Universidad Simón Bolívar,
Laboratorio de Bioquímica (BC-3181)
Ácidos Nucleicos
INFORME - Practica 5
Fecha: 02 y 09 de marzo de 2023 Franci Blanco 1810880 - Jessica Rodríguez, 1511670
RESUMEN
INTRODUCCIÓN
La unidad estructural de un ácido nucleico es el nucleótido, que desempeña una amplia
variedad de funciones dentro del metabolismo celular: actúan con señales químicas que
responden a hormonas y otros estímulos extracelulares, componen cofactores enzimáticos e
intermediarios metabólicos y operan como fuente de energía en reacciones metabólicas
entre otras labores (Biología Celular USB, 2019, Nelson et al., 2008, McKee, 2009, Stryer
et al., 2020).
Los nucleótidos están formados por tres componentes: una base nitrogenada (guanina,
adenina, citosina y timina), una pentosa y un grupo fosfato. La base está unida mediante un
enlace N-β-glucosídico al carbono 1’ de la pentosa, y el fosfato está esterificado con el
carbono 5’(Pierce et al., 2016). La concatenación de nucleótidos es lo que forma los ´ácidos
nucleicos por medio de enlaces fosfodiéster entre el grupo hidroxilo en el carbono 5’ de un
nucleótido, y el grupo hidroxilo en el carbono 3’ del nucleótido siguiente (Nelson et al.,
2008, McKee, 2009, Stryer et al., 2020).
Hay dos ácidos nucleicos: ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN).
La estructura del ADN fue dilucidada en 1953 por James Watson y Francis Crick. En este
caso debido a la complementariedad de las bases nitrogenadas (adenina con timina y
guanina con citosina), la unión de dos cadenas o hebras complementarias provoca el
apareamiento de sus bases mediante puentes de hidrógeno (dos enlaces de hidrogeno para
la unión de adenina con timina, y tres enlaces entre guanina y citosina), creando un ADN
bicatenario con hebras antiparalelas (Nelson et al., 2008, McKee, 2009, Stryer et al., 2020).
El ADN bicatenario adquiere una conformación de doble hélice cuyas bases hidrofóbicas se
encuentran en el interior y el esqueleto de fosfatos se encuentra en el exterior, permitiendo
que la molécula sea soluble en agua. Esta estructura tan estable, junto con la ausencia de un
grupo hidroxilo en el carbono 2´ de la desoxirribosa de cada nucleótidos, hace que el ADN
sea una molécula ideal para el almacenamiento de información, además de que permite su
paso a las siguientes generaciones con alta fidelidad (Herráez, 2012).
Los seres vivos pueden contener diversos tipos de ADN. Los organismos eucariotas tienen
cromosomas lineales de gran tamaño confinados en el núcleo, las células animales
adicionalmente tienen ADN mitocondrial de menor tamaño y circular, mientras que las
células vegetales además del ADN mitocondrial también tienen ADN circular en los
cloroplastos (Lodish et al., 2016). En cambio, las bacterias tienen un cromosoma circular,
ubicado en el nucleoide en el citoplasma, junto con los plásmidos, que son pequeñas
moléculas de ADN extracromosómico, generalmente circular, de doble cadena, que se
replican de manera independiente al ADN cromosómico. Los plásmidos aparecen de forma
natural en las bacterias. Su tamaño varía entre 1 y más de 1,000 kpb, no son esenciales para
su supervivencia, pero pueden conferirles ventajas como la resistencia a un antibiótico
(Pierce et al., 2016).
Debido a que el ADN se encuentra dentro de las células y esta contiene varios tipos de
ácidos nucleicos, las técnicas de purificación son esenciales para obtener muestras
concentradas del ADN de un organismo que pueden ser usadas para clonación celular o
PCR, identificación de genes, estudios forenses o evolutivos, diagnóstico de enfermedades,
entre otro sin fín de aplicaciones (Brown, 2016). La purificación de ADN consiste en varias
etapas que van desde la toma de una muestra de tejido, la disociación de las células, el
estudio de viabilidad y caracterización celular, la lisis de las células, el fraccionamiento
subcelular y la separación del conjunto de lípidos, proteínas u otras moléculas utilizando
compuestos químicos con los que se puede alterar selectivamente la solubilidad de las
moléculas y hacer que precipiten.
Otra molécula similar al ADN es el ARN, cuyas diferencias consisten en que su pentosa es
una ribosa, por lo que tienen el grupo hidroxilo en el carbono 2´ de la desoxirribosa, la
timina es sustituida por el uracilo, y se encuentra de forma monocatenaria. Debido a su
menor estabilidad estructural, no cumple funciones de almacenamiento de información (a
excepción de algunos virus), sino que van orientado a la síntesis de proteínas, como ARN
mensajeros, de transferencia o ribosómico, o para regular la expresión génica, como por
ejemplo los ARN de interferencia (Pierce et al., 2016).
Los procesos para su purificación son similares al del ADN, pero es necesario tener un
especial cuidado debido a la frecuente contaminación con ARNasas (Herráez, 2012).
Por último, las nucleasas son enzimas que hidrolizan los enlaces fosfodiéster de los
polímeros de ácidos nucleicos, pudiendo clasificarse en exonucleasas si remueven un
nucleótido a la vez en los extremos de la molécula, o endonucleasas si cortan en secuencias
internas específicas (Herráez, 2012). Con el tratamiento de una muestra de ADN con
enzimas de restricción se puede, por ejemplo, crear fragmentos que pueden ser insertados
en un vector de clonación mediante técnicas de ADN recombinante, o separar estos
fragmentos mediante electroforesis en gel, atraídos por su carga negativa, para crear mapas
de restricción que permitan la identificación de polimorfismos.
La evaluación de la pureza y concentración del ADN aislado puede realizarse con facilidad
al medir su absorbancia mediante espectrofotometría a las longitudes 260 y 280 nm del
espectro UV. Los ácidos nucleicos tienen un pico de absorción a 260 nm debido a los
anillos aromáticos de sus bases nitrogenadas, mientras que el pico de absorción de las
proteínas es a 280 nm. Al medir la absorbancia de una muestra de ADN a esas dos
longitudes de onda, se considera como pura si la relación A260/A280 es de 1.8, mientras
que valores inferiores indican la presencia de contaminantes (Brown, 2016). La
concentración se puede calcular sabiendo que 1 D.O equivale a 50 µg de ADN por mililitro
(Ganske, 2014). Purificar los acidos nucleicos es un paso clave en experimentos de biología
molecular; el aislamiento del ADN ha permitido avances sobre el estudio de mutaciones
causantes de enfermedades para permitir un diagnóstico certero y su respectiva terapia; así
como para analizar patrones de distribución y diversidad genética en poblaciones de
animales salvajes.
Todo comienza con la extracción del polímero de un organismo y termina con su
precipitación usando sales y un alcohol (Castaño et al., 1996). En soluciones acuosas el
ADN se disuelve debido a la repulsión entre sus grupos fosfatos, que están cargados
negativamente; esto forma una capa hidratante alrededor de la molécula. La presencia de un
alcohol reduce la constante diaeléctrica del solvente, rompe la capa hidratante y quedan
expuestos los fosfatos. Estas condiciones favorecen la unión con cationes,
aportados por la sal, que disminuyen las fuerzas repulsivas entre los nucleótidos y permiten
al ADN precipitar (Cornejo Romero et al., 2014). El objetivo de la experiencia expuesta en
este informe es extraer ADN genómico de sangre humana y ADN plasmídico de una
bacteria para cuantificar la concentración y pureza de ADN presente en los extractos de
mediante espectrofotometría UV.
Además de separar ácidos nucleicos digeridos con la endonucleasa de restricción EcoRV y
comparar los patrones de bandas de ADN digerido y sin digerir separados por electroforesis
en geles de agarosa
En este sentido, la electroforesis de ADN sobre gel de agarosa es una herramienta
importante en diversos campos de la biología. La idea de usar la electroforesis para
cuantificar el ADN surgió en los años 60 del siglo XX de la mano de Vin Thorne, un
bioquímico del Instituto de virología de Glasgow; el usó la electroforesis para separar y
visualizar el ADN del polyomavirus. El razonamiento de Thorne es que la carga negativa
de los ácidos nucleídos los obliga a migrar hacia el ánodo cuando son sometidos a un
campo eléctrico; al estar en contacto con una superficie rugosa como un gel, la fricción
hace que las moléculas más grandes de desplacen con mayor lentitud, mientras las más
pequeñas avanzan más en el gel (Cornejo et al, 2014). Fueron Matsubara y Takagi quienes
propusieron usar agarosa para fabricar el gel de corrimiento en 1969 debido a sus
características al ser gelificada: consiste en una bobina aleatoria de doble hélice al inicio de
la gelificación y a medida que avanza se forman las dobles hélices finales; esto crea una red
fibrosa que puede ser usada como filtro para clasificar diferentes moléculas (Montalvo,
Navarro y Lugo Flores, 2019).
METODOLOGÍA
RESULTADOS
En relación a los resultados de la primera etapa, vinculados a la determinación de la pureza
de las muestras, se consideran tantos los valores obtenidos experimentalmente en el
laboratorio el día 02 de marzo de 2023, como los proporcionados por la profesora, quien
repitió la experiencia.
En este sentido, durante la extracción en el laboratorio del ADN Genómico después de
centrifugar se apreció un pellet blanco, en lugar de transparente, lo que sugiere
contaminación con cloroformo; mientras que en el caso del ADN plasmídico las muestras
se tornaron turbias al agregar el buffer de extracción y al centrifugar se pudo observar un
pellet pálido en el fondo del tubo. En ninguno de los casos tras agregar el etanol se
visualizaron los hilos que se forman durante la precipitación del ADN.
Después de agregarle 50 μl de TE se midió la absorbancia a distintas concentraciones. La
Tabla $$$$ resume los valores detectados en las muestras realizadas en la práctica del
laboratorio y la Tabla $$$$ muestra las mediciones proporcionadas.
Tabla $$$: Mediciones de absorbancia muestras de ADN
realizadas en el Laboratorio.
Absorbancia
Muestra Volumen (μl) C (ng/μl) DO (260/280)
260 nm 280 nm
2 0 0 0
ADN Genómico 4 0,0808 0,06 1,346667
6 0,1039 0,0738 1,407859
2 0,0105 0,0093 1,129032
ADN
4 0,0191 0,0149 1,281879
Plasmídico
6 0,0342 0,0252 1,357143
Se aprecia que los valores obtenidos de DO260/DO280 se incrementaron conforme se
trabajó con muestras de mayor volumen, lo cual corresponde a una mayor concentración de
ADN. En el caso de ADN Genómico, se desestimó el valor de la medición a 2 µl, pero aun
así varió de 1,35 (4 µl) hasta 1,41 (6 µl); mientras que las de ADN Plasmídico variaron de
1,13 (2 µl) hasta 1,36 (6 µl). En ninguno de los casos se alcanzó la relación
DO260/DO280 para un ADN purificado de 1.8 a 2, lo que indicó que las muestras
posiblemente estaban contaminadas, Verificar concentración, pues estos indicadores son
aplicables a muestras de igual o mayores a 50 ng/μl.
Tabla $$$: Mediciones de absorbancia proporcionadas
por el equipo profesoral
Muestra C (ng/μl) Abs. 260 nm Abs. 280 nm DO260/DO280
Blanco 1 0,0009 0,0011 0,81818182
ADN genómico 2 0,1217 0,0722 1,68559557
ADN Plasmídico 1 0,8791 0,4574 1,92195015
ADN Plasmídico 2 0,8765 0,4551 1,92595034
Con respecto a los resultados proporcionados, aunque no están discriminadas por volumen
empleado, se puede observar que la relación A260/A280 de los ADN genómico es superior
a 1,6 pero inferior a 1,7; lo que indica que tiene una pureza aceptable; mientras el ADN
plasmídico, al tener ambas muestras un cociente de 1,92 se puede catalogar que cuentan
con una pureza óptima. (Departamento de Control de Calidad del Banco Nacional de ADN,
BANCOADN , 2020).
Con respecto al estudio de la integridad y tamaño del ADN aislado se evaluó empleando
electroforesis en gel de agarosa. Para este estudio solo se contó con los datos
proporcionados por el equipo profesoral.
En la Figura $$$ se muestra el estudio en gel agarosa 0,8 %, en los que los carriles 1 y 2
corresponden a muestras de ADN genómico y los carriles 3 y 4 a las del ADN Plasmídico
proporcionados.
G1 G2 P1 P2 M
G1 G2
ARN
Figura $$$: Gel estudio electroforesis sin digerir
En cuanto a la integridad de las muestras de ADN empleadas, es importante destacar que
se corresponde con una banda definida, determinándose el nivel de degradación por la
pérdida de definición de la banda predominante y el acompañamiento de una estela o smear
a lo largo del gel. En este caso, según los criterios indicados por el Departamento de control
de calidad del Banco Nacional de ADN (2020), las muestras de ADN genómico mostraron
una alta integridad, mientras que la correspondiente al ADN Plamidico muestran cierta
degradación al observarse menor definición en la banda y presencia de smear ligero
concentrado principalmente en la parte superior. Al estar degradado el marcador resulta
imposible construir la curva de caligración y definir en función a la distancia recorrida por
las bandas de las muestras el tamaño del ADN.
Cabe destacar que no se calcularon las cantidades de pares de bases de las muestras
SD y D porque se está trabajando como moléculas de ADN cromosómicos grandes y
altamente enrolladas, así que no se obtendrá una estimación real del tamaño de este ADN.
Posteriormente, en la Figura $$$ se ilustra la corrida de electroforesis de las muestras de
ADN tanto plamídico digerido (EcoRV) y sin digerir, como de genómico digerido
(EcoRV), a 2,5 μg y a 5 μg.
Es importante
explicar que el vacío en el gel significa que las muestras añadidas
en esos bolsillos se salieron al momento de agregar la muestra,
ADN 2,5 μg Marcador ADN 5 μg
P SD PD G1 D 1kb ladder P SD PD G2 D
1 2 3 4 5 6 7
Figura ###: Gel estudio Electroforesis Plasmídio
y Genómico / digerido sin digerir
(G: Genomico, P: Plasmídico; D: Digerido; SD: Sin digerir)
Cabe destacar, que solo se aprecian las bandas correspondientes a las muestras de ADN
Genómico digerido (carriles 3 y 7) y las del carril del medio, el número 4, en el que se
encuentra el marcador empleado: 1kb ADN ladder Promega, cuyo patrón se ilustra en la
Figura $$$, que se compone de trece fragmentos de ADN individuales purificados (en
pares de bases), que van desde 250 pb hasta 10 000 pb. Lo observado en la Figura ####
son los fragmentos de 10,000; 8,000; 6,000; 5,000; 4,000; 3,000; 2,000 y 1,500.
Ante la ausencia de resultados de ADN Plasmídio, dado el enfoque académico de este
trabajo y poder realizar los análisis comparativos se incluye el estudio electroferetico
reseñado en el prelaboratorio como parte de los resultados a considerar, la Figura $$$, en
el cual se empleó como marcador Lambda DNA/HindIII el cual produce bandas entre
0.125 kb y 23 kb. El marcador se compone de 8 fragmentos de ADN individuales
purificados (en pares de bases): 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 y 125 (Biotools
B&M Labs.S.A., 2014). Lo observado en la Figura 1 son los fragmentos de 23130, 9416,
6557 y 2322, 2027
Figura $$$. Patron del Figura $$$: Gel estudio electroforesis
marcador empleado muestras ADN Plasmidio digerido
1kb ladder Promega (EcoRV)
Utilizando los datos obtenidos de todos los estudios de electrofores y considerando que el
análisis de los recorridos es comparativo y que en estas circunstancias las mediciones de
recorrido responden a criterios de proporcionalidad analíticos y gráficos, se trabajaran las
medidas bajo este enfoque al desconocer la longuitud total del gel empleado en cada caso.
En este sentido, la figura $$$ muestra las curvas de calibración obtenidas, la ###.a se
corresponde al estudio de los ADN genómicos, mientras la ###.b esta asociada al estudio
del ADN Plasmídico digerido. Cada una construida en función al marcador empleado.
A Curva calibración
Marcador 1kb ladder Promega
4.5
4
f(x) = − 0.0152707017017524 x + 4.387280234892
3.5 R² = 0.946848148286484
Log(pb)
2.5
2
30 40 50 60 70 80 90
Distancia (mm)
B Curva de calibración
Marcador Lambda DNA/Hindlll
4.5
4
f(x) = − 0.0163450900905642 x + 4.45256303057003
3.5 R² = 0.811315035564665
Log (pb)
2.5
2
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Distancia (mm)
Figura ###. Curvas de calibración.
A) curva de calibración estudio ADN genómico marcador 1kb ADN Ladder Promega.
B) curva de calibración ADN Plasmídico-marcador Lambda DNA/HindIII
En el primer caso, empleando la curva de calibración para los ADN Genómicos, que
muestran una sola banda en ambas muestras, se tiene en base a la ecuación de la recta
y= -0,0153x + 4,3873, que el tamaño del ADN de la muestra G1 (2,5μg) es de 17151 pb y
de la muestra G2 (5 μg) es de 16558 pb.
Paralelamente, se tiene que para las muestras de ADN Plasmídico digeridas, asociadas a la
figura ###, donde cada una de las muestras muestra 2 bandas, una superior difusa y una
inferior de mayor recorrido definida, cada banda corresponde a ADN con diferentes
configuraciones. La banda superior representa al plasmido circular, mientras la inferior
está compuesta por plásmido superenrrollado, que por su conformación reducida puede
lograr un mayor desplazamiento en su recorrido por el gel.
La tabla ### resume los valores asociados a cada muestra y banda. En general el
comportamiento es análogo.
Tabla $$$: Tamaño de las muestras de ADN Plasmídico digeridos
Muestra Banda bp
Superior 11959
P1 – carril 1
Inferior 7071
Superior 13384
P2 – carril 2
Inferior 7071
Superior 13384
P3 – carril 3
Inferior 7071
Con esta información se construyó el siguiente mapa de restricción en cada caso:
11959 7071 13384 7071
Figura $$$: Mapa de restricción del plasmido
Como se puede ver en la Figura $$$, el plásmido tiene dos sitios de restricción para la
enzima, lo que provoca que se formen los dos fragmentos que se pueden identificar en
el gel.
DISCUSIÓN
La espectrofotometría se fundamenta en el paso de un haz de luz en una solución con
moléculas suspendidas, que mide la intensidad de luz absorbida por las mismas, mientras
mayor luz absorba la muestra, mayor será la concentración, en este caso de ácidos
nucleicos, y por tanto mayor será el valor de la absorbancia, medida en unidades de
densidad óptica (DO).
Entre las aplicaciones de este método se cuenta el determinar la concentración y la pureza
de una muestra de ADN, en función a su capacidad de absorbancia a una longitud de onda
determinada. Ello, contemplando que cada molécula específica, a una determinada longitud
de onda por unidad de distancia, manifiesta un comportamiento particular ().
En el caso del ADN presenta una absorbancia máxima a una longitud de onda de 260nm,
dentro del espectro UV; en la cual una OD de 1 equivale a 50 μg/ml de ADN doble cadena
(Rodríguez y Rizo, 2011), relación que explica los valores de concentración obtenidos.
En relación al estudio de la pureza de las muestras, se emplea la relación entre las
absorbancias a 260/280, por ser una relación muy estable. Según el Departamento de
control de calidad del Banco Nacional de ADN (2020), se considera que un ADN de pureza
óptima tiene un valor entre 1.8-2.0; y uno de pureza aceptable debe alcanzar un valor igual
o superior a 1.6. Señalando además, que la obtención de valores inferiores a 1,6 indican la
presencia de contaminantes, mientras que el registro de valores superiores a 2, aunque
puede que la muestra esté pura, ello implica una rotura de las cadenas de los ácidos
nucleicos, por lo que se considera que es un ácido nucleico de calidad insuficiente
(Rodríguez y Rizo, 2011; Departamento de control de calidad del Banco Nacional de ADN,
2020).
En consideración a lo indicado, los valores de las muestras obtenidas en el laboratorio
(table ##), se encuentran todos por debajo del rango de 1,6, lo que revela la presencia de
contaminantes. En el caso del ADN genómico puede tratarse de proteínas, las que
acompañan el ADN para ayudar en su compactación y su adecuado funcionamiento, pero
que dificultan el proceso de aislamiento. La presencia de proteínas, que absorben luz a una
longitud de onda de 280 nm, incide directamente en la obtención de valores menores a lo
esperado.
Alejos y col (2014) recomiendan verificar en paralelo la relación 260/230, pues de obtener
valores inferiores a 2.0-2.2 se confirma la presencia incluso de carbohidratos. Sin embargo
debido a que no se realizó este análisis no es posible determinar con exactitud su presencia,
Al respecto, según el estudio de Azmat y col (2012), los polisacáridos pueden coprecipitar
con los ácidos nucleicos, bajando así el rendimiento en la purificación del ADN (Sika y col,
2015).
La relación 260/230 se utiliza como una medida secundaria de la pureza del ácido nucleico.
A 260 nm se miden los ácidos nucleicos y a 230 se miden las sustancias químicas que
quedan en la muestra desde el paso de aislamiento. Los valores de 260/230 deben estar en
el intervalo de 2,0-2,2. Si la relación es inferior a la esperada, eso podría indicar la
presencia de contaminantes, que absorben a 230 nm
En cuanto a las muestras de ADN Plasmídico, otro posible contaminante es el ADN
cromosómico ().
Contrariamente, las muestras de ADN trabajadas por el equipo profesoral (tabla ##),
muestran un adecuado proceso de aislamiento, alcanzando una pureza optima las muestras
de ADN Plasmídico, y pureza aceptable la muestra de ADN genómico. Esto,
indudablemente da garantía a los estudios de electroforesis realizados a partir de estas
muestras.
Al evaluar los resultados reflejados en la figura %%%, se aprecia la definición en la banda
representativa de cada muestra de ADN genómico (carriles 1 y 2) sin digerir, lo que es
indicativo de una integridad alta del ADN empleado. En cuanto a las muestras sin digerir de
ADN Plasmídico (carriles 3 y 4),
muestra del carril 1 en la electroforesis en el gel de agarosa con el uso de
la enzima restricción EcoRI, se observó como parte de la muestra migró pero sin
diferenciarse en franjas, sino que se creó un barrido bajo una banda de alta intensidad. Esto
significa que la muestra se fragmentó por acción de la enzima (Alejos y col, 2014). Lo
mismo se observó para las demás alícuotas de los otros equipos. Guzmán y col (2018)
mencionan que ese barrido puede significar DNA degradado, fragmentado o presencia de
RNA contaminante. También puede tratarse de los fenoles, polisacáridos y otros
metabolitos secundarios que conllevan a un bajo rendimiento de ADN mediante la
modificación de enzimas, como las de restricción (Friar, 2005).
Por otra parte, es importante considerar que la distribución de los fragmentos en el gel
de agarosa implica un contenido de ADN bastante significativo, más o menos puro, como
resultado de una alta calidad del ADN extraído (Huang y col, 2013).
Se destaca que todas las muestras obtuvieron bandas de intensidades similares y
puede ser debido a que todos los grupos tomaron muestras de la misma planta. Y, como se
explicó con anterioridad, no se calcularon las cantidades de pares de bases de las muestras
SD
y D porque se está trabajando con moléculas de ADN cromosómicos grandes y altamente
enrolladas, donde en las muestras D migró un ADN super compactado y en las muestras SD
migraron moléculas de ADN grandes y pequeñas en diferentes conformaciones originadas
del corte realizado por la enzima de restricción, por lo que la estimación real del tamaño del
ADN será imposible con los datos reflejados en la figura 2.
En el caso de ADN plasmídico la relación 260/280 fue de 1,66 y 1,75, que de acuerdo
al Departamento de control de calidad del Banco Nacional de ADN (2010) se considera una
pureza aceptable. Para ambas muestras el coeficiente de correlación da como resultado un
valor cercano o igual a uno, lo que indica la linealidad entre las variables y, por lo tanto,
que el proceso de purificación fue realizado exitosamente (Rodrigo, 2016).
Los plásmidos son elementos pequeños circulares de ADN presentes en bacterias que
pueden existir en varias conformaciones: cerradas covalentemente (Covalently Closed
Circular, CCC), abiertas circulares (Open Circular, OC) o lineales (L), donde estas últimas
son consecuencia de la ruptura de la cadena de ADN (Coll y col, 2005). En el caso del
carril SD de la muestra de 4 µg de la Figura 5, la banda con menor desplazamiento
corresponde a plásmidos de conformación OC, y la segunda banda corresponde a la
conformación superenrollada, donde los plásmidos están más empaquetados y pueden
desplazarse con mayor facilidad en el gel, razón por la cual no se ve una migración
uniforme y se puede interpretar erróneamente como una diferencia en el peso molecular
(Yábar, 2003). Cabe destacar, que en el carril de 4µg las bandas se visualizaron con mayor
intensidad, más detalladas a simple vista, debido a la mayor cantidad de ADN plasmídico
agregado. En el carril D, donde se añadió la enzima de digestión EcoRI, la banda con
menor desplazamiento pertenece a la conformación lineal de los plásmidos bacterianos
(Hintermann, 1981). Por último, las bandas difusas que se observan al final son moléculas
de ARN que se encontraba en la muestra, pudiéndose ver el aumento de la intensidad a
medida que aumenta la concentración (Novogene, s.f).
Por último, una variable importante que podemos identificar al ver un gel de agarosa
es la intensidad de las bandas. Un ejemplo es en la Figura 5, donde las bandas de las
muestras con 1 y 2 μg de ADN tienen menor intensidad que cuando se utilizó 4 μg.
Utilizando estándares con concentración conocida, se puede hacer una estimación de la
concentración de las muestras de ADN que se está trabajando (Promega Corporation, s.f).
Así, conociendo el volumen de muestra cargado en la electroforesis, se puede obtener un
valor aproximado de su concentración comparando la intensidad de las bandas. Sin
embargo, para más exactitud lo ideal es utilizar.
CONCLUSIONES
El ADN puede ser aislado de muestras de tejido, como de hijas de plantas, o cultivos
de bacterias. De acuerdo al tipo de ADN que se busca aislar, sea genómico y plasmídico, y
según la procedencia de la muestra, se aplica un conjunto de métodos físicos y químicos
para la eliminación de los otros compuestos celulares.
A pesar de que con estos métodos se logra obtener muestras concentradas de ADN,
estas pueden estar contaminadas. La relación DO260/DO280 permite conocer el grado de
pureza de una muestra, y se consiguió que la pureza fue mayor al aislar ADN plasmídico en
bacterias, debido a que al extraer ADN genómico de sangre humana es normal la
contaminación con proteínas, carbohidratos y otros compuestos.
Con la densidad óptica también se pudo determinar la concentración de estas muestras.
Mediante electroforesis en gel de agarosa se puede analizar una muestra de ADN,
usando o no enzimas de restricción. El ADN genómico, debido a su gran tamaño, se ve
como un barrido a lo largo de la columna, mientras que en los plásmidos, que son
elementos genómicos de menor tamaño, sí identifican bandas aisladas.
Utilizando marcadores de peso molecular se pudo determinar el tamaño del plásmido.
Para esto fue necesario tomar en cuenta las diferentes conformaciones de los plásmidos, y
utilizar la conformación lineal, cuyo plásmido ha sido cortado con la enzima, como la que
representa el tamaño correcto del plásmido
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