TEMA 1.
CONCEPTOS BÁSICOS E HISTÓRICOS DE LA INGENIERÍA GENÉTICA
La diversificación consiste en una mutación del ADN y por la cual luego sobreviven tan solo
aquellos organismos mejor adaptados. Es una modificación genética y de una forma natural.
Tras aparecer nosotros comenzamos a fabricar nuestras propias herramientas sin apenas sufrir
modificaciones genéticas, adaptando el ambiente a nosotros.
Además, llevamos a cabo la domesticación de animales, plantas y microorganismos. De esta
forma, la mayoría de los productos han sido seleccionados por modificación genética,
cruzando aquellas especies que nos interesan. Es a lo que llamamos selección espontánea.
Sin embargo, los biotecnólogos actuales llevan a cabo una selección artificial, se hace
mutagénesis en el laboratorio, no se espera a que se produzca ninguna mutación, la
diseñamos.
En la ingeniería genética da igual el organismo en el que se encuentre el gen, se coge y se
modifica el genoma de otro organismo cualquiera. No hay necesidad de que ambos puedan
generar descendencia. un ejemplo sería la proteína GFP (fluorescente) de las medusas, lo corto
de su genoma y lo inserto en el del animal que me interese, en nuestro caso, en el de un
gusano.
Los productos modificados por ingeniería genética que están legalizados son utilizados
fundamentalmente en investigación y para la generación de fármacos.
Los pasos típicos que se siguen en ingeniería genética son:
1. Identificar y aislar el gen.
2. Caracterizarlo (averiguar secuencia DNA, cómo modificarlo…)
3. Modificarlo.
4. Introducirlo en el nuevo o en el mismo organismo.
5. Comprobar que se ha hecho bien el transgénico.
Para llevar a cabo todos estos pasos son necesarias una serie de herramientas:
a) Enzimas de restricción
b) Recombinación: necesita de un complejo muy amplio de proteínas, aunque existen
recombinasas que sólo hacen la recombinación de una zona muy específica.
c) Virus lisogénico
d) Plásmidos: posiblemente sea la mejor forma de amplificar un fragmento.
e) PCR
f) Secuenciación con ARN polimerasa
g) Ligasa: usada para unir los fragmentos de Okazaki durante la replicación.
Es esencial conocer el código genético
La secuencia ORI (fragmento por el cual comienza la replicación) se puede aislar e insertar en
una secuencia que no posea ningún ORI. De esta forma podremos replicar cualquier DNA.
La ciencia básica da conocimientos básicos para que la ciencia experimental consiga las
herramientas necesarias y emplearlo en algo.
Es importante recordar que los ORF son comunes en todos los organismos, son universales.
El código es universal haciendo dos excepciones:
1. Promotor
2. Procesamiento de intrones (splicing)
Con los plásmidos podemos obtener gran cantidad de copias idénticas. Después se puede
congelar, hacer miniprep, y finalmente manipularlo (transformarlo). Cada bacteria coge un
único plásmido con muchas copias pero siempre el mismo. De esta forma, se usa como
herramienta para separar mezclas de plásmidos.
Ej: tenemos 3 vectores iguales en secuencia y 2 fragmentos DNA. Para averiguar en
qué bacteria encontraremos el vector que nos interesa de los que hemos introducido,
hacemos PCR, de forma que si aparece una banda en el gel significa que esa es la
colonia que no contiene.
Para llevar a cabo el aislamiento del gen se pueden dar dos casos:
a) Conocemos la secuencia y su función: diseñaríamos los oligos y realizamos una PCR
b) No conocemos la secuencia pero sí conocemos su función: separaríamos las proteínas
en función de su tamaño, su hidrosolubilidad, polaridad…, y luego las secuenciamos
(tipo y orden de aminoácidos), sacamos la secuencia y averiguamos el gen.
Es importante resaltar que ambos gusanos tienen los mismos genes pero difieren en su
secuencia. Es a lo que llamamos variación del nucleótido simple o SNP (polimorfismo del
nucleótido simple).
Sin embargo, con aquellos genes que están relacionados con el desarrollo o
encargados del envejecimiento, la memoria… ,la mejor técnica es la siguiente:
Le introducimos un mutágeno y observamos la descendencia, así, si se trata de una
mutación simple, dicha mutación la podremos relacionar fácilmente con una función
concreta.
En caso de que no se trate de una mutación simple, llevaremos a cabo una clonación
posicional. Realizamos la mutación, ésta, altera el tamaño, por ejemplo, del gusano
haciéndolo más grande. Seguidamente, comparemos el organismo sano y mutado y
busco la diferencia para encontrar el gen. Como nos saldrán varias diferencias (varias
mutaciones) buscamos en qué región de qué cromosoma está.
En el ejemplo, la mutación es recesiva, la mutación que genera el cambio de tamaño
está en la parte de arriba del cromosoma. Los cachos de cromosoma inglés deben
estar juntos, enfrentados, en el cromosoma. Es a lo que comúnmente llamamos
mapeo genético.
Entonces, hacemos un transgénico cambiando los genes mutados con los sanos y si el
organismo sale normal significa que ese era el gen responsable.
Los organismos modelos nos permiten averiguar la función de muchos de los genes
que poseen. En los humanos, una de las estrategias es usar genes que son muy
parecidos en otros organismos modelo (de esta forma probablemente la función que
definamos se mantendrá). Otro recurso en humanos sería observar aquellas
enfermedades que se transmiten hereditariamente e identificar el gen que se
encuentra afectado. Esto último es lo más barato y lo que más se suele hacer,
comparar genomas dentro de la misma familia que presenta una enfermedad
hereditaria.
En humanos hay regiones que tienden a ser más polimórficas que cambian con mayor
frecuencia y provocan más combinaciones que las de los gusanos que tenían
polimorfismo del nucleótido simple (en lugar de cambiar un único nucleótido cambian
mínimo un par). Podemos secuenciar estas regiones y secuenciar qué regiones son
homocigóticas. Como la enfermedad es recesiva, necesita de estar en homocigosis
para que la enfermedad se exprese, de esta forma, como hay mucha homocigosis
(porque la descendencia ha sido muy endogámica), la enfermedad se presenta mucho.
Hay que mapear buscando esas regiones polimórficas para encontrar en qué región
del cromosoma se encuentra el gen responsable. En el ejemplo, si las regiones 6 y 2
están en homocigosis, se produce la enfermedad (se encuentran en la región central).
En los seres humano sabemos que la mayoría de gente que sufre de una misma
enfermedad genética es porque proviene de un mismo ancestro, todos poseen la
misma mutación.
Para hacer análisis de población, partimos del punto anterior. Aquellos que heredaron
el gen que producía la enfermedad, lo más seguro es que también hereden todas las
regiones polimórficas que rodean a dicho gen que produce la enfermedad. De esta
forma, estas regiones asociadas a la enfermedad tendrán una frecuencia determinada
en la población sana, pero en la población enferma todos tendrán ese polimorfismo,
esa región, que provoca la enfermedad, es decir, tendrá una frecuencia del casi el
100%. De esta manera, podremos concluir que cerca de este polimorfismo se
encontrará en gen que buscamos.
Las levaduras se reproducen por gemación, habitualmente son haploides. En levaduras
se encuentran dos tipos, las Alpha y las a. cuando ambos tipos se encuentran y
reproducen, fusionan sus citoplasmas y núcleos y se convierte en una única levadura
pero diploide, que por gemación va generando células hijas. Sin embargo,
eventualmente crean esporas donde 50% serán a y el otro 50% será Alpha (todas
haploides).
En principio cortamos el genoma completo con enzimas de restricción y creamos
plásmidos. Estos plásmidos se introducen en una levadura distinta y se insertan en un
medio sin adenina, de forma que aquella levadura que posea el plásmido capaz de
sintetizar adenina será la única que crezca en este medio. Para la levadura que
sobreviva en el medio sin adenina, coges el plásmido y secuencias el gen que tenga
dentro.
Para hacer el proceso anterior en humanos, cogemos el ARN, el cual no posee intrones
y por ello no hay problema de procesamiento, se pasa a cDNA por medio de una
retrotranscriptasa. Después, al vector hay que incluirle el promotor del organismo al
que le vamos a introducir dicho vector*. Así se generan numerosas genotecas.
*Le introducimos el promotor constitutivo (se expresa siempre) de levadura en el plásmido y
después se conecta el cDNA al promotor.
Construcción de genotecas: tenemos muchos genomas y los cortamos con enzimas de
restricción. El DNA digerido lo tenemos que meter en un vector y luego, en presencia
de ligasa, pegamos los fragmentos digeridos.
Absolutamente todos los vectores tendrán un ORI y tendrán un gen resistencia a
antibiótico, porque la mejor forma de amplificar es en bacterias de forma que
obtengamos millones de copias de forma muy fiel al original. Una vez crecidas las
bacterias se recogen y se les extrae el plásmido (todo el que queramos siempre que le
añadamos a la bacteria más medio de cultivo)
