INFORME DE LA ACTIVIDAD DE PRÁCTICA PCR

Asignatura: Biología Molecular

Docente: Gloria Patricia Castillo Urquiza
Estudiante: Luis Eduardo Castilla López 2019111035
INTRODUCCIÓN

La amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de

laboratorio simple pero poderosa utilizada para hacer millones de copias de una región
particular de ADN. Este método fue inventado por K. B. Mullis en 1983 y que le llevó a
ganar el nobel de Química en 1993, en cual se amplifican fragmentos de ADN mediante la
incubación sucesiva a diferentes temperaturas. Por lo general, se emplea ADN de doble
cadena el cual es desnaturado o sus cadenas se separan a 94-95 ºC, alineamiento de dos
iniciadores o cebadores u oligonucleótidos complementarios en los extremos 3’de cada
cadena molde (la temperatura depende de los cebadores utilizados) y finalmente la
síntesis o elongación de las cadenas a 72 - 74 ºC por la enzima termoestable, Taq
Polimerasa. Todo este proceso se conoce como un ciclo, estos pasos o ciclos se repiten
(generalmente 35 veces), replicando enzimáticamente el ADN in vitro, permitiendo que a
partir de una pequeña cantidad de moléculas de ADN molde sean amplificadas
selectivamente de forma exponencial (Figura 1).

Figura 1. Amplificación exponencial del ADN por PCR (NIH, 2023)

Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la región blanco para
que pueda analizarse o usarse de alguna otra manera, por eso esta técnica tuvo gran
impacto en 4 áreas principales de la biología molecular: mapeo de genes, clonación,
secuenciación de ADN y detección de genes. Por ejemplo, podría ser un gen cuya función
quiere entender un investigador o un marcador genético usado por científicos forenses
para relacionar el ADN de la escena del crimen con los sospechosos. Por ejemplo, el ADN
amplificado por PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis en gel o clonar en
un plásmido para otros experimentos. La PCR se utiliza en muchas áreas de la biología y
la medicina, como la investigación en biología molecular, el diagnóstico médico,
diagnóstico en fitopatología, mejoramiento genético e incluso algunas ramas de la
ecología.

La sensibilidad de la técnica de PCR es muy alta, pero puede presentar algunos

inconvenientes como la probabilidad relativamente alta de obtener falsos positivos por
contaminación. Para resolver este aspecto, se debe optimizar la secuencia de los
cebadores, así como su temperatura de anelamiento o de unión correcta al ADN molde y
realizar una adecuada manipulación de los reactivos. Otro aspecto de la PCR de punto
final o convencional es que no es una técnica cuantitativa, sino semi-cuantitativa.
Modificaciones de esta técnica, como la PCR en tiempo real o cuantitativa (qPCR),
permiten que se pueda conocer la cantidad exacta del ADN original y el que se está
produciendo durante cada ciclo.

Otra desventaja de la PCR es el tamaño limitado de los productos de la amplificación a

medida que se aumenta la longitud del producto deseado. Sin embargo, recientemente se
encuentran ADN polimerasas termoestables que son capaces de amplificar fragmentos de
hasta 30 kb.

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

La electroforesis en gel de agarosa es un procedimiento utilizado en varias áreas de la

Biotecnología, es un procedimiento analítico utilizado en laboratorios de investigación,
biomédicos y forenses. La electroforesis es un procedimiento que se lleva a cabo con el
fin de separar el ADN en función de su carga, su tamaño y su nivel de enrollamiento.

Existen diferentes tipos de electroforesis, siendo la electroforesis en gel de agarosa el

método más común y utilizado. La agarosa es un polisacárido que tiene la capacidad de
formar un enmallado de tamaño de poro constante y que depende de la concentración a
la que se utilice al realizar un gel. Este polisacárido es derivado del agar, originario de las
algas, es altamente purificado para eliminar todas las impurezas.

Laboratorio virtual Electroforesis – Herramienta interactiva

[Link]

Video sobre Electroforesis en gel [Link]

Tomado de: Muñoz et al. 2011. Extracción de ADN y electroforesis. En: Fundamentos y técnicas
básicas en biología molecular.
OBJETIVO

Conocer y explicar los principios básicos de la PCR, así como realizar en la práctica el
montaje de una reacción de PCR de punto final y una electroforesis en gel de agarosa
que permite observar el resultado de la reacción.

MATERIALES Y EQUIPOS
Termociclador (Techne TC-4000)
Cámara para electroforesis de ácidos nucleicos (horizontales) o cubas de electroforésis
Fuente de poder
Transiluminador
Horno de microondas
Hielo frapé
Muestra de ADN (molde)
Tubos estériles tipo Eppendorf de 0.2 mL, de pared delgada para PCR
Micropipetas de volumen variable 1 a 20 μL, 10 a 100 μL
Soporte para micropipetas
Puntas para micropipetas (estériles)

SOLUCIONES Y REACTIVOS
Buffer de reacción de la enzima
Mezcla de nucleótidos trifosfatados o dNTP’s (10 mM de cada uno: dATP, dCTP, dGTP,
dTTP)
Cebadores u Oligonucleótidos 5’ (sentido, superior, “forward”, “upper”)
Cebadores u Oligonucleótidos 3’ (antisentido, inferior, “reverse”, “lower”)
Ampli Taq DNA polimerasa
Agarosa
Solución TBE (TAE) 0.5 X
Solución de carga para ADN 6X
GelReed o agente intercalante disponible
Marcador de bajo peso molecular (1 Kb plus o similar).

MÉTODO

A. REACCIÓN PCR – DETECCIÓN DE BEGOMOVIRUS

Concentraciones finales*
Buffer de la enzima (Taq Polimerase) 1x
MgCl2 2,5 mM (1 – 4 mM)
dNTP’s 0,2 mM de cada um
Cebadores 0,4 µM (hasta 1 µM) de cada uno
Taq DNA Polimerase 2,5 unidades
DNA molde
Água Hasta completar 50 µl
Mix para PCR*

no. de reacciones* por reacción Total

Buffer 10x 6 x 5 µl = 30 µl
MgCl2 6 x 5 µl = 30 µl
dNTP’s 6 x 4 µl = 24 µl
Primer #1 (1978) 6 x 0,5 µl = 3 µl
Primer #2 (496) 6 x 0,5 µl = 3 µl
Taq Polimerase 6 x 0,5 µl = 3 µl
H2O 6 x 30,5 µl = 183 µl
__________________________________________________________
Total 50 µl

* Para evitar error por pipetaje se coloca una reacción a más.

DNA = 46 µl Para garantizar que todos los tubos tengan la misma cantidad

Procedimiento

• Inicialmente los componentes se colocaron en un tubo Eppendorf nuevo y estéril

de acuerdo con los cálculos del número de reacciones (+1), excepto el ADN
molde.

• El “Mix” se introdujo en cada tubo Eppendorf de 0,2 ml (termociclador) y

posteriormente se colocó el ADN correspondiente a cada tubo. Debido a una
recomendación de la profesora se comenzó por los controles negativos para
evitar contaminaciones.

B. PARÁMETROS DE AMPLIFICACIÓN**:

Desnaturación inicial: 94oC por 2 minutos

30 ciclos de: Desnaturación (94oC por 1 minuto),

Anelamiento (50oC por 2 minutos)
Síntesis (72oC por 2 minutos)
Síntesis final: 72oC por 10 minutos

_______
** Este es el ejemplo de una reacción típica para detección de Begomovirus en una
muestra de ADN vegetal. Las concentraciones finales y los parámetros de amplificación
pueden variar dependiendo de las condiciones específicas de cada experimento.
C. ELECTROFORESIS - PREPARO GEL DE AGAROSA

Con el objetivo de ver el resultado de PCR o de la amplificación del DNA objetivo, se

separan los fragmentos por electroforesis en un gel de agarosa al 1% en 50 ml de TBE o
TAE 0.5X a 100 V por 40 minutos (avaliar de acuerdo con lo que corre la muestra con el
tampón de carga).

D. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

Los puntos que se deben tomar en consideración para hacer la descripción de los
resultados son:

• Determinar el número de bandas obtenidas en la reacción de PCR. Solamente debe

aparecer una del tamaño (pb) esperado, ya que las demás bandas corresponden a
productos de amplificación inespecíficos.

• En el caso de la formación de productos inespecíficos en la muestra (bandas no

esperadas) se deberá realizar nuevamente la PCR, subiendo la temperatura de
alineamiento de los cebadores o modificando la concentración del MgCl2. Si los productos
no específicos se forman en el control de reactivos (sin ADN molde) se deberán hacer
nuevamente las reacciones, procurando evitar las contaminaciones con ADN no deseado
(p. ej. el que tenemos en las manos o se encuentra en puntas usadas).

• En el caso de no obtener productos de amplificación se deberá realizar nuevamente la

PCR, bajando la temperatura de alineamiento de los cebadores.
• Comparar los valores observados del tamaño en pb con los esperados (teóricos –
primer).

Los fragmentos más cortos de ADN viajarán más rápido a través de los poros de la matriz
del gel que los fragmentos más grandes. Después de un rato que ha corrido el gel, los
fragmentos más cortos de ADN estarán más cerca del extremo positivo del gel y los más
largos se mantendrán cerca de los pozos.
INDICACIONES PARA REALIZAR EL INFORME DE ESTE TALLER/LABORATORIO.

1. Describir con sus propias palabras los pasos a realizar para montar una reacción
de PCR, es decir hasta colocar en el termociclador (escoger el programa y colocar
a correr).
Para montar una reacción de PCR para , los pasos generales son los siguientes:

 Tener el espacio donde se va a realizar la montura de PCR limpio y

desinfectado para evitar la contaminación.
 Se hace el “Mix” que es donde todos los componentes se tienen que
multiplicar por el numero de reacciones en este caso son 5 muestras,
que son, un control negativo (ADN de planta sana), un control positivo
(ADN de planta infectada del virus), agua ultrapura, y las dos muestras
de ADN en este caso de tomate, para evitar error por pipetaje se coloca
una reacción a más, para garantizar que todos los tubos tengan la
misma cantidad de “Mix”, que al final el número de reacciones es 6. En
ese Mix debe tener estos componentes: buffer 10 x para estabilizar el
pH a la ADN polimerasa, MgCl2 es el cofactor de la AND polimerasa,
dNTP’s se utiliza para sintetizar nuevas cadenas, AND polimerasa (Taq
Polimerase) y agua ultrapura para evitar contaminacion, primer (1978) y
primer (496) son un punto de inicio para la síntesis de nuevas cadenas
de AND (imagen 1). Por tanto, como van ser 5 muestras se tendrá que
hacer 5 mix, con la ayuda de una pipeta(imagen 2) en cada tubo del
mix se depositará todos los componentes y el ultimo por agregarse será
Tap polimerasa.

 Una vez que se han añadido todos los componentes al tubo de

reacción, se debe mezclar suavemente para asegurar que todos los
reactivos estén bien mezclados y la reacción sea homogénea.
 Luego, se coloca la mezcla en un termociclador, que es un equipo que
permite controlar la temperatura para llevar a cabo la PCR.
 Transferir al termociclador: Colocar los tubos de reacción en el bloque
térmico del termociclador (imagen 3)
 Asegurándose de que estén bien sellados y distribuidas las muestras
(imagen 3)

 Se baja con mucho cuidado la tapa del termociclador y se cierra

(imagen 4).
 Luego, se selecciona el programa de PCR: en este caso es de
Begomovirus, luego le da la opción de ver el programa y se selecciona
(imagen 4 )
 Te mostrara también la última vez que modificaste el programa, el
calentamiento de la placa de la tapa, luego te indica que hay una
Desnaturación inicial: 94oC por 2 minutos que es la temperatura de
inicio.
 Después teniendo en cuenta los parámetros de amplificación del PCR
o los pasos y se programa los ciclos, los cuales en este caso fue de:

# de ciclos de 30: Desnaturación (94oC por 1 minuto),

Anelamiento (50 oC por 2 minutos)
Síntesis (72 oC por 2 minutos)
Síntesis final:72 oC por 10 minutos

 Y finalmente se coloca a rodar por durante aproximadamente 2 horas y

medias, este es el ejemplo de una reacción típica para detección de
Begomovirus en una muestra de ADN vegetal.
Anexo:

Imagen 1: Fotos de los componentes del Mix Imagen 2: Deposito de los componentes
Imagen 3: Termociclador con las 5 muestras Imagen 4: Cierre y programación del termociclador

2. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS CUESTIONARIO

2.1. Señalar las ventajas de utilizar DNA polimerasas termoestables y diga de qué tipo de
enzimas se utilizaban antes.
Las principales ventajas de utilizar DNA polimerasas termoestables en la técnica de PCR
son:
 Permiten realizar la amplificación a altas temperaturas (alrededor de 72-74°C), lo
cual aumenta la especificidad de la reacción al evitar uniones inespecíficas de los
cebadore
 Son resistentes a la desnaturalización por calor, lo que permite repetir múltiples
ciclos de amplificación sin perder su actividad enzimática.
 Pueden amplificar fragmentos de ADN de mayor tamaño, llegando incluso a 30 kilo
bases, a diferencia de las polimerasas convencionales que se limitan a amplificar
fragmentos más cortos.
 Rapidez
 Facilidad de optimalización
 Lo puedes programar

La enzima termoestable utilizada en las reacciones de PCR mencionadas es la

Taq DNA polimerasa, que proviene de la bacteria Thermus aquaticus. Esta enzima
es una de las más comúnmente empleadas en la técnica de PCR debido a sus
características de termo estabilidad.

2.2. Mencionar la función de cada uno de los componentes de la mezcla de reacción de

PCR:
a) Buffer de reacción: Mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN
polimerasa. También ayuda a estabilizar la temperatura durante los ciclos de
calentamiento y enfriamiento.

b) MgCl2: Actúa como cofactor para la actividad de la ADN polimerasa, permitiendo la

unión de los nucleótidos y la estabilidad de la doble hélice de ADN durante la
amplificación.
 c) Mezcla de dNTP's: Contiene los nucleótidos desoxirribonucleósidos trifosfato
(dNTP's) que son los bloques de construcción utilizados para sintetizar nuevas
cadenas de ADN durante la PCR. Cada dNTP representa una base específica (A, T,
C, G) necesaria para la replicación del ADN.
(dNTPs) desoxirribonucleótidos-trifosfato para polimerizar la nueva cadena ADN.

d) Oligonucleótidos: Son pequeñas secuencias de ADN diseñadas específicamente

para ser complementarias a las regiones del ADN molde que se desean amplificar.
Actúan como cebadores o primers, proporcionando un punto de inicio para la síntesis
de nuevas cadenas de ADN.
Los oligonucleótidos, son complementarios a una de las dos hebras del ADN (foward,
reverse). Deben estar enfrentados. Delimitan la zona de ADN a amplificar

e) DNA polimerasa: Es una enzima que cataliza la síntesis de nuevas cadenas de

ADN utilizando los nucleótidos y los cebadores como sustratos. La DNA polimerasa
más común es la polimerasa Taq (Thermus aquaticus). Enzima termoestable –mayor
actividad cerca a los 70 °
f) ADN molde: Es la secuencia de ADN original que se amplificará durante la reacción
de PCR. Sirve como plantilla para la síntesis de nuevas cadenas de ADN
complementarias, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

2.3. Explicar por qué razón la temperatura de anelamiento es variable y porqué esta
depende de la secuencia de los cebadores:

La temperatura de anillamiento en la PCR es variable y depende de la secuencia de

los cebadores. Esta temperatura óptima permite que los cebadores se unan de
manera específica y estable al ADN molde, facilitando la síntesis de nuevas cadenas
de ADN. La secuencia de los cebadores es crucial, ya que determina su capacidad de
unirse de forma complementaria al ADN molde. Factores como la longitud,
composición de bases y contenido de G-C en los cebadores influyen en la
temperatura de anillamiento. La optimización de esta temperatura es esencial para
lograr una amplificación eficiente y selectiva durante la PCR, garantizando una unión
precisa entre los cebadores y el ADN molde.

2.4. ¿Cuáles son las características óptimas que deben tener los cebadores
(oligonucleótidos) para que la técnica de PCR amplifique solamente el producto
deseado?

1. Los cebadores deben tener una longitud adecuada, generalmente entre 18 y 30

nucleótidos.
 2. Deben tener una temperatura de fusión (TM) similar para una unión específica al
ADN molde.
3. La composición de bases debe ser equilibrada, con una proporción adecuada de
A, T, C y G.
4. Los cebadores deben tener una secuencia específica que sea complementaria a la
región de ADN objetivo.
5. Se deben evitar repeticiones y secuencias similares en los cebadores para
minimizar la formación de productos no específicos.

2.5. Mencionar una variación a la técnica de PCR (Q-PCR, RT-PCR, PCR multiplex,
PCR anidado etc.) y describa las semejanzas y diferencias con la técnica de PCR
convencional.

Una variación de la técnica de PCR es la PCR cuantitativa (qPCR). La qPCR, al

igual que la PCR convencional, amplifica secuencias específicas de ADN, pero
difiere en su capacidad para cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en
una muestra en tiempo real. Mientras que la PCR convencional amplifica el ADN
en ciclos y luego se analiza al final de la reacción, la qPCR utiliza sondas
fluorescentes que se unen a las secuencias amplificadas durante la reacción,
permitiendo la medición en tiempo real de la cantidad de ADN presente.
En cuanto a las semejanzas, ambas técnicas utilizan primers específicos para
amplificar secuencias de ADN, requieren una polimerasa de ADN termoestable y
ciclos de temperatura para la amplificación. Sin embargo, la principal diferencia
radica en la capacidad de la qPCR para cuantificar la cantidad de ADN amplificado
durante la reacción, lo que la hace especialmente útil en aplicaciones donde se
necesita medir la expresión génica, detectar patógenos o identificar variaciones
genéticas de manera precisa y cuantitativa.

2.6. ¿Detalle cómo se mueven los fragmentos de ADN a través del gel? ¿Hacia qué
electrodo migrará y por qué?

En la electroforesis en gel, los fragmentos de ADN migran hacia el ánodo

(electrodo positivo) debido a su carga negativa de su esqueleto fosfato, y su
velocidad de migración está determinada principalmente por su tamaño, siendo los
fragmentos más pequeños los que se desplazan más rápidamente a través del gel
y lo más grandes se mueven lentamente por su tamaño.

2.7. ¿De qué depende la concentración de agarosa a ser utilizada en un gel en una
electroforesis?
La concentración de agarosa a utilizar en un gel de electroforesis depende
principalmente del tamaño de los fragmentos de ADN que se desean separar:
Para separar fragmentos de ADN pequeños (100 pb a 1 kb), se utilizan geles de
agarosa a concentraciones altas, generalmente entre 1.5-2%.
 Para separar fragmentos de ADN de tamaño medio (0.5 a 10 kb), se usan
concentraciones de agarosa entre 0.7-1.2%.
Para separar fragmentos grandes de ADN (5 a 25 kb), se emplean geles de baja
concentración de agarosa, entre 0.3-0.5%.
Otros factores que influyen en la concentración de agarosa son:
El tamaño de los poros del gel, que disminuye al aumentar la concentración de
agarosa.
La fuerza y resistencia del gel, que aumentan con la concentración.
El rango de separación, que es mayor para geles de baja concentración.
Equipo y sistema de electroforesis utilizado: El equipo y el sistema de
electroforesis utilizado pueden tener limitaciones o requerimientos específicos en
cuanto a la concentración de agarosa.
Compatibilidad con la muestra y las condiciones de electroforesis: La
concentración de agarosa seleccionada debe ser compatible con la muestra de
ADN y las condiciones de electroforesis utilizadas.
Es importante seleccionar la concentración adecuada de agarosa para obtener
una separación óptima de los fragmentos de ADN.

2.8. ¿Como se llama el componente o reactivo que permite visualizar el ADN por
fluorescencia al ser sometido el gel a luz UV? Visible cuando se tiñe con una gente
intercalante (bromuro de etidio, GelRed, GelGreen)

GELRED: foto sacada de la diapositiva

El tinte SYBR Safe es una alternativa menos peligrosa al bromuro de etidio para
visualizar el ADN en geles de agarosa o acrilamida.
 SYBR Safe es un tinte de alta sensibilidad que se utiliza para visualizar el ADN en
geles, y puede ser excitado por luz UV o luz azul.

2.9. ¿Qué es un marcador de peso molecular?

Conjunto de fragmentos de ADN de tamaño conocido.
¿Cuál es su utilidad?
- Estimar el peso molecular o tamaño de proteínas o fragmentos de ADN
desconocidos
- Controlar el progreso de la separación electroforética
- Confirmar la finalización del electro transferencia
¿Cuál es el patrón de bandas con sus respectivos tamaños de cada una de las
bandas del marcador 1Kb plus DNA Ladder?
El marcador 1 Kb Plus DNA Ladder contiene fragmentos de ADN de los siguientes
tamaños:

- 20,000 pb
- 10,000 pb
- 7,000 pb
- 5,000 pb
- 4,000 pb
- 3,000 pb
- 2,500 pb
- 2,000 pb
- 1,500 pb
- 1,200 pb
- 1,000 pb
- 900 pb
- 800 pb
- 700 pb
- 600 pb
- 500 pb
- 400 pb
- 300 pb
- 200 pb
- 100 pb

Estos fragmentos se separan en un gel de agarosa durante la electroforesis,

formando un patrón de bandas que permite estimar el tamaño de fragmentos
desconocidos por comparación

2.10. ¿Qué voltaje se usa para correr un gel? ¿Cómo afectan las variaciones de voltaje la
corrida en un gel de agarosa?
Para correr un gel de agarosa, se recomienda aplicar un voltaje constante entre 4-
10 V/cm de distancia entre el ánodo y el cátodo (no la longitud del gel). Por ejemplo,
aplicar 125 V constantes es común para geles de tamaño estándar.
Las variaciones en el voltaje aplicado afectan la corrida del gel de la siguiente
manera:
Poco voltaje: La movilidad de las bandas se reduce, y tienden a ensancharse y
difundir como manchas difusas.
 Demasiado voltaje: Disminuye la resolución, las bandas pueden distorsionarse y el
ADN puede salirse del gel.
Por lo tanto, es importante mantener un voltaje constante dentro del rango
recomendado para obtener una buena separación y resolución de las bandas de
ADN en el gel de agarosa

2.11. Después de realizar una extracción de ADN total de hojas de tomate se corrió un gel
de agarosa al 1% para determinar la calidad de este ADN. ¿Después de ver el gel
en la foto documentador como puedo evaluar la calidad de este ADN, es decir si
está degradado o si es de buena calidad? Explica tu respuesta.
Para evaluar la calidad del ADN en un gel de agarosa, debes observar la presencia
de bandas nítidas y definidas, verificar que no haya arrastre o smear, considerar el
tamaño y la intensidad de las bandas. Si el ADN muestra bandas claras, bien
definidas y de tamaño adecuado, es probable que sea de buena calidad. Por otro
lado, si hay arrastre, un smear difuso o bandas de tamaño inesperado, podría
indicar que el ADN está degradado o contaminado.

2.12. Si tenemos un gel de agarosa después de correr una electroforesis (esquema). En

este gel se numeraron los carriles del 1 al 4 (un carril es un corredor por el cual pasa
el ADN al salir del pozo):

¿Qué carril corresponde a las siguientes descripciones?

Este carril contiene el fragmento de ADN más largo: Carril 1
Este carril contiene el fragmento de ADN más corto: carril 2
Este carril contiene un fragmento de ADN de 1500 pares de bases (pb): carril 3
ANEXOS

Parámetros de amplificación de PCR ajustada para Begomovirus en tomate y

arvenses

Desnaturación inicial: 94oC por 2 minutos

30 ciclos de: Desnaturación 94oC por 1 minuto
Anelamiento 50oC por 2 minutos
Síntesis 72oC por 2 minutos
o
Síntesis final: 72 C por 10 minutos

Secuencias de los cebadores degenerados Begomovirus (Rojas et al, 1993)

BIBLIOGRAFIA Y MATERIAL DE CONSULTA SUGERIDO4

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