo, para compuestos incoloros es necesario utilizar
diferentes técnicas de revelado:
a) Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase estacionaria
impregnada con un indicador fluorescente (F25a ó F366), el número que aparece como
subíndice nos indica Ia longitud de onda de excitación del indicador utilizado" Ello permite
visualizar el cromatograma iluminando la placa con una lámpara de luz ultravioleta UV.
Los diferentes compuestos aparecen en la placa como manchas circulares.
b) La introducción de la placa en vapores de yodo Para ello la placa se introduce en una
cubeta que contiene cristales con Iodo y se deja estar en ella durante unos minutos. Los
vapores de iodo se disuelven en las manchas de los compuestos orgánicos tiñéndolas de
color marrón
c)El rocío con una solución de agua H2SO4 1:1 (dentro de un compartimiento
especialmente protegido y bajo una campana de extracción de gases). Después calentar
intensamente, por ejemplo, con un mechero. hasta carbonizar los compuestos
Las placas de cromatografía comerciales portan un agente fluorescente inorgánico en la
fase estacionaria.
d)Diferentes reactivos orgánicos también permiten el revelado permanente de la placa,
obteniéndose manchas coloreadas en los compuestos separados sobre la placa por
alguna reacción con alguna parte de la molécula.

Bibliografía:
1) Burriel F., Lucena F. y Arribas S.: "Química Analítica Cualitativa",15 edición,
Editorial Paraninfo, Madrid, 1994.
2) Galagovsky Kurman L., “Química Orgánica: Fundamentos teórico-prácticos para el
laboratorio”, 6 ta ed., EUDEBA, [Link]., 1999.

Dra. Bellozas Reinhard M_ Mg. Scoles G.- Dra. García P.-Dra Castaño C. 14
 Química Analítica – Química Orgánica Apunte Cromatografía
3) Domínguez X. A., Monografía Nº 16 “Cromatografía en papel y en capa delgada”,
2da ed., Departamento de Asuntos Científicos y Tecnológicos Secretaría General de
la O.E.A., 1982.

Dra. Bellozas Reinhard M_ Mg. Scoles G.- Dra. García P.-Dra Castaño C. 15