UNIVERSIDAD NACIONAL MULTIDISCIPLINARIA

RICARDO MORALES AVILES

SEDE - MASAYA

CARRERA: BIANALISIS CLINICO

MARTERIA: INMUNOHEMATOLOGIA
 INTRODUCCION

En la Inmunohematología se aplican los principios básicos inmunológicos para el estudio de los antígenos
presentes en los elementos formes de la sangre y su comportamiento sexológico. Igualmente estudia los
desórdenes hematológicos relacionados con el estado inmune del individuo.

Dentro de este campo se le ha dado un gran impulso al estudio de los grupos sanguíneos y sus anticuerpos, y
ello ha conducido a que la transfusión sanguínea se convierta en un procedimiento más seguro y salvador de
vidas. Por otro lado ha permitido conocer la fisiopatología y desarrollar el tratamiento de ciertas
enfermedades de la sangre con base inmunológica, como son la enfermedad hemolítica del recién nacido y
los procesos de autoinmunidad contra glóbulos rojos, leucocitos y plaquetas.

Dos términos son de uso frecuente en inmunología: antígenos y anticuerpos. Cada uno es independiente del
otro, pero ambos comparten importantes propiedades como por ejemplo, la especificidad, según la cual el
anticuerpo resultante de la estimulación antigénica solamente reconocerá al antígeno que estimuló la
producción.

I. ANTÍGENOS

Es una sustancia que introducida en un organismo provoca una respuesta inmunológica específica,
mediante la producción de anticuerpos específicos para éstas (repuesta humoral o sérica) o despertar
mecanismos mediados por células dirigidas contra tales sustancias (respuesta celular).

Se pueden diferenciar dos características primordiales en un antígeno. Por una parte la inmunogenicidad o
capacidad que presenta una molécula para generar una respuesta inmune en un organismo dado y la
antigenicidad o particularidad del antígeno que hace que éste sea reconocido por un determinado
anticuerpo. Ambas propiedades pueden o no estar presentes en un determinado antígeno.

Moléculas de pequeño tamaño (haptenos o péptidos) son poco inmunogénicas y por ello se asocian a
proteínas transportadoras de alto peso molecular o 'carriers' para inducir una respuesta inmune adecuada.

A la región del antígeno reconocida por un anticuerpo se le denomina epítope o determinante antigénico.
Un antígeno puede presentar un número variable de epítopes de estructura única o repetitiva.

Los antígenos que interesan a la inmunohematología se hallan principalmente en la membrana de los

eritrocitos, son estructuras estables, perdurables durante la vida de un individuo y que están determinados
genéticamente.

Un antígeno responsable de inducir una respuesta inmune se denomina inmunógeno y puede reaccionar in
vivo o in Vitro con el anticuerpo específico. In Vitro, la reacción antígeno-anticuerpo dependerá de ciertas
condiciones, tales como temperatura, pH, fuerza iónica del medio de reacción etc., y se podrá visualizar como
aglutinación, hemólisis, precipitación, inhibición, etc.
 Un factor importante que afecta la inmunogenicidad de un antígeno es su tamaño molecular. Las moléculas
con capacidad inmunogénica generalmente tienen un peso molecular de 10.000 daltons o más. Moléculas más
pequeñas (ej. Drogas como la penicilina) han sido denominados haptenos, los cuales no tienen poder
antigénico por sí solos, pero pueden ser inmunogénicos cuando se acoplan o fijan a proteínas
“transportadoras” de mayor peso molecular. Los haptenos pueden combinarse con el anticuerpo específico
una vez formado.

Los antígenos de grupos sanguíneos son configuraciones inmunoquímicas presentes en la membrana de los
glóbulos rojos, pudiendo se glucolípidos, proteínas y glucoproteínas. Los antígenos ABH han sido ampliamente
estudiados y se encuentran bajo la forma de glucolípidos que se proyectan en la membrana eritrocitaria. Se
encuentran presentes en otros tejidos, células y líquidos orgánicos. Por el contrario, antígenos como los del
sistema Rh están restringidos a la membrana del glóbulo rojo, el material antigénico parece ser una
lipoproteína y forman parte integral de la membrana.

Composición química y ubicación orgánica de algunos antígenos de grupossanguíneos

Glucolípidos (oligosacáridos + A,B,H Membrana del

lípidos P1 eritrocito
Lea,Leb Plasma
Proteína (polipéptido + lípido) Rh Membrana del
eritrocito
Glucoproteína A,B,H, Secreciones
(polipéptido +oligosacárido Lea,Leb (moco)
M,N Membrana del
eritrocito.

II. ANTICUERPOS

3.1 ¿Que son las inmunoglobulinas?

Son moléculas circulantes secretadas por las células plasmáticas procedentes de activación, proliferación y
diferenciación de células B. Las proteínas plasmáticas que tienen actividad de anticuerpos se han denominado
inmunoglobulinas, las cuales son producidas por el sistema reticuloendotelial en repuesta a la presencia de
un antígeno extraño. Estos anticuerpos se localizan en el suero, en los líquidos tisulares (intersticiales) y
recubriendo ciertos epitelios internos.

3.2 Funciones de las Inmunoglobulinas

Las inmunoglobulinas son creadas para:

Reconocer antígenos infecciosos

Reconocer antígenos no infecciosos
Neutralizar sustancias extrañas
Apoyar el fenómeno de citotoxicidad dependiente de los anticuerpos
 Apoyar al fenómeno de opsonización

La molécula de inmunoglobulina consta de una o más unidades básicas y cada unidad está compuesta a su vez
de 4 cadenas de polipéptidos: dos cadenas pesadas (H) que contienen entre 420 a 440 aminoácidos y dos
cadenas livianas mas cortas (L) formadas por 210 a 220 aminoácidos. Estas cadenas están unidas entre sí
por enlaces covalentes disulfídicos (S-S) y enlaces no covalentes formando una molécula en forma de Y.

La secuencia de aminoácidos de ambas cadenas ha permitido dividirlas en segmentos bien identificados, de

aproximadamente 100 aminoácidos cada uno denominados “dominios o regiones”. La actividad serológica y
biológica de los anticuerpos procede de la secuencia de aminoácidos de estos dominios. Una cadena liviana
IgG tiene una región variable (V1) y otra constante (C1). Una cadena pesada IgG tienen una región variable (VH)
y tres constantes (CH1, CH2, CH3). Las regiones variables(VH y VH1) confieren la especificidad al anticuerpo y en
ciertas partes de estas regiones se han observado muy frecuentes cambios o sustituciones en las moléculas
de aminoácidos. Estos segmentos hipervariables, también varían considerablemente en su longitud, por lo
que han sido denominados zonas calientes, pues parecen ser las regiones más importantes, que controlan la
especificidad de los anticuerpos.

La acción de enzimas proteolíticas sobre los anticuerpos permite obtener fragmentos que presentan
actividades biológicas diferenciales. Los fragmentos obtenidos son:

 Fc. Corresponde al extremo Carboxi-terminal de las dos cadenas pesadas. Este fragmento está
constituido por la región constante de la cadena pesada y es característica de cada clase de
inmunoglobulinas. Es en esta región donde radican las funciones efectoras de la molécula como son
la fijación del complemento, la interacción con los receptores celulares de monocitos y
 macrófagos, la interacción con la proteína A de S. aureus y G de Streptococcus sp. etc... La región
Fc es característica de especie.

 Fab'2. Corresponde al extremo amino-terminal de las dos cadenas pesadas y a las dos cadenas
ligeras. Se obtiene por digestión con pepsina quien escinde la molécula en extremo carboxi-terminal
por debajo del puente disulfuro que mantiene unidas las cadena pesadas.

 Fab. Corresponde al extremo N-terminal de una cadena pesada y a una cadena liviana, unidas por
puentes disulfuro. Se obtiene por digestión con papaina quien escinde las cadenas pesadas
inmediatamente por encima de los puentes disulfuro que las unen entre sí.

3.3 Clase de Inmunoglobulinas

Se han reconocido cinco clases de inmunoglobulinas en base a las diferencias antigénicas observadas en las
cadenas pesadas, a saber; IgG, IgA, IgD, IgE, IgM.

Los anticuerpos de grupos sanguíneos pertenecen a las clases IgG, IgM y en raras ocasiones a la clase IgA.

IgG: Comprende cerca del 75% del total de la

inmunoglobulinas séricas y se encuentra en el líquido
extravascular. Se presenta en forma de monómeros
(7S), formada por 2 cadenas H y 2 cadenas L, teniendo
un peso molecular de 160.000 daltons y una longitud de
240 Ǻ. Hay cuatro subclases de IgG
(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), las cuales se diferencian
estructuralmente entre sí por el tamaño de la región
bisagra y el número de puentes disulfuro entre las
cadenas pesadas.

La IgG es la única inmunoglobulina que atraviesa la barrera placentaria de la madre hacia el feto, siendo la
menos eficaz la Ig2.
La IgG es capaz de fijar complemento, El orden de eficacia es IgG3> IgG1> IgG2.. la subclase IgG4 es incapaz de
fijar complemento por la vía clásica. Pero puede participar en la vía alterna.

Función de la IgG

B Las IgG poseen gran capacidad de desarrollar elevada afinidad de unión alantígeno.
B Son las mayoritarias durante la respuesta secundaria.
B Difunden más fácilmente al espacio extravascular (hasta el 50% de las IgG se encuentran en los fluidos
tisulares), donde son las principales responsables de
 neutralizar toxinas bacterianas (de hecho, son las únicas que funcionan como antitoxinas).
B Las IgG1 e IgG3 funcionan muy bien como opsoninas: se unen a receptores para Fc de la superficie de
células fagocíticas (sobre todo macrófagos), ayudándolas a fagocitar y destruir el microorganismo.

IgM: Constituye entre el 5-10% de las inmunoglobulinas séricas y se presentan como un pentámero
compuesto por cinco unidades monoméricas 7S unidas por enlaces disulfuros formado un pentámero de 19S y
una cadena polipeptídica corta adicional denominada cadena J (de unión). Tiene un peso molecular
cercano a 1.000.000 de
daltons. Tiene una longitud de 420 Ǻ, por lo cual pueden
aglutinar los glóbulos rojos suspendidos en solución
salina. La cadena mµ contiene una región variable (VH) y
cuatro regiones constantes (CH); es decir, una más de
las que contienen la IgG e IgA. Solamente se encuentra en
el compartimiento vascular y no atraviesa la placenta,
debido a su elevado peso molecular.

Aunque la molécula pentamérica tiene 10 zonas de

combinación, las 10 zonas se combinan simultáneamente
sólo con antígenos pequeños como haptenos. La valencia
(número de zonas de combinación
disponibles) disminuye hasta 5 cuando reaccionan simultáneamente antígenos mayores, probablemente
debido a la flexibilidad limitada dentro de cada cadena µ de esta molécula, dando lugar a una restricción del
número de zonas de combinación con antígeno disponibles para la unión del antígeno.

La igG es la primera clase de inmunoglobulina producida por el sistema inmunitario fetal maduro y también
es el anticuerpo producido en mayor cantidad en las primeras etapas de una repuesta primaria de
anticuerpos. El plasma es el único fluído humanoque contiene cantidades significativas de IgM.

Los anticuerpos IgM son aglutininas muy eficaces y activan el complemento eficazmente. Una sola
molécula unida a la superficie de un eritrocito puede iniciar la lisis de éste mediada por el complemento.
Si se realiza una ligera reducción de la igM con 2-mercaptoetanol o ditiotreitol, se separan las 5 unidades y
se libera la cadena J. . Con este tratamiento se pierden la actividad hemolizante y aglutinante directa.

IgA: Es la inmunoglobulina
predominante en las
secreciones corporales y
comprende aproximadamente el
20% delas inmunoglobulinas del
plasma, en donde se
encuentra principalmente en
forma de monómeros 7S, pero en las secreciones existe primariamente como dímeros
11S incluyendo no sólo la cadena J sino ta mbién una cadena polipetídica de origen epitelial denominada
componente secretor.

En la especie humana se han descrito 2 subclases antigénicamente distintas, IgA1 eIgA2.

IgE e IgD:

Hasta el presente no se ha demostrado qué anticuerpos de grupos sanguíneos corresponden a estas clases.
La IgE interviene o es responsable de las reacciones de hipersensibilidad inmediata. Este proceso envuelve la
interacción con basófilos y mastocitos, conduciendo a la liberación de potentes aminas vasoactivas
(histamina y braquinina). La función de la IgD no está bien definida, aunque recientemente se ha encontrado
sola o conjuntamente con la IgM en la membrana del 75% de los linfocitosB.

3.4 Clasificación de los anticuerpos

Los anticuerpos se clasifican en dos grandes grupos: Naturales e Inmunes

Anticuerpos naturales

Se presentan sin necesidad de que haya una estimulación por antígenos de los eritrocitos. Los anticuerpos
regulares naturales se presentan en todos los individuos.

Anticuerpos Inmunes

Son todos irregulares y se presenta tras una estimulación de glóbulos rojos originados en embarazo,
parto, aborto o bien por transfusión de sangre.

Los anticuerpos naturales ocasionales y los inmunes integran el conjunto de

anticuerpos irregulares.

Una clasificación viene a cruzar la anterior, según que los anticuerpos tengan o no capacidad de reaccionar
contra antígenos presentes en los glóbulos rojos del mismo individuo. La mayoría de los anticuerpos
irregulares no tienen tal capacidad sino que están presentes en los de otro individuo. Se les llama
aloanticuerpos y pueden producir hemólisis de una unidad de sangre transfundida y EHRN.

Cuando un anticuerpo tiene especificidad para un antígeno presente en los eritrocitos del mismo individuo
se le llama autoanticuerpo. Producen hemólisis de los eritrocitos propios y también de los transfundidos.

Son anticuerpos completos aquellos que aglutinan a los eritrocitos en medio salino (IgM) y anticuerpos
incompletos aquellos que solo pueden sensibilizar a los eritrocitos sin llegar a la aglutinación.

Se denominan anticuerpos calientes los que reacciona mejor a una temperatura de 37ºC(IgG) y
anticuerpos fríos los que reacciona mejor a una temperatura de 4ºC.
3.5 Respuesta Inmunológica

O Respuesta Inmunológica Primaria

Cuando un individuo entra en contacto por primera vez con un antígeno eritrocitario, este es reconocido
como extraño en un proceso muy complejo. Por lo tanto la respuesta inmunológica es lenta. Por tal
antígeno se produce un anticuerpo específico que generalmente pertenece a la clase IgM.

O Respuesta Inmunológica Secundaria

Cuando un individuo está expuesto por segunda vez al mismo antígeno, su sistema inmunitario “recuerda” que
antes ha estado en contacto con este antígeno extraño y contesta rápidamente, produciendo abundante
cantidad de anticuerpo de tipo IgG, estos pueden ser evidenciados dentro de pocas horas, días o semanas.

Cuando un individuo haya producido un anticuerpo y se le suministran células positivas por el antígeno
correspondiente por medio de una transfusión o de un embarazo, las células transfundidas pueden ser
lisadas de la forma siguiente:

 Los acs pueden fijar complemento

 Pueden sensibilizar los eritrocitos. El SER reconoce los eritrocitos cubiertos por el anticuerpo
como anormales y los saca de circulación.
 En esta eliminación intervienen el bazo, hígado, corazón y los riñones determinando la reacción
transfusional.
En el embarazo los anticuerpos maternos pueden atravesar la placenta y sensibilizar los eritrocitos
fetales, determinando una destrucción de los mismos.
III. COMPLEMENTO

Fue descrito como un factor presente en el plasma necesario para lisis de anticuerpos pegados a células
tales como bacterias y eritrocitos. Una segunda función es mediar en la opsonización, proceso en el cual
las células son preparadas para la fagocitosis.

Una tercera función de las proteínas del

complemento, es la generación de fragmentos de
péptidos que regulan las características de la
respuesta inflamatoria e inmune. Una cuarta función
es que su deficiencia se encuentra relacionada con
enfermedades. La activación del sistema del
complemento resulta en una interacción en cascada
con las proteínas del mismo, permitiendo la
generación de productos que tiene importantes
actividades biológicas. Las principales actividades
biológicas del complemento son: opsonización,
inmuno- adherencia, quimiotaxis y actividad
anafilotóxica.

En el Banco de sangre el complemento es importante en dos áreas principales:

1. Algunos complejos antígeno-anticuerpo producen suficiente cantidad de complemento que se une a los
eritrocitos al completar la activación del ciclo produciendo hemólisis.
2. Los complejos antígeno-anticuerpo inician la unión del complemento en una forma que siempre
demuestra la presencia de tales complejos mediante el uso de técnicas serológicas y la prueba de
antiglobulina sérica, porque muchas proteínas del complemento son inestables y lábiles al calor,en las
pruebas de banco de sangre es necesario utilizar suero fresco, para que el complemento se encuentre
activo.

El complemento puede activarse por la vía clásica o por la vía alternativa. La vía clásica se activa por la
interacción antígeno-anticuerpo específica. Representa el amplificador primario de los efectos biológicos de
la inmunidad humoral. La vía alternativa amplifica las defensas no inmunitarias contra la infección
microbiana y otras alteraciones biológicas. Convencionalmente, los componentes individuales del
complemento se designan C1,C4,C2, etc.; los fragmentos escindidos de estos componentes se designan C4a,
C3D, etc. Y los componentes activados se designan mediante una línea horizontal sobre el número del
componente. Se utilizan letras mayúsculas para los componentes de la vía alternativa, por ejemplo factores
B y D.
IV. REACCION ANTIGENO-ANTICUERPO

La unión del anticuerpo con su antígeno específico depende de su estructura y cambios en la molécula.
Estas reacciones de antígeno-anticuerpo pueden desarrollarse in vivo o in vitro y son definidas como la
interacción físico-química entre antígenos y anticuerpos, siendo las bases del sistema inmunológico humano.

La reacción in vivo generalmente coincide con la invasión del organismo por antígenos extraños contra los
que reacciona por intermedio de los anticuerpos, como sucede en la reacción hemolítica transfusional o
mediante la transferencia pasiva de anticuerpos como es el caso de la enfermedad hemolítica del recién
nacido. En estados de auto inmunidad, la reacción in vivo puede causar enfermedades tales como la anemia
hemolítica autoinmune, la púrpura trombocitopénica autoinmune etc.

La reacción in vitro es de particular importancia porque ella permite que tanto los antígenos como los
anticuerpos puedan ser determinados y estudiados en el laboratorio del banco de sangre. Son ejemplos de
estas reacciones la precipitación, aglutinación y hemólisis que requiere la participación del complemento. La
aglutinación desde el punto de vista del banco de sangre es la forma más sencilla de demostrar la relación
entre antígenos y anticuerpos.

5.1 Principios generales que rigen la reacción Antígeno- Anticuerpo.

1. Especificidad, es decir, que el anticuerpo reacciona solamente con su determinante antigénico.

2. Reaccionan moléculas enteras, esto es, que no se produce intercambio de partes o fracciones,
ni se forma un nuevo producto.

3. La unión del antígeno con el anticuerpo es firme pero reversible, o sea que bajo condiciones
apropiadas tanto uno como el otro se pueden recuperar sin que aparentemente hayan
cambiado.

4. Es un fenómeno de superficie, que no altera la estructura primaria de las partes reaccionantes.

5. Las partes reaccionantes se combinan en proporciones variables, dependiendo de las

condiciones del experimento. Esta característica es la diferencia con la reacción química en la
cual, la proporción de los elementos es exacta.

6. El tiempo en que se produce la reacción es variable, a veces muy corto tomando menos de un
minuto, pero en otras circunstancias bien conocidas requiere de un tiempo mayor. (Linares)

La detección de reacciones antígeno anticuerpo eritrocitarias en el Banco de Sangre puede ser realizada
usando varias técnicas inmunológicas. Técnicas como la aglutinación, la precipitación y hemólisis son los
métodos cualitativos más comúnmente usados.
En las técnicas de grupos sanguíneos eritrocitarios las reacciones más importantes son las de aglutinación.
Los antígenos situados en la membrana del eritrocito reaccionan con los anticuerpos y el resultado de la
reacción es la formación de grumos de hematíes o aglutinados. Las determinaciones de antígenos
eritrocitarios se basan principalmente en la aglutinación de eritrocitos, aunque en ocasiones la unión
antígeno/ anticuerpo que actúa por la vía clásica del sistema de complemento puede ser detectada por una
hemólisis<<in vitro>>

1.2 AGLUTINACIÓN

Aglutinación es la agrupación de partículas que tiene antígenos en su superficie por parte de las moléculas
de los anticuerpos formando puentes entre los determinantes antigénicos de las células adyacentes. La
aglutinación es el objetivo final de la mayoría de las pruebas realizadas con los hematíes y los anticuerpos de
grupos sanguíneos: puede observarse mediante técnicas directas, como la prueba ABO, o utilizando
técnicas indirectas como la prueba de antiglobulina.

Basado en estudios y observaciones científicas, se ha establecido que el proceso de aglutinación ocurre en

dos etapas distintas y definidas.

El proceso de aglutinación depende de varios factores, y la manipulación de dichos factores constituyen las
bases para el desarrollo de los potenciadores. Estos aditivos disminuyen el tiempo de incubación y/o
intensifican la reactividad, aumentando a sí la capacidad detectora del sistema mediante la inducción de
cambios que afectan al anticuerpo mismo, la membrana molecular donde los antígenos residen, o ambos.
Algunos factores pueden ser manipulados para lograr cambios en las condiciones de la reacción que agilicen
o intensifiquen los resultados.

O Primera Etapa.

5.2 Sensibilización

La reacción entre el anticuerpo con el antígeno situado en la membrana del glóbulo rojo es reversible, es
decir se asocia o combina con su antígeno para formar complejos antígeno-anticuerpo, pero también se
disocia hasta alcanzar un equilibrio, entendiéndose por tal, el punto en el cual la cantidad de complejos
formados es igual a la cantidad disociada. Se ha establecido que la reacción entre el antígeno y el
anticuerpo obedece a la ley de acción de masas.

En esta etapa el anticuerpo identifica y se fija a los antígenos presentes. Esta fijación ocurre entre la región
variable de la molécula de inmunoglobulina (Fab) y los determinantes antigénicos de la membrana celular
del eritrocito, la cual es mantenida por enlaces químicos no-covalentes. A este punto, la aglutinación no es
visible todavía

La constante de equilibrio puede variar según las condiciones de reacción, por lo que es importante que
en el laboratorio del banco de sangre se diseñen tales condiciones de reacción con el objeto de alcanzar el
máximo de equilibrio, es decir la mayor formación de complejos antígeno anticuerpo.
5.3 Factores que afectan la aglutinación

O Temperatura de la reacción.

La mayoría de los anticuerpos de grupos sanguíneos presentan una capacidad reactiva dentro de una escala
restringida de temperatura. Por lo general, la mayoría de los anticuerpos contra grupos sanguíneos de
significancia clínica reaccionan mejor en un rango térmico específico. Por ejemplo las Inmunoglobulinas M
son más reactivas a temperaturas bajas (4-27ºC), mientras que las IgG reaccionan mejor a 37ºC. Tomando
en cuenta que un anticuerpo clínicamente significativo es aquel que abrevia la supervivencia in vivo del
glóbulo rojo, y que la mayoría de ellos son IgG, la incubación de la reacción a la temperatura es
extremadamente importante.

Algunos anticuerpos IgM de reactividad en frío pueden activar el complemento a temperaturas inferiores a
los 30ºC pero producen sólo un acortamiento mínimo de supervivencia de los hematíes incompatibles
transfundidos.

Aquellos anticuerpos que reaccionan in vitro a temperaturas inferiores a 37ºC, raramente son
considerados de importancia con la excepción de aquellos que fijan complemento (anti-P) en la fase fría, y
más tarde causan destrucción de los eritrocitosal elevar la temperatura del medio.

Los anticuerpos fríos pueden causar reacciones hemolíticas, particularmente en pacientes sometidos a
hipotermia; pero en cambio, frecuentemente interfieren en la determinación de grupos sanguíneos y en las
pruebas de compatibilidad.

Casi todas las personas normales poseen anticuerpos fríos irregulares que reacciona a 4 C, pero son de
bajo título y no tienen importancia clínica.

La manipulación de la temperatura puede ser una arma útil en el arsenal de identificación del banco de
sangre.

O Tiempo de incubación

La formación del complejo antígeno anticuerpo es un a reacción que requiere de cierto tiempo para que se
produzca. En este sentido es necesario un periodo de incubación, el cual es a menudo muy corto para la
mayoría de los anticuerpos de grupos sanguíneos. Estas variaciones tienen que ver principalmente con la
clase de inmunoglobulina del anticuerpo, la interacción con los determinantes antigénicos y la configuración
de la región Fab del anticuerpo. Los estudios de hematíes suspendidos en suero o solución salina han
demostrado que de la cantidad total de anticuerpo Rh finalmente fijado, aproximadamente un 25% lo hará
en los primeros 15 minutos y un75% durante la primera hora.

Generalmente, 30 minutos de incubación son suficientes para la fijación de la mayoría de anticuerpos

importantes y su posterior detección e identificación. En algunos casos el anticuerpo es sumamente débil y
la extensión del tiempo de incubación puede incrementar la sensibilidad del sistema. Reacciones entre el
anticuerpo Anti-A y hematíes A1 son rápidas, pero con los subgrupos débiles de A generalmente se
requieren períodos mas largos para alcanzar su equilibrio.
La adición de varios agentes potenciadores puede aumentar la cantidad de anticuerpo fijado durante los
primeros 15 minutos, y por lo tanto disminuir el tiempo de incubaci{on necesario para alcanzar el equilibrio.

O pH

El pH de la sangre varía entre 7,3 y 7,4, es decir, muy cerca de lo neutral. Durante esta etapa, y aunque no
se ha demostrado el nivel de acidez para la mayoría de los anticuerpos contra grupos sanguíneos de mayor
significado clínico, el pH de la solución debe mantenerse cerca del nivel fisiológico de 7.0. Pero en algunos
casos, como el ejemplo de muchos anti-M, la reacción se intensifica si se lleva a cabo a niveles más ácidos.
Hughes-Jones y col. Demostraron que la reactividad óptima para el anti-D es entre 6,5 y 7.0, presentando
muy pequeños cambios de reactividad entre 5,5 y 8,5. Casi todas las muestras de sangre que se procesan
en el banco de sangre tienen valores dentro de este rango; a{un en el plasma tomado en CPD el pH es de
6,9a 7,2, es decir, no mu ácido ni muy alcalino y las pruebas son satisfactorias.

O Concentración relativa del antígeno y del anticuerpo.

Bajo condiciones ideales, y en cantidades equivalentes, la unión antígeno –anticuerpo ocurre en proporciones
óptimas. Exceso de anticuerpos (pro-zona), o de antígenos (post-zona). Pueden causar falsos negativos.
Un incremento en la concentración de anticuerpo presente, tal como la elevación de la relación suero-
eritrocito, proporcionaría más inmunoglobulina para combinarse con determinantes antigénicas finitas y
consecuentemente podría incrementar la sensibilidad de la reacción. De forma contraria la dosis antigénica
de la superficie celular puede determinar el nivel de reactividad observado (efecto de dosis) si la disminución
ha sido determinada por herencia.

Zona de Zona de
exceso de exceso de
acs ags

Zona de
equivalencia
PROZONA POSTZONA
En la práctica es frecuente el fenómeno de prozona por exceso de antígeno, que coincide con el empleo de
suspensiones celulares muy concentradas, por lo que se insiste que esta sea ajustada a un 5% como
máximo. Concentraciones mayores generalmente conducen a reacciones muy débiles o negativas,
especialmente cuando el anticuerpo investigado se halla en baja concentración.

O Fuerza iónica del medio de reacción.

Es una de las condiciones fisicoquímicas que

influye notablemente la unión antígeno-
anticuerpo. Esta fuerza mide la intensidad del
campo eléctrico generado por la presencia de
iones en el medio de reacción, los cuales
determinan y modifican la magnitud de las fuerzas
electrostáticas producidas.

Los glóbulos rojos están sometidos a fuerzas

electrostáticas porque poseen
cargas eléctricas negativas en su superficie, primariamente asociadas con el contenido de ácido siálico de la
membrana y que impiden su agregación espontánea, permitiéndoles que se desplacen independientemente y
puedan cumplir su función de transporte de gases. Cuando se suspenden en una solución electrolítica, por
ejemplo NaCl, los cationes (Na+) son atraídos sobre las cargas negativas del glóbulo rojo, formando una capa
difusa o especie de nube iónica a su alrededor, que se desplaza con la célula como si formara parte de
ella. La parte externa de esta nube iónica es denominada superficie o plano de deslizamiento. La carga
eléctrica efectiva del glóbulo rojo denominada potencial Z es determinada en este plano y es responsable de
la repulsión electrostática entre una célula y otra. La capa de iones de Na disminuye la fuerza electrostática o
potencial z que mantiene los glóbulos rojos aislados, produciéndose un acercamiento entre ellos y por ende
acortándose la distancia que los separa, lo cual facilita la interacción de inmunoglobulinas o anticuerpos
cargados positivamente, con la superficie de la célula cargada negativamente.

En la rutina el medio iónico más usado para suspender los glóbulos rojos es la solución salina fisiológica
(0,90%).

Segunda Etapa.

5.4 Aglutinación

Una vez combinados antígenos y anticuerpo deben de permanecer unidos. Esta fase constituye la unión de los
glóbulos rojos sensibilizados con la formación de una estructura molecular en forma de red o enrejado, y la
subsiguiente visualización de la reacción de aglutinación. Esta red solidifica y estabiliza la reacción.
5.5 Factores que afectan la aglutinación

O Potencial zeta

Al finalizar la primera etapa de la

aglutinación los anticuerpos se han fijado
a los determinantes antigénicos presentes
en la membrana celular de los glóbulos
rojos, rindiendo un eritrocito sensibilizado.
A este punto, las propiedades físicas de la
solución de las células en suspensión y de
las moléculas de inmunoglobulina
presentes, toman primer plano.

Los eritrocitos poseen una carga eléctrica negativa sobre su superficie originado por la presencia de ácido
siálico, lo cual los hace repelerse dificultando así la interacción celular. Esta fuerza se conoce como Potencial
Z y debido a ella, los glóbulos rojos se mantienen como unidades individuales, no se agregan
espontáneamente y pueden circular y cumplir con su función de transportar gases.

Cuando los glóbulos rojos se suspenden en soluciones electrolíticas, por ejemplo solución salina fisiológica, la
carga eléctrica negativa atrae los iones Na+. La energía o fuerza de repulsión que existe entre ellos se reduce
y la distancia que los separa se acorta a un punto donde puede ser cubierta fácilmente por anticuerpos
IgM, pero noIgG.

Algunos autores han señalado que el potencial zeta es el más importante de los factores que afectan la
capacidad de los anticuerpos IgG para aglutinar los glóbulos rojos. La longitud de las moléculas de IgG
resulta muy corta para cubrir la distancia que existe entre dos glóbulos rojos adyacentes, bajo las
condiciones normales creadas por las fuerzas electrostáticas que los mantiene separados. Sin embargo,
dichos anticuerpos pueden algunas veces aglutinar los glóbulos rojos en un medio que contenga albúmina,
debido a que esta eleva la constante dieléctrica del medio de reacción, bajando a su vez el potencial Z y
permitiendo que los glóbulos rojos se acerquen lo suficiente para que se produzca a aglutinación. Las
enzimas proteolíticas, como la papaína, ficina, bromelina y tripsina, también favorecen la aglutinación de los
glóbulos rojos por anticuerpos IgG pero siguiendo un mecanismo diferente, como e que ellas alteran o
desdoblan el ácido siálico de la membrana del glóbulo rojo, reduciendo en esta forma el potencial Z.

Steane y Greenwalt apoyan la teoría del agua de hidratación. El agua que está fuertemente unida a las
superficies de los hematíes mantiene a estos separados en la solución formando alrededor una zona de
hidratación como burbujas de aire actuando como aislante.
O Densidad del antigeno (Número de sitios antigénicos en la membrana)

Se ha estimado el número de antígenos eritrocitarios sólo para algunos sistemas, entre ellos, ABO, Rh, Lewis,
Kell, Duffy. El mayor número de antígenos por célula corresponde al grupo A (aproximadamente 1 x 106) y el
menor para el Kell (2 x 103).
Investigaciones han demostrado que se requieren una mayor concentración de determinantes antigénicos en
la membrana eritrocitaria, para que pueda haber aglutinación directa en medio salino por anticuerpos del
tipo IgG en comparación con los del tipo IgM. Se han mencionado otros factores que pueden favorecer o
influir en la aglutinación. Entre ellos se citan:

El grado hasta donde el antígeno puede proyectarse sobre la membrana eritrocitaria.

La proximidad de los sitios antigénicos. Esta variable depende a su vez del número de puntos antigénicos
en cada célula, de su distribución normal en forma de grumos o zonas de alta concentración del antígeno y
finalmente de su capacidad para movilizarse y formar grumos después de combinarse con el anticuerpo.

O Características del anticuerpo

El tamaño de la molécula y el tipo de inmunoglobulina presente es un factor influyente en la interacción

antígeno – anticuerpo. Una reacción que comprenda la IgM, generalmente podrá causar aglutinación en medio
salino sin mayores problemas, mientras que la molécula de IgG tendrá varios requerimientos para poder
inducir la reacción. La molécula de IgM aglutina eritrocitos con una eficiencia de 750 veces más que la de IgG,
principalmente a su tamaño y diseño físico los cuales permiten la cobertura de una mayor distancia entre
células sensibilizadas. Así mismo, la molécula de IgM consta con 10 sitios de combinación (en vez de 2
en la de IgG) por lo quepuede fijarse a varios eritrocitos a la vez.

O Centrifugación

La centrifugación facilita el acercamiento de los glóbulos rojos a fin de que los anticuerpos hagan el trabajo
necesario entre los sitios antigénicos y se produzca la aglutinación. Sin embargo, la centrifugación debe ser
la adecuada para obtener un botón de células aglutinadas en el fondo del tubo y un sobrenadante claro.
El exceso de centrifugación conduce a un fuerte empaquetamiento de los hematíes lo cual dificulta su
suspensión y por otro lado puede conducir a lecturas falsas positivas.

Existen dos modelos de centrífugas de uso común: uno tiene la velocidad fija (3200 – 3600 rpm), pero el
tiempo es variable; en el segundo modelo, tanto la velocidad como el tiempo se pueden variar. Se
recomienda respectivamente, para los dos modelos aquí señalados las siguientes velocidades y tiempos:
3400 rpm por 15 seg.
1000 rpm por 1 min.

La centrifugación puede ser afectada por diversas causas:

 El mecanismo automático del reloj puede estar descontrolado.

 El tiempo de aceleración puede variar de una centrífuga a otra, dependiendo del
 peso del cabezal.
  La viscosidad del medio afecta la sedimentación de la suspensión celular; por
 ejemplo, las células suspendidas en albúminas al 30% requieren ser centrifugadas a mayor
velocidad o por un tiempo más largo que las suspendidas en salina.

6. Medios de reacción

El fenómeno de aglutinación requiere de medios adecuados para que se [Link] más usados son:

 Solución salina fisiológica

 Albúmina bovina
 Enzimas proteolíticas
 Solución salina de baja fuerza iónica (LISS)

6.1 Solución salina fisiológica

Tiene una concentración de NaCl al 0.9%. Los anticuerpos que aglutinan en salina son de la clase IgM y
muchos de ellos reaccionan mejor a temperaturas menores de 22 grados.

Los anticuerpos que aglutina en salina son generalmente de la clase IgM y muchos de ellos reaccionan mejor
a temperaturas menores de 22ºC. Este tipo de anticuerpos no tiene importancia clínica, pero algunos pueden
reaccionar a temperatura ambiente y también a 37ºC. Cuando un anticuerpo se comporta en esa forma, es
considerado de importancia clínica.

6.2 Albúmina bovina

Se emplea como medio proteico destinado a potenciar determinados anticuerpos de grupo sanguíneo. La
materia prima es la albúmina obtenida por fraccionamiento del plasma bovino, fraccionamiento.

En 1945 Diamond y Denton introdujeron las soluciones de albúmina bovina como un medio altamente efectivo
para potenciar la aglutinación de los glóbulos rojos Rh positivos, por su correspondiente anticuerpo. En 1953,
Grove – Rasmussen y Souter demostraron la importancia de agregar albúmina a la prueba cruzada. Hoy, la
albúmina es ampliamente usada en la metodología del banco de sangre como un medio para potenciar la
reacción de un gran número de anticuerpos de la clase IgG. Por esta razón se usa en la investigación,
identificación y titulación de anticuerpos así como en la prueba cruzada. En estos procedimientos la
albúmina actúa en dos vías: a) potenciando la aglutinación de los glóbulos rojos por algunos anticuerpos,
tales como el Rh, y b) aumentando la captación de anticuerpos por los glóbulos rojos, incrementando en esta
forma la sensibilidad de la prueba de antiglobulina humana.

Se ha sugerido que la albúmina actúa aumentando la constante dieléctrica del medio de reacción, por lo
tanto, causa una reducción del potencial Z permitiendo el acercamiento de los glóbulos y su aglutinación por
los anticuerpos IgG.
Este medio de alta proteína se puede obtener comercialmente en concentraciones del 22 – 30 %
generalmente como soluciones con buffer de baja fuerza iónica. La albúmina promueve la captación de
anticuerpos IgG por medio de la reducción de la carga eléctrica negativa en la membrana eritrocítica, la
disminución del potencial zeta y/o afectando el agua de hidratación.

El uso de albúmina en el sistema de detección intensifica la reactividad de anticuerpos de la clase IgG en

forma indiscriminada causando así efecto deseados y adversos al mismo tiempo. Por un lado la albúmina
aumenta la capacidad detectora del sistema; por otro lado, la captación de anticuerpos fríos
insignificantes puede causar retrasos yla necesidad de identificar un anticuerpo sin significado.

6.3 Enzimas proteolíticas

En 1947, Morton y colaboradores encontraron que los extractos enzimáticos de cultivos de Vibrio cholerae, y
preparaciones de tripsina de estómago de cerdo hacían los glóbulos rojos más susceptibles de ser
aglutinados por anticuerpos IgG. Posteriormente, se ha encontrado un efecto similar con otras enzimas,
tales como la papaína extraída de la papaya, la ficina extraída del higo y la bromelina extraída de la piña.

Se ha sugerido que debido a su efecto proteolítico, las enzimas alteran la membrana del glóbulo rojo
removiendo péptidos que contienen ácido siálico. La liberación del ácido siálico conduce a la pérdida de
cargas negativas del glóbulo rojo y consecutivamente, disminución del potencial Z; ello permite que
aquellos anticuerpos que no aglutinan los glóbulos rojos suspendidos en salina, puedan aglutinarlos
después del tratamiento con enzimas.

Las reacciones de los antígenos de ciertos grupos sanguíneos son selectivamente intensificados o suprimidos
por el tratamiento de las células con enzimas proteolíticas. Esta actividad enzimática no es entendida
completamente y varias teorías han sido desarrolladas para tratar de explicar su origen. Una de las
teorías explica que estos catalizadores reducen la carga eléctrica neta en la superficie del glóbulo rojo por
medio de la liberación de ácido siálico, reduciendo así el potencial zeta y al mismo tiempo la distancia
entre los eritrocitos.

Otra idea indica que el tratamiento enzimático remueve glicoproteínas hidrofílicas de la membrana celular,
causando que la membrana se haga más hidrófoba. Esta destrucción de proteínas provoca el despeje de la
atmósfera antigénica que rodea al eritrocito facilitando la interacción entre anticuerpos y antígenos en la
superficie celular. Este hecho explica la intensificación de la reactividad de anticuerpos en los sistemas
Rh, Kidd, P, I y Lewis.

Asimismo, y tomando en cuenta que varios antígenos están formados por glicoproteínas, la remoción de las
mismas eliminaría la reactividad antigénica correspondiente, afectando así la detección de ciertos
anticuerpos. El tratamiento enzimático del glóbulo rojo generalmente causa la depresión o destrucción de
antígenos en los sistemas Duffy, MNS y Xg, eliminando la reactividad de esos anticuerpos.
6.4 Solución salina de baja fuerza iónica (LISS)

Hughes – Johns y colaboradores en 1964, demostraron la capacidad de la solución de fuerza iónica baja
para incrementar tanto la rapidez de asociación del anticuerpo con su respectivo antígeno, como la
cantidad de anticuerpo fijado a la célula.

El mecanismo mediante el cual dicha solución acelera y potencia la reacción del antígeno anticuerpo,
posiblemente sea debido a que ocasiona una reducción de la barrera electrostática que rodea al glóbulo.

Löw y Messeter en 1974 introdujeron esta técnica en la rutina del banco de sangre. Demostraron que
sustituyendo la solución salina fisiológica aceleraba la velocidad de asociación antígeno anticuerpo en tal
forma que el periodo de incubación podía ser reducido hasta 5 minutos, sin pérdida de sensibilidad para la
detección de anticuerpos por la técnica de antiglobulina humana. Esto constituye una ventaja sobre el uso de
albúmina la cual requiere un período de incubación de 30 – 60 minutos. Se han reportado algunos casos en
los que la reactividad de muestras de anti K ha sidodeprimida, en sistemas con aditivo LISS.

6.5 Polybrene®

Polybrene® o bromuro de hexamiditrina, es un aditivo macromolecular que generalmente se usa en

conjunción con la solución salina de baja fuerza iónica (LISS) en un medio acidificado, y puede ser usado
para intensificar la reacción y disminuir el tiempo de incubación. El Polybrene® puede detectar
incompatibilidades ABO, además de anticuerpos IgG débiles, pero se han reportado problemas en su uso
incluyendo: reacciones positivas falsas debido a la fijación de componentes del complemento(AGH
poliespecífica), la detección disminuida de anticuerpos en el sistema Kell y la detección incrementada de
anticuerpos fríos insignificantes. Considerado más efectivo en detección de anticuerpos débiles que la
albúmina o el LISS.

6.6 Polietilenglicol(PEG)

Este aditivo es otra macromolécula usada para aumentar la captación de anticuerpos, con una reducción
significativa en el tiempo de incubación. El PEG produce reacciones muy específicas debido a su capacidad
hidrófoba. Simplemente el PEG remueve el agua del sistema de detección, concentra los anticuerpos, induce
la captación de inmunoglobulinas e intensifica la fuerza de la reacción.

Para evitar reacciones positivas falsas se debe utilizar la variante anti-IgG de antiglobulina humana, durante
las pruebas de Coombs’s utilizando PEG, También es importante recordar que anticuerpos de la clase IgM,
tales como ABO, Lewis, M y algunos casos de Kell, presentan reactividad deprimida o erradicada en sistemas
de PEG. Por otra parte, la relación entre el volumen de PEG añadido al sistema y la concentración de
proteínas presentes puede causar la precipitación del anticuerpo, si la concentración de Polietilenglicol es
muy elevada. Considerado más efectivo en la detección de anticuerpos débiles que la albúmina o el LISS.
BIBLIOGRAFIA

 Manual Técnico AABB, 10 a. Edición

 Principios de Inmunohematología y Transfusión, Jesús Linares
 Simposio de Inmunohematología, Houston, Texas, año 2000