UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA
ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
“FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS BIOQUÍMICAS
BIOTECNOLÓGICAS”
CURSO:
Biología Molecular
DOCENTE:
Ing. Kevin Garcia
PRÁCTICA:
Reacción en cadena de polimerasa (PCR) punto final
INTEGRANTES:
Chalco Alvarez Juleyma Laylin
Huanca Merma Gleny Milagros
Mantilla Alvis Greile Marina
Pari Mamani Ana Belén
Arequipa – Perú
2024
RESUMEN:
El objetivo principal de esta práctica de la reacción en cadena de la polimerasa
punto final es amplificar de manera eficiente y específica una región de interés del
ADN a partir de una cantidad limitada de muestra inicial. La PCR (Reacción en
Cadena de la Polimerasa) es una técnica molecular que se utiliza para amplificar
una región específica del ADN de manera exponencial. En la PCR punto final, se
lleva a cabo una sola reacción de amplificación y luego se analiza el producto final
en un gel de agarosa para observar la presencia de bandas que indican la
amplificación del fragmento de ADN deseado. Para llevar a cabo la PCR punto final,
se prepara una mezcla de reacción que contiene el ADN molde, primers
específicos, el supermix (contiene nucleótidos, ADN polimerasa, el buffer de
reacción y sales) y el agua libre de nucleasas.
Se coloca la mezcla en un termociclador, donde se llevan a cabo una serie de ciclos
de temperatura que incluyen desnaturalización del ADN, apareamiento de
primers y extensión de la cadena de ADN.
Al final de la reacción, se obtiene una gran cantidad de copias del fragmento de
ADN de interés. Los cuales se cargan en un gel de agarosa y se someten a
electroforesis para separar los fragmentos de ADN de diferentes tamaños.
Finalmente se visualizan las bandas en el gel de agarosa ,el cual es esta práctica
nos dio como resultado, que si se observan las bandas fluorescentes de ADN en el
gel de electroforesis de PCR, lo que indica que si se obtuvo la amplificación, pero
no se pudo corroborar ya que no teníamos un marcador de peso molecular que
nos ayude a estimar el tamaño del fragmento de ADN.
ABSTRACT:
The primary goal of this endpoint polymerase chain reaction practice is to
efficiently and specifically amplify a region of interest from DNA from a limited
amount of initial sample. PCR (Polymerase Chain Reaction) is a molecular
technique used to amplify a specific region of DNA exponentially. In endpoint PCR,
a single amplification reaction is carried out and the final product is then analyzed
on an agarose gel for the presence of bands indicating amplification of the desired
DNA fragment. To carry out the endpoint PCR, a reaction mixture is prepared that
contains the template DNA, specific primers, the supermix (contains nucleotides,
DNA polymerase, the reaction buffer and salts) and the nuclease-free water.
The mixture is placed in a thermocycler, where a series of temperature cycles are
carried out that include DNA denaturation, primer annealing, and DNA chain
extension.
At the end of the reaction, a large number of copies of the DNA fragment of interest
are obtained. Which are loaded onto an agarose gel and subjected to
electrophoresis to separate DNA fragments of different sizes.
Finally, the bands are visualized in the agarose gel, which is how this practice gave
us the result that fluorescent bands of DNA are observed in the PCR
electrophoresis gel, which indicates that amplification was obtained, but not It
could be corroborated since we did not have a molecular weight marker to help us
estimate the size of the DNA fragment.
PALABRAS CLAVES: Reacción en cadena de polimerasa, amplificar,
específica, ADN molde, electroforesis.
MARCO TEÓRICO
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular
utilizada para amplificar secuencias específicas de ADN. Fue desarrollada por Kary
Mullis en 1983 y ha revolucionado la investigación genética, permitiendo la
creación de millones de copias de una secuencia particular de ADN en un corto
período de tiempo.
Principios de la PCR
● Desnaturalización: La doble hélice de ADN se desnaturaliza mediante calor (94-
98°C), separando las dos hebras para que cada una pueda servir de molde.
● Alineamiento (Hibridación): Se reduce la temperatura (50-65°C) para permitir
que los primers, secuencias cortas de nucleótidos diseñadas para ser
complementarias a los extremos de la región objetivo del ADN, se unan (hibriden)
a las hebras molde.
● Extensión (Elongación): La temperatura se ajusta a aproximadamente 72°C, la
temperatura óptima para la ADN polimerasa Taq, que extiende los primers
sintetizando una nueva hebra de ADN complementaria al molde.
Estos tres pasos se repiten típicamente en 25-40 ciclos, lo que resulta en la
amplificación exponencial de la secuencia objetivo.
Tipos de PCR
La PCR ha evolucionado desde su desarrollo inicial, y diversas variantes han sido
desarrolladas para adaptarse a diferentes aplicaciones y mejorar la sensibilidad,
especificidad y cuantificación de la amplificación de ADN:
● PCR convencional (punto final): Detecta los productos amplificados al
final de todos los ciclos de PCR mediante técnicas como la electroforesis en
gel de agarosa.
● PCR en tiempo real (qPCR): Permite la cuantificación de ADN en tiempo
real utilizando colorantes fluorescentes o sondas específicas.
● RT-PCR: Combina la transcripción inversa y la PCR para amplificar
secuencias de ARN mediante la conversión inicial a ADN complementario
(cDNA).
● PCR multiplex: Permite la amplificación simultánea de múltiples objetivos
en una sola reacción utilizando varios pares de primers.
Aplicaciones de la PCR
● Diagnóstico médico: Detección de enfermedades infecciosas (por ejemplo, VIH,
tuberculosis) y trastornos genéticos (por ejemplo, fibrosis quística).
● Investigación genética: Análisis de la expresión génica, estudios de mutaciones
y variabilidad genética, clonación de genes.
● Forense: Identificación de individuos mediante análisis de ADN en muestras
biológicas.
● Biotecnología: Producción de organismos genéticamente modificados, desarrollo
de terapias génicas.
● Ecología y biología evolutiva: Estudio de la biodiversidad, relaciones
filogenéticas y evolución de especies.
INTRODUCCIÓN
La PCR de punto final es una variante de la PCR en la que el análisis de los
productos amplificados se realiza al final de todas las etapas de amplificación. Esta
técnica se usa comúnmente para la clonación de genes, diagnóstico de
enfermedades genéticas, identificación de patógenos y estudios de variabilidad
genética.A diferencia de la PCR en tiempo real (qPCR), donde la cantidad de ADN
se cuantificó en cada ciclo, la PCR de punto final solo permite la detección
cualitativa de los productos amplificados. Los productos de PCR se visualizan
generalmente mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de
etidio o colorantes similares, permitiendo la identificación de fragmentos de ADN
de interés basados en su tamaño.
El desarrollo de la PCR de punto final ha sido un pilar en la biología molecular y la
genética. Antes de la invención de la PCR, la amplificación de secuencias
específicas de ADN era un proceso laborioso y limitado. La capacidad de amplificar
rápidamente fragmentos de ADN específicos ha facilitado avances significativos.
Ventajas y Limitaciones:
● Ventajas:
○ Sensibilidad: Puede amplificar secuencias de ADN a partir de
cantidades extremadamente pequeñas de muestra.
○ Especificidad: La elección de primers específicos permite la
amplificación de secuencias particulares dentro de un genoma
complejo.
○ Versatilidad: Puede ser aplicada en una amplia variedad de
contextos y tipos de muestras
● . Limitaciones:
○ Contaminación: La alta sensibilidad de la PCR también la hace
susceptible a la contaminación, que puede llevar a resultados falsos
positivos.
○ Limitaciones cuantitativas: A diferencia de la qPCR, la PCR de
punto final no proporciona una medida cuantitativa de la cantidad
de ADN presente.
○ Optimización: Requiere una optimización cuidadosa de las
condiciones de la reacción para cada conjunto específico de primers
y plantilla de ADN.
MATERIALES Y MÉTODOS
● Termociclador: Equipo utilizado para realizar los ciclos de
temperatura necesarios para la PCR.
● Micropipetas y puntas estériles: Para la manipulación precisa de
pequeñas cantidades de reactivos.
● Tubos de PCR: Pequeños tubos de plástico diseñados para soportar
cambios rápidos de temperatura.
● Electroforesis en gel de agarosa: Equipamiento necesario para la
separación y visualización de los productos de PCR.
Preparación de la mezcla de reacción:
En un tubo de PCR, añadir los siguientes componentes:
● ADN plantilla.
● Primers (directo e inverso).
● dNTPs (desoxinucleótidos trifosfato).
● Buffer de reacció[Link] polimerasa Taq.
● Agua libre de nucleasas.
Ciclo de amplificación:
● Desnaturalización inicial: 95°C durante 2-5 minutos.
● Ciclos de PCR (30-40 ciclos):
○ Desnaturalización: 94-98°C durante 20-30 segundos.
○ Alineamiento: 50-65°C durante 20-30 segundos.
○ Extensión: 72°C durante 30 segundos a 1 minuto (dependiendo del tamaño
del producto de ADN).
● Extensión final: 72°C durante 5-10 minutos.
Electroforesis en gel de agarosa:
● Preparar un gel de agarosa al 1-2%.
● Cargar los productos de PCR en los pocillos del gel.
● Correr la electroforesis a un voltaje adecuado (80-120 V) hasta que los fragmentos
se separen adecuadamente.
● Tincar el gel con bromuro de etidio y visualizar bajo luz ultravioleta.
REACTIVOS Y SOLUCIONES
● Buffer de PCR: Proporciona las condiciones químicas óptimas para la
actividad de la ADN polimerasa.
● dNTPs: Mezcla de desoxinucleótidos trifosfato (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
necesarios para la síntesis de nuevas hebras de ADN.
● Primers: Secuencias cortas de ADN que flanquean la región de interés y
proporcionan un punto de inicio para la síntesis de ADN.
● ADN polimerasa Taq: Enzima que sintetiza nuevas hebras de ADN
utilizando el ADN molde y los dNTPs.
● ADN plantilla: Fragmento de ADN que contiene la secuencia objetivo a
amplificar.
● Bromuro de etidio: Agente intercalante utilizado para teñir el ADN en
geles de agarosa, permitiendo su visualización bajo luz UV.
● Agarosa: Polímero utilizado para formar geles que permiten la separación
de fragmentos de ADN por tamaño durante la electroforesis.
● Buffer de carga: Solución utilizada para cargar muestras de ADN en el gel
de agarosa, que contiene colorantes que facilitan el seguimiento de la
migración del ADN durante la electroforesis.
RESULTADOS:
[Link] de electroforesis de PCR punto final
● Se pudo observar en el gel de agarosa unas bandas fluorescentes de ADN en el gel
de electroforesis de PCR, lo que indica que si se obtuvo amplificación ,pero no se
pudo corroborar ya que no teníamos un marcador de peso molecular que nos
ayude a estimar el tamaño del fragmento de ADN.
CONCLUSIONES:
● La presencia de bandas fluorescentes en el gel de electroforesis de PCR indica que
la amplificación del fragmento de ADN deseado se llevó a cabo de manera efectiva
pero el tamaño no es el correcto debido a que los primers que no están bien
diseñados.
● La ausencia de un marcador de peso molecular impide determinar con precisión
el tamaño del fragmento amplificado. La incorporación de un marcador de peso
molecular en la electroforesis permitiría comparar el tamaño del producto de PCR
con fragmentos de ADN de tamaño conocido, proporcionando información valiosa
sobre la especificidad y la eficiencia de la amplificación.
● La práctica demostró la utilidad de la PCR punto final como técnica para amplificar
regiones específicas de ADN. La simplicidad del procedimiento, la alta sensibilidad
y la especificidad la convierten en una herramienta valiosa para diversas
aplicaciones en biología molecular, genética y diagnóstico.
BIBLIOGRAFÍA:
● Mullis, K., & Faloona, F. (1987). "Specific synthesis of DNA in vitro via a
polymerase-catalyzed chain reaction." Methods in Enzymology, 155, 335-
350. Este es uno de los artículos fundamentales en los que Kary Mullis
describe la técnica de PCR.
● Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A., &
Arnheim, N. (1985). "Enzymatic amplification of beta-globin genomic
sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia."
Science, 230(4732), 1350-1354. Este estudio muestra la aplicación práctica
de la PCR en el diagnóstico de enfermedades genéticas.
● Bartlett, J. M., & Stirling, D. (2003). "A short history of the polymerase chain
reaction." Methods in Molecular Biology, 226, 3-6. Este artículo ofrece una
visión general del desarrollo histórico y la evolución de la PCR.
● Dieffenbach, C. W., & Dveksler, G. S. (Eds.). (2003). PCR Primer: A
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Este manual es
una referencia completa para protocolos y aplicaciones de PCR.
● Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., & White, T. J. (Eds.). (1990). PCR
Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press. Otro
recurso fundamental que cubre una amplia gama de métodos y
aplicaciones de PCR.
