Caracterización morfológica, patogénica y molecular de aislamientos de

Ceratocystis spp. provenientes de seis zonas cafetaleras de Costa Rica

María José Cordero Vega

TESIS PRESENTADA PARA OPTAR POR EL GRADO DE

PROFESIONAL DE INGENIERA AGRÓNOMA CON EL GRADO DE
LICENCIADA EN AGRONOMÍA

ESCUELA DE AGRONOMÍA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS

UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

2017

i
 DEDICATORIA

A mi Dios por bridarme todas las oportunidades y fortalezas para finalizar una etapa muy
importante en mi vida personal.

A mis padres María Auxiliadora y Jose por su infinito apoyo y guía durante toda mi vida y
a mis hermanos Jazmín y Alonso por todos sus momentos de ánimo y colaboración.

A Mainor por su comprensión y compañía.

ii
 AGRADECIMIENTO

Quiero manifestar mi fuerte agradecimiento al coordinador del departamento de

Fitopatología del Centro de Investigaciones en Café, el [Link]. Miguel Barquero Miranda,
por su guía, apoyo, carácter y confianza durante todo este proceso.

A mi directora de tesis, la [Link]. Amy Wang Wong por su guía y consejos brindados
durante el desarrollo del proyecto.

Al Ph.D. Luis Felipe Arauz Cavallini, por sus consejos durante mi formación académica.

A la Dra. Mónica Blanco Meneses, por todo su apoyo y conocimientos brindados.

Al Dr. Danny Humphreys, por la ayuda brindada en la finalización de este trabajo.

A la Lic. Alejandra Robles, por la paciencia y apoyo brindado.

A mis compañeros de las regionales de Coto Brus, Pérez Zeledón, Los Santos, Turrialba,
Valle Central y Valle Occidetal del Instituto del Café por su guía y colaboración en la
recolecta de las muestras.

Al Instituto del Café por todas las oportunidades brindadas.

Y a todas aquellas personas que me apoyaron durante la ejecución de la tesis.

iii
Caracterizaci6n morfol6gica, patogenica y molecular de aislamientos de Ceratocystis spp.
provenientes de seis zonas cafetaleras de Costa Rica

Maria Jose Cordero Vega

TESIS PARA OPTAR AL TITULO DE INGENIERA AGRONOMA CON EL

GRADO ACADEMICO DE LICENCIADA EN AGRONOMiA

DIRECTORA DE TESIS
Amy Wang Wong, M .Sc

MIEMBRODELTRmUNAL

MIEMBRO DEL TRmUNAL

MIEMBRO DEL TRmUNAL

DIRECTOR DE ESCUELA

SUSTENTANTE

2017

iv
 ÍNDICE GENERAL

DEDICATORIA ................................................................................................................................ ii
AGRADECIMIENTO ......................................................................................................................iii
ÍNDICE GENERAL.......................................................................................................................... v
RESUMEN ........................................................................................................................................ vii
LISTA DE CUADROS .....................................................................................................................ix
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................................x
LISTA DE ANEXOS....................................................................................................................... xiv
INTRODUCCIÓN............................................................................................................................. 1
ANTECEDENTES ............................................................................................................................ 4
OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................... 9
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................................... 9
MATERIALES Y MÉTODOS....................................................................................................... 10
1. Muestreo de las plantas enfermas a nivel de campo ............................................................ 10
1.1 Preparación de aislamientos ............................................................................................. 10
1.2 Recuperación de los aislamientos..................................................................................... 10
2. Caracterización morfológica .................................................................................................. 11
2.1 Preparación del inóculo .................................................................................................... 11
2.2 Evaluaciones ...................................................................................................................... 12
3. Evaluación de la agresividad .................................................................................................. 12
4. Identificación molecular ......................................................................................................... 15
4.1 Preparación de los aislamientos ....................................................................................... 15
4.2 Extracción de ADN............................................................................................................ 15
4.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ................................................................. 16
RESULTADOS ................................................................................................................................ 18
1. Muestreo de las plantas enfermas a nivel de campo ........................................................ 18
2. Caracterización morfológica .............................................................................................. 23
3. Evaluación de la patogenicidad .......................................................................................... 33

v
 4. Identificación molecular ..................................................................................................... 44
DISCUSIÓN..................................................................................................................................... 46
1. Muestreo............................................................................................................................... 46
2. Morfología ............................................................................................................................ 49
3. Agresividad .......................................................................................................................... 53
4. Identificación molecular ..................................................................................................... 57
CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 61
RECOMENDACIONES ................................................................................................................. 62
LITERATURA CITADA ............................................................................................................... 63
ANEXO ............................................................................................................................................ 71

vi
 RESUMEN

El presente trabajo se realizó con la finalidad de evaluar la variabilidad morfológica,

patogénica y molecular de 30 aislamientos de Ceratocystis spp. obtenidos de plantas de
cafeto en las regiones cafetaleras de Costa Rica: Coto Brus, Pérez Zeledón, Los Santos,
Turrialba, Valle Central y Valle Occidental.

Se identificaron fincas con presencia de síntomas característicos de la enfermedad. De esta

forma se obtuvo para la región de Coto Brus: 2 aislamientos; Pérez Zeledón 5; Los Santos
6; Turrialba 4; Valle Occidental 4 y el máximo número de individuos se obtuvo del Valle
Central con 9. Se determinó que la distribución de la enfermedad está presente en parches,
plantas aisladas y en podas.

La caracterización morfológica en los aislamientos recuperados se realizó mediante la

observación y mediciones del peritecio (cuello, base y diámetro), ascosporas,
clamidósporas, conidias, color del micelio y distribución de los peritecios en medio de
cultivo artificial, obteniendo variabilidad entre los aislamientos.

La evaluación de la patogenicidad de los 30 aislamientos se realizó mediante un Índice de

Agresividad en el cual se consideran valores de incidencia (%), área final de la lesión,
esporas por lesión, periodo de aparición la lesión y de las estructuras sexuales (peritecios).
De esta forma, se obtuvo que el tamaño de la lesión final en el tallo varía entre los
tratamientos donde el VC22 procedente del Valle Central presentó el mayor valor con 9,9
cm y el aislamiento de Los Santos LS4 el menor, con un valor de 4,75 cm. La tasa de
crecimiento diaria estuvo entre 0,94-1,9 cm y para los resultados del Índice de Agresividad
se obtuvo que únicamente el 7 % de los individuos presentaban valores de índice menores a
30.000 y el 10 % presentaban los mayores valores, por encima de los 160.000; el 50 % de
los individuos presentaban un índice entre 40.000-100.000 y el restante 33 % muestra
valores entre 100.000 y 140.000. Para esta variable no se mostró una relación directa entre
agresividad y la región de origen y se obtuvo que el aislamiento más agresivo corresponde
vii
al aislamiento LS63 procedente de Santa María de Dota con un valor de 160.000 y el menor
lo obtuvo el aislamiento LS4 procedente de la misma región.

Se identificaron diferencias genéticas entre los aislamientos determinados por agresividad y

variabilidad morfológica mediante la utilización de los primers ITS, β- tubulina y factor de
elongación 1-α. Se obtuvo amplificación de ~ 500 pb para la región ITS y la β- tubulina y ~
800 pb para el factor de elongación 1-α. Se mostraron polimorfismos entre los aislamientos
de Ceratocystis spp. obtenidos de plantas enfermas de cafeto en las distintas regiones
cafetaleras de Costa Rica. Los aislamientos LS63 y LS4 muestran valores de bootstrap
entre ellos de 53 separándose de los aislamientos T43 y PZ67 con un valor de 80. Los
aislamientos T43 y PZ67 muestran valores de bootstrap de 100 con la especie C.
papillata, no obstante, se agrupan en ramas separadas. De forma general, se obtiene una
separación genética entre los aislamientos LS63 y LS4 correspondientes a la región de Los
Santos del aislamiento de Cajón de Pérez Zeledón PZ67 y del aislamiento de Santa Cruz de
Turrialba T43 pudiendo corresponder a especies distintas.

viii
 LISTA DE CUADROS

Cuadro 1. Imprimadores para PCR de las regiones utilizadas en al análisis multilocus….16

Cuadro 2. Total de muestras positivas y negativas para Ceratocystis spp. analizadas en las
regiones cafetaleras del Valle Occidental, Los Santos, Turrialba, Pérez Zeledón, Coto
Brus y Valle Central de Costa Rica para la búsqueda de aislamientos de Ceratocystis
spp., setiembre 2014-mayo 2016………………………………………………………18

Cuadro 3. Número de aislamientos obtenidos para Ceratocystis spp. según las distintas
regiones cafetaleras del país, 2015-2016………………………………………………20

Cuadro 4. Agrupación de los aislamientos de Ceratocystis spp. obtenidos en las distintas

regiones según la característica de color mediante la utilización de la tabla
Munsell……………………………………………………………………………..33

Cuadro 5. Aislamientos de Ceratocystis spp. de las regiones cafetaleras de Costa Rica y

sus variables morfológicas y patogénicas determinadas para la selección en las
pruebas de identificación molecular………………………………………………..39

Cuadro 6. Aislamientos de Ceratocystis spp. de las regiones cafetaleras de Costa Rica,

especie C. papillata y C. colombiana y la medición de sus variables morfológicas
comparativas……………………………………………………………………….53

ix
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Porcentaje de aislamientos obtenidos para Ceratocystis spp. según las distintas
regiones cafetaleras del país, 2015-2016…………………………………………...21

Figura 2. Puntos de muestreo de Ceratocystis spp. en las distintas regiones cafetaleras de

Costa Rica: Valle Occidental, Los Santos, Turrialba, Pérez Zeledón, Coto Brus y
Valle Central, 2015-2016…………………………………………………………..22

Figura 3. Tamaño de las ascosporas (µm) en una muestra de la población de C. fimbriata

proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica.; LS: Límites superior, LI:
Límite inferior……………………………………………………………………...23

Figura 4. Frecuencia poblacional para el tamaño (µm) de las ascosporas en una muestra de
la población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa
Rica…………………………………………………………………………………24

Figura 5. Tamaño de las conidias (µm) en una muestra de la población de C. fimbriata

proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica; LS: Límites superior, LI:
Límite inferior……………………………………………………………………...24

Figura 6. Frecuencia poblacional para el tamaño de las conidias (µm) en una muestra de la
población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa
Rica…………………………………………………………………………………25

Figura 7. Tamaño de las clamidiósporas (µm) en una muestra de la población de C.

fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica; LS: Límites
superior, LI: Límite inferior………………………………………………………..26

Figura 8. Frecuencia poblacional para el tamaño (µm) de las clamidiósporas en una

muestra de la población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras
de Costa Rica……………………………………………………………………….26

x
Figura 9. Tamaño de la base de peritecio (µm) en una muestra de la población de C.
fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica; LS: Límites
superior, LI: Límite inferior………………………………………………………..27

Figura 10. Frecuencia poblacional para el tamaño (µm) de la base del peritecio en una
muestra de la población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras
de Costa Rica……………………………………………………………………….28

Figura 11. Tamaño del cuello de peritecios (µm) en una muestra de la población de C.
fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica; LS: Límites
superior, LI: Límite inferior………………………………………………………..28

Figura 12. Frecuencia poblacional para el tamaño del cuello del peritecio en una muestra
de la población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa
Rica…………………………………………………………………………………29

Figura 13. Tamaño del diámetro del peritecio (µm) en una muestra de la población de C.
fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica; LS: Límites
superior, LI: Límite inferior………………………………………………………..30

Figura 14. Frecuencia poblacional para el tamaño del diámetro de peritecio en una muestra
de la población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa
Rica…………………………………………………………………………………30

Figura 15. Tamaño del ostiolo (µm) en una muestra de la población de C. fimbriata
proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica; LS: Límites superior, LI:
Límite inferior……………………………………………………………………...31

Figura 16. Frecuencia poblacional para el tamaño (µm) del ostiolo en una muestra de la
población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa
Rica…………………………………………………………………………………32

xi
Figura 17. Tamaño de la lesión (cm) 15 días después de la inoculación en una muestra de
la población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa
Rica; LS: Límites superior, LI: Límite inferior…………………………………….34

Figura 18. Frecuencia poblacional para el tamaño (cm) de la lesión final a los 15 días
después de la inoculación en una muestra de la población de C. fimbriata
proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica………………………...34

Figura 19. Tasa de crecimiento diaria (cm) en una muestra de la población de C. fimbriata
proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica………………………...35

Figura 20. Frecuencia poblacional en una muestra de la población de C. fimbriata

proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica según Índice de
Agresividad………………………………………………………………………...36

Figura 21. Agrupamiento de los aislamientos de Ceratocystis spp. en cantones según

variables morfológicas, patogénicas y climáticas (lluvia-temperatura-humedad)
correspondientes al I y II semestre año 2014-2015………………………………...37

Figura 22. Características morfológicas del aislamiento LS4; crecimiento en medio

nutritivo (A); ascosporas, conidias y clamidiósporas cilíndricas (B); peritecio (C),
base del peritecio (D), hifas ostiolar divergentes con salida de ascosporas (E),
tamaño de lesión final promedio (H)……………………………………………….40

Figura 23. Características morfológicas del aislamiento LS63; crecimiento en medio

nutritivo (A); ascosporas, conidias y clamidiósporas cilíndricas (B); peritecio (C),
base del peritecio (D), hifas ostiolar divergentes con salida de ascosporas (E),
tamaño de lesión final promedio (H)……………………………………………….41

Figura 24. Características morfológicas del aislamiento T43; crecimiento en medio

nutritivo (A); ascosporas, conidias y clamidiósporas cilíndricas (B); base del
peritecio (C), peritecio (D), hifas ostiolar divergentes (E), tamaño de lesión final
promedio (H)……………………………………………………………………….42

xii
Figura 25. Características morfológicas del aislamiento PZ67; crecimiento en medio
nutritivo (A); ascosporas, conidias y clamidiósporas cilíndricas (B); base del
peritecio (C), peritecio (D), hifas ostiolar divergentes con salida de ascosporas (E),
tamaño de lesión final promedio (H)……………………………………………….43

Figura 26. Árbol filogenético de consenso basado en los criterios de análisis Bayesiano que
ilustra la relación de los aislamientos de Ceratocystis spp. asociados a la “Llaga
macana” en café de Costa Rica y demás especies de Ceratocyistis spp encontrados
en café, cacao, cítricos en Colombia. El árbol se generó mediante secuencias de las
regiones ITS, B-tubulina y el Factor de Elongación 1-α…………………………...45

Figura 27. Muestreo de plantas con presencia de Ceratocystis sp., plantas enfermas de
forma aislada (A), en podas (B) y en parches
(C)………………………………………………......................................................47

Figura 28. Lesión irregular marrón- gricácea en tronco característica de C. fimbriata,

Costa Rica, 2015-2016……………………………………………………………..47

xiii
 LISTA DE ANEXOS

ANEXO 1. Variable morfológica color mediante la utilización de la Tabla Munsell de los

aislamientos de Ceratocystis spp. obtenidos en las distintas regiones cafetaleras en
el país……………………………………………………………………………….71

ANEXO 2. Variables morfológicas para implementación de Índice de Agresividad: 0 día

de la inoculación (A), 2 días después de la inoculación con aparición de lesión (B),
4-6 días después de la inoculación aparición de peritecios (C) lesión final 15 días
después de la inoculación (D), desarrollo de peritecios sobre la lesión en herida
realizada (E), medición de la cantidad de peritecios mediante el conteo en un área
conocida su equivalencia al área total final de la lesión a los 15 días después de la
inoculación (F)……………………………………………………………………..72

ANEXO 3. Extracción de ADN mediante el macerado micelio (A-B), PCR y electroforesis

con gel de agarosa 1 % para verificación de amplificación de PCR (C-
D)…………………………………………………………………………………...73

ANEXO 4. Aislamiento de Ceratocystis spp. y números de accesiones del GeanBank

utilizados para generar el árbol filogenético en el presente trabajo………………..74

xiv
 INTRODUCCIÓN

El cafeto, Coffea arabica, pertenece a la familia de las Rubiáceas. Su origen se estableció

en las tierras altas de más de 1000 m.s.n.m en Etiopía y Sudán, África. Fue introducido en
América por el año de 1720 y en Costa Rica a finales del siglo XVIII (Alvarado y Rojas,
2007).

La Organización Internacional del Café (OIC 2014) considera que el café es uno de los
productos primarios de mayor valor, superado únicamente por el petróleo. En países en
desarrollo, es fuente importante de divisas y genera empleo a millones de personas en todo
el mundo durante los procesos de producción y comercialización. También tiene influencia
en la economía y en la política de los países productores. Además, es considerado un
producto básico con un mercado especial y selecto en Londres y Nueva York.

El consumo de café proporciona grandes aportes a la salud humana. No contiene gran

concentración de nutrientes y calorías, sin embargo, diversos estudios han demostrado que
es fuente de antioxidantes, retrasa el envejecimiento, posee un efecto protector contra el
cáncer, disminuye el riesgo frente a enfermedades cardiovasculares, estimula el sistema
nervioso y mejora la capacidad en la concentración (Instituto de Café de Costa Rica
(ICAFE) 2014). Lo anterior, ha incrementado su consumo a nivel mundial.

En el año 2012 el área cafetalera en Costa Rica, según el ICAFE (2014), fue de 93 774
hectáreas con una producción para el ciclo 2012/2013 de 2 245 543 fanegas (400 litros de
café en fruta) distribuidas entre las regiones de Coto Brus, Pérez Zeledón, Los Santos,
Turrialba, Valle Central, Valle Central Occidental y la Zona Norte. Este mismo ente
informa que el país exporta el 90 % del café que produce, representando para el último
ciclo 2015/2016, según la OIC, una exportación total de 995 mil sacos de 60 kg,
disminución ocasionada por el ataque severo de la roya del cafeto (Hemileia vaxtatris).

1
El 92 % de los productores nacionales poseen un área de siembra menor a las cinco
hectáreas, el 6 % tienen una superficie entre 5-20 hectáreas y únicamente el 2 % poseen un
área de siembra mayor a las 20 hectáreas (ICAFE 2014).

El cultivo del cafeto en Costa Rica se ve afectado por enfermedades foliares, de grano y de
raíz y tallo. Entre las de tipo foliar encontramos a antracnosis (Colletotrichum spp.), derrite
(Phoma spp.), ojo de gallo (Mycena citricolor), Myrotecium sp. y la roya del cafeto
(Hemileia vastatrix); afectando los granos encontramos a antracnosis (Colletotrichum spp.);
y a nivel de raíz y tallo se encuentra Fusarium spp., Rosellinia spp. y Ceratocystis spp.
(ICAFE 2014).

De esta forma, encontramos una amplia gama de patógenos afectando la caficultura

nacional, en donde, las enfermedades foliares y de grano pueden ser manejadas mediante
buenas prácticas culturales y productos químicos, por el contrario, para la mayoría de
enfermedades de suelo los productos químicos han sido poco eficientes. En estos casos, la
mejor herramienta de combate va dirigida a una adecuada implementación de prácticas
culturales y la búsqueda de alternativas en el mejoramiento de plantas con tolerancia o
resistencia a enfermedades como Ceratocystis spp., fomentando en un contexto de
competitividad, la optimización de los recursos y la reducción de los costos unitarios de
producción para el combate de enfermedades y plagas (ICAFE 2014; Castro-Caicedo et al.
2003; Castro et al. 2003).

De los patógenos presentes en el suelo, se menciona a Ceratocystis fimbriata como uno de

los más agresivos, debido a que es capaz de reducir la población de plantas de un 20 a
40% (Castro-Caicedo 1999; Castro y Zuluaga 2012). A nivel de suelo, según Ferreira et al.
(2010) y Baker et al. (2003), este agente fitopatógeno es el causante de numerosas pérdidas
económicas en diferentes cultivos de importancia agrícola a nivel de 41 países en los seis
continentes del mundo.

Barnes et al. (2001) encontraron que cepas de Ceratocystis fimbriata pueden mantener un
alto grado de especialización tanto por sus hospederos como por el área geográfica donde
se localizan. Además, Ferreira y colaboradores (2010), hacen mención que aislamientos de
2
Ceratocystis fimbriata en Brasil, obtenidos a partir de diferentes hospederos, no eran
patógenicos en otras especies de las que fueron aislados y que el nivel de agresividad de las
cepas nativas varía según el hospedante y los rangos geográficos. Baker y Harrington
(2005) y Zauza y colaboradores (2004) determinaron que los distintos linajes
(descendientes) de Ceratocystis sp. en América Latina presentan una alta especialización y
que mediante el estudio de la morfología se pueden caracterizar nuevas especies.

Wingfield y colaboradores (1996) determinaron que se presentaban diferencias entre

aislamientos de Ceratocystis fimbriata originarios de Sudáfrica en relación a aislamientos
obtenidos de Nueva Guinea, Francia, Italia y Japón, por lo tanto, incursionaron en la
identificación mediante técnicas morfológicas convencionales y con secuencias del ADN
ribosómico utilizando los primers ITS1, LR1, 5.8SR y CS2.

Marín y colaboradores (2003), concluyeron que los daños causados por este patógeno
pueden agravarse en el futuro a menos que se busque medidas eficaces de combate de la
misma. De esta forma Van Wyk y colaboradores (2010) mencionan la importancia de
realizar estudios de caracterización de especies en las distintas regiones en los países
productores. Esto tendría la finalidad de incursionar en el proceso de selección de plantas
para mejoramiento, donde se dirija a la especie del patógeno más agresivo presente en la
región de estudio.

Como se ha mencionado anteriormente, el combate químico de la enfermedad es ineficiente

(Castro-Caicedo, 1999), además, se conoce que la agresividad varía entre las regiones y
que existe diversidad de especies encontradas en los países productores de café. Por tanto,
conociendo que este patógeno influye negativamente, causando pérdidas económicas a los
sectores cafetaleros, se requiere determinar, mediante pruebas morfológicas, de agresividad
e identificación molecular, el comportamiento y la variabilidad de la población en sus
distintos ambientes naturales a nivel del territorio nacional, tomando en consideración que
no se cuenta con ningún estudio sobre la diversidad y patogenicidad del mismo en nuestro
país.

3
 ANTECEDENTES

Durante la producción de los cultivos, la presencia de agentes fitopatógenos limitan el

desarrollo y crecimiento adecuado de los mismos. En Costa Rica, las enfermedades del
tronco y la raíz en los cafetos se mencionan desde inicios del siglo XIX donde se observan
daños tanto en almácigos como en plantas adultas (Bianchini, 1955). Castro-Caicedo y
Cortina-Guerrero (2009) hacen mención de la enfermedad conocida como “llaga macana”
desde el año de 1932.

Los primeros informes del género Ceratocystis se establecen en el año de 1890 como el
causante de la podredumbre negra de la papa en los Estados Unidos (De Beer et al., 2014;
Roux y Wingfield, 2009). Saccardo en 1892 le transfirió el nombre de Sphaeronaema, en
1923 Elliott le nombró como Ceratostomella, en el año de 1934 Melin y Nannfeldt le
conocieron como Ophiostoma y un año después Davidson se lo transfirió a
Endoconidiphora. Sin embargo, fue reconocida mundialmente como Ceratocystis en el año
de 1950 (CABI, 2017).

Echandi (1955) a partir de aislamientos obtenidos de plantas enfermas de Cartago y San

José, encontró la presencia del hongo Ceratostomella, organismo similar al mencionado en
Colombia, Venezuela y Guatemala. Mencionó que el patógeno ataca a plantas de café con
edades entre los 40-50 años y que desde años anteriores se encontraba en los cafetos del
Valle Central del país. Posteriormente, se le conoció con el nombre de Ceratocystis y
Castro-Caicedo y colaboradores (2003) mencionan que dicho patógeno en países
productores, se encuentra en plantas adultas y jóvenes, y aparece con mayor frecuencia
entre los 2 años y 4 años de edad o en cafetos después de su primera poda.

Ceratocystis sensu lato pertenece al grupo de los ophiostomatoides e incluye los géneros:
Ceratocystis sensu stricto, Ceratocystiopsis (Upad. & Kendr) y Ophiostoma (H. y P.
Sydow) (Jacobs et al., 1998; Pérez, 2009). Se conoce que dentro de estos existe variabilidad

4
en la patogenidad entre ellos, por ejemplo C. paradoxa y C. moreau son menos agresivos
que O. ulmi (Buism.), O. novoulmi brasier y C. fimbriata (Wingfield et al., 1996).

Ceratocystis sp. pertenece al reino Fungi, a la división Myxomicota, subdivisión

Ascomycotina, clase Microascales y a la familia Ceratocysteacea. Tiene la capacidad de
infectar al menos 31 especies en 14 familias de importancia económica, la mayoría
dicotiledóneas a excepción de una arácea (Johnson et al. 2005; Baker et al. 2003; Roux*† et
al. 2004; De Beer et al. 2014; Waller at al. 2007; Lui et al. 2015); sin embargo, García et
al., 2016 informa de un total de 40 especies de importancia agrícola afectadas por la
enfermedad. Afecta a cultivos en diferentes países, Zauza et al. (2004) lo encuentra en
banano (Musa spp.) y en árboles como Prunus spp, melina (Gmelina arborea), Populus
spp., acacia (Acacia spp.), Hevea brasiliensis y el híbrido Eucalyptus grandis x E.
urophylla en Brasil. En Costa Rica afecta mango (Mangifera indica), cítricos (Citrus sp.),
caucho (Ficus elastica), cacao (Theobroma cacao L.) y otras especies como la guanábana
(Annona muricata) y el guapuruvú (Schizolobium parahyba) (Van Wyk et al. 2010;
Meneses, 2008; Barnes et al. 2001).

Ferreira et al. (2010) y Araujo et al. (2014) hacen mención que, en Brasil, el primer informe
sobre la enfermedad fue en Crotalaria juncea, posteriormente, seencuentra en mango
donde provoca grandes pérdidas económicas y en eucalipto (Eucalyptus spp.); además,
produce la pudrición del cormo en la especie Colocasia esculenta. En Colombia, Van Wyk
et al. (2010) hacen referencia a la presencia de la enfermedad en 1932, presentando los
mismos hospederos que en países como Costa Rica y Brasil.

Este patógeno provoca la enfermedad reconocida como “llaga macana” o también “mal de
machete”, posee una alta capacidad saprofítica y se encuentra presente en la mayoría de los
suelos cafetaleros (Cadena y Gaitán 2006). Los síntomas externos a nivel de planta son
clorosis, marchitamiento y la progresiva muerte de las mismas; a nivel de tejido interno se
produce una obstrucción de los tejidos vasculares del tallo (xilema principalmente), donde
las lesiones se extienden hacia arriba y bajo del tronco causando la muerte de la planta
(Castro-Caicedo et al. 2013; Araujo et al. 2014; Bispo et al. 2015; CABI, 2017). No

5
obstante, Araujo et al. (2014), en una investigación sobre la resistencia a la enfermedad
realizada en cultivares de mango en Brasil, evidenció la presencia de estructuras del hongo
en todos los tejidos de los tallos (colénquima y parénquima), por lo que no lo considera un
patógeno estrictamente vascular, sin embargo, la presencia de hifas en estos tejidos se ve
restringido por la presencia de compuestos fenólicos por parte de dichas células.

Estudios realizados indican que Ceratocystis fimbriata se encuentra principalmente en

suelos de América Central y del Sur, no obstante, también se ha aislado de zonas templadas
y las regiones tropicales de todo el mundo (Barnes et al. 2001; Waller at al. 2007). Según
Castro -Caicedo (1999) se encuentra distribuido en forma aleatoria en los suelos abarcando
altitudes que van desde los 800 m hasta los 2 000 m. Tiene la capacidad de sobrevivir de 7
a 15 días en la superficie de una herida y en fragmentos de madera en ríos y a nivel de suelo
hasta 3 meses con temperaturas menores a los 35 °C; su temperatura óptima de crecimiento
es de 18 a 28 °C, no obstante, puede desarrollarse a temperaturas entre los 10 °C y 45 °C en
presencia de su huésped (Thorpe et al. 2005; Meneses 2008; Grosclaude et al, 1991; CABI,
2017).

Es considerado como la enfermedad de más importancia a nivel de tallo y raíz en los

cafetos y ha tenido una alta diseminación y frecuencia de aparición debido a las heridas
causadas a las plantas, primordialmente el zaqueo (poda), el uso de herramientas
contaminadas y terrenos con alta pendiente que puede ocasionar una herida ocasionada por
el apoyo de los recolectores en las plantaciones (Castro-Caicedo et al. 2013). Además,
Ferreira et al. (2010), Van Wyk et al. (2007a), De Beer et al. (2014), Pérez et al. (2011) y
Roux y Wingfield (2009) mencionan que la transmisión de este hongo está relacionada en
muchos casos con insectos de la familia Curculionidae como agentes vectores. Se ha
asociado la característica de un olor afrutado fuerte como medio de atracción de vectores y
se cree, que la presencia de la enfermedad en países donde no es originario, es debido a la
trasmisión por dichos insectos, observado en cultivos como mango en Oman -Pakistan y en
Eucalyptus en Australia. Dicha enfermedad puede ocasionar pérdidas en la producción
entre el 20 % y el 50 % e influye en pérdidas económicas directas al tener que reemplazar
las plantas muertas de café (Castro-Toro y Rivillas-Osorio 2003; Castro-Caicedo 1999;
6
Castro et al. 2003; Castro y Zuluaga 2012). En este caso, Castro et al. (2003) hacen
mención en un estudio realizado, que las pérdidas económicas aumentan cuando la planta
presenta la enfermedad y ésta se encuentra en período de producción, disminuyendo así la
vida útil de las mismas con un promedio de 4,6 años/árbol atacado; agregaron que con una
incidencia del 13 % de la enfermedad en una hectárea, se producen pérdidas en la
productividad entre los $ 495 000 a $ 728 000/ ha/año, lo que hace de suma importancia
una mayor investigación sobre este patógeno.

La identificación taxonómica actual de hongos se basa en el estudio de las características

micro y macromorfológicas: características de la colonia, color en medio de cultivo,
tamaño, forma, desarrollo de esporas, esporas sexuales o asexuales y medios de cultivos
selectivos. Los métodos moleculares han complementado estos estudios con técnicas
basadas en los estudios del ácido desoxirribonucleico (ADN) para evaluar diferencia y
relaciones filogenéticas. Se realizan comparaciones de secuencias del rADN mitocondrial y
rADN nuclear, este último contienen los espaciadores internos ITS-1 e ITS-2 y un
espaciador intergénico llamado IGS que son la base en estudios de filogenie. Los
marcadores mitocondriales son considerados como códigos de barras para los hongos y los
marcadores nucleares son más susceptibles a acumular mutaciones por lo que son de gran
importancia en dichos estudios (Glass y Donaldson 1995; Fourie et al. 2015).

A nivel del mundo existen tres clanes o grupos para este patógeno ubicados en el centro de
Asia, América del Norte y Latinoamérica. De cada clan se desarrollan diversos linajes en
donde se ha encontrado que aislamientos de los mismos poseen una alta especialización y
que mediante diferencias en pruebas morfológicas y taxonómicas se descubren nuevas
especies (Baker y Harrington 2005).

Wingfield y colaboradores (1996) determinaron que se presentaban diferencias entre

aislamientos de Ceratocystis fimbriata originarios de Sudáfrica en relación a aislamientos
obtenidos de Nueva Guinea, Francia, Italia y Japón, por lo tanto, incursionaron en la
identificación mediante técnicas morfológicas convencionales y con secuencias del ADN
ribosómico utilizando los primers ITS1, LR1, 5.8SR y CS2.

7
Para Baker y Harrington (2005), Ceratocystis fimbriata presenta alta variación genética
debido, en muchos casos, a los amplios rangos geográficos en donde se localiza. Araujo et
al. (2014) hacen mención que existen diferencias en la agresividad de poblaciones de C.
fimbriata que atacan mango en diferentes regiones geográficas en Brasil.

Van Wyk y colaboradores (2010) determinaron, mediante pruebas morfológicas y de

secuenciación de cinco regiones de genes, la existencia de dos nuevas especies dentro del
complejo Ceratocystis fimbriata sensu lato con la capacidad de enfermar al cafeto:
Ceratocystis colombiana y Ceratocystis papillata. Según Castro-Caicedo et al. (2013) estas
nuevas especies representan una amenaza en la producción de cafeto en Colombia.

El combate de la enfermedad mediante manejo químico ha sido poco exitoso por lo que las
recomendaciones van enfocadas a evitar cualquier tipo de herida en la planta, utilizar
fungicidas protectores cuando se hacen las respectivas podas y desinfectar las herramientas
de corte. Con respecto a la poda, se recomienda realizarla en un periodo seco, para
disminuir la probabilidad de infección y estimular la cicatrización (Castro-Caicedo, 1999;
Castro y Zuluaga, 2012). Castro-Toro y Rivillas-Osorio (2003) hacen referencia a la
utilización de Trichoderma harzianun como una buena herramienta de combate biológico
para dicho patógeno.

Conociendo la diversidad del patógeno, la capacidad de sobrevivencia, la forma de

penetración al hospedero, las pérdidas económicas en las que se incurre y la dificultad en el
combate, se incursiona en la búsqueda de materiales con resistencia o tolerancia a las cepas
más agresivas imperantes en las regiones cafetaleras en países de América Latina y Sur
América.

8
 OBJETIVO GENERAL
Determinar la morfología, la patogenicidad y la identificación molecular de aislamientos de
Ceratocystis sp. provenientes de las regiones cafetaleras del Valle Occidental, Los Santos,
Turrialba, Pérez Zeledón, Coto Brus y el Valle Central de Costa Rica.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Establecer una muestra de cultivos axénicos de la población de Ceratocystis spp.
provenientes de cafetos de las regiones cafetaleras del Valle Occidental, Los Santos,
Turrialba, Pérez Zeledón, Coto Brus y Valle Central de Costa Rica.

 Caracterizar morfológicamente una muestra de la población de Ceratocystis sp.

mediante la medición del tamaño del peritecio, las ascosporas, las clamidiósporas y
las conidias, así como diferencias en la coloración de la colonia y las distribuciones
de los peritecios.

 Evaluar la patogenicidad de aislamientos de Ceratocystis sp. mediante el uso de un

Índice de Agresividad en troncos ortotrópicos de plantas de café var. Catuaí.

 Identificar, molecularmente, diferencias o similitudes genéticas entre los

aislamientos según su morfología y patogenicidad.

9
 MATERIALES Y MÉTODOS

La presente investigación se llevó a cabo en las instalaciones del Laboratorio de

Fitopatología del Centro de Investigaciones en Café (CICAFE), ubicadas en San Pedro de
Barva de Heredia, desde el 9 de marzo del 2015 al 21 de abril del 2017.

1. Muestreo de las plantas enfermas a nivel de campo

1.1 Preparación de aislamientos

Se inspeccionó, al azar, al menos 10 fincas distribuidas en cada una de las principales

regiones cafetaleras de Costa Rica: Valle Occidental, Los Santos, Turrialba, Pérez Zeledón,
Coto Brus y Valle Central. En cada finca se identificó plantas que presentaban síntomas
característicos de la enfermedad como marchitamiento y clorosis. Posterior a la observación
visual, se realizó un raspado del tronco a nivel de suelo y se verificó la presencia de una
lesión irregular necrótica-rojiza, donde se pudo observar una lesión previa o podas bajas
(menores a los 20 cm). Se trasladaron en bolsas plásticas con una toalla humedecida al
Laboratorio de Fitoprotección de CICAFE en donde se procedió con la recuperación del
patógeno.

Cada unidad experimental tuvo la siguiente información: fecha de recolecta, coordenadas

geográficas, provincia, cantón, distrito y altura mediante la utilización de un Sistema de
Posición Global (GPS).

1.2 Recuperación de los aislamientos

Se tomaron pequeñas secciones del tejido enfermo (tronco), se desinfectaron con

aspersiones de alcohol 70 % y se llevaron a la cámara de flujo laminar donde se tomaron 12
secciones del tejido de la zona interna de avance de la lesión de cada una de las muestras.
Cada una se colocó en placas Petri en medio con papa dextrosa agar (PDA, marca Difco

10
TM
) a una dosis de 35 g/l, acidificado con ácido láctico (250 µl/litro de medio de cultivo).
Además, se colocaron secciones de tejido enfermo en dos placas Petri conteniendo rodajas
de zanahoria (dos por placa), a las cuales se les colocó papel filtro estéril humedecido con
agua destilada esterilizada, esto, como una segunda opción para el crecimiento del patógeno
(Marín et al. 2003; Meneses. 2008). La zanahoria es un medio selectivo para Ceratocystis
sp., lo que promueve la obtención de un aislamiento en un menor tiempo y sin la presencia
de otros contaminantes que crecen rápidamente en PDA. El utilizar ambas técnicas
aumentó la probabilidad de obtener el patógeno de interés.

Al final, se tomaron estructuras del patógeno de cualquiera de los 16 puntos inoculados (en
PDA o zanahoria), con el cuidado de que no se presentara ningún contaminante. La
cantidad de secciones utilizadas fue para aumentar la probabilidad de crecimiento del
patógeno de interés ya que tiende a contaminarse con otros hongos y bacterias oportunistas
que presentan una tasa de crecimiento mayor.

De esta forma, se obtuvo la colección de aislamientos necesario para los posteriores

estudios morfológicos, patogénicos y moleculares.

2. Caracterización morfológica

2.1 Preparación del inóculo

Una vez establecido el cultivo axénico para todas las muestras (cuando el patógeno
colonizó el total del área de la placa Petri y se observó la presencia de peritecios,
aproximadamente entre 18-22 días dependiendo del aislamiento) se realizó un raspado a
cada una de las placas y se colocó en un punto sobre un porta objeto, se le colocó una gota
de agua estéril (~ 200 μl) e inmediatamente se colocó un cubre objeto. Se prepararon tres
repeticiones por aislamiento (correspondientes a tres distintas placas Petri).

11
 2.2 Evaluaciones

Se llevó a cabo la caracterización morfológica mediante observaciones y mediciones

realizadas en un microscopio óptico (Olympus CX31), el cual poseía un lente ocular con
micrómetro para medir las variables cuantitativas:

2.2.1 Base del peritecio, largo del cuello, diámetro del peritecio con un lente 10x y el
largo del ostiolo con un lente de 40x.

2.2.2 Ancho de las ascosporas y largo de las clamidiósporas con un lente de 40x.

2.2.3 Distribución de los peritecios en el medio de cultivo (placa PDA) en tres grupos:
grupos centrales, distribuidos en todo el medio y en anillos concéntricos (Van Wyk et
al. 2010).

2.2.4 Coloración de los aislamientos mediante la utilización de la tabla Munsell (Soil-

Color Charts, 2010) utilizada para la caracterización del color en suelos.

Se realizó una descripción de las estructuras reproductivas. Para las variables cuantitativas
se utilizó los límites de confianza y el comportamiento poblacional se evaluó mediante el
desarrollo de frecuencias poblacionales.

3. Evaluación de la agresividad

Para la evaluación de la agresividad se utilizaron tallos ortotrópicos de café de la variedad

catuaí establecido en una parcela de la finca experimental del CICAFE, ubicada en San
Pedro de Barva, con 10 años de edad y con un ciclo de poda de 4 iniciado en el 2016.

Se tomaron los tallos con un diámetro de 2 cm y estos se cortaron en segmentos de 10 cm

de largo; a cada segmento de tallo se realizó un raspado de 1 cm de la corteza de forma
longitudinal hasta llegar a los haces vasculares con la ayuda de un cuchillo de cocina
desinfectado con alcohol del 70 % para evitar contaminación. Se verificó que los troncos

12
utilizados se encontraban sanos y se trabajó con el mínimo contacto en la preparación de
los segmentos.

Se colocaron 12 segmentos de troncos en grupos de tres en cámaras húmedas, las cuales

consisten en cajas plásticas de 21 cm de ancho por 29 cm de largo y 7 cm de alto; las
mismas contenían 200 ml de agua destilada en el fondo y un soporte de cedazo donde se
colocaron las secciones de troncos.

Para la preparación del inóculo, se tomaron ascósporas y clamidósporas de una placa Petri
de cada uno de los aislamientos y se preparó una suspensión de esporas en agua destilada a
una concentración de 1x106 esporas/ml. Para determinar la concetración, se tomaron 10 µl
de cada tubo conteniendo la suspensión y se depositaron en una cámara de Neubauer por
medio de una micropipeta. Con un microscopio óptico (Olympos CX31), aumento 40x, se
contaron las células del retículo central (cuatro esquinas y el centro). Se realizó lo mismo
para cada aislamiento, luego se determinó el número de esporas utilizando la fórmula:

C = N * Fc * Fd

Donde, C= células/ml

N= Número de células del retículo central

Fc= Factor de la cámara

Fd= Factor de dilución.

Cada segmento de tronco se inoculó con 10 µl de la suspensión de esporas a una

concentración de 1x106 esporas/ml, en el centro de la lesión longitudinal realizada
previamente. Las cámaras húmedas cerradas se mantuvieron en un cuarto con temperatura
controlada (23 ± 1 ºC) y un fotoperiodo de 12 horas durante 15 días.

Se realizaron evaluaciones tres veces por semana durante 15 días para cada uno de los
aislamientos, la cual consistía en la medición del crecimiento de la lesión en forma
longitudinal (largo del tronco). Tres cajas plásticas (cámara húmeda) con 4 secciones de

13
tronco cada una; esto para cada uno de los aislamientos (para un total de 3 repeticiones con
4 secciones de tronco cada una) con un diseño irrestricto al azar.

Se aplicó el índice de agresividad (IA) (Anexo. 2) utilizado por Pliakhnevich e Ivaniuk

(2008) y Waldemar (2012) para medir agresividad y patogenicidad en Phytophthora
infestans y Mycena citricolor respectivamente; esto mediante la fórmula:

“IA: (FI*LA*SC) /(IP*LP)” donde,

1. FI es frecuencia de infección (incidencia).

2. LA es el área de la lesión 15 días después de la inoculación (cm).
3. SC es la esporulación (esporas/lesión).
4. IP es el período de incubación (tiempo en días durante el cual se lleva a cabo el
proceso de infección que finaliza con la aparición de los síntomas visibles).
5. LP corresponde al período de latencia (tiempo en días de crecimiento del hongo
hasta la formación de estructuras reproductivas sobre la sección de tronco).

Además, se realizó una medición del crecimiento de la lesión para cada uno de los
aislamientos, 6 veces en los 15 días de evaluación para la obtención de la tasa de
crecimiento.

Los datos obtenidos para el caso de Índice de Agresividad se evaluaron mediante el

desarrollo de un análisis poblacional (histograma) (Pliakhnevich e Ivaniuk 2008; Waldemar
2012).

Se analizaron los datos de crecimiento para cada uno de los aislamientos mediante la
utilización de límites de confianza.

Se desarrolló, además, un análisis de conglomerados (cluster) en cantones mediante el

programa estadístico R- Project, considerando variables morfológicas y de agresividad para
los aislamientos de Ceratocystis spp. de Costa Rica y variables climáticas lluvia-
temperatura-humedad tomados por las Estaciones Climáticas del Instituto de Café de Costa
Rica durante los periodos correspondientes al I y II semestre años 2014-2015.

14
4. Identificación molecular

4.1 Preparación de los aislamientos

Se seleccionaron los aislamientos LS4, T43, LS67 y PZ67 para realizar las pruebas
genéticas. Cada aislamiento se encontraba puro en PDA a 21 ± 1 ºC y 75-85 % de humedad
relativa (HR) en condiciones de oscuridad.

Una vez establecido los aislamientos en PDA se realizó el cultivo del hongo en medio
líquido compuesto por 3,12 g/l de extracto de levadura (Yeast Extract Hy.,Yest ®412,
Sigma) y 14,8 g/l de sacarosa (azúcar de mesa “Doña María”) en agua destilada. Se preparó
una solución de 50 ml en erlenmeyers de 100 ml para cada muestra y se autoclavó durante
30 minutos y se dejó enfriar. En la cámara de flujo laminar se tomó una asada de micelio o
ascosponrangios de cada aislamiento establecido en PDA, mediante la utilización de un asa
micológica estéril y se colocó en un Erlenmeyer con el medio líquido de extracto de
levadura. Se selló cada frasco con papel aluminio y papel parafilm y se colocó en agitación
a 1500 r.p.m en un agitador orbital durante 10 días.

Trascurridos los 10 días, se llevaron los erlenmeyers a la cámara de flujo laminar, y

utilizando puntas de micropipetas de 1000 µl, se depositó una muestra del líquido en tubos
para microcentrífuga (eppendorf) estériles, uno para cada aislamiento. Luego, se tomaron
10 µl de cada tubo y se depositaron en una cámara de Neubauer utilizando una micropipeta,
la cual se colocó en un microscopio óptico (Olympos CX31) para verificar la pureza del
patógeno y descartar la posibilidad de contaminación. El micelio obtenido para cada
aislamiento se almacenó en tubos estériles de vidrio en un sistema de enfriamiento a -30
°C.

4.2 Extracción de ADN

Se extrajo el micelio contenido en los tubos de vidrio almacenados a -30 °C y se colocó en

tubos de microcentrífuga utilizando una espátula estéril, permitiendo la toma de una mayor
cantidad de estructuras del hongo (De Beer et al. 2014). A la masa de micelio se le añadió
800 µl del buffer de extracción de ADN (BEB: 250 Mm de Tris HCl [pH 8], 250 mM de
15
NaCl, 25 mM de EDTA [pH 8] y 0.5 % de SDS). Seguidamente se incubaron las muestras
en baño maría a 37 ºC durante 30 minutos. Transcurrido el tiempo anterior, se les agregó
fenol: cloroformo (5:3) y se centrifugó a 10 000 rpm durante 15 minutos hasta obtener una
interfase clara. Esta se extrajo y se le adicionó acetato de sodio 3 M (0.1 volúmenes) [pH
5,5] y se centrifugó 2 min a 10 000 rpm; el precipitado se incubó a 4º C durante toda una
noche. La mezcla se centrifugó durante 30 minutos a 10 000 rpm. Se descartó el
sobrenadante y se realizaron dos lavados con etanol 70 %. Se descartó el etanol y se colocó
el pellet a secar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Transcurrido dicho tiempo, se
suspendió el ácido nucleico en 50 µl de agua estéril libre de nucleasas.

4.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Se emplearon las regiones de genes utilizadas para la identificación de nuevas especies (C.
papillata y C. colombiana) de patógenos de café descritas por Van Wyk et al. (2012)
(Cuadro 1)

Cuadro 1. Imprimadores para PCR de las regiones utilizadas en al análisis multilocus

Región Primer Secuencia Referencia

ITS 1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS White at al. 1990
ITS 4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
B-T1a TTCCCCCGTCTCCACTTCTTCATG
BT Glass y Donaldson 1995
B-T1b GACGAGATCGTTCATGTTGAACTC
EF-1R TCGGGTGGTATCGACAAGCGT
EF Jacobs et al. 2004
EF-2R AGCATGTTGTCGCCGTTGAAG

Para realizar la PCR se utilizó 3.5 ng de ADN, 2.5 µl del Buffer 10x (Promega), 2.18 µl
de MgCl2 (Promega), 0.5 µl de cada dNTP, 1 µl para cada uno de los primers y 0.4 µl de la
Taq (Tap ADN Polimerasa de Thermo Scientific). El volumen final se ajustó a 25 µl con
agua estéril por reacción.
Para las reacciones del PCR se utilizó un termociclador (Esco SwiftºMaxpro) mediante la
utilización de los siguientes ciclos térmicos según Van Wyk et al. (2006): 2 minutos a 96
16
ºC, seguido de 10 ciclos de 20 segundos a 94 ºC, 40 segundos a 55 ºC y 45 segundos a 72
ºC. Los últimos tres intervalos de temperatura se repitieron 30 ciclos con un incremento de
5 segundos para la etapa de alineamiento y la etapa final de elongación de 10 minutos a 72
ºC

Los resultados de la PCR se purificaron con el Kit Wizard ® SV Gel and PCR Clean-up
System (Promega) y se mandaron a secuenciar mediante Biocientifica Internacional S. de
R.L a la empresa internacional Macrogen.

Para el análisis se utilizó en programa Bio Edit Sequence Alignment Editor para desarrollar
las secuencias en formato fasta; para el alineamiento de las secuencias se utilizó en
programa ClustalX 2.1.

Se desarrollaron las matrices con el programa Mesquite versión 3.04. El algoritmo de

Markov Chain Monte Carlo (MCMC) se utilizó para crear el árbol filogenético basado en
probabilidades Bayesianas usando el programa del software MrBayes versión 3.2 y se
visualizó el árbol filogenético con el programa Fig [Link]ón 1.4.3. El árbol fue obtenido
con la adición de 1000 réplicas. Fueron calculados los intervalos de confianza utilizando
1000 réplicas de bootstrap.

Se utilizaron las regiones β- tubulina, ITS y el Factor de Elongación 1-α de 5 especies de C.

papillata y de 4 especies de C. colombiana para comparar con especies que afectan las
plantas de café a nivel de América. También se incluyó en el análisis una especie de C.
virescens, C. cacaofunesta, C. manginecans, C. platani, y C. fimbriata obtenidas del Gen
Bank. Dichas accesiones pueden verificarse en el anexo 4.

17
 RESULTADOS

1. Muestreo de las plantas enfermas a nivel de campo

Se muestrearon un total de 74 puntos con la finalidad de obtener un promedio de 5 muestras

por región, no obstante, en algunas regiones como por ejemplo Coto Brus, se dificultó la
colecta de muestras positivas para Ceratocystis spp., dando como resultado la obtención de
otros patógenos entre los que destacaron Fusarium spp. y Rosellinea spp. Para cada uno de
los puntos muestreados se tomaron datos de altura, coordenadas geográficas, región
cafetalera de procedencia, cantón y distrito/caserío (Cuadro 2).

Cuadro 2. Total de muestras positivas y negativas para Ceratocystis spp. analizadas en las
regiones cafetaleras del Valle Occidental, Los Santos, Turrialba, Pérez Zeledón, Coto
Brus y Valle Central de Costa Rica para la búsqueda de aislamientos de Ceratocystis
spp., setiembre 2014-mayo 2016

Coordenadas
Código1 Altura Zona Cafetalera Provincia Cantón Distrito/ Caserío Positiva Negativa
x y
VC1 1327 10.059936 084.152627 Valle Central Heredia Santa Bárbara Birrí x
VC2 1400 09°.54' 38 93°. 58' 15 Valle Central Cartago Tres Ríos Tres Ríos x
PZ3 585 503577,33 1070171,03 Pérez Zeledón San José Pérez Zeledón San Pedro x
LS4 1779 547147,2 1025279,137 Los Santos San José Dota Santa María x
VC5 - 493637 1088311 Valle Central San José Desamparados San Miguel x
LS6 1670 491190 1064481 Los Santos San José Tarrazú San Carlos x
LS7 - - - Los Santos San José Tarrazú San Lorenzo x
LS8 - 495843 1059458 Los Santos San José Tarrazú San Lorenzo x
LS9 1641 502830 1065896 Los Santos San José Dota Santa María x
LS10 1451 492479 1066945 Los Santos San José Tarrazú San Lorenzo x
LS11 1514 493136 1066958 Los Santos San José Tarrazú San Lorenzo x
LS12 1875 486101 1070385 Los Santos San José León Cortes Llano Bonito x
VC13 1206 493018 1107209 Valle Central Heredia Santo Domingo - x
VC14 1300 475336 1114997 Valle Central Alajuela Sabanilla Caserío Lajas x
VC15 1249 47293 1116119 Valle Central Alajuela Poás San Juan x
VC16 1535 479745 1117646 Valle Central Alajuela Alajuela Carrizal x
VC17 1352 476057 1116243 Valle Central Alajuela Alajuela Los Ángeles x
VC18 1323 477704 1114856 Valle Central Alajuela Alajuela San Isidro x
VC19 1479 486949 1111824 Valle Central Heredia Barva San José de la Montaña x
VC20 1410 485113 1112870 Valle Central Heredia Santa Bárbara Jesús x
VC21 1552 482809 1115060 Valle Central Heredia Santa Bárbara Santa Bárbara x
VC22 1502 481856 1115619 Valle Central Alajuela Alajuela Carrizal x
VC23 1428 503253 1095616 Valle Central Cartago Tres Ríos La Unión x
PZ24 - - - Pérez Zeledón San José Pérez Zeledón Cajón x

18
PZ25 780 540079 1031661 Pérez Zeledón San José Pérez Zeledón Cajón x
PZ26 558 551574 1021401 Pérez Zeledón San José Pérez Zeledón San Pedro x
PZ27 625 553256 1023192 Pérez Zeledón San José Pérez Zeledón San Pedro x
PZ28 620 550089 1025850 Pérez Zeledón San José Pérez Zeledón San Pedro x
VO29 1098 440380 1119081 Valle Occidental Alajuela San Ramón Piedades Sur x
VO30 - 462552 1122473 Valle Occidental Alajuela Naranjo Robles I x
VO31 - 468594 1116072 Valle Occidental Alajuela Grecia San Isidro x
VO32 1340 448328 1107355 Valle Occidental Alajuela San Ramón Berlín x
VO33 1466 458667 1120876 Valle Occidental Alajuela Naranjo Sirrí x
VO34 1474 458600 1120920 Valle Occidental Alajuela Naranjo Sirrí x
VO35 1003 460314 1116235 Valle Occidental Alajuela Naranjo San Jerónimo x
VO36 1076 451239 1114015 Valle Occidental Alajuela Palmares Buenos Aires x
VO37 - 451851 1115458 Valle Occidental Alajuela San Ramón San Isidro x
VO38 996 460787 1117215 Valle Occidental Alajuela Naranjo San Jerónimo x
T39 951 982132 8356676 Turrialba Cartago Turrialba Dulce Nombre x
T40 1045 993698 8372701 Turrialba Cartago Turrialba Santa Rosa x
T41 1056 993981 8372686 Turrialba Cartago Turrialba Santa Rosa x
T42 1268 9.95418 83.11809 Turrialba Cartago Turrialba Santa Cruz x
T43 1188 1006983 8426139 Turrialba Cartago Turrialba Santa Cruz x
PZ44 651 9.33960 83.65536 Pérez Zeledón San José Pérez Zeledón General Viejo x
PZ45 612 9.90043 83.66747 Pérez Zeledón San José Pérez Zeledón General Viejo x
PZ46 673 93536 8365243 Pérez Zeledón San José Pérez Zeledón General Viejo x
PZ47 681 9.33021 83.63541 Pérez Zeledón San José Pérez Zeledón General Viejo x
PZ48 692 9.33006 83.63472 Pérez Zeledón San José Pérez Zeledón General Viejo x
PZ49 617 9.27522 83.54384 Pérez Zeledón San José Pérez Zeledón San Pedro x
PZ50 615 9.27479 83.54417 Pérez Zeledón San José Pérez Zeledón San Pedro x
PZ51 614 927436 8354437 Pérez Zeledón San José Pérez Zeledón San Pedro x
VO52 1131 450965 1115789 Valle Occidental Alajuela San Ramón Berlín x
VO53 1385 449161 1107050 Valle Occidental Alajuela San Ramón Berlín x
VO54 1093 451174 1116088 Valle Occidental Alajuela San Ramón San Isidro x
VO55 1210 449723 1106309 Valle Occidental Alajuela San Ramón Pata de Gallo x
VO56 1219 489483 1107053 Valle Occidental Alajuela San Ramón Pata de Gallo x
CB57 998 8.83531 082.96940 Coto Brus Puntarenas Coto Brus San Vito x
CB58 931 8.84471 82.95083 Coto Brus Puntarenas Coto Brus San Vito x
CB59 1021 8.83391 82.96162 Coto Brus Puntarenas Coto Brus San Vito x
CB60 1014 9.98645 84.4414 Coto Brus Puntarenas Coto Brus Sabalito x
CB61 999 8.83480 82.96879 Coto Brus Puntarenas Coto Brus San Vito x
CB62 1071 8.86557 82.88146 Coto Brus Puntarenas Coto Brus Sabalito x
LS63 1784 09.66223 083.95588 Los Santos San José Dota Santa María x
LS64 1678 09.64400 084.04839 Los Santos San José Tarrazú San Lorenzo x
LS65 1773 09.66238 083.95546 Los Santos San José Dota Santa María x
LS66 1412 9.65312 84.06406 Los Santos San José Tarrazú San Lorenzo x
PZ67 630 0547229 1025727 Pérez Zeledón San José Pérez Zeledón Cajón x
VO68 1327 10.113466 084.270358 Valle Occidental Alajuela Grecia San Isidro x
VC69 - 476577 1118458 Valle Central Alajuela Poás Sabana x
VO70 - - - Valle Occidental Alajuela Palmares Zaragoza x
VC71 1132 09°.52' 08 82°. 49' 53 Coto Brus Puntarenas Coto Brus Sabalito x
CB72 1132 08°.52'08.0" 82°.49'53.9" Coto Brus Puntarenas Coto Brus Sabalito x
CB73 988 08°.48'32.5" 82°.54'53.0" Coto Brus Puntarenas Coto Brus Buenos Aires x
CB74 958 08°.49'15.1" 82°.53'35.8" Coto Brus Puntarenas Coto Brus Buenos Aires x
1
CB: Coto Brus; PZ: Pérez Zeledón; LS: Los Santos; T: Turrialba; VC: Valle Central y VO: Valle Occidental

19
En cada región se pretendía recolectar un mínimo de 5 muestras de Ceratocystis spp., no
obstante, conforme se realizaba el muestreo, la presencia de síntomas en plantas eran más
evidentes en unas regiones que en otras, por lo que se muestreó más puntos para obtener
este número. De esta forma, en el Valle Occidental se obtuvo un máximo de 17 puntos y
Turrrialba, con el mínimo número de muestras de 5 (esta área cafetalera presentaba menor
presencia de plantas con los síntomas de la enfermedad). De los 74 puntos en total,
positivas para Ceratocystis spp. fueron únicamente 30, distribuidas de la siguiente forma:

Cuadro 3. Número de aislamientos obtenidos para Ceratocystis spp. según las distintas
regiones cafetaleras del país, 2015-2016

Región N° Aislamientos

Coto Brus 2
Pérez Zeledón 5
Los Santos 6
Turrialba 4
Valle Central 9
Valle Occidental 4

Del total de muestras positivas para Ceratocystis spp. en las distintas regiones cafetaleras se
obtiene que el mayor porcentaje se encuentra en el Valle Central con un 30 % de la
población total seguido por Los Santos con un 20 %, Pérez Zeledón con un 17 %,
Turrialba-Valle Occidental con un 13 % las dos y la menor proporción se obtuvo en la
región de Coto Brus con un 7 % (Fig. 1).

20
 Valle Coto Brus
Occidental 7%
13% Pérez Zeledón
17%

Valle Central
30%
Los Santos
20%
Turrialba
13%

Figura 1. Porcentaje de aislamientos obtenidos para Ceratocystis spp. según las distintas
regiones cafetaleras del país, 2015-2016.

En la Figura 2, se observa los límites geográficos de cada una de las regiones cafetaleras
establecidas para Costa Rica. La coloración café representa fincas cafetaleras en cada una
de las zonas. La mayor área cafetalera corresponde a la región de Los Santos, seguido por
El Valle Occidental y el Valle Central. Los puntos en coloración azul muestran los puntos
de muestreo positivos para la presencia de Ceratocystis spp., el punto marcado en rojo
representa a la muestra LS63 siendo el aislamiento más agresivo y el punto marcado en
verde correspondiente a LS4 es el que mostró una menor agresividad.

21
Figura 2. Puntos de muestreo de Ceratocystis spp. en las distintas regiones cafetaleras de
Costa Rica: Valle Occidental, Los Santos, Turrialba, Pérez Zeledón, Coto Brus y
Valle Central, 2015-2016.

22
 2. Caracterización morfológica

Se mostraron diferencias en algunas de las variables morfológicas evaluadas para los

aislamientos de Ceratocystis sp. en las distintas regiones cafetaleras del país.

Las ascosporas presentaban forma de sombrero y el intervalo de medición se encontró entre

5,43-6,97 µm, donde los aislamientos VC23, VO34, VC21, VO56 y LS4 mostraron
diferencias obteniendo los valores más bajos en relación a los aislamientos T39, VO68,
T43, VC16, PZ67, CB57 y T40 con las mayores mediciones (Fig. 3).

8
Tamaño ascosporas (µm)

7
6
5
4
3 LS
2 LI
1
0
T41

T39

T43

T40
LS65
LS63

PZ46

LS10

LS12
LS64

PZ28
PZ51

PZ67
PZ3
LS4
VC23

VC21

VC19

VC14

VC22

VC18

VC15
CB72

VC16

CB57
VO34

VO56

VC1

VO52

VO68
Aislamiento

Figura 3. Tamaño de las ascosporas (µm) en una muestra de la población de C. fimbriata

proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica.; LS: Límites superior, LI:
Límite inferior.

La distribución del tamaño de las ascosporas en la población estudiada está compuesta por
tres grupos, un 3,3 % de la población se presenta en el extremo de menor valor, el 87 % de
los individuos mostraron valores intermedios entre los 5,7 y 6,8 µm y únicamente el 10 %
se encuentra en el extremo máximo con una distribución normal (Fig. 4).

23
 Normal
Mean 6,244
7
StDev 0,3905
N 30
6

Frecuencia
4

0
5,6 6,0 6,4 6,8
Tamaño áscosporas (µm)

Figura 4. Frecuencia poblacional para el tamaño (µm) de las ascosporas en una muestra de
la población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa
Rica.

Las conidias tenían formas cilíndricas y en algunos casos en forma de barril, el tamaño de
las conidias mantuvo valores entre 20.73-29.20 µm, donde el aislamiento PZ46 obtuvo el
menor tamaño y el VC15 el mayor (Fig. 5).

35
Tamaño Conidia (µm)

30
25
20
15 LS
10 LI
5
0
PZ46

T39

PZ28
T40

T41

T43
CB72
PZ51

LS12
PZ67

LS63

LS64

LS65

LS10
CB57

PZ3

VC21

LS4

VC16
VO56

VC19

VC23

VC14
VC18
VO68

VO52

VC22
VO34

VC15
VC1

Aislamiento

Figura 5. Tamaño de las conidias (µm) en una muestra de la población de C. fimbriata

proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica; LS: Límites superior, LI:
Límite inferior.

24
En la Figura 6 se observa el tamaño de las conidias, en donde el 10 % de los individuos se
localizan en el extremo de menor valor, el 87 % de los individuos en valores intermedios
entre los 25 y 27 µm y el 6,7 % en el extremo máximo de la campana, mostrando el
comportamiento de una distribución normal.

Normal
9 Mean 25,20
StDev 2,078
8 N 30

6
Frecuencia

0
22 24 26 28 30
Tamaño conidia (µm)

Figura 6. Frecuencia poblacional para el tamaño de las conidias (µm) en una muestra de la
población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica.

En el caso de las clamidiósporas, estructura globosa con paredes gruesas, el intervalo de

tamaño de la población se mantuvo entre 13.73-16.53 (µm), donde el aislamiento LS64
presentó el menor valor y el aislamiento T43 el mayor valor (Fig. 7).

25
 18

Tamaño Clamidióspora (µm)

16
14
12
10
8
6 LS
4 LI
2
0

T39

T41

T40
T43
LS64

PZ46
LS63

VC16

PZ51

LS65
PZ28
LS12
LS10
PZ3

LS4

VC14

PZ67
VC18
VC21

VC23
VO52

VO34

VC15
VC19

CB57

CB72
VO68
VO56

VC22
VC1
Aislamiento

Figura 7. Tamaño de las clamidiósporas (µm) en una muestra de la población de C.

fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica; LS: Límites
superior, LI: Límite inferior.

En la Figura 8 se observó cómo, para el tamaño de las clamidiósporas, el 7 % de la

población se presentó en el extremo de menor valor, el 90 % valores intermedios entre los
14 y 15,8 µm y un 3,3 % en el extremo máximo de la campana, mostrando resultados de
una distribución normal.
Normal
8 Mean 14,62
StDev 0,6248
7 N 30

5
Frecuencia

0
13,6 14,4 15,2 16,0
Tamaño clamidiósporas (µm)

Figura 8. Frecuencia poblacional para el tamaño (µm) de las clamidiósporas en una

muestra de la población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras
de Costa Rica.

26
La base del peritecio de los diferentes aislamientos mostró una mayor variabilidad. La
población se mantuvo en un intervalo entre los 34,23-71,67 (µm), mostrando diferencias
principalmente entre los aislamientos LS10 y VO56 con el LS64, con menores y mayor
valor respectivamente (Fig. 9).

80
Base del peritecio (µm)

70
60
50
40
LS
30
20 LI
10
0

T40

T39

T41

T43
LS10

LS12

PZ28
PZ46

PZ51

LS63
PZ67

LS65
LS64
PZ3

VC19

LS4
VO56

VC18

VC21
VO52
VC14

CB57
VO68
VC23

CB72
VC15

VO34
VC22
VC16
VC1

Aislamiento

Figura 9. Tamaño de la base de peritecio (µm) en una muestra de la población de C.

fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica; LS: Límites
superior, LI: Límite inferior.

En la Figura 10 se observa cómo, para el tamaño de la base del peritecio, el 13,3 % de los
individuos mostraron valores menores a 35 µm, el 83,3 % se encuentró en la media
poblacional y únicamente el 3,3 % presentó un valor de 70 µm ubicado en el extremo
máximo de la curva.

27
 Normal
8 Mean 47,00
StDev 8,438
7 N 30

Frecuencia
4

0
30 40 50 60 70
Tamaño base peritecio (µm)

Figura 10. Frecuencia poblacional para el tamaño (µm) de la base del peritecio en una
muestra de la población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras
de Costa Rica.

En cuanto al tamaño del cuello del peritecio, los valores promedio fueron entre 307,77-
717,77 µm, donde el aislamiento VO56 representa el menor valor y el T41 con el mayor
valor, mostrando diferencias entre ellos (Fig. 11).

800
Cuello del peritecio (µm)

700
600
500
400
300 LS

200 LI
100
0
T40

T39

T43

T41
LS12

LS63
PZ51

PZ67
PZ46

LS64
LS10

LS65

PZ28
PZ3

LS4
VO56

VC15

VC14
VC21

CB57

VC19
VC16

VC18

CB72

VO68
VO34

VO52

VC23
VC22
VC1

Aislamiento

Figura 11. Tamaño del cuello de peritecios (µm) en una muestra de la población de C.
fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica; LS: Límites
superior, LI: Límite inferior.

28
En la Figura 12 se observó cómo, para el tamaño del cuello del peritecio, el 3,3 % de los
individuos mostraron valores de 300 µm ubicado en el extremo mínimo, el 80 % de estos se
ubicaron entre 400-650 µm y el 16,7 % mostró valores máximos de 700 µm.
Normal
Mean 554,8
7
StDev 98,78
N 30
6

5
Frecuencia

0
300 400 500 600 700
Tamaño cuello peritecios (µm)

Figura 12. Frecuencia poblacional para el tamaño del cuello del peritecio en una muestra
de la población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa
Rica.

El peritecio presenta una base globosa, el intervalo de medición del diámetro se encuentra
entre 147,23-294,77 µm, donde el aislamiento VO52 obtiene el menor valor seguido por el
LS4 con la medición más alto (Fig. 13).

29
 350
Diámetro del peritecio (µm) 300
250
200
150
LS
100
LI
50
0

T40

T39

T43

T41
CB57

PZ46
PZ51

LS12

LS10
PZ67

PZ28

LS64

LS65

LS63

PZ3
LS4
CB72

VC23

VC16
VC18

VC22

VC14

VC21

VC19
VC15
VO52

VO56

VO68

VO34

VC1
Aislamiento

Figura 13. Tamaño del diámetro del peritecio (µm) en una muestra de la población de C.
fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica; LS: Límites
superior, LI: Límite inferior.

Para la variable diámetro de peritecio, el 3,3 % de los individuos mostró valores de 140 µm,
el 93,3 % presentó valores entre los 160-280 µm y un 3,3 % se presentó el máximo valor
con un 290 µm (Fig. 14)
Normal
9 Mean 211,7
StDev 34,91
8 N 30

6
Frecuencia

0
160 200 240 280
Tamaño diámetro de peritecios (µm)

Figura 14. Frecuencia poblacional para el tamaño del diámetro de peritecio en una muestra
de la población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa
Rica.

30
Para la variable ostiolo (hifas ostiolares divergentes), la población de Ceratocystis sp. varía
entre los 24,17- 63,30 µm, mostrándose diferencias entre el aislamiento CB72 con el menor
valor en relación al individuo LS4 con la mayor medición (Fig. 15).

70
60
50
Ostiolo (µm)

40
30 LS
20 LI
10
0
T43

T39

T40

T41

VC15
LS12
PZ67

PZ51
PZ46

PZ28

LS64
LS63
LS10

LS65
CB72
VC21

VC16

VC18

VC19

VC23

VC22

CB57

VC14
LS4
VO52
VO56

VO34
VC3

VO68

VC1
Aislamiento

Figura 15. Tamaño del ostiolo (µm) en una muestra de la población de C. fimbriata
proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica; LS: Límites superior, LI:
Límite inferior.

Para la variable tamaño del ostiolo es la que presenta mayor diferencia entre los individuos;
un 10 % presenta valores de 30 µm, un 33,3 % presenta valores de 35 µm, la mayor
cantidad de individuo con un 53,3 % valores entre 40 y 55 µm y únicamente un 3,3%
presenta el valor máximo de 70 µm (Fig. 16).

31
 Normal
Mean 40,56
10
StDev 8,634
N 30

Frecuencia
6

0
20 30 40 50 60
Tamaño ostiolo (µm)

Figura 16. Frecuencia poblacional para el tamaño (µm) del ostiolo en una muestra de la
población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica.

La distribución de los peritecios en el medio de cultivo (PDA) de los 30 aislamientos de

Ceratocystis spp. fue: un 40 %, correspondiente a 12 individuos mostraron formación de
los peritecios en anillos concéntricos, el 57 % de los individuos presentaron una
distribución en todo el medio de cultivo y un 3 % (1 individuo únicamente) permaneció en
un grupo central.

Como lo muestra el cuadro 4, 18 de los aislamientos presentaron un tono olivo, 3 de ellos

un olivo pálido, 2 con tonalidad marrón grisáceo y 1 aislamiento para los colores: amarillo,
pardo grisáceo oscuro, gris olivo, marrón amarillento, marrón, gris olivo claro y gris olivo
oscuro.

32
Cuadro 4. Agrupación de los aislamientos de Ceratocystis spp. obtenidos en las distintas
regiones según la característica de color mediante la utilización de la tabla Munsell

Color N° de aislamientos
Amarillo 1
Olivo 18
Pardo grisáceo oscuro 1
Gris olivo 1
Marrón grisáceo 2
Marrón amarillento 1
Marrón 1
Gris olivo claro 1
Olivo pálido 3
Gris olivo oscuro 1

3. Evaluación de la patogenicidad

En la evaluación de la patogenicidad, se realizó la medición de tres variables: tamaño final

de la lesión ocasionada por el patógeno en los troncos de café, tasa de crecimiento diaria
para cada uno de los individuos durante los 15 días de crecimiento en los troncos de café y
el Índice de Agresividad donde se incluyen las variables anteriores y valores intrínsecos de
cada individuo en su establecimiento.

El tamaño final de la lesión a los 15 días posteriores a la inoculación varía entre los
aislamientos, donde se observan tres grupos: el mayor presenta valores entre 9,9-8 cm; los
valores de la media se encuentran entre 8,13-7,9 cm y los individuos con menor tamaño se
ubican entre los 7,1-4,7 cm. El individuo VC22, correspondiente al Valle Central, presenta
el mayor tamaño con un promedio de 9,9 cm con diferencias con el aislamiento LS4 con un
menor valor de 4,7 cm. No se mostró una correlación entre el tamaño de la lesión final
entre cada uno de los individuos de una misma región (Fig. 17).

33
 10

Crecimetno de la lesión (cm)

9
8
7
6
5
4 LS
3
2 LI
1
0
T40

CB72
VC3

T41

CB57

T43

VC1
T39

LS10
VO34

VO68
PZ51

VO56

PZ46

PZ28

VO52
PZ67

LS4
LS12

LS63

LS65

LS64
VC22

VC19

VC16

VC21

VC14
VC18

VC15
VC23
Aislamiento

Figura 17. Tamaño de la lesión (cm) 15 días después de la inoculación en una muestra de
la población de C. fimbriata proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa
Rica; LS: Límites superior, LI: Límite inferior.

En la figura 18 se muestra como el 20 % presentó valores menores a 6,4 cm, el 70 % de los

individuos presenta valores de crecimiento de la lesión entre los 7,2 - 8,8, y únicamente el
10 % presentó los mayores valores de crecimiento final.
Normal
Mean 7,542
9
StDev 1,270
N 30
8

6
Frecuencia

0
4,8 5,6 6,4 7,2 8,0 8,8 9,6 10,4
Tamaño final de lesión (cm)

Figura 18. Frecuencia poblacional para el tamaño (cm) de la lesión final a los 15 días
después de la inoculación en una muestra de la población de C. fimbriata
proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica.

34
En la figura 19, se observa la tasa de crecimiento diaria para los aislamientos, donde se
obtiene que el aislamiento VC22 presenta la mayor tasa de crecimiento diaria de 1,9 cm en
relación al aislamiento LS4 con menor crecimiento (0,94 cm). El restante de los
aislamientos muestra una tasa de 1-1,8 cm.

2
Tasa de creciimiento diaria

1,6

1,2
(cm)

0,8

0,4

0
LS12

LS63

LS65

LS64

LS10
T40

PZ51

T41

PZ46

PZ28

PZ67

VC18
T43
T39

LS4
VC22

VC19

CB72

CB57

VC21

VC16
VC14

VC15
VC23
VC3

VC1
VO34
VO68

VO56

VO52
Aislamiento

Figura 19. Tasa de crecimiento diaria (cm) en una muestra de la población de C. fimbriata
proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica.

Mediante la implementación del Índice de Agresividad se obtuvo que la frecuencia

poblacional del patógeno a nivel de país muestra un comportamiento de una distribución
normal donde encontramos individuos en cada uno de los extremos de la campana. De esta
forma se obtiene que únicamente el 7 % de los individuos presentan valores bajos de índice
menores la 30 000, el 50 % de los individuos presentan un índice moderadamente bajo
entre 40 000-100 000, el 33 % muestra valores intermedios con tendencia a ser
moderadamente altos entre 100 000 - 140 000 y el 10 % presentan los valores más altos,
por encima de los 160 000. Del total de los aislamientos obtenidos en las distintas regiones,
los individuos VC22, CB72, T40 y LS63 obtuvieron los mayores valores de índice con
134037, 164030, 165956 y 166362 respectivamente y los aislamientos LS10, VC15 y VC3
con los menores valores de 12218, 27290 y 31062 respectivamente. (Fig. 20).

35
 Mean 83582
6
StDev 42597
N 30

Frecuencia poblacional
4

0
0 40000 80000 120000 160000
Índice de agresividad

Figura 20. Frecuencia poblacional en una muestra de la población de C. fimbriata

proveniente de las seis regiones cafetaleras de Costa Rica según Índice de
Agresividad.

Considerando las caracteristicas morfológicas, los resultados en los datos del Índice de
Agresividad y las variables climáticas incluyendo lluvia, temperatura y humedad relativa,
durante el periódo de muestreo correspondiente a I y II semestre del 2014-2015 se realizó
un agrupamiento (cluster) por cantones para relacionar dichas variables obtenidas en los
distintos lugares de muestero (Fig. 21). De esta forma, se agrupan los aislamientos en 5
clusters: León Cortes, Barva, Santa Bárbara y Alajuela; Grecia, Coto Brus, Turrialba y
Pérez Zeledón; Naranjo, Dota, Tarrazú, y Sabanilla (Alajuela); Poás; Tres Ríos y San
Ramón.

36
Figura 21. Agrupamiento de los aislamientos de Ceratocystis spp. en cantones según
variables morfológicas, patogénicas y climáticas (lluvia-temperatura-humedad)
correspondientes al I y II semestre año 2014-2015.

En la figura 21 se muestra que el cluster 1 se forma por una relación más directa entre
precipitación (mm) - humedad relativa (%) y en menor grado la variable de Índice de
Agresividad. En el cluster 2 las variables Índice de Agresividad precipitación y temperatura
son los que representan una mayor similitud. Para el cluster 3, se obtiene una relación
menos fuerte entre las tres variables; el cluster 4 presenta la misma situación que el cluster
3, con un cambio en la variable humedad relativa donde se muestra una mayor similitud. Y,
el cluster 5 presenta una mayor similitud por variables temperatura-Índice con valores
menores de cercanía.

37
Del análisis de las variables morfológicas y de Índice de Agresividad, se realizó la
identificación molecular de los aislamientos LS4, T43, LS63, PZ67.

El aislamiento LS4, correspondiente a Santa María de Dota, se localizó a una altura de

1779 m.s.n.m, y presentó los mayores valores para el diámetro del peritecio (297,8 µm) y
tamaño del ostiolo (63,3 µm), presentó un color olivo amarillo con una distribución de los
peritecios en todo el medio y un Índice de Agresividad de 55254 (dentro del 50 % del total
de la población) (Fig. 22).

El aislamiento LS63 correspondiente a Santa María de Dota, se localizó a una altura de

1784 m.s.n.m, y presentó uno de los mayores valores para la base del peritecio (56,4 µm) y
uno de los menores para el tamaño del cuello del peritecio (435 µm), presenta un color
olivo pálido con una distribución de los peritecios en forma de anillos concéntricos y el
mayor Índice de Agresividad con 166 362 (dentro del 10 % del total de la población) (Fig.
23).

El aislamiento T43 correspondiente a Santa Cruz de Turrialba, se localizó a una altura de

1188 m.s.n.m, y presentó uno de los mayores valores para la base del peritecio (59,1 µm) y
uno de los menores para el tamaño del ostiolo (33,6 µm), presentó un color amarillo con
una distribución de los peritecios en todo el medio y un Índice de Agresividad de 113326
(dentro del 33 % del total de la población) (Fig. 24).

El aislamiento PZ67 correspondiente a Cajón de Pérez Zeledón, se localizó a una altura de

630 m.s.n.m, y presentó uno de los mayores valores para la base del peritecio (56,9 µm) y
uno de los menores para el tamaño del cuello del peritecio (469,4 µm) y tamaño del ostiolo
(32,8 µm), presentó un color marrón con una distribución de los peritecios en todo el medio
de cultivo con un Índice de Agresividad de 80 066 (dentro del 50 % del total de la
población) (Fig. 25).

De esta forma, en el cuadro 5 se muestra un resumen de las variables morfológicas y de

agresividad por las cuales fueron selecciones dichos aislamientos para la identificación
molecular.

38
Cuadro 5. Aislamientos de Ceratocystis spp. de las regiones cafetaleras de Costa Rica y
sus variables morfológicas y patogénicas determinadas para la selección en las
pruebas de identificación molecular
Variable de selección
Altura Diámetro del Base del Cuello del Tamaño Distribución
Aislamiento Región Cantón/ Color Índice de
([Link].m) peritecio peritecio peritecio del ostiolo de peritecios
micelio agresividad
(µm) (µm) (µm) (µm) en PDA
55 254
Olivo
LS4 Los Santos Santa María 1779 297,8 - - 63,3 Todo el medio moderadamente
amarillo
bajo
Anillos
LS63 Los Santos Santa María 1784 - 56,4 435 - Olivo pálido 166362 alto
concéntricos
113326
T43 Turrialba Santa Cruz 1188 - 59,1 - 33,6 Amarillo Todo el medio moderadamente
alto
80066
Pérez
PZ67 Cajón 630 - 56,9 469,4 32,8 Marrón Todo el medo moderadamente
Zeledón
bajo

39
 A B

C D

E F

Figura 22. Características morfológicas del aislamiento LS4; crecimiento en medio

nutritivo (A); ascosporas, conidias y clamidiósporas cilíndricas (B); peritecio (C),
base del peritecio (D), hifas ostiolar divergentes con salida de ascosporas (E),
tamaño de lesión final promedio (H).

40
 A B

C D

E F

Figura 23. Características morfológicas del aislamiento LS63; crecimiento en medio

nutritivo (A); ascosporas, conidias y clamidiósporas cilíndricas (B); peritecio (C),
base del peritecio (D), hifas ostiolar divergentes con salida de ascosporas (E),
tamaño de lesión final promedio (H).

41
 A B

C D

F
E

Figura 24. Características morfológicas del aislamiento T43; crecimiento en medio

nutritivo (A); ascosporas, conidias y clamidiósporas cilíndricas (B); base del
peritecio (C), peritecio (D), hifas ostiolar divergentes (E), tamaño de lesión final
promedio (H).

42
 A B

C D

E F

Figura 25. Características morfológicas del aislamiento PZ67; crecimiento en medio

nutritivo (A); ascosporas, conidias y clamidiósporas cilíndricas (B); base del
peritecio (C), peritecio (D), hifas ostiolar divergentes con salida de ascosporas (E),
tamaño de lesión final promedio (H).

43
 4. Identificación molecular

Se obtuvo amplificación de ~ 500 pb para la región ITS y la β- tubulina y ~ 800 pb para el

Factor de Elongación 1-α. Para desarrollar el árbol filogenético se utilizaron secuencias de
aislamientos de C. fimbriata, C. papillata, C. colombiana, C. platani, C. manginecans, C.
cacaofunesta, C. tanganvicensis y C. virescens como especie más lejana (Anexo 4).

Se mostraron polimorfismos entre los aislamientos de Ceratocystis spp. obtenidos de

plantas enfermas de café en las distintas regiones cafetaleras de Costa Rica. Los
aislamientos LS63 y LS4 muestran valores de bootstrap entre ellos de 53 separándose de
los aislamientos T43 y PZ67 con un valor de 80. Los aislamientos T43 y PZ67 muestran
valores de bootstrap de 100 con la especie C. papillata, no obstante, los agrupa se agrupan
en ramas distintas.

44
 CMW5746 [Link]
CMW9561 [Link]

[Link]
100
CMW8857 [Link]
CMW8850 [Link]

100
T43

80 PZ67

LS63
53
LS4

56 CMW5761 [Link]
100 CMW5768 [Link]

96 CMW9565 [Link]
CMW14802 [Link]
95 CMW13851 [Link]
CMW15049 [Link]
100 66
CMW15051 [Link]
CMW15991 [Link]
CMW11164 [Link]

0.5

Figura 26. Árbol filogenético de consenso basado en los criterios de análisis Bayesiano que
ilustra la relación de los aislamientos de Ceratocystis spp. asociados a la “Llaga
macana” en café de Costa Rica y demás especies de Ceratocyistis spp encontrados
en café, cacao, cítricos en Colombia. El árbol se generó mediante la combinación de
secuencias provenientes de las regiones ITS, B-tubulina y el Factor de Elongación
1-α.

45
 DISCUSIÓN

1. Muestreo

En cada una de las regiones cafetaleras se realizó una verificación visual de fincas con
síntomas a nivel de planta de la presencia de patógeno Ceratocystis sp. Los síntomas a nivel
de planta fueron clorosis y marchitamiento generalizado, síntomas similares a los
provocados por el complejo de llagas de cafeto donde se incluyen a los patógenos
Rosellinia bunodes y R. pepo. (Bianchini, 1955; Castro-Caicedo, 1999) y demás patógenos
de suelo como Fusarium spp. (en mayor frecuencia) y Nectria sp. Lo anterior y la
confusión en la de visualización de lesiones ocasionadas por Ceratocystis spp. dificultó la
localización de muestras positivas. Debido a lo anterior, se analizaron un total de 74
muestras (entre 6-10 muestras por región cafetalera), de las cuales únicamente 30 fueron
positivas (Cuadro 1).

Plantas con la presencia de Ceratocystis spp. se presentan en fincas donde existían

problemas con prácticas culturales o en podas bajas. Waller et al. 2007 hacen mención que
la mayor incidencia se da en plantas de café viejas o de más de tres años, lo que concuerda
con el muestreo ya que en su mayoría eran plantaciones viejas (más de 10 años) y en podas
bajas; lo anterior recalca que las primeras prácticas culturales o inadecuados manejos son
los principales causantes de la entrada del patógeno al hospedero. De esta forma, se
encontró en plantas aisladas, en plantas con poda reciente o en parches en donde existe
daño del tallo por cuchillo o motoguadaña (Fig. 27).

46
 A B C

Figura 27. Muestreo de plantas con presencia de Ceratocystis sp., plantas enfermas de forma
aislada (A), en podas (B) y en parches (C).

Debido a que la principal causa de entrada de Ceratocystis spp. a la planta es mediante

heridas, unas de las principales características para poder reconocer la presencia de la
enfermedad es verificar, a nivel de tallo (en los primeros 20 cm de la base en contacto con
el suelo), la presencia de una herida y realizar un raspado de la corteza en dicha área, de
esta forma se puede observar la presencia de una lesión marrón grisacea irregular como lo
muestra la figura 28.

Figura 28. Lesión irregular marrón- gricácea en tronco característica de C. fimbriata,

Costa Rica, 2015-2016.
47
Existen regiones donde Ceratocystis spp., presenta una mayor incidencia, como en el Valle
Central con 9 aislamientos, seguido por Los Santos con 6, Pérez Zeledón con 5, Turrialba
con 4, Valle Occidental con 4 y Coto Brus con 2 (Cuadro 3). Los aislamientos del Valle
Central corresponden a los cantones de Sabanilla, Poás, Alajuela, Barva, Santa Bárbara y
Tres Ríos con alturas entre los 1249 m.s.n.m y 1552 m.s.n.m. En el caso de la región de los
Santos, corresponden a los cantones de Santa María de Dota, Tarrazú y León Cortés con
alturas entre los 1451 m.s.n.m y 1875 m.s.n.m. En Pérez Zeledón, las muestras positivas
fueron de los distritos de San Pedro, General Viejo y Cajón con alturas entre los 585
m.s.n.m y 673 m.s.n.m. En el cantón de Turrialba, se obtuvieron muestras de los distritos de
Dulce Nombre, Santa Rosa y San Cruz con alturas entre los 951 y 1188 m.s.n.m. En el
Valle Occidental se localizó el patógeno en los cantones de Naranjo, San Ramón y Grecia
en los 1219 m.s.n.m y 1474 m.s.n.m. Y, por último, en Coto Brus, se obtuvieron en los
cantones de San Vito y Sabalito con altura de 998 m.s.n.m y 1132 m.s.n.m.

Castro -Caicedo (1999) hace referencia a la presencia del patógeno en los diversos suelos
de área tropicales y zonas templadas en el mundo en altitudes que abarcan entre los 800
m.s.n.m y 2 000 m.s.n.m., sin embargo, en este estudió se determinó su presencia en
alturas mínimas de 585 m.s.n.m y máximas de 1875 m.s.n.m.

Además, las regiones donde se presentó el patógeno, muestran características de suelos

distintos. Considerando en macro los órdenes de suelo, encontramos que la región de
muestreo del Coto Brus y el Valle Central pertenecen al orden de los Andisoles (suelos de
origen volcánico); la región de Los Santos, Pérez Zeledón y Valle Occidental pertenecen al
orden de los Ultisoles (suelos más viejos y meteorizados del país) y los suelos del orden
Inceptisoles de la región de Turrialba (Mata, 1991; Bertsch, 1995). De esta forma, se
recalca que Ceratocystis spp. no muestra una especialización por un tipo específico de
suelo, siendo capaz de permanecer en suelos poco nutritivos, baja materia orgánica y con
características de compactación. Es importante considerar que Ceratocystis spp. penetra
exclusivamente por heridas, por lo tanto, la mayor incidencia de la enfermedad en la
Región del Valle Occidental va dirigida principalmente a problemas en las prácticas
culturales realizadas en plantaciones, en su mayoría viejas (mayores a los 20 años),
48
llevando esto a un mayor número de podas, deshierbas y deshijas, favoreciendo el ataque
del patógeno.

2. Morfología

Desde 1967, Webster y Butler reconocen que existe variabilidad entre aislamientos de C.
fimbriata s.l. Estos autores mencionan que desde este año existían diferencias en el tipo de
colonia, patogenicidad y tasa de crecimiento de distintos aislamientos, aun así, mantenían
las características de crecimiento, morfología del peritecio y el comportamiento sexual
semejantes. Sin embargo, muestran la inquietud de que el amplio rango de hospederos,
regiones geográficas y diferencias en la morfología representan indicios de una fuerte
variabilidad de la especie, reconociendo a C. fimbriata s.l como un complejo de especies
crípticas. Muchas de las nuevas especies existentes por muchas décadas formaron parte del
complejo de especies crípticas y en los últimos años con la implementación de nuevas
herramientas se les reconoció como distintas (Johnson et al. 2005; Engelbrecht y
Harrington 2005; Van Wyk et al. 2010).

Pérez (2009) hace referencia que la clasificación de especies dentro de un complejo (por
ejemplo, el complejo C. coerulescens) se requieren comparaciones entre las secuencias ITS,
isoenzimas, morfología y el hospedante al cual ataca. De esta forma, se requiere aunar en
todas estas variables para determinar la variabilidad existente, ya que una sola variable
puede ser insuficiente dentro de un grupo tan poco variable.

La identificación a nivel morfológico representa la base para la diferenciación e

identificación de nuevas especies en diversos estudios taxonómicos sobre la diversidad de
los hongos existentes. Por ejemplo, las especies Ophiostoma europhioides (E.F. Wright y
Cain) y O. huntii (Rob-Jeff) fueron determinadas como especies distintas mediante estudios
morfológicos, encontrando diferencias en ascosporas y dimensiones de los peritecios, esto
demostró la importancia de la evaluación de dichas variables en los estudios taxonómicos
(Jacobs et al. 1998). Barnes et al. (2003) hacen mención de la presencia de una nueva

49
especie presente en Eucalyptus nitens en Australia conocida como C. pirilliformis. Esta
especie presenta tamaño de peritecios, ascosporas y conidios semejantes a los observados
en C. fimbriata y C. albofundus, especies encontradas en Eucalyptus nitens. No obstante,
existen diferencias importantes que las dividen. En este caso C. albofundus posee color
claro, hifas ostiolares divergentes y carecen de clamidiósporas; C. pirilliformis y C.
fimbriata son muy semejantes entre sí, con la única diferencia en la forma de las bases de
los peritecios. C. fimbriata posee bases globosas y las C. pirilliformis son piriliformes,
además, las colonias de estas tres especies difieren entre ellos: en C. albofundus son
pálidas, en C. fimbriata varía entre verduzco a marrón y en C. pirilliformis las colonias se
forman con un micelio aéreo grisáceo y en el centro verduzco, después de cierto tiempo.

Ceratocystis fimbriata, agente causal de la enfermedad conocida como “mal de machete”

presenta variables morfológicas características de dicho género (Barker y Thomas, 2001;
Lui et al. 2015). Crece en medio de cultivo PDA, desarrolla un micelio hialino que con el
posterior desarrollo se torna marrón verdoso oscuro. Además, especies de ese grupo
presentan formas morfológicas “chalara” (Hunt, 1956) o más recientemente “thielaviopsis”
(Paulin-Mahady et al. 2002) los cuales desarrollan células conidiógenas tubulares simples
que se estrechan hacia sus ápices y producen cadenas de conidios rectangulares o conidios
secundarios con forma de barril y pueden tener tamaños entre los 11-16 µm de largo por 4-
5 µm de ancho. Los conidióforos especializados forman clamidósporas de paredes gruesas
consideradas como las estructuras de resistencia de Ceratocystis. Estas presentan tamaños
entre 9-16 µm de largo y 6-13 µm de ancho (CABI, 2017).

La morfología en el género Ceratocystis se caracteriza, además, por la presencia de

ascomatas color marrón oscuro a negro (cuerpos frutíferos, peritecios), los cuales poseen
bases redondeadas con tamaños entre los 130-200 μm. Dichas bases forman cuellos largos y
delgados hasta los 800 μm de largo con terminación en hifas ostiolares (8-15) que varían
entre los 50 – 90 μm por donde se da la exudación de masas de ascosporas pegajosas
hialinas y de forma de sombrero con tamaños entre 4.5-8 μm de largo por 2.5-5.5 μm de
ancho. Las ascosporas pueden tener formas redondeadas, en forma de sobrero, ovoides y
elipsoides. Existen especies que forman clamidósporas simples, las cuales permiten la
50
permanencia en los suelos como estructuras de resistencia (Jacobs et al., 1998; De Beer et
al., 2014; CABI, 2017; Pérez, 2009; Lui et al. 2015).

Marín et al. (2003) realizan una primera investigación donde aislan a Ceratocytis fimbriata
de 50 muestras de suelos infectados y plantas con síntomas en 11 provincias de Colombia
para realizar una caracterización morfológica y patogénica con el fin de obtener una base en
el desarrollo de variedades de café resistentes. En los resultados en morfología se determina
que presentan las características típicas descritas para C. fimbriata (Webster y Butler,
1967), no obstante, mencionan que se obtiene una mayor diversidad morfológica, pero no
tiene la capacidad de realizar agrupaciones con estas variables. La mayoría de aislamientos,
un total de 35, mostraron colonias verde olivo, 22 aislamiento se presentaron en anillos
concéntricos, 14 en grupos centrales y 14 en todo el medio. 18 de los aislamientos de
Ceratocystis en café de Costa Rica muestra en su mayoría colonias de color olivo con una
distribución distinta, donde 57 % se ubican en todo el medio, el 40 % forman anillos
concéntricos y únicamente el 1% muestra un grupo central.

Van Wyk et al. (2010), continuando con el trabajo de Marín et al. (2003), realizó un estudio
morfológico y molecular de estos aislamientos, donde encontró diferencias morfológicas
específicas permitiendo la separación de dos nuevas especies del complejo C. fimbriata s.l.:
Ceratocytis papillata y Ceratocystis colombiana, especies nuevas reconocidas como
patógenos en el cultivo del café. Ambas especies presentan diferencias en la temperatura
óptima de crecimiento, C. papillata presenta bases de peritecios con ápices papilares a
diferencia de las bases globosas de C. colombiana; C. papillata muestra hifas ostiolares
más grandes y sus conidios en forma de barril son más pequeños. La diferencia más
considerable entre C. papillata y el complejo C. fimbriata s.l. es la característica de la
morfología “cap-like” en las bases del cuello del peritecio. Estas presentan cuellos e hifas
ostiolares más largas. Las características morfológicas como la base de los cuellos,
presencia de conidióforos primarios –secundarios y tamaño del cuello de los peritecios de
C. papillata presenta similitudes y diferencias que los separara de otras especies como C.
caryae, C. smalleyi, C. variospora y C. populicola. En el caso de C. colombiana, presenta

51
conidióforos y conidios secundarios que no presenta C. fimbriata s.s., además, las bases de
los peritecios y los cuellos de C. colombiana son más pequeños.

Los individuos de Ceratocystis spp. en Costa Rica presentan una morfología característica
del complejo C. fimbriata s.l. Además, los valores obtenidos para las variables tamaños de
las ascosporas y conidias concuerdan con las especies C. papillata y C. colombiana. No
obstante, sí se observan diferencias en otras características como se observa en el cuadro 6.
Para el tamaño de las clamidósporas, se muestra más similitud con C. papillata como por
ejemplo, en el tamaño máximo de las clamidósporas con 16,53 cm; para el tamaño de
diámetro del peritecio, la población de Ceratocystis en Costa Rica presenta más similitud
con las especies C. colombiana con valores mayores de diámetro que los obtenidos por C.
papillata; en cuanto a la base del peritecio, se muestra una mayor relación con la especie C.
papillata, mostrando valores más cercanos a su máximo tamaño, pero con mediciones
mayores que este individuo (70 µm máximo valor). Aunque existe similitudes
morfológicas, Ceratocystis spp. no presenta la característica de presencia de ápices
papilares de C. papillata. Para el caso del tamaño del cuello de los peritecios de la especie
C. papillata muestra una mayor similitud que los del presente estudio y, con respecto al
tamaño del ostiolo, se presenta una mayor similitud con esta misma especie de origen
colombiano (Cuadro 6).

52
 Cuadro 6. Aislamientos de Ceratocystis spp. de las regiones cafetaleras de Costa Rica,
especie C. papillata y C. colombiana y la medición de sus variables morfológicas
comparativas

Tamaño (µm)
Especie Diámetro Base del Cuello del
Áscosporas Conidias Clamidiósporas Ostiolo
peritecio peritecio peritecio
Ceratocystis
fimbriata 4.5-8 11-16 9-16 130-200 No reportado hasta los 800 50-90
s.l1
Ceratocystis 3-7 12-29 11-14 140-294 24-43 375-676 28-52
colombiana2
Ceratocystis 3-6 17-29 10-16 169-258 30-58 472-753 44-78
papillata2
Ceratocystis
spp. (Costa 5-6.9 20-29 13-16 147-294 34-72 307-717 24-63
Rica)3
1. CABI, 2017
2. Van Wyk et al. 2010
3. Presente estudio

Con los anteriores resultados, podemos concluir, que los tamaños encontrados en las
características morfológicas muestran semejanzas a las nuevas especies encontradas en
plantas enfermas de café de Colombia. No obstante, existen diferencias entre ellos por lo
que se requiere visualizar el resultado en el análisis molecular (ver punto 4 de resultados).

3. Agresividad

La agresividad de un patógeno, es considerada como el componente cuantitativo de la

patogenicidad. Pariaud et al. 2009 hacen referencia que las selecciones por la agresividad,
pueden validarse con parámetros climáticos y que los cambios poblaciones o en las
estructuras sexuales o asexuales pueden explicar la variación en agresividad y que esta
agresividad puede favorecer a la especificidad en el ataque a un hospedero específico en la
región donde se establezca. Dichos autores hacen referencia al efecto directo de factores
climáticos en los procesos de infección, no obstante, el género Ceratocystis presenta

53
estructuras de resistencia (clamidósporas) las cuales permiten el establecimiento en suelo
por largos periodos aún en condiciones climáticas desfavorables. Además, Pariaud et al.
2009 mencionan que la variación dentro de una población en la agresividad es parte
fundamental en el proceso de adaptación, por lo cual, se hace referencia a la importancia
del estudio de los patotipos individuales y no considerar toda la población como iguales.

Barnes et al. 2001 mencionan que, en ensayos de patogenicidad, existen aislamientos de

Ceratocystis que pueden llegar a ser específicos de un huésped. Al realizar inoculaciones en
plantas de papa, café y cacao con un aislamiento considerado como C. fimbriata aislado de
pimiento no se presentó indicios de infección. Pontis (1951) encontró que al inocular café
con aislamientos de Ceratocystis obtenidos de plantas de cafeto y de papa, únicamente el
aislamiento obtenido de plantas de caféeto logró provocar infección.

Hamid et al. (1982) encontraron diferencias considerables en la eficacia de infección, la

longitud de la lesión y la capacidad de esporulación del ascomicete Cochliobolus carbonum
que afecta sorgo, con diferencias del 91 % entre el menos y el más agresivo. Milus et al.
(2006), en un estudio realizado en los Estados Unidos, encontró que dos aislamientos de
Puccinia striiformis f., mostraron diferencias en la temperatura óptima de crecimiento: uno
a 12 °C y otro a 18 °C. Carlisle et al. (2002) encontraron diferencias significativas en la
tasa de crecimiento de la lesión, período de latencia, tasa de esporulación y capacidad de
infección de 17 aislamientos de Phytophthora infestans en Irlanda del Norte; aún con esta
diferencias en la patogenicidad, estos individuos comparten un genotipo multilocus
idéntico, presentan sensibilidad al mismo fungicida y pueden superar el gen de resistencia
R1 (similares genéticamente).

Las especies C. papillata y C. colombiana aisladas de plantas de café, cacao y cítricos, en

donde se inocularon todos los aislamientos entre los distintos huéspedes, se obtuvo que
todos son patogénicos, aún en los huéspedes de los que no fueron aislados. En conclusión,
no se observa una especificidad de ninguna de estas dos especies de Ceratocystis spp. Van
Wyk y colaboradores en trabajos realizados en los años 2009 y 2010 concluyen que existen
especies dentro del complejo de Ceratocystis con distintos tipos de hospederos, ejemplo de

54
esta inespecífica relación es C. albifundus, el cual se ha aislado de nueve distintos
hospederos. Caso semejante ocurre con las especies C. atrox, C. pirilliformis, C. negleta y
la más reciente descubierta de estas, C. fimbriatoma, especies encontradas en árboles de
Eucalyptus.

Sin embargo, Van Wyk et al. 2010 también mencionan que el complejo de C. fimbriata s.l.,
se conocen especies que presentan alta especificidad a sus huéspedes. Pérez (2009) y
Jonhnson et al. 2005 mencionan que la patogenicidad de C. platani (causante del cancro en
Platanus spp.) y C. cacaofunesta (causante del marchitamiento vascular en cacao) difiere
de C. fimbriata.

Ferreira et al. (2010) mencionan, que la población de estudio Ceratocystis en Brasil, no

presentan sólo diferencias por las regiones geográficas, sino además, en la agresividad
mostrada en los diferentes hospederos exóticos en los que logran ser patogénico.

Por tanto, dentro del complejo de C. fimbriata s.l. existen diferencias en la patogenicidad,
morfología, tipos de hospederos y regiones geográficas (Webster y Butler, 1967; Barnes et
al. 2001). Esto sucede con los aislamientos de Ceratocystis spp. en el cafeto de Costa Rica,
que muestran esa variabilidad en su morfología y patogenicidad, dando como resultado una
población muy diversa ya que, aunque al área cafetalera es pequeña en comparación con
países como Colombia y Brasil, se presenta una alta diversidad agroecológica tanto en
condiciones climáticas, suelos, alturas y edades de los cultivos.

Los resultados de la tasa de crecimiento diaria varía entre los aislamientos de Ceratocystis
spp. en el cafeto de Costa Rica, no obstante, presentan relación con los datos de crecimiento
final de la lesión. Estos aislamientos no presenta una relación entre agresividad y cada una
de las regiones de muestreo, ejemplo de esto lo muestra que el aislamiento más agresivo
LS63 perteneciente a Santa María de Dota, ubicado a una altura de 1784 m.s.n.m y uno de
los aislamiento menos agresivos correspondiente a LS4, localizado a una altura de 1779
m.s.n.m, comparten las mismas características de la región, condiciones climáticas
semejantes, con la única diferencia que son aislamientos de fincas distintas, con posibles
diferencias en el manejo de la plantación. Todos los aislamientos fueron capaces de infectar
55
nuevamente al mismo hospedero con distinta tasa de crecimiento e índice de agresividad,
donde, un porcentaje considerable de la población (10 %) presentó valores altos de Índice
(≥ 160 000). Marín et al (2003) hace mención que la variabilidad en la patogenicidad
mostrada por Ceratocystis en Colombia, puede deberse a una alta variabilidad genética y un
endemismo del hongo en la región de muestreo, además, la presencia de otros tipos de
posibles huéspedes del patógeno como es el caso de cacao o cítricos en asocio con el
cultivo de café puede favorecer nuevas fuentes de virulencia del patógeno como resultado
de las distintas interacciones huésped-patógeno. No obstante, en los lugares de muestreo,
no se observaba el asocio con especies de cacao y cítricos, sin embargo, es difícil predecir
si en algún momento existió este asocio y el tipo de uso del suelo antes de cultivar café.

De esta forma, considerando la agresividad y factores climáticos (precipitación, humedad

relativa y temperatura), los aislamientos correspondientes a los cantones de Grecia, Coto
Brus, Turrialba y Pérez Zeledón muestran similitudes importantes para las variables de
Índice Agresividad, precipitación y humedad relativa. Para los demás cantones, se muestra
relaciones con variables climáticas, no así con el Índice de Agresividad; lo anterior
muestra, que para este patógeno, las diversas condiciones climáticas de las regiones
cafetaleras no interfieren en la capacidad infectiva, por lo que lo más importante es evitar
heridas a nivel de troncos.

Los individuos con mayor capacidad de agresividad, poseen una ventaja evolutiva en los
patosistemas (Pariaud et al. 2009), de esta forma, es importante reconocer el
comportamiento de estos individuos, los cuales, tiene que ser la base en los estudios de
combate químico, biológico y no menos importante en la búsqueda de materiales con
resistencia o tolerancia a dichas enfermedades (Van Wyk et al. 2009). Y como
recomendaciones, evitar trasladar el patógeno de la zona más agresiva, a zonas donde el
patógeno es menos virulento (Marín et al. 2003).

56
 4. Identificación molecular

Barnes et al. (2001) mencionan que las características morfológicas y patogénicas son de
suma importancia en los estudios de identificación de especies, sin embargo, hace hincapié
en la necesidad de implementar las técnicas moleculares con el conocimiento existente en
las huellas de ADN en poblaciones de hongos. Dichos autores mencionan en su estudio,
que los resultados obtenidos con el uso de algunos microsatélites en la identificación del
género Ceratocystis, podrían estar subestimando la diversidad genética mostrada.

De esta forma Van Wyk et al. (2007a) hacen mención que la variabilidad en los
aislamientos de C. fimbriata, la amplia gama de hospederos y la extensa distribución
geográfica, hacen concluir que dicho patógeno puede representar un complejo de especies.
Los estudios basados en técnicas de ADN han representado una herramienta para la
distinción de taxones en las distintas especies de hongos. El análisis multigenes representa
una herramienta útil para la distinción entre complejos de especies como Colletotrichum,
Diplodia y Lasiodiploidia, Fusarium, Mycosphaerella, Phomopsis y Ceratocystis (Van
Wyk et al., 2010).

Ferreira et al. (2010) concluyen, en un estudio realizado sobre la diversidad y variabilidad

entre poblaciones de Ceratocystis fimbriata en Brasil, la dificultad de distinguir
aislamientos de C. fimbriata sensu stricto, y que mediante la utilización de microsatélites
específicos, se logró diferenciar a C. platani y C. cacaofunesta de C. fimbriata. Estos
autores concluyen que, aislamientos de una misma región pueden presentar diferencias
dentro de las mismas poblaciones, por la localización geográfica y por el tipo de hospedero,
resultados que podrían relacionarse a las población de aislamientos de Ceratocystis spp.
encontradas en plantas de café de Costa Rica.

Pérez et al. (2011) aseguran que las secuencias de Ceratocystis de las regiones ITS de los
genes rADN han sido utilizadas desde hace algunos años en la determinación de las
relaciones filogenéticas entre los hongos ophiostomatoides (incluye a Ceratocystis
fimbriata sensu lato), herramienta que presenta una mayor ventaja considerando que las

57
características morfológicas son muy semejantes. De esta forma, mencionan que con base
en sus características morfológicas, Ophostioma rigrocorpum es similar al complejo de O.
stenoceras, no obstante, en comparaciones de las secuencias de ADN se muestran ciertas
diferencias.

Morris et al. (1993), en uno de los primeros trabajos con la utilización de técnicas
moleculares, hace la descripción de que el hongo que provocaba la marchitez en Acacia
mearnsii en el Sur de África, reconocida inicialmente como C. fimbriata, pertenecía a un
taxón distinto al cual se le conoció como C. albifunus, iniciando el estudio de la amplia
variabilidad presentada por aislamientos de C. fimbriata.

Barnes et al. (2003), con los resultados en diferencias morfológicas previas, realizaron un
análisis molecular utilizando las regiones ITS1, 5.8 S y la ITS2 dando como resultado la
separación entre las especies C. fimbriata, C. albofundus y C. pirilliformis.

Van Wyk et al. (2007a) utilizaron los primers ITS, B–tubulina y EF-1α para la
identificación de 43 aislamientos de Ceratocystis spp. obtenidos de mango (Mangifera
indica) en Oman y Pakistan; el patógeno que afectaba este cultivo era conocido como C.
fimbriata, ya que sus características morfológicas eran muy similares a las descritas para
dicho patógeno (considerando que pertenecían al mismo taxón en el pasado), sin embargo,
con dichos resultados se obtuvo que la especie presente era C. manginecans (bootstrap =
88%), patógeno virulento, con capacidad de matar rápidamente los árboles de mango.
Además, se concluyó que el aislamiento obtenido de mango en Brasil se separaba de dicho
grupo de aislamientos (bootstrap = 66%), los cuales requerían más estudio para verificar su
separación.

Van Wyk et al. (2009) determinaron, mediante la utilización de los primers ITS, β-tubulin y
EF 1- α, que existía una nueva especie de Ceratocystis presente en árboles de Eucalyptus
en Venezuela: C. fimbriatomina (bootstrap = 100).

Para la diferenciación de C. cacaofunesta de C. fimbriata se determinaron variables

morfológicas, patogenicidad hacia dicho hospedero y la identificación molecular utilizando
el factor de transcripción (ITS)-rADN (Engelbrecht et al. 2007). Lo anterior con la
58
finalidad de incursionar en la búsqueda de materiales resistentes hacia dicha enfermedad la
cual en los últimos años, ha reemergido debido al sistema de reproducción por esquejes de
este cultivo.

En Colombia, mediante la implementación de dicha herramienta, con la utilización de los

primers del presente estudio, se demostró que C. fimbriata s.l. en café desciende de dos
lineamientos filogenéticos distintos (Barnes et al., 2001, Marin et al., 2003; Van Wyk et al.,
2010). En Costa Rica, los primeros estudios sobre la enfermedad fueron realizados por
Echandi (1955), donde, mediante el aislamiento del patógeno, pruebas morfológicas y la
verificación de los postulados de Koch, se determinó la presencia del agente causal
conocido como C. fimbriata en Colombia, Venezuela y Guatemala. De esta forma, se le
reconoció como Ceratocystis fimbriata hasta la actualidad, sin embargo, con el
descubrimiento de las pruebas moleculares, se incursionó en la búsqueda de la
especificidad de la especie previo a diferencias morfológicas observadas (Van Wyk et al.
2004; Van Wyk et al. 2007a; Van Wyk et al. 2007b; Van Wyk et al. 2009).

Los aislamientos de Ceratocystis spp. de plantas de café en las distintas regiones cafetaleras
de Costa Rica mostraron diferencias en su morfología y patogenicidad. Se encontraron
polimorfismos fijos (diferencias genéticas) en las regiones estudiadas entre aislamientos de
este estudio y las especies C. colombiana y C. papillata, determinadas como nuevas
especies patógenas del cultivo del café. Los resultados en el presente estudio muestran la
similitud genética entre los aislamientos LS63 y LS4 con valores de bootstrap de 53 y los
aislamientos PZ67 y T43 muestran una similitud genética con valores de bootstrap de 100,
presentando similitud con la especie C. papillata. No se logró incluir secuencias con
similitudes en el Blast ya que no se encontraban aislamientos con las tres regiones
secuenciadas más que las del estudio realizado por Van Wky et al. (2010). En conclusión,
existe una similitud entre los aislamientos LS4 y LS63 y estos con los aislamientos T43 y
PZ67, sin embargo, no son iguales, por lo que se requiere el secuenciamiento de todos los
aislamientos para determinar la presencia de nuevas especies. Además, a pesar que los
aislamientos T43 y PZ67 presentan una mayor similitud con la especie C. papillata, estos
se ubican en dos ramas separadas, probablemente debido a distintas condiciones
59
geográficas u otra presión ejercida sobre el patógeno, por lo que es importante incluir más
secuencias para verificar una mayor separación. Además, ninguno de los 4 aislamientos del
presente estudio muestran una alta similitud con las demás especies comparadoras
incluyendo a C. fimbriata descrita por Van Wyk et al. (2010).

En el caso de los aislamientos LS63 y LS4 que presentan similitud genética, esto no se
observa en sus características morfológicas y patogénicas; en el caso de los aislamientos
PZ67 y T43, si muestran similitud para el tamaño de la base del peritecio y del ostiolo,
mostrando una separación con los individuos de la región de Los Santos. Además, con lo
que respecta a la agresividad, todos los aislamientos presentan categorías de Índice de
Agresividad distintos.

De esta forma, los aislamientos considerados como más cercanos genéticamente, no

necesariamente lo son para variables morfológicas y de agresividad. Con lo que se
concluye, que existe diversidad entre la población de Ceratocystis a nivel de país.

Fourie et al. (2015) y Oliveira et al. (2015) mencionan que se han encontrado dos tipos de
ITS para un mismo aislamiento de Ceratocystis en mango, determinados como especies
distintas, por lo que, recalcan la importancia de utilizar otras regiones genéticas alternativas
para apoyar los resultados o diferir entre el género Ceratocystis. Se cuentan con regiones
genéticas alternativas para análisis filogénicos: proyectos AFTOL y FBoL, tipos de
secuencias de apareamiento (MAT1-1-2), otras secuencias de ITS, genes codificadores de
co-proteínas, la proteína de procesamiento pre-Rard (Tsr1), el complejo de proteínas de
mantenimiento de minicromosomas (Mcm7), la proteína ribosomal L37 (FG1093), la
proteína beta de la subunidad de la proteína de unión a nucleótidos guanina (MS204) y los
polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs).

Por lo tanto, aunque las regiones utilizadas en el presente estudio nos permiten determinar
diferencias genéticas entre aislamientos, existen aún más preguntas sobre aislamientos con
diferencias más específicas, donde Oliveira et al. (2015) hacen mención si se puede tratar
de nuevas especies o más bien patotipos distintos de la especie.

60
 CONCLUSIONES

 Los síntomas ocasionados por patógenos de suelo como Rosellinea spp. y Fusarium
spp. son similares a Ceratocystis spp. por lo que la verificación de una herida y la
presencia de una lesión irregular es una característica específica del género
Ceratocystis.
 Existe una mayor presencia de la enfermedad en la región del Valle Central.
 Los aislamientos LS4, LS63, T43 y PZ67 presentan diferencias morfológicas entre
ellos, pero mantienen las características similares del género y todos muestran
similitud con la especie C. papillata.
 Los aislamientos LS4, LS63, T43 y PZ67 presentan diferencias en su agresividad y
no se muestra una relación directa de esta variable con aislamientos de la misma
región geográfica cafetalera del país. El aislamiento más agresivo corresponde
LS63 y el menos agresivo al aislamiento LS4, ambos de la región de Los Santos.
 A nivel genético, se muestra diferencias genéticas entre los aislamientos LS4 y
LS63 con los aislamientos T43 y PZ67, mostrando una similitud con la especies C.
papillata.
 Existen diferencias en la morfología, agresividad y genética de los aislamientos de
Ceratocystis spp. en la regiones cafetalera de Costa Rica.
 Se tiene al aislamiento más agresivo para estudios en mejoramiento de plantas con
resistencia u tolerancia a este patógeno.

61
 RECOMENDACIONES

 A nivel de campo, capacitar a los técnicos sobre la lesión característica de

Ceratocystis spp. e incentivar las buenas prácticas culturales para evitar la presencia
de heridas.
 Realizar un estudio genético de todos los aislamientos de Ceratocystis spp. del
presente estudio.
 Utilizar el aislamiento más agresivo en los proceso de mejoramiento de plantas por
parte de las instituciones interesadas.
 Realizar este tipo de estudio para otros patógenos en café de los cuales se conoce
poco de su comportamiento, distribución y agresividad.
 Conocer la biología de los organismos que afectan la caficultura en nuestra región y
no trasladar y hacer como verdadera, cualquier información del comportamiento de
los patógenos en otras regiones.

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70
 ANEXO

ANEXO 1. Variable morfológica color mediante la utilización de la Tabla Munsell de los

aislamientos de Ceratocystis spp. obtenidos en las distintas regiones cafetaleras en
el país

Aislamiento Hoja tabla Munsell Valor en la hoja Color respectivo

VC1 10YR 5/2 Marrón grisáceo
VC3 5Y 5/3 Olivo
LS4 5Y 5/4 Olivo
LS10 5Y 4/3 Olivo
LS12 5Y 4/4 Olivo
VC14 5Y 5/4 Olivo
VC15 10YR 5/2 Marrón grisáceo
VC16 5Y 4/3 Olivo
VC18 5Y 5/4 Olivo
VC19 5Y 5/4 Olivo
VC21 5Y 5/3 Olivo
VC22 5Y 5/3 Olivo
VC23 5Y 5/4 Olivo
PZ28 5Y 5/4 Olivo
VO34 5Y 4/2 Gris olivo
T39 10YR 5/4 Marrón amarillento
T40 5Y 5/4 Olivo
T41 5Y 5/4 Olivo
T43 10YR 5/4 Amarillo
PZ46 5Y 4/4 Olivo
PZ51 5Y 5/3 Olivo
VO52 5Y 3/2 Gris olivo oscuro
VO56 5Y 5/4 Olivo
CB57 5Y 6/2 Gris olivo claro
LS63 5Y 6/3 Olivo pálido
LS64 5Y 6/3 Olivo pálido
LS65 10YR 4/2 Pardo grisáceo oscuro
PZ67 10YR 5/3 Marrón
VO68 5Y 6/4 Olivo pálido
CB72 5Y 5/3 Olivo

71
ANEXO 2. Variables morfológicas para implementación de índice de Agresividad: 0 día de
la inoculación (A), 2 días después de la inoculación con aparición de lesión (B), 4-6
días después de la inoculación aparición de peritecios (C) lesión final 15 días
después de la inoculación (D), desarrollo de peritecios sobre la lesión en herida
realizada (E), medición de la cantidad de peritecios mediante el conteo en un área
conocida su equivalencia al área total final de la lesión a los 15 días después de la
inoculación (F)

A B C D

E F

72
ANEXO 3. Extracción de ADN mediante el macerado micelio (A-B), PCR y electroforesis
con gel de agarosa 1 % para verificación de amplificación de PCR (C-D)

A B

C D

73
 ANEXO 4. Aislamiento de Ceratocystis spp. y números de accesiones del GeanBank
utilizados para generar el árbol filogenético en el presente trabajo

Número de Número de accessión Región

Especie Hospedero Referencia
Aislamiento en el GenBamk geográfica

CMW15051 DQ520636
Van Wyk,M., Van der Merwe,N.A., Roux,J., Wingfield,B.D.,
C. cacaofunesta EF070427 Theobroma caao Costa Rica
Kamgan,G.N. and Wingfield,M.J.(2006)
EF070398
CMW13851 AY953383
Van Wyk,M., Al-Adawi,A.O., Wingfield,B.D., Al-Subhi,A.M.,
C. manginecans EF433308 Mangifera indica Oman
Deadman,M.L. and Wingfield,M.J. (2005)
EF433318
Heath,R.N., Wingfield,M.J., Wingfield,B.D., Meke,G., Mbaga,A. and
C. tanganyicensis CMW15991 EU244997 Acacia mearnsii Tanzania
Roux,J (2009)
EU244969
EU244929
C. virensis CMW11164 DQ520639 Quercus robur USA Van Wyk,M., Van der Merwe,N.A., Roux,J., Wingfield,B.D.,
EF070441
EF070413
C. platani CMW14802 EF070425 Platanus occidentalis USA
Van Wyk,M., Al Adawi,A.O., Khan,I.A., Deadman,M.L., Al
EF070396
Jahwari,A.A., Wingfield,B.D., Ploetz,R. and Wingfield,M.J. (2007)
DQ520630
C. fimbriata CMW15049 EF070442 Ipomoea batatas USA Van, M; Wingfield, B; Marin, M; Wingfield, M (2010)
CBS141.37 EF070394
DQ520629
C. papillata CMW8860 GQ478241 Theobroma caao Colombia Van, M; Wingfield, B; Marin, M; Wingfield, M (2010)
GQ478237
GQ478239
C. papillata CMW5746 EU241480 Coffea arabica Colombia Van, M; Wingfield, B; Marin, M; Wingfield, M (2010)
EU241482
EU241479
C. papillata CMW9561 GQ478242 Theobroma caao Colombia Van, M; Wingfield, B; Marin, M; Wingfield, M (2010)
GQ478238
GQ478240
C. papillata CMW8850 AY233875 Citrus x tangelo Colombia Van, M; Wingfield, B; Marin, M; Wingfield, M (2010)
CBS121794 EU241485
AY233866
C. papillata CMW8857 AY233878 Annona muricata Colombia Van, M; Wingfield, B; Marin, M; Wingfield, M (2010)
EU241483
AY233868
C. colombiana CMW5768 AY177222 Coffea arabica Colombia Van, M; Wingfield, B; Marin, M; Wingfield, M (2010)
EU241491
AY177235
C. colombiana CMW5761 AY177224 Coffea arabica Colombia Van, M; Wingfield, B; Marin, M; Wingfield, M (2010)
CB121791 EU241492
AY177234
CMW9565 AY233870
C. colombiana EU241487 Soil in coffe planttion Colombia Van, M; Wingfield, B; Marin, M; Wingfield, M (2010)
CB121790
AY233864

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