FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES

ÁREA DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR E INGENIERÍA BIOQUÍMICA

GRADO EN BIOTECNOLOGÍA

PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA: METABOLISMO Y SU REGULACIÓN

CURSO 2019-2020

Inmunodetección de la Proteína Actina

NOMBRE……………………………………………….
OBJETIVOS

Desarrollo y aprendizaje de la técnica de detección de una proteína mediante su unión

a un anticuerpo (Inmunodetección o Western Blotting, WB).

FUNDAMENTO

El Western Blotting es una técnica analítica que permite identificar una proteína
determinada en una muestra biológica que contenga miles de proteínas diferentes.

La técnica consta de las etapas siguientes:

1. Separación de las proteínas presentes en la muestra en función de su peso

molecular mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes (SDS-PAGE).
2. Transferencia de las proteínas separadas a un soporte rígido (en la práctica a
una membrana de PDVF) mediante la aplicación de un campo eléctrico
perpendicular al gel (electroblotting).
3. Exposición de la membrana a un anticuerpo (Ac) que se une específicamente
a la proteína de interés, que actúa como antígeno (Ag).
4. Tinción o revelado
Ya que el complejo Ag/Ab no se ve, es necesario realizar un proceso de
tinción.
En esta práctica se empleará un Anticuerpo anti IgG de ratón acoplado a la
enzima fosfatasa alcalina. Tras añadir un reactivo apropiado, donde se
encuentre el complejo Ag/Ab/ Ac-fosfatasa alcalina aparecerá una señal
visible.

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

MATERIALES

Equipos

 Micropipetas semiautomáticas
 Vórtex
 Termobloque
 Sistema para electroforesis
 Sistema de transferencia húmeda
 Membrana de PVDF
 Papel de filtro Whatman
 Agitador orbital
 Cubetas de plástico

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Soluciones:

- Buffer lisis
Inhibidor de fosfatasas 10µl
Inhibidor de proteasas 40µl
Buffer de lisis RIPA- (Radio-Immunoprecipitation Assay) 950µl

- Buffer Laemmly 5x
Tris base 3.79 g
SDS 5g
H2Od 50 ml
Ajustar a pH 8,5
Glicerol 25 ml
Azul de bromofenol 75 mg
Completar hasta 100 ml con H2Od
Cada vez que se vaya a utilizar: añadir 25 µl de β-mercaptoetanol por cada ml de
Laemmly 5x

- Tampón Tris 1,5M pH 8,8

Tris HCl 118,2 gr
H2Od 400 ml
Ajustar a pH 8,8
Completar hasta 500 ml con H2Od

- Tampón Tris 1M pH 6,8

Tris HCl 78,8 gr
H2Od 400 ml
Ajustar a pH 6,8
Completar hasta 500 ml con H2Od

- Tampón de Electroforesis (Running Buffer) 10x

Tris base 30 gr
Glicina 145 gr
SDS 10% 100 ml
Completar hasta 1000 ml con H2Od

- Tampón de Transferencia (Transfer Buffer) 10x

Tris base 58,2 gr
Glicina 29,3 gr
Completar hasta 1000 ml con H2Od

Tampón de Transferencia (Transfer Buffer) 1x

Transfer buffer 10x 100 ml
Metanol 200 ml
SDS 10% 3,75 ml

Tampón TBS 10x

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 Tris Base 12 gr
NaCl 88 gr
H2Od 800 ml
Ajustar a pH 7,5
Completar hasta 1000 ml con H2Od

Tampón TBS-Tween 0,1% )TBS-T)

TBS 10x 100 ml
H2Od 900 ml
Tween 1 ml

Membrana de PDVF (Polyvinylidene fluoride)-Pall Life Sciences #P/N 66543

Solución de tinción de proteínas
Rojo Ponceau Solución (0.1% Ponceau S (p/v) en 5% ácido acético (v/v)-(Sigma -
#P7170)
Anticuerpo anti-actina-(Sigma - #A5441)
Anticuerpo anti-IgG de ratón acoplado a fosfatasa alcalina-(Sigma - #A4312)
Sustrato de la fosfatasa alcalina (BCIP/NBT) -(Calbiochem- #203790)
Marcador Proteico de peso molecular: (Thermo Scientific #26619)

PROTOCOLO
Extracción y cuantificación de proteínas
(Realizada previamente en el laboratorio)
1. Preparación del buffer de lisis.
2. Incubar 30 minutos los pellets de células con buffer de lisis (1.10 6 células + 100 µL
buffer de lisis) en hielo. Las células que se emplean en la práctica son la línea de
células embrionarias de ratón D1. Su contaje se lleva a cabo mediante microscopía
óptica en cámara de Neubauer.
3. Centrifugar a 13.000 rpm durante 20 minutos a 4ºC
4. Recuperar el sobrenadante
5. Cuantificación de proteínas en el sobrenadante ( con la técnica de Bradford)

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Preparación de geles (están preparados previamente)
1. Preparar el molde para los geles (usar cristal externo de 1 mm y cristal fino). Lavar
los cristales antes de usarlos con agua y jabón y luego con etanol. Secar bien y
montar. Comprobar su estanqueidad con agua destilada. Eliminar el agua y secar
con papel de filtro antes de añadir el gel.

2. Geles de apilamiento y de separación

Gel de separación 10% Gel de apilamiento

H2Od 4.0 ml H2Od 1.90 ml
Tampón Tris pH 8,8 2.5 ml Tampón Tris pH 6,8 830 µl
Sol. Acrilamida 2.48 ml Sol. Acrilamida 430 µl
/Bisacrilamida 40% /Bisacrilamida 40%
SDS 10% 100 µl SDS 10% 33 µl
APS 10% 50 µl APS 10% 16 µl
TEMED 5-10 µl TEMED 5 µl

Nota: el APS (Ammonium persulfate) y el TEMED (tetrametiletilendiamina) se añaden

justo en el momento de usar cada fase. Mezclar bien después de añadirlos
3. Añadir el gel de separación lentamente con una pipeta Pasteur hasta dejar unos 2
cm libres en la parte superior. Añadir agua hasta arriba y dejar solidificar unos
minutos
4. Retirar y secar el agua del molde y añadir el gel de apilamiento
5. Rápidamente colocar el peine y dejar solidificar unos minutos

DIA 1

Carga del gel

1. Colocar los geles en la cubeta de electroforesis y añadir tampón de electroforesis
en el interior. Limpiar los pocillos.
2. Preparar el cóctel de proteínas (1/5 parte de buffer Laemmly 5x y 4/5 partes de
solución de proteínas) y desnaturalizar 5 minutos a 95ºC en el termobloque.
3. Depositar (cargar) los pocillos con un volumen de solución de proteínas
equivalente a 10 microgramos.
4. Añadir el tampónee de electroforesis en el exterior y conectar el sistema para
empezar la electroforesis. Aplicar la corriente eléctrica al gel durante 30 minutos a
100 V y 30-40 minutos a 140 V (corriente continua). La franja azul ( Azul de
Bromofenol) indica cómo avanza el frente durante la electroforesis.

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Transferencia
1. Hacer un sándwich que contenga el gel de PA, la membrana de PDVF y los papeles
de filtro empapados en buffer de transferencia según el siguiente esquema:

Ojo!: activar la membrana de PVDF, 10-15 seg. en metanol.

2. Añadir tampón de transferencia al interior y dejar que se vaya llenando toda la caja
3. Aplicar una corriente de 90 mA (corriente continua, DC) durante 24 h. La
transferencia se hace en frío.

DIA 2
Tinción
1. Una vez finalizada la transferencia, se deposita la membrana en una cubeta que
contenga la solución rojo Ponceau. Esperar unos 5 minutos.
2. Quitar el rojo Ponceau y lavar la membrana con H 2Od hasta eliminar la coloración
de fondo (normalmente con 3 lavados es suficiente). Aparecerán marcadas de rojo
todas las proteínas presentes en la muestra. Este paso sirve para comprobar que la
electroforesis y la transferencia han sido correctas.

Inmunodetección

Para identificar la proteína de interés (en este caso la actina), se emplea un anticuerpo
que la reconozca específicamente y que por tanto no reaccionará con el resto de las
proteínas. Este proceso se llama inmunodetección.

Etapas

1. Lavar la membrana en TBS-Tween 0.1%, 3 veces durante 3 min.

2. Incubar con el anticuerpo anti-actina (anticuerpo monoclonal Anti -β-actina de
ratón).
Previamente se ha optimizado la dilución de anticuerpo (en la jerga de laboratorio
a la dilución del anticuerpo se la llama título) necesaria para que se una a la

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 proteína en la membrana y así se pueda identificar y visualizar el complejo Ag/Ab
posteriormente.
El título de anticuerpo que hemos establecido para esta práctica es de 1:5000
(v/v). La dilución del anticuerpo se lleva a cabo con leche descremada (5% (w/v) en
TBS-T. Se utiliza leche porque contiene una alta concentración de proteínas (~ 3%) ,
pero se puede emplear cualquier otra fuente de proteínas. El objeto de emplear
una alta concentración de proteínas es saturar la membrana y con ello reducir la
adsorción inespecífica del anticuerpo a ella (background). Se emplea 10 ml de la
dilución de anticuerpo que se deposita en la cubeta de plástico donde se
encuentra la membrana lavada (paso 1).
La incubación se lleva a cabo durante 30 min a temperatura ambiente y agitación
orbital (para que toda la membrana esté en contacto con la solución de
anticuerpo).

Tinción/Revelado
El propósito de esta etapa del protocolo es la visualización del complejo
actina/anticuerpo anti-actina
Para ello:
1. Quitar la disolución de anticuerpo (guardarla en un tubo de ensayo apropiado).
2. Lavar la membrana en TBS-Tween 0.1%, 3 veces durante 3 minutos.
3. Incubar con el anticuerpo secundario Anti-Mouse IgG (whole molecule)−Alkaline
Phosphatase (diluido en leche al 5% en TBS-T, 1:20.000 v/v) durante 30 min a
temperatura ambiente y agitación orbital.
1. Lavar la membrana en TBS-Tween 0.1%, 3 veces durante 3 min.
2. Tinción de la membrana: cubrir la membrana con 5ml de solución BCIP/NBT
durante 10 min en oscuridad.

Resultado
Aparece una sola banda azulada que se corresponde con la actina

CUESTIONES

1.-Describe brevemente el fundamento teórico de la técnica de Western Blot.

2.-Enumera brevemente los pasos a seguir en la técnica Western Blot.

3.-¿Cómo influyen el porcentaje de acrilamida/bisacrilamida, el APS y el TEMED en la

formación del gel?

4.-¿Por qué es importante el bloqueo de la membrana?

5.-Explica el resultado obtenido: Busca el peso molecular de la actina y compáralo con el que
resulta de su migración en el gel (emplea para ello los pesos moleculares de los marcadores
coloreados) ¿Podrían encontrase más bandas? ¿Por qué?

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