INFORME6 ENZIMAS

RESULTADOS

En primer lugar, se determinó el volumen óptimo de la fosfatasa alcalina graficando la

actividad enzimática a diferentes volúmenes de enzima (Figura 1) (Tabla 1).

Tabla 1. Valores de actividad enzimática de acuerdo a volumen de enzima/suero

Actividad enzimática Volumen
1 22,33062331 4
2 55,93495935 10
3 186,6666667 20
4 88,1300813 30
5 121,300813 40

Actividad enzimática vs Volumen

200
180
160
Actividad (nanomoles/min)

140
f(x) = 23.0135501355013 x + 25.8319783197833
120 R² = 0.332082723144802
Fosfatasa alcalina
100 Linear (Fosfatasa alcalina)
80
60
40
20
0
4 10 20 30 40
Volumen enzima (μl)

Figura 1. Gráfica de actividad enzimática frente al volumen de suero en las muestras

Se puede observar una marcada tendencia creciente al aumentar el volumen de enzima en la

muestra, traduciéndose como un incremento de la actividad enzimática de la fosfatasa
alcalina; mientras mayor cantidad de fosfatasa alcalina había en la muestra, el ensayo se
volvía más lineal. Sin embargo, una vez se llegó a los 20 μl de suero los valores de
actividad enzimática disminuyeron hasta que volvieron a aumentar a los 40 μl; una
disminución de la actividad enzimática no es congruente con los valores esperados, es
decir, un aumento en la actividad de la fosfatasa alcalina a medida que se aumenta el
volumen de suero en la muestra y con un valor R 2 de 0,332 se puede decir que hubo
problemas al seguir el protocolo del ensayo con las muestras posteriores a 20 μl. Debido a
la imposibilidad, a ese momento de la práctica, de repetir la experiencia se determino que el
volumen óptimo de enzima serían 20 μl como consecuencia de la linealidad exhibida en los
valores de las muestras anteriores (Figura 2), con un valor R2 de 0,966.

Actividad enzimática vs Volumen

200
180
R² = 0.965984895721959
160
Actividad (nanomoles/min)

140
120 Fosfatasa alcalina
Linear (Fosfatasa alcalina)
100 Linear (Fosfatasa alcalina)
80 Linear (Fosfatasa alcalina)
60
40
20
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Volumen enzima (μl)

Figura 2. Gráfica de actividad enzimática frente al volumen de suero en las muestras

Debido a la limitada cantidad total de suero solo los valores de las últimas mediciones
fueron desestimadas y repetidas posteriormente durante la experiencia, incluyendo 20 μl
(Figura 3) (Tabla 2).

Tabla 2. Valores de actividad enzimática de acuerdo a volumen de enzima/suero

Actividad enzimática Volumen
3 25,47425474 20
4 46,0704607 30
5 51,92411924 40
 Actividad enzimatica vs Volumen
55
R² = 0.906161214384283
50
45
Actividad (nanomoles/min)

40
35 Fosfatasa alcalina
Linear (Fosfatasa alcalina)
30 Linear (Fosfatasa alcalina)
25
20
15
10
20 30 40
Volumen enzima (microlitros)

Figura 3. Gráfica de actividad enzimática frente al volumen de suero en las muestras

Ahora bien, aunque idealmente se repetirían la totalidad de las mediciones con el propósito
de mantener una continuidad e igualdad de condiciones en los cálculos, al comparar los
valores de las muestras de 4 a 20 μl de la Tabla 1 y los valores de las muestras de 20 a 40 μl
de la Tabla 2 se puede apreciar la similitud en la tendencia lineal; podría asumirse que de
no haber ocurrido errores la curva habría alcanzado el mayor grado de linealidad entre los
10 a 30 μl de enzima, justificando la escogencia de 20 μl como el posible volumen optimo
de enzima.

GRAFICA DE ENZIMA TIEMPO CONTINUO

Una vez confirmada el volumen de enzima a agregar, se estudió el efecto de la

concentración del sustrato (pNPP, p-nitrofenilfosfato) sobre la actividad de la enzima
(Figura 4) (Tabla 3).

Tabla 3. Actividad enzimática a diferentes concentraciones de sustrato

Actividad
(nanomoles/min Conc
) sustrato
1 (Blanco) -14,09 0,00
2 11,71 0,03
3 53,12 0,05
 4 46,83 0,08
5 59,30 0,11
6 102,55 0,22
7 149,49 0,43

Actividad enzimática vs Conc. sustrato

160.00
f(x) = 308.339904129189 x + 23.3208329699506
140.00 R² = 0.926932118845187
Actividad enzimática (nanomoles/min)

120.00

100.00
Fosfatasa alcalina
80.00 Linear (Fosfatasa alcalina)
Linear (Fosfatasa alcalina)
60.00

40.00

20.00

0.00
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50
Concentración de sustrato (mmol/L)

Figura 4. Gráfica de la actividad de la enzima frente al volumen de p-nitrofenilfosfato

Como en el caso anterior, se observa una tendencia creciente en los valores al aumentar la
concentración del sustrato en la muestra, lo que conlleva al incremento de la actividad
enzimática de la fosfatasa alcalina.

Es importante destacar que la muestra con 14 μl y concentración de 0,08 mmol/L de

sustrato se obtuvó un valor de absorbancia menor que la muestra de 10 μl y concentración
de 0,05 mmol/L, lo que causó que la tendencia de los datos no fuese tan lineal como se
esperaba sino que se generó un pico en la gráfica.

LINEWEAVER-BURK

Finalmente, se estudió el efecto de deferentes pH sobre la actividad enzimática de la

fosfatasa alcalina (Tabla 3) (Figura 5).

Tabla 3. Actividad enzimática a diferentes pH

Actividad
(nanomoles/min
) pH
 1 25,26 5,00
2 2,06 6,00
3 4,66 7,00
4 25,26 8,00
5 149,49 10,00

Actividad enzimática vs pH
160.00

140.00
Actividad enzimática (nanomoles/min)

120.00

100.00

80.00 Fosfatasa alcalina

60.00

40.00

20.00

0.00
5.00 6.00 7.00 8.00 10.00
pH

Figura 5. Gráfica del efecto del pH sobre la Actividad enzimática

Se puede observar que la fosfatasa alcalina encuentra su mayor actividad a pH = 10, tal y
como se espera por su nombre. Asimismo, se observa que a pH no tan ácidos tiene cierta
actividad. Destaca que su menor actividad ocurre a pH neutro aunque tiene sentido porque
por la sangre viajan sustancias que pueden llevar grupos fosfatos por lo que no es viable,
biológicamente, la actividad de la enzima al pH de la sustancia que transporta todo en el
cuerpo: la sangre. No se ensayaron pH superiores a 10 debido a que a pH más alcalinos la
fosfatasa alcalina pierde su actividad como se infiere en la metodología cuando la reacción
se detiene por alcalinización del medio con NaOH 2 M (pH >10).

DISCUSIÓN

En el presente estudio se analiza la cinética enzimática de la fosfatasa alcalina, que no es

solo una enzima sino una familia de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces
monoéster fosfóricos (Smith y col., 2013). Por esta razón, como sustrato hemos usado el p-
nitrofenilfosfato, que es un compuesto que tiene un grupo fosfato que puede ser hidrolizado
por la enzima, convirtiéndose p-nitrofenol, un producto cromogénico que absorbe luz a 405
nm y la reacción puede ser detenida al agregar NaOH (Biolabs, 2014).

La actividad enzimática es la medición de la tasa de formación de sustrato por minuto

(Roberts y Gibb, 2013), aumenta a medida que incrementa la concentración de enzima
debido a que hay más enzima disponible en el medio de reacción y el sustrato se transforma
en producto más rápidamente, como se pudo ver en las Figuras 1, 2 y 3.

De esta manera, en el primer experimento realizado se determinó la cantidad de enzima

necesaria para que el ensayo fuese lineal y se comprobó como a mayores volúmenes de
fosfatasa alcalina la actividad enzimática era mayor. Cabe destacar, luego de observar el
color amarillo intenso del eppendorf correspondiente a la réplica de la muestra 3 de 20 μl,
que el aumento y disminución de los valores de actividad enzimática durante el estudio del
volumen óptimo de enzima se debió a la no adición del NaOH a la muestra lo que permitió
que la reacción catalizada por la Fosfatasa alcalina continuara y se distorsionaran las
mediciones de absorbancia posteriores. De igual manera, al analizar el valor de absorbancia
obtenido para la muestra 3 original de 0,634 y al comparar con el valor de la muestra 1 y 2
original de 0,141 y 0,292 se puede observar un aumento exponencial; según el análisis
realizado por Miquet et al (2018), la utilización de concentraciones de enzima mayores o
iguales a 10 μg/ml dificultan el trabajo experimental, debido a que la adición de los
reactivos para iniciar y detener la reacción tendría que ser realizada de manera rápida, en un
ensayo discontinuo como el realizado durante la experiencia la adición del NaOH no podría
ser inmediata y la reacción no se detendría en todas las muestras al mismo tiempo.

Nelson y Cox (2019) comentan que cuando la concentración de enzima supera a la de

sustrato poco se saturará, y esto es porque en la muestra realmente existe una gran cantidad
de moléculas de enzima que serán capaces de formar el complejo ES (enzima-sustrato) y
posteriormente generar el producto; explican que el paso limitante de la velocidad de
reacción es la formación de este complejo ES y la liberación del producto. Por lo tanto, se
requiere un volumen de fosfatasa alcalina tal que la enzima estuviese lo suficientemente
saturada, donde la concentración de sustrato fuese mucho mayor que la de enzima con el
motivo de calcular la velocidad inicial de la reacción, ya que en ese punto la cantidad de
sustrato fijado en cualquier momento es despreciable con respecto a la concentración total
de sustrato al inicio de la reacción. Siguiendo el análisis de la linealidad vista en la gráficas
y lo expresado anteriormente, se llegó a la conclusión que el volumen ideal era 20 μl.

Mediante el ensayo continuo se llegó a una conclusión similar, la concentración óptima de

enzima debe estar entre 5 μl y 10 μl. Los ensayos continuos consisten en monitorear
directamente el progreso de la reacción porque el producto o el sustrato de la reacción
pueden ser cuantificados, mientras que en los ensayos discontinuos la catálisis ocurre
durante un determinado periodo de tiempo y luego se detiene, cuantificándose un producto
directo o indirecto de la reacción (Bénard y Gibon, 2016). En particular, el ensayo
discontinuo es muy útil cuando la actividad enzimática no se puede medir directamente, o
la actividad es muy lenta como para ser detectable.

Además, se encontró que en los blancos de las muestras también aumentaba la absorbancia
a pesar de la ausencia de enzima. Hay que recordar que las enzimas son catalizadores
biológicos que aceleran la velocidad en la cual sucede una reacción (Franklin, 2011; Nelson
y Cox, 2019), de modo que la descomposición de un compuesto puede ocurrir sin la enzima
pero lo hará lentamente. Entonces, el p-nitrofenilfosfato puede hidrolizarse sin la acción de
la fosfatasa alcalina y lo que se observa en los blancos es la generación de producto p-
nitrofenol y, luego del NaOH, p-nitrofenolato.

Otra variable importante a tener en cuenta en los estudios de cinética enzimática es la

concentración de sustrato [S]. Al igual que cuando se aumenta la concentración de enzima,
la actividad enzimática también se incrementa al aumentar la [S], como se puede ver en la
Figura 3. Sin embargo, cuando la [S] es alta, la interacción enzima-sustrato se complica,
puesto que los sustratos están compitiendo por el sitio activo de la enzima (Liu, 2017).

Debido a que la concentración de sustrato es una variable que cambia en el transcurso de la

reacción, en el laboratorio se analiza la velocidad inicial Vo de la reacción cuando la [S] es
muy alta. A concentraciones bajas de sustrato, la Vo aumenta linealmente con el
incremento de [S], mientras que a mayores [S] la Vo aumenta cada vez menos hasta llegar a
una meseta que corresponde a la Vmax (Nelson y Cox, 2019). En la Figura 4 se tiene una
curva Michaelis-Menten, donde se puede ver que a concentraciones de sustrato mayores a
0,2 mM se comienza a notar una ligera disminución del aumento de la Vo.

Para la determinación de la Vo a diferentes [S] hemos usado una concentración constante

de enzima y se detuvo la reacción a apenas 3 minutos desde su inicio. Al utilizar 3 ul de
sustrato se produjo 8,3*10-4 μmol de producto, lo que corresponde a la conversión de un
9,7% de sustrato a producto, mientras que al utilizar 40 ul de sustrato se obtuvo 3,4*10-3
μmol de producto, que es una conversión del 3,2 % del sustrato; se obtienen resultados
similares con las otras concentraciones. Como en este periodo de tiempo solo se ha
convertido a producto una pequeña fracción del sustrato, se asume las velocidades en este
punto como las iniciales.

La constante de Michaelis-Menten (Km) y la Vmax son los dos valores más relevantes que
se pueden obtener de la curva Michaelis-Menten. La Km corresponde a la [S] donde Vo =
1/2 Vmax (Hougen-Eitzman, s.f.). Debido a que no es muy exacta la obtención de estos dos
valores usando la curva Michaelis-Menten, existen otros métodos donde se linealiza los
valores de [S] y Vo.

Usando la gráfica de dobles recíprocos de Lineweaver-Burk se obtuvo valores de Vmax y

Km de 3,95 μM producto/min y 0,094 mM, respectivamente, similares de los de la gráfica
según el método de Eadie-Hofstee, donde se obtuvo una Vmax de 4,33 μM producto/min y
Km de 0,106 mM. La mayor variación fue con el método Hanes-Woolf, con Vmax de 5,5
μM producto/min y Km de 0,166 mM. Rogers y Gibon (2009) explican que los errores en
la determinación de V a bajas [S] son magnificados en las gráficas de Lineweaver-Burk y
Eadie-Hofstee, y afectan en menor magnitud a Hanes-Woolf. Cabe destacar que la Vmax
obtenida con el método de Lineweaver-Burk es bastante cercano a la Vo cuando se utiliza
una concentración de 0,372 M de sustrato (3,93 μM producto/min), por lo que es un indicio
de que la enzima ya estaba cercana a alcanzar su Vmax.
Bárcena y col. (s.f), utilizando un método similar al que empleamos reportaron con el
método de Lineweaver-Burk una Vmax de 12,5 μM producto/min y Km de 0,25 mM,
mientras que para el método de Eadie-Hofstee reportaron Vmax 12,2 μM producto/min y
Km 0,265. En cuanto a la Vmax, se obtuvo unos valores aproximadamente 3 veces menores
al reportado por los autores, mientras que para la Km se obtuvo valores 2,5 veces menores.
Un motivo de esta diferencia se puede deber a los métodos de purificación de la enzima.
Cómo trabajamos directamente con suero, puede existir algún compuesto que se esté
comportando como inhibidor acompetitivo, provocando la disminución de Km y Vmax
(Silverstein, 2019); otra razón puede ser a las variaciones de isoenzimas que puede haber en
la muestra del estudio mencionado y en nuestra muestra de suero.

Por último, un factor que se debe tener en cuenta al trabajar con enzimas es su PH óptimo.
La fosfatasa alcalina, como lo dice su nombre, es una fosfatasa que actúa en medio alcalino.
El pH óptimo de una enzima se puede determinar estudiando su actividad usando la misma
concentración de enzima y sustrato, pero empleando buffers con diferentes pHs. En la
Figura 8 se puede ver como la actividad enzimática disminuye desde pH 5 hasta un mínimo
a pH 7, y luego aumenta hasta su máximo de actividad a pH 10. Grote-Koska y col. (2016)
mencionan que para estudios de laboratorio clínico se debe medir la actividad de la
fosfatasa alcalina a pH 10,20, que es el pH ideal para las isoenzimas de hígado y hueso, las
cuales son las más abundantes en el suero. El pH es una variable tan importante en la
actividad enzimática debido a que influye en los estados de ionización de los residuos de
aminoácidos, que afecta directamente su estructura y sitio catalítico.

ABLE Poster

[Link]
biochemistry/enzyme-kinetics-lab-report/14909099

Hinberg, I., & Laidler, K. J. (1973). Influence of pH on the Kinetics of

Reactions Catalyzed by Alkaline Phosphatase. Canadian Journal of
Biochemistry, 51(7), 1096–1103. doi:10.1139/o73-143

Miquet, J.G., González, L., Sotelo, A.I. and González Lebrero, R.M. (2019), A laboratory work
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Dean, R.L. (2002), Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of
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