ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES ENTRE LA VICILINA Y

LAS LECTINAS Con A y CEL-II DE LA SEMILLA DE Canavalia ensiformis

PATRICIA MARTINEZ MUÑOZ

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá, Colombia

2009
 ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES ENTRE LA VICILINA Y

LAS LECTINAS Con A y CEL-II DE LA SEMILLA DE Canavalia ensiformis

PATRICIA MARTINEZ MUÑOZ

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de: Doctora en
Ciencias-Química

Directora:

M.Sc., PhD. Marta Lucía Pabón

Línea de investigación: Bioquímica de proteínas

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá, Colombia

2009
 AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Nacional de Colombia, a la Facultad de Ciencias y al

Departamento de Química, por brindarme la oportunidad de realizar el
doctorado, permitiéndome de esta forma fortalecer mi formación en el campo
de la investigación, crecer como docente y cómo persona.

Al Doctor Gerardo Pérez, por permitirme trabajar en su laboratorio,

facilitándome espacio y reactivos para el desarrollo del trabajo.

A la Dra. Marta Lucía Pabón, por asumir la dirección del trabajo y por su
orientación y apoyo.

A los Doctores Fernando Acevedo y Wilson Mejía, por su colaboración para el

análisis de las muestras por Espectrometría de masas.

Al Doctor Leopold Ilag, del Laboratorio Arrhenius, del Departamento de

Química, de la Universidad de Estocolmo, por el análisis de las muestras por
MALDI-TOF-PMF.

A la Doctora Carmen María Romero, por su invaluable gestión y orientación.

Al Doctor Luís Blanco, por su orientación y valiosos consejos.

Al Doctor Edgar Daza, por su diligente labor.

En forma muy especial a Germán, mi esposo, por su apoyo incondicional,

estímulo y comprensión permanente.

A mis hijos Lina Paola y Germán Andrés, por el tiempo concedido, su

solidaridad y comprensión.

A Chela, mi hermano Luis Roberto y a mis compañeras y amigas,

especialmente Luz Mary, Sixta Tulia, María Inés y Piedad, por su apoyo e
invaluables consejos.

A mis padres por su constante voz de aliento.

Al Dr. Augusto Rivera, por su orientación y apoyo.

Al Dr. Luis Enrique Cuca, por su apoyo permanente.

A la Dra. Myriam Sánchez de Gómez, por facilitarme el uso de los equipos de

su laboratorio.

A Vanessa Gómez por su especial colaboración.

A Mónica Ávila por su cooperación.

A Diego Gómez y Nelson Arenas, por su asesoría y apoyo en el área de
sistemas.

A quienes durante el camino me brindaron su apoyo en momentos cruciales:

Dr. Oscar Osorno.

Dra. Elizabeth López.
Dr. Enrique Forero.
Dra. Luz Marina Melgarejo.
 RESUMEN

Las lectinas de las leguminosas son proteínas que han llamado mucho la
atención debido a la diversidad de funciones que exhiben “in vitro”. Se han
propuesto varias hipótesis concernientes a su función biológica, pero la
evidencia experimental que apoya los diferentes papeles propuestos no es
suficiente y por lo tanto su función permanece aún sin establecer.
En las semillas maduras de las leguminosas tanto las lectinas como las
proteínas de reserva se encuentran depositadas en estructuras vacuolares
características denominadas cuerpos proteicos. Sin embargo, es muy poco lo
que se sabe acerca de la forma cómo están organizadas las proteínas de
reserva dentro del cuerpo proteico, a pesar de que esta organización podría ser
importante para asegurar el uso eficiente del espacio de almacenamiento y
facilitar la utilización de las proteínas de reserva durante la germinación.
Con el fin de contribuir al conocimiento del papel fisiológico de las lectinas y al
de los mecanismos moleculares involucrados en el almacenamiento de estas
y las proteínas de reserva en el mismo organelo subcelular de las semillas de
leguminosas, en este trabajo se estudiaron las interacciones lectina-proteína de
reserva utilizando como modelo la proteína de reserva más abundante de la
semilla de Canavalia ensiformis (vicilina) y las lectinas Con A y CEL-II aisladas
y purificadas a partir de la misma semilla.
El estudio de interacción Con A-vicilina se realizó por los métodos de Enzyme
Linked Lectinosorbent Assay (ELLSA), Cromatografía de Afinidad, Direct Over
Transmembrane Blotting (DOT-BLOT) y Western Ligand Blotting (WLB).Los
resultados muestran, por primera vez, evidencia de la presencia de residuos
glicosídicos en la vicilina de Canavalia ensiformis y la participación de dichos
residuos en la interacción de la vicilina con la lectina Con A, además de la
participación de fuerzas hidrofóbicas en la interacción entre las dos proteínas.
Adicionalmente, los resultados sugieren que las interacciones hidrofóbicas y el
reconocimiento Con A- glicósido ocurren en forma cooperativa.
La desaparición de la interacción al desnaturalizar o deglicosilar la vicilina
indican que la estructura nativa de la vicilina y su residuo glicosídico son
esenciales para la interacción.
Los resultados obtenidos permiten postular la posible participación de la Con A
en el proceso de deposición de la vicilina en la semilla de Canavalia
ensiformis, mediante la participación de fuerzas hidrofóbicas proteína-proteína
además del reconocimiento del residuo glicosídico de la vicilina por parte de la
lectina, constituyendo esto un importante papel fisiológico para la lectina y una
posible explicación de la razón por la cual las lectinas y las proteínas de
reserva se encuentran en el mismo organelo subcelular en las semillas de
leguminosas.
La interacción CEL-II-vicilina se evalúo por los métodos de ELLSA y DOT-
BLOT. Los resultados obtenidos muestran una baja interacción entre dichas
proteínas y sugieren que probablemente la lectina CEL-II, a diferencia de la
Con A, no participa en el proceso de deposición de la vicilina en Canavalia
ensiformis.

Palabras clave: Canavalia ensiformis; Concanavalina A; vicilina; leguminosas;

lectinas.
 ABSTRACT

The legume lectins are proteins that have attracted a lot of attention they exhibit
many functions in vitro. Several hypotheses concerning their functional role
have been proposed, but experimental evidence supporting the different roles
proposed is not enough and therefore their function remains unestablished as
yet.
In the mature legume seeds both lectins as storage proteins are deposited in
characteristic vacuolar structures called protein bodies. However, very little is
known about the way storage proteins are organized within the protein body,
although this organization may be important to ensure efficient use of storage
space and facilitate the use of storage proteins during germination.
To contribute to knowledge regarding the physiological role of lectins and
molecular mechanisms involved in their packaging within the same subcellular
organelle as storage proteins in leguminosae seeds, the lectin- storage protein
interactions were studied in this work using a model involving the most
abundant storage protein from the seeds of Canavalia ensiformis (vicilin) and
Con A and CEL-II lectins isolated and purified from the same seed.
Con A-vicilin Interactions were studied by using Enzyme Linked Lectinosorbent
Assay (ELLSA), Affinity Chromatography, Direct Over Transmembrane Blotting
(DOT-BLOT) and Western Ligand Blotting (WLB).The results presented here,
provide for the first time, evidence of the presence of glycoside moieties in
Canavalia. ensiformis vicilin and the involvement of such moieties in the
molecular interactions between vicilin and Con A. The involvement of
hydrophobic forces in the interactions between the two proteins was also
determined. The results suggests that hydrophobic interactions and Con A
glycoside recognition occur in cooperative form.
Disappearance of the interaction upon vicilin denaturation or deglycosilation
indicates that both vicilin’s native structure and glycoside moiety are essential
for the interaction.

The results allow to postulate a possible involvement of Con A in vicilin’s

deposition process in Canavalia ensiformis seeds, by means of hydrophobic
protein-protein interactions and lectin recognition of vicilin’s glycoside moiety,
this constituting an important physiological role for the lectin and a possible
explanation to the reason why both lectins and storage proteins are found within
the same subcellular organelle in leguminosae seeds.
CELL-II-vicilin interactions were studied by using ELLSA and DOT-BLOT
methods .The results show a low interaction between these proteins and
suggest that probably the lectin CEL-II, unlike Con A, does not participate in the
deposition process in Canavalia ensiformis vicilin.

Key words: Canavalia ensiformis; Concanavalin A; vicilin; leguminosae; lectin.

 TABLA DE CONTENIDO

página

1. INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN 1

2. OBJETIVOS 3

3. ESTADO ACTUAL DEL TEMA 3

3.1 LECTINAS 3

3.1.1 LECTINAS EN Canavalia ensiformis 9

3.2 PROTEÍNAS DE ALMACENAMIENTO 11

3.2.1 PROTEÍNAS DE ALMACENAMIENTO EN Canavalia ensiformis 14

3.3 INTERACCIONES LECTINA-PROTEÍNA DE ALMACENAMIENTO 17

3.4 PROTEÍNAS EN LA SEMILLA DE Canavalia ensiformis E INTERACCIONES

DE ALGUNAS DE ELLAS CON LA Con A 20

4. MATERIALES Y MÉTODOS 23

4.1 MATERIAL VEGETAL 23

4.2 EXTRACCION Y PURIFICACIÓN DE LA Con A 23

4.3 BIOTINILACIÓN DE LA Con A 24

4.4 EXTRACCIÓN DE VICILINA 25

4.5 ANÁLISIS POR MALDI-TOF-PMF 26

4.6 PURIFICACION DE VICILINA 27

4.6.1 CROMATOGRAFÍA EN SEPHADEX G-75 27

4.6.2 CROMATOGRAFÍA EN DEAE SEPHADEX A-50 27

4.6.3 CROMATOGAFIA EN DEAE SEPHADEX A-50 CON LEUPEPTINA 27

4.6.4 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD EN Con A SEPHAROSA 4B 28

4.7 ELECTROFORESIS 28

4.8 DETERMINACIÓN DE α-MANOSIDASA EN LA VICILINA 29

4.9 DETECCIÓN DE CARBOHIDRATOS EN LA VICILINA 29

4.10 DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE CARBOHIDRATOS EN LA VICILINA 30

4.11 DEGLICOSILACIÓN ENZIMÁTICA DE LA VICILINA 30

4.12 AISLAMIENTO DE LOS FRAGMENTOS DE HIDRÓLISIS ASOCIADOS A LA VICILINA 31

4.13 ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN ENTRE LA VICILINA Y LA Con A 31

4.13.1 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD EN Con A SEPHAROSA 4B 31

4.13.2 ELLSA 32

4.13.2.1 INTERACCIÓN Con A-VICILINA 32

4.13.2.2 INTERACCIÓN DE LOS FRAGMENTOS DE PROTEÓLISIS DE LA VICILINA CON

LA Con A 33

4.13.3 DOT-BLOT 33

4.13.4 WESTERN LIGAND BLOTTING (WLB) 34

4.14 EFECTO DE LA DEGLICOSILACIÓN DE LA VICILINA Y LA PREINCUBACIÓN DE

Con A CON METIL α-D-MANÓSIDO SOBRE LA INTERACCIÓN 35

4.15 EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA CEL-II 36

4.16 BIOTINILACIÓN DE LA CEL-II 36

4.17 ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN ENTRE LA VICILINA Y LA CEL-II 37

4.17.1 ELLSA 37

4.17.2 DOT-BLOT 37

4.17.2.1 ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN POR DOT-BLOT EMPLEANDO BSA COMO

BLOQUEADOR 37

4.17.2.2 ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN POR DOT-BLOT EMPLEANDO TWEEN 20

COMO BLOQUEADOR 38

4.17.3 ESTUDIO DE LA INTERFERENCIA DE LA BSA EN LA MEDIDA DE LA INTERACCIÓN

DE LA VICILINA CON LA CEL-II 38

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 39

5.1 EXTRACCIÓN, PURIFICACIÓN Y BIOTINILACIÓN DE Con A 39

5.2 EXTRACCIÓN DE VICILINA 41

5.3 PURIFICACIÓN DE LA VICILINA 45

5.4 DETECCIÓN DE CARBOHIDRATOS EN LA VICILINA 54

5.5 DEGLICOSILACIÓN ENZIMÁTICA DE LA VICILINA 55

5.6 AISLAMIENTO DE LOS FRAGMENTOS DE PROTEÓLISIS ASOCIADOS A LA VICILINA 57

5.7 ESTUDO DE LA INTERACCIÓN ENTRE LA VICILNA Y LA Con A 59

5.7.1 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD 59

5.7.2 ELLSA 60
5.7.2.1 INTERACCIÓN Con A-VICILINA 60

5.7.2.2 INTERACCIÓN DE LOS FRAGMENTOS DE PROTEÓLISIS DE LA VICIINA

CON LA Con A 61

5.7.3 DOT-BLOT 62

5.7.4 WESTERN LIGAND BLOTTING 63

5.7.5 EFECTO DE LA DEGLICOSILACIÓN DE LA VICILINA Y LA PREINCUBACIÓN DE LA

LECTINA CON METIL α-D MANOPIRANÓSIDO 68

5.8 EXTRACCIÓN, PURIFICACIÓN Y BIOTINILACIÓN DE LA CEL-II 70

5.9 ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN ENTRE LA VICILINA Y LA CEL-II 74

5.9.1 ELLSA 74

5.9.2 DOT-BLOT 75

5.9.2.1 DOT-BLOT EMPLEANDO BSA COMO BLOQUEADOR 75

5.9.2.2 EFECTO DEL TWEEN 20 COMO AGENTE BLOQUEADOR 77

5.9.2.3 DOT-BLOT EMPLEANDO TWEEN 20 COMO BLOQUEADOR 78

5.9.3 ESTUDIO DE LA INTERFERENCIA DE LA BSA EN LA MEDIDA DE LA INTERACCIÓN

CEL-II-VICILINA POR EL MÉTODO DE ELLSA 79

6. CONCLUSIONES 82

7. PERSPECTIVAS 84

8. BIBLIOGRAFÍA 86
 INDICE DE FIGURAS

página

FIGURA 1 ELEMENTOS DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE LA SUBUNIDAD

DE LA GLOBULINA 7S DE Canavalia ensiformis. 15

FIGURA 2 INTERFASE ENTRE LOS DOS DOMINIOS DE LA SUBUNIDAD DE LA

GLOBULINA 7S DE Canavalia ensiformis. 16

FIGURA 3 DIAGRAMA ESQUEMÁTICO GENERADO POR COMPUTADOR DEL

TRÍMERO DE LA GLOBULINA 7S DE Canavalia ensiformis. 16

FIGURA 4 CROMATOGRAFÍA EN SEPHACRYL S-500 DE Canavalia ensiformis.

FRACCIÓN 50-70 % SULFATO DE AMONIO. 39

FIGURA 5 PAGE-SDS: PICO 2 ELUÍDO DE LA COLUMNA DE SEPHACRYL S-500.

(TINCIÓN: AZUL DE COOMASSIE R 250). 40

FIGURA 6 PAGE-SDS: PICO 2 ELUÍDO DE LA COLUMNA DE SEPHACRYL S-500.

(TINCIÓN: PLATA). 40

FIGURA 7 MARCACIÓN DE LA Con A CON BIOTINA. 41

FIGURA 8 PAGE-SDS: EXTRACCIÓN DE VICILINA. 42

FIGURA 9 PAGE-SDS: EXTRACCIÓN DE VICILINA. 43

FIGURA 10 PAGE-SDS: EFECTO DEL MERCAPTO ETANOL (ME) SOBRE LA FRACCION

DE VICILINA. 44
FIGURA 11 CROMATOGRAFÍA DE LA FRACCIÓN CRUDA DE VICILINA EN SEPHADEX

G-75. 45

FIGURA 12 PAGE-SDS: PICOS ELUIDOS DE LA COLUMNA DE SEPHADEX G-75. 46

FIGURA 13 CROMATOGRAFÍA DE LA FRACCIÓN CRUDA DE VICILINA EN DEAE

SEPHADEX A-50 SIN LEUPEPTINA. 48

FIGURA 14 CROMATOGRAFIA DE LA FRACCION CRUDA DE VICILINA EN DEAE

SEPHADEX A-50 CON LEUPEPTINA 10 µM. 48

FIGURA 15 PAGE-SDS: PICOS ELUIDOS DE LAS COLUMNAS DE DEAE SEPHADEX A-50. 49

FIGURA 16 CROMATOGRAFÍA EN Con A SEPHAROSA 4B DEL PICO 1 DE FIG.14. 50

FIGURA 17 PAGE-SDS: PICO 2 ELUÍDO DE LA COLUMNA DE Con A SEPHAROSA

4B (FIG.16). 51

FIGURA 18 PAGE-SDS: PICO 2 ELUIDO DE LA COLUMNA DE Con A SEPHAROSA

4B (2.15-80 µg). 51

FIGURA 19 ACTIVIDAD DE α-MANOSIDASA EN LA FRACCIÓN PURA DE VICILINA. 53

FIGURA 20 DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE CARBOHIDRATOS EN LA

FRACCIÓN PURA DE VICILINA. 54

FIGURA 21 DEGLICOSILACIÓN ENZIMATICA DE LA FRACCION PURA DE VICILINA. 56

FIGURA 22 CROMATOGRAFÍA EN Con A SEPHAROSA 4B DEL PICO 1 DE FIG. 11. 58

FIGURA 23 PAGE-SDS: PICO 2 ELUIDO DE LA COLUMNA DE Con A SEPHAROSA

4B (FIG.22). 58

FIGURA 24 PAGE-SDS: PICO 1 ELUIDO DE LA COLUMNA DE Con A SEPHAROSA

4B (FIG.22). 59

FIGURA 25 INTERACCION Con A –VICILINA (ELLSA). 60

FIGURA 26 INTERACCION Con A-VICILINA Y Con A-FRAGMENTOS DE PROTEÓLISIS

(ELLSA). 62

FIGURA 27 DOT-BLOT Con A-VICILINA. DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE INCUBACION. 63

FIGURA 28 DOT-BLOT Con A-VICILINA (TIEMPO DE INCUBACION 24 HORAS). 63

FIGURA 29 DETERMINACION DEL TIEMPO DE TRANSFERENCIA DE LA FRACCION PURA

DE VICILINA A MEMBRANAS DE NITROCELULOSA (10-30 MINUTOS). 64

FIGURA 30 DETERMINACION DEL TIEMPO DE TRANSFERENCIA DE LA FRACCION PURA

DE VICILINA. GELES TRANSFERIDOS (10-30 MINUTOS). 64

FIGURA 31 DETERMINACION DEL TIEMPO DE TRANSFERENCIA DE LA FRACCION PURA

DE VICILINA A MEMBRANAS DE NITROCELULOSA (22-28 MINUTOS). 65

FIGURA 32 DETERMINACION DEL TIEMPO DE TRANSFERENCIA DE LA FRACCION PURA

DE VICILINA. GELES TRANSFERIDOS (22-28 MINUTOS). 66

FIGURA 33 WESTERN LIGAND BLOTTING Con A-VICILINA. 67

FIGURA 34 INTERACCION Con A-VICILINA. EFECTO DE LA DEGLICOSILACION DE LA

VICILINA Y LA PREINCUBACION DE LA LECTINA CON α-D-Me-Man

(ELLSA). 69

FIGURA 35 CROMATOGRAFIA EN SEPHACRYL S-200 DE Canavalia ensiformis.

FRACCIÓN 50-70 % SULFATO DE AMONIO. 71

FIGURA 36 PAGE-SDS: PICO 4 ELUIDO DE LA COLUMNA DE SEPHACRYL S-200. 71

FIGURA 37 CROMATOGRAFIA EN FENIL SEPHAROSA DEL PICO 3 DE FIG.35. 72

FIGURA 38 PAGE-SDS: PICO ELUIDO DE LA COLUMNA DE FENIL SEPHAROSA

(TINCION: AZUL DE COOMASSIE). 73

FIGURA 39 PAGE-SDS: PICO ELUIDO DE LA COLUMNA DE FENIL SEPHAROSA

(TINCION: PLATA). 73

FIGURA 40 MARCACION DE LA CEL-II CON BIOTINA. 74

FIGURA 41 INTERACCION CEL-II-VICILINA (ELLSA). 75

FIGURA 42 DOT-BLOT CEL-II-VICILINA EMLPEANDO BSA COMO BLOQUEADOR. 76

FIGURA 43 CONTROL DE LA INTERFERENCIA DE LA BSA EN LA INTERACCION

CEL-II-VICILINA POR DOT-BLOT. 77

FIGURA 44 EFECTO BLOQUEADOR DEL TWEEN 20 (2% V/V). 78

FIGURA 45 DOT-BLOT CEL-II-VICILINA EMPLEANDO TWEN 20 COMO BLOQUEADOR. 79

FIGURA 46 INTERFERENCIA DE LA BSA EN LA MEDIDA DE LA INTERACCION CEL-II

VICILINA (ELLSA). 80

FIGURA 47 INTERACCION CEL-II-VICILINA Y Con A-VICILINA (ELLSA). 81

 INDICE DE ANEXOS

ANEXO 1. FUNCIONALIDAD BIOLÓGICA DE LAS LECTINAS Con A Y CEL-II.

ANEXO 2. CONCENTRACIÓN, EFECTIVIDAD DE LA MARCACIÓN Y FUNCIONALIDAD

BIOLÓGICA DE LAS LECTINAS MARCADAS CON BIOTINA.

ANEXO 2A RESULTADOS DE LA BÚSQUEDA POR MASCOT PARA LA IDENTIFICACIÓN

DE LAS PROTEÍNAS CORRESPONDIENTES A LAS BANDAS DE 50, 25 Y 24

kDa.

ANEXO 3. ACTIVIDAD DE α-MANOSIDASA EN LA FRACCIÓN PURA DE VICILINA.

ANEXO 4. DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE CARBOHIDRATOS EN LA VICILINA

DE Canavalia ensiformis. MÉTODO DE DUBOIS A ESCALA MICRO.

ANEXO 5. INTERACCIÓN Con A-VICILINA (MÉTODO DE ELLSA).

ANEXO 6. INTERACCIÓN Con A-VICILINA Y Con A FRAGMENTOS DE PROTEÓLISIS

(MÉTODO DE ELLSA).

ANEXO 7. EFECTO DE LA DEGLICOSILACIÓN DE LA VICILINA Y LA PREINCUBACIÓN

DE LA LECTINA CON α-D-ME-MAN (MÉTODO DE ELLSA).

ANEXO 8. INTERACCIÓN CEL-II-VICILINA (MÉTODO DE ELLSA).

ANEXO 9. INTERFERENCIA DE LA BSA EN LA MEDIDA DE LA INTERACCIÓN CEL-II-

VICILINA (MÉTODO DE ELLSA).

ANEXO 10. INTERACCIÓN CEL-II-VICILINA Y Con A-VICILINA (MÉTODO DE ELLSA).

ANEXO 11. PROPORCIÓN CEL-II-VICILINA EN EL ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN

(MÉTODO DE ELLSA).
 ABREVIATURAS

ABTS 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-ácido sulfónico)

ACN Acetonitrilo
ATPasa Adenosin trifosfatasa
Biotina-x-NHS Biotina-x-N-Hidroxisuccinimida
BrCN Bromuro de cianógeno
BSA Albúmina Sérica Bovina
CEL-II Lectina II de Canavalia ensiformis
Complete TM Coctel inhibidor de proteasas
Con A Concanavalina A
Con B Concanavalina B
DAB Diamino benzamidina
DEAE Dietilaminoetil
DLL-II Lectina II de Dioclea lemanni
cDNA Ácido desoxirribonucleico cromosómico
DTT Ditiotreitol
DOT-BLOT Direct over transmembrane-BLOT
(Ensayo directo sobre membrana de transferencia)

EDTA Ácido etilén diamino tetraacético

EGTA Etilén glicol-bis (2-aminoetileter)-N,N,N’,N’-ácido tetraacético
ELLSA Enzyme Lynked Lectino Sorbent Assay
FMN Favin Mononucleótido
Glc Glucosa
kDa kilodaltons
MALDI-TOF Ionización desorción por laser asistida por una matriz -tiempo
de vuelo.
(Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight)

Me α-D-Man Metil α-D-manopiranósido

α-D-Me-Man Metil α-D-manopiranósido
MeCN Cianuro de metilo (Acetonotrilo)
Mr Masa molecular relativa
NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido
NCBI Centro Nacional de Información Biotecnológica
(National Center for Biotechnology Information).

PAGE Electroforésis en gel de poliacrilamida.

PBS Buffer de fosfato salino
PMF Peptide mass fingerprinting
PMSF Fenil metano sulfonil fluoruro
PNGasa F Péptido N-glicosidasa F
SDS Dodecil sulfato de sodio
TBS Buffer Tris salino

TFA Ácido trifluoro acético

Tris Tris (hidroximetil) aminometano
UV Ultravioleta
WLB Western Ligand Blotting
1. INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN

Las lectinas son proteínas, frecuentemente glicoproteínas, de origen no inmune,

que se unen específica y reversiblemente a carbohidratos sin modificarlos
(1,2).Estas proteínas son generalmente más abundantes en las semillas de las
plantas, especialmente en las semillas de leguminosas y gramíneas (3).Las
lectinas de las leguminosas han llamado la atención debido a la diversidad de
funciones que exhiben “in vitro” y se han propuesto varias hipótesis concernientes
a su función biológica; sin embargo, la evidencia experimental que apoya los
diferentes papeles propuestos no es suficiente y por lo tanto su función "in vivo"
permanece aún sin establecer (3-8). En Canavalia ensiformis se ha descrito la
presencia de dos lectinas: la Concanavalina A (Con A), la cual representa la
segunda proteína en abundancia en la semilla, constituyendo cerca del 20% de la
proteína total (9,10) y La CEL-II, la cual se encuentra en muy baja proporción en la
semilla (11).
Otro tipo de proteínas presentes en las semillas de leguminosas son las proteínas
de reserva. Dichas proteínas son globulinas, las cuales se clasifican de acuerdo a
su coeficiente de sedimentación en dos tipos: globulinas 11S o leguminas y
globulinas 7S o vicilinas (12).
En Canavalia ensiformis (Jack bean) se ha reportado la presencia tanto de
leguminas como de vicilinas siendo más abundante la fracción de vicilinas (13-15).
En las semillas maduras de las leguminosas tanto las lectinas como las proteínas
de reserva se encuentran depositadas en estructuras vacuolares características
denominadas cuerpos proteicos (13,16). Sin embargo, es muy poco lo que se
sabe acerca de la forma cómo están organizadas las proteínas de reserva dentro
del cuerpo proteico, a pesar de que esta organización podría ser importante para
asegurar el uso eficiente del espacio de almacenamiento y facilitar la utilización de
las proteínas de reserva durante la germinación (17). La localización común de las
proteínas de reserva y las lectinas puede deberse a que éstas últimas
desempeñan algún papel en el mecanismo de almacenamiento de las proteínas
de reserva (4,7,13), el cual no está aún claramente establecido.

1
Respecto a dicho mecanismo, Einhoff et al. (13) sugieren que la lectina una vez
sintetizada es depositada en el cuerpo protéico en desarrollo y después de que se
ha formado una capa de lectina sobre la membrana del cuerpo protéico, la
proteína de almacenamiento recién sintetizada se ensambla a la lectina. En
seguida puede suceder que más proteína de almacenamiento se una a la primera
fracción de proteína de almacenamiento ya ensamblada, debido a la
autoasociación proteína de almacenamiento-proteína de almacenamiento.
De otro lado, en Pisum sativum se ha postulado la participación de la lectina en la
unión de la vicilina glicosilada a la membrana del cuerpo protéico, lo cual
posiblemente ocurra a través de la interacción de la lectina con el carbohidrato de
la vicilina glicosilada (4).
En C. ensiformis se ha descrito la interacción de la Con A con una muestra de
proteína de almacenamiento constituida mayoritariamente por leguminas y se
ha propuesto que dicha interacción se lleva a cabo a través de fuerzas iónicas
(13), pero no se ha determinado si la lectina interactúa directamente tanto con las
leguminas como con las vicilinas ó sólo con una de ellas, ni se ha establecido si la
fracción de vicilinas se encuentra glicosilada y el posible efecto del carbohidrato en
la interacción. Tampoco se han hecho estudios de interacción entre la CEL-II y las
proteínas de reserva de Canavalia ensiformis, que permitan establecer si
eventualmente esta lectina podría intervenir en el proceso de deposición de las
proteínas de almacenamiento.

Con el fin de evaluar si el mecanismo de deposición de las vicilinas propuesto para

P. sativum (4) puede ser extrapolado a C. ensiformis y posiblemente a otras
leguminosas, en este trabajo se busca establecer si en C. ensiformis la fracción
de vicilina interactúa con las lectinas Con A y CEL-II y si la fracción de vicilina se
encuentra o no glicosilada, así como la posible influencia del residuo glicosídico
en las interacciones.

2
Este estudio constituye un aporte al conocimiento de las interacciones lectina-
proteína de reserva, así como al de los mecanismos moleculares probablemente
involucrados en el almacenamiento y/o organización de las lectinas y las
proteínas de reserva en el mismo organelo subcelular de las semillas de
leguminosas y por ende al del posible papel de las lectinas „„in vivo”.

A pesar de que la existencia de las lectinas se conoce desde mediados del siglo
pasado, su actividad “in vivo‟‟ es casi por completo desconocida. Debido a esto,
es preciso contar con más información sobre sus propiedades y por lo tanto,
trabajos como el presente adquieren gran relevancia en el campo de la bioquímica
de las lectinas.

2. OBJETIVOS

General: Realizar estudios de interacción entre la vicilina y las lectinas Con A y

CEL-II de la semilla de Canavalia ensiformis y evaluar la posible participación de
las interacciones en el proceso de deposición de la vicilina.
Específicos:
Establecer si las lectinas Con A y CEL-II de la semilla de Canavalia
ensiformis interactúan con la fracción de vicilina de la misma semilla y
determinar si tales interacciones ocurren en forma similar o diferente.
Determinar si la fracción de vicilina de la semilla de Canavalia ensiformis
se encuentra o no glicosilada.
Si la fracción de vicilina se encuentra glicosilada, evaluar el efecto del
residuo glicosídico en las posibles interacciones.

3. ESTADO ACTUAL DEL TEMA

3.1 LECTINAS

Las lectinas son proteínas que unen carbohidratos con considerable especificidad.
Ellas están ampliamente distribuidas en la naturaleza, encontrándose en plantas,

3
bacterias, virus, hongos y tejidos animales y son involucradas en numerosos
procesos celulares que dependen del reconocimiento específico de complejos
carbohidratos (18-21).
Las lectinas son generalmente más abundantes en el reino vegetal, en las semillas
de las plantas, especialmente en las semillas de leguminosas y gramíneas. Sin
embargo, estas no están únicamente confinadas a las semillas, también se
encuentran presentes en tejido vegetativo como raíces, hojas, tallo, corteza, flores
y bulbos (3).
En las semillas de las leguminosas las lectinas están fundamentalmente
localizadas en los cotiledones y allí se encuentran principalmente, si no
exclusivamente, en los cuerpos protéicos de las células del parénquima a donde
son transportadas para su deposición después de haber sido sintetizadas en el
retículo endoplasmático (3,20).
Las lectinas de leguminosas son una gran familia de proteínas homólogas las
cuales están confinadas a especies de plantas de la familia Leguminosae (6). Se
han purificado lectinas de especies de diferentes tribus, muchas de las cuales
provienen de semillas maduras. Las lectinas de leguminosas son tal vez las más
conocidas en la actualidad; todas ellas, sin considerar su especificidad de enlace
con el azúcar, están compuestas de monómeros de un peso molecular similar,
entre 25 y 30 kDa, con una notable similitud en la estructura tridimensional, la cual
es tipificada por la ocurrencia de dos hojas antiparalelas (estructuras β) ; los
residuos que no están involucrados en las estructuras β están localizados en giros
y bucles que interconectan las hebras de las hojas plegadas. Cada monómero
contiene como mínimo sitios simples de unión a carbohidratos, así que su
estructura cuaternaria determina las propiedades de aglutinación que exhiben.
Pueden formar desde dímeros hasta tetrámeros y se asume comúnmente que
todas deben presentar una función común, o mejor una familia de funciones
comunes, por la similitud de sus secuencias primarias, a pesar de que algunas de
ellas presenten permutaciones circulares, como en el caso de la Concanavalina A
.Las diferentes lectinas de leguminosas no solamente poseen en general una
estructura muy similar sino que tienen marcadamente conservados los sitios de

4
enlace para Mn+2 y Ca+2. Por el contrario, los aminoácidos involucrados en el sitio
de enlace con el carbohidrato son menos conservados aunque frecuentemente
muy similares.
Se ha indicado que para la estabilidad funcional de algunas lectinas es importante
la presencia de iones metálicos como Mn+2 y Ca+2, que hacen parte de los sitios
de unión al carbohidrato. En estos casos, la eliminación de los iones inhibe la
unión con carbohidratos. En otros, la lectina no cuenta con iones en su estructura
o cuenta con ellos pero su presencia no determina la afinidad de la unión con los
carbohidratos. Otros iones importantes son Mg +2, Zn+2 o Cd+2.
Hay cada vez mas evidencia que muchas de las especies de leguminosas
contienen más de dos lectinas, algunas de las cuales están solamente presentes
en pequeñas cantidades. Algunas semillas almacenan dos lectinas con diferentes
propiedades de reconocimiento de carbohidratos. En algunas de estas proteínas
los rasgos en los sitios de enlace al carbohidrato son conservados aun cuando la
especificidad por el azúcar sea muy diferente (21-23).
El hecho de que los genes de las lectinas hayan sido conservados durante la
evolución, especialmente en las leguminosas y que las lectinas codificadas por
dichos genes presenten gran homología, es un fuerte argumento para postular que
las lectinas pueden tener un papel importante en la vida de las plantas (3).
Estas proteínas han llamado mucho la atención debido a la diversidad de
funciones que exhiben (3) y se han propuesto varias hipótesis concernientes a su
función biológica. Una de las funciones propuestas para las lectinas en plantas es
su participación en la unión de bacterias fijadoras de nitrógeno a las células de la
raíz y la internalización de éstas para formar nódulos. Igualmente, la presencia de
lectinas en hojas, vástagos y raíces, con la misma especificidad de unión, da luces
sobre su acción como mediadoras en la defensa contra infecciones, ya que se
unen a sacáridos de la pared de hongos, virus y bacterias (24). Además, ellas
están involucradas en procesos tales como interacción hospedero-patógeno,
interacción de proteínas entre las células e interacción célula-célula (21).Sin
embargo, la evidencia experimental que apoye los diferentes papeles propuestos
no es suficiente y por lo tanto su función permanece aún sin establecer (3-6).

5
La unión de las lectinas a los carbohidratos es de tipo no covalente, en la que
intervienen puentes de Hidrógeno, fuerzas de van der Waals, metales de
coordinación e interacciones hidrofóbicas.
La disponibilidad de un gran número de grupos hidroxilo en los azúcares los hace
a ellos los obvios compañeros en el complejo sistema de puentes de Hidrógeno.
Los átomos de las cadenas laterales de aspartico (D) y asparagina (N), los
hidrógenos amida y el oxígeno carbonílico de la cadena principal, comúnmente
participan en tales enlaces de hidrógeno, con una ocurrencia menos frecuente de
cadenas laterales de otros aminoácidos. Los enlaces de Hidrógeno proteína-
carbohidrato son directos y mediados por el agua (21).
Los cationes divalentes como Ca+2 y Mn+2 presentes en algunas lectinas participan
indirectamente en el reconocimiento del carbohidrato, formando enlaces de
coordinación en las proteínas, los cuales estabilizan la arquitectura del sitio de
enlace del carbohidrato y aseguran a las cadenas laterales enlaces óptimos al
azúcar (21).
A pesar de la característica hidrofílica de los carbohidratos, las interacciones
hidrofóbicas juegan un papel importante en su reconocimiento por las lectinas. Es
particularmente notable la interacción entre residuos aromáticos y la galactosa, en
los sitios de combinación de lectinas específicas a galactosa, la cual es atribuida a
una interacción entre una región extendida de protones alifáticos parcialmente
cargados que se encuentran sobre el anillo de la hexosa y la carga parcial
negativa de los electrones π del sistema aromático (21).
Algunas lectinas son específicas hacia un monosacárido simple y no discriminan
sobre la base de que otros azúcares estén ligados a su elemento de
reconocimiento. En otros casos, la afinidad se incrementa sustancialmente cuando
azúcares adicionales están enlazados a su determinante primario, aunque al
mismo tiempo la lectina no muestre la misma afinidad por el segundo azúcar como
por el monosacárido. El término “sitio extendido‟‟ describe sitios de enlace que
interactúan específicamente con más de un residuo de azúcar para proveer
incremento en la afinidad. Esta característica también ha sido llamada sitio de
multivalencia.

6
Mientras la selectividad final de las lectinas es probablemente lograda por el
fenómeno de multivalencia, un mayor factor discriminatorio en el reconocimiento
del carbohidrato es la especificidad primaria por el monosacárido, la cual es
usualmente también indicativa de la ramificación particular del carbohidrato a ser
reconocida por la lectina. Así las lectinas de leguminosas específicas a Glc/Man
unen complejos carbohidratos que contienen glucosa ó manosa, mientras que las
lectinas de leguminosas específicas a galactosa requieren la presencia de
galactosa o su derivado amino acetilado para unirse. Del mismo modo, algunas
lectinas animales unen complejos carbohidratos terminados en el monosacárido al
cual ellas son específicas.
Se debe anotar sin embargo, que la especificidad primaria no siempre sirve como
una clara indicación de la selectividad total.
Estudios sobre las características estructurales que determinan la especificidad
primaria en el grupo de lectinas que unen galactosa o glucosa/manosa, han
mostrado la dependencia de la estereoquímica de los átomos del ligando
(carbohidrato) que participan en la formación de puentes de hidrógeno, en
combinación con una disposición preferencial de los residuos aromáticos en la
proteína. Esto sugiere que aunque las interacciones clave responsables del
reconocimiento del carbohidrato son comunes, cada familia de lectinas ha
desarrollado una estereoquímica única en el sitio principal de combinación, para
discriminar entre ligandos.
Las lectinas pueden tener dos sitios de unión de carbohidrato claramente
separados e independientes termodinámicamente en un mismo protómero. Para
algunas lectinas, los sitios de enlace primario y secundario son homólogos,
mientras que en otras los sitios secundarios no tienen homología en secuencia o
estructura con el sitio primario. En estos casos, el sitio secundario tiene una
afinidad más baja por los ligandos comparado con el sitio primario (21, 25-28).
Algunas lectinas reconocen sacáridos en las regiones externas de los
oligosacáridos de las glicoproteínas y otras reconocen secuencias en las regiones
internas de éstos; algunas reconocen sólo los sacáridos y otras unos pocos
aminoácidos unidos a los sacáridos (29).

7
Los sitios de enlace de las lectinas son poco profundos, principalmente en forma
de una depresión sobre la superficie de la proteína y parecen estar preformados
con moléculas de agua ordenadas formando enlaces de hidrógeno con la proteína,
en un modelo que imita los enlaces de hidrógeno con los hidroxilos del azúcar.
Este efecto provee una geometría fija para la interacción con ligandos e
interacciones entre residuos de aminoácidos y algunos cationes divalentes en el
sitio de enlace, que mantiene la conformación de la cadena en ausencia de
azúcares ligandos (21, 26-28).
Las lectinas pueden entrecruzar glicoproteínas y glicolípidos en membranas de la
misma célula para varios propósitos de organización en un amplio rango de
procesos (30). La mayoría de los análisis suministran evidencia acerca de que las
lectinas han estado adaptándose a una gran cantidad de funciones en las
superficies celulares en las que las zonas de interacción específica con
carbohidratos las condicionan para múltiples tareas. La especificidad de la
interacción de algunas lectinas parece estar determinada por requerimientos
estructurales no solo a nivel molecular sino también a nivel de los procesos de
organización biológica (29).
Desde su descubrimiento las lectinas se han utilizado como herramienta
bioquímica para la localización y caracterización de glicoproteínas que presentan
afinidad a un tipo de lectina, así como para la caracterización de grupos
sanguíneos en muchos grupos de animales, la purificación de glicoproteínas y el
marcaje de glicoproteínas para estudios “in vivo‟‟, entre otros muchos usos (31).
Se conoce hoy en día la propiedad insecticida de algunas lectinas que actúan
sobre plagas de importancia comercial (31) y dentro de las aplicaciones más
importantes en la actualidad se cuenta el diagnóstico clínico en enfermedades
relacionadas con el crecimiento tumoral o el desarrollo de procesos de
transformación celular incipientes, con la posibilidad de efectuar el reconocimiento
temprano de algunos tipos de cáncer (32,33).

8
3.1.1 LECTINAS EN Canavalia ensiformis

En Canavalia ensiformis se ha reportado la presencia de dos lectinas: la

Concanavalina A (Con A) y la CEL-II.
La Concanavalina A (Con A) representa la segunda proteína en abundancia en la
semilla, constituyendo cerca del 20% de la proteína total (10,34). Esta es
inicialmente sintetizada como un precursor glicosilado (9,35) el cual sufre un
procesamiento posttraslacional para convertirse en su forma madura no glicosilada
(9,10, 35).
La Con A es una de las lectinas más caracterizadas (3); se conoce su estructura
primaria (35), su estructura cuaternaria es tetramérica constituída por cuatro
subunidades idénticas de masa molecular relativa (Mr) 26.500 (3) cada una de las
cuales contiene un Ca+2 y un Mn+2 requeridos para su actividad (36), aglutina
eritrocitos de conejo (18) y se han hecho estudios sobre su síntesis y
modificaciones posttranslacionales (9, 35).
La Con A fue la primera lectina cuya estructura tridimensional fue completamente
determinada por difracción de Rayos X (3) y los sitios funcionales de la molécula
han sido establecidos. Los sitios de unión del metal se encuentran en la región N-
terminal de la lectina. Varios aminoácidos están implicados en la unión del azúcar
y aunque ellos se encuentran en posiciones muy diferentes en la estructura
primaria de la subunidad, espacialmente están estrechamente localizados en la
conformación nativa de la molécula de la lectina. Los residuos de aminoácidos
involucrados son: Y-12, N-14, D-16, L-99, Y-100, S-168, D-208 y R-228 (3).
La Con A une específicamente glucosa y manosa (18) y se ha establecido que de
estos monosacáridos la manosa en su forma α anomérica es el inhibidor más
potente de la actividad biológica de la lectina. En oligosacáridos y polisacáridos el
residuo que es reconocido principalmente por la lectina es la manosa terminal no
reductora. Aunque esto se cumple generalmente para la mayoría de los
polisacáridos interactuando con la Con A, en oligosacáridos que contienen
residuos de manosa unidos mediante enlace glicosídico α-(1-2), otros residuos de
manosa y no justamente el residuo terminal no reductor contribuyen

9
apreciablemente a la interacción. Estos resultados sugieren que el carbohidrato
que mejor encaja en el sitio de unión del carbohidrato de la Con A es
probablemente un oligosacárido con tres a cuatro residuos de manosa unidos
mediante enlace α-(1-2) (3).La Con A une con gran afinidad estructuras
ramificadas con manosa presentes en glicopéptidos de la ovoalbúmina.
La Con A contiene sitios de unión no polares de varias afinidades. Uno de dichos
sitios, de alta afinidad, se encuentra cerca al sitio de unión del carbohidrato. Es
claro que, con los ligandos adecuados, los sitios de unión no polares pueden
hacer considerables contribuciones a la unión primaria del azúcar específico,
ocasionando una unión más estrecha entre la lectina y el ligando.
La demostración de la unión específica de mioinositol por Con A, la cual es
independiente del sitio de unión al carbohidrato, demuestra que las interacciones
entre lectinas y glicoconjugados naturalmente presentes en la naturaleza, no están
necesariamente confinadas a estructuras glicosídicas en los ligandos. Así la Con A
se une fuertemente a liposomas, que contienen fosfatidilinositol, aun cuando estos
no contienen residuos de azúcares (3).
Se ha demostrado que las interacciones hidrofóbicas juegan un papel muy
importante en el mantenimiento de la estructura nativa de la mayoría de la lectinas
estudiadas.
Los sitios hidrofóbicos también hacen una importante contribución a la unión del
ligando, particularmente en ligandos de carácter hidrofóbico.
En Con A hay una cavidad hidrofóbica, bien definida la cual está constituida por
aminoácidos hidrofóbicos. Las cadenas laterales de leucina (L 81), valina (V 89) y
tres residuos de fenilalanina (F 11, 191 y 212) constituyen la parte principal de la
cavidad hidrofóbica. Dado que todos estos residuos de aminoácidos están
estrictamente conservados en muchas de las lectinas estudiadas, la naturaleza
esencial de las interacciones hidrofóbicas para la conformación de las lectinas y la
unión del ligando es claramente demostrada. Cuando los aminoácidos que
contribuyen a la cavidad hidrofóbica en Con A, no son conservados en otras
lectinas, ellos siempre son reemplazados por otros aminoácidos hidrofóbicos.

10
La existencia de tales cavidades hidrofóbicas en la estructura de las lectinas
puede tener importantes consecuencias biológicas. Así por ejemplo, la unión a
través del sitio hidrofóbico de auxinas o citoquinas y adenina por Con A, puede
tener una importante consecuencia sobre la posible función de esta lectina en el
ciclo de vida de la planta. También es posible que la fuerte unión de Con A a
liposomas vía fosfatidilinositol pueda ser considerablemente fortalecida por las
interacciones hidrofóbicas entre las cadenas laterales de los aminoácidos apolares
de la lectina y los componentes lipídicos de los liposomas (3).
La segunda lectina detectada en Canavalia ensiformis (CEL-II), aglutina eritrocitos
humanos (A+,A1+,B+,O+) pero no eritrocitos de conejo. Su actividad
eritroaglutinante es inhibida únicamente por di y trisacáridos sin aparente relación
estructural y los azúcares simples son débilmente reconocidos por la lectina, al
contrario de lo establecido con la Con A, la cual reconoce glucosa / manosa. La
CEL-II tiene un peso molecular de 57.5 kDa y está constituída por dos monómeros
con un Mr de 29-30 kDa unidos no covalentemete. Esta lectina se encuentra en
una baja proporción en la semilla (5.3-7.1 mg/ 100 g de harina), contiene un 1.3%
de azúcares neutros y su región N-terminal presenta una secuencia única
encontrada solamente en algunas lectinas de la subtribu Diocleinae (designadas
lectinas tipo II). La CEL-II reconoce específicamente al grupo sanguíneo H tipo 2 y
su punto isoeléctrico (5.2-5.4) indica que la lectina es una proteína ligeramente
ácida (11).

3.2 PROTEINAS DE ALMACENAMIENTO

Las semillas sintetizan y almacenan grandes cantidades de proteínas para usarlas

como fuente de carbón, nitrógeno y azufre durante su desarrollo y crecimiento;
éstas proteínas son denominadas proteínas de almacenamiento o proteínas de
reserva y la mayoría de ellas se acumulan en vacuolas subcelulares localizadas
en el endospermo de la semilla o en los cotiledones de los embriones y son
posteriormente degradadas durante la germinación. Las vacuolas en las cuales se

11
depositan las proteínas de reserva son denominadas vacuolas de almacenamiento
de proteínas o cuerpos protéicos (37).
Los dos tipos fundamentales de proteínas de almacenamiento que se encuentran
en las semillas son: globulinas, presentes en los embriones de la mayoría de las
semillas, y prolaminas: presentes en el endospermo de muchos cereales (38).
Las proteínas de reserva presentes en las semillas de leguminosas son globulinas,
las cuales constituyen entre el 50 y el 90% de las proteínas de la semilla y se
clasifican en dos tipos de acuerdo a su coeficiente de sedimentación: globulinas
7S o vicilinas y globulinas 11S o leguminas (12). Aunque frecuentemente se
utilizan nombres triviales para identificar estas proteínas, dependiendo de la
especie de la cual provengan, los términos leguminas (11S) y vicilinas (7S) son
comúnmente usados (37).
Las globulinas 11S son proteínas con un peso molecular entre 300-400 kDa,
compuestas por seis subunidades con pesos moleculares entre 50-67 kDa. Cada
subunidad está compuesta por un polipéptido de tipo ácido (cadena α) de masa
molecular de 30-40 kDa y un polipéptido de tipo básico (cadena β) con una masa
molecular de 18-22 kDa. Los dos polipéptidos están unidos por enlace disulfuro
(39) y su contenido de carbohidratos es generalmente menor del 1%, constituido
principalmente por azúcares neutros, aunque en algunos casos se han identificado
glucosamina y galactosamina (12).
Las globulinas 7S son trímeros con una masa molecular entre 140-210 kDa
(40,41). El tamaño de las subunidades es heterogéneo. Se conocen dos grupos de
subunidades 7S, una con Mr alrededor de 45-55 kDa y otra de Mr de 70-80 kDa.
Ambos grupos de subunidades pueden ser divididos en subfamilias con pequeñas
diferencias en las características moleculares. En Pisum sativum, Vicia faba y
otras leguminosas, al grupo de subunidades pequeñas se le conoce con el nombre
de vicilinas, mientras que al grupo de mayor tamaño se le da el nombre de
convicilinas. Las vicilinas son proteínas frecuentemente glicosiladas (12,37), con
un contenido de azúcares neutros de menos del 2% al 5% y hexosaminas de
menos del 0.2% al 1.2% (12) y en la mayoría de los casos las subunidades no
están unidas por puentes disulfuro (12).

12
Estudios de proteínas de reserva en varias especies han mostrado que la
glicosilación está principalmente restringida a las subunidades de las globulinas
7S y que esta involucra la transferencia de un “core‟‟ oligosacárido N-
acetilglucosamina-manosa (GlnNAcGlnNAc(Man)9GlcGlcGlc) a un residuo de
asparagina. La secuencia de aminoácidos deducida de clones de cDNA de
globulinas 7S generalmente contiene la señal de N-glicosilación “Asn-X-Ser/Thr‟‟
una a tres veces en diferentes regiones del polipéptido. La transferencia del core
oligosacárido a la naciente globulina 7S es prevenido por tunicamicina, pero
interesantemente, la inhibición de la glicosilación no afecta la síntesis, el
ensamblaje o el transporte de la proteína. Por ésta razón y dado que las
globulinas 11S son predominantemente no glicosiladas, el significado fisiológico
de la glicosilación de las proteínas de almacenamiento no es claro.
El “core‟‟ oligosacárido de las globulinas 7S puede ser modificado
posttranslacionalmente durante el transporte intracelular de la proteína por
remoción o adición de residuos de azúcar. En la globulina 7S de Phaseolus
vulgaris (Faseolina) se encuentran diferentes patrones de glicosilación, los cuales
se reflejan en la variación de pesos moleculares estimados por electroforésis en
poliacrilamida (38).
Algunas subunidades 7S son modificadas posttranslacionalmente por rompimiento
proteolítico de ciertos enlaces peptídicos debido a la acción de endopeptidasas
que co-ocupan los cuerpos protéicos junto con las globulinas de almacenamiento.
Los fragmentos resultantes pueden ser estabilizados en los oligómeros por
interacciones no covalentes y se evidencian cuando los oligómeros purificados son
desnaturalizados y los péptidos resueltos por electroforésis (37).
Las globulinas 7S están ampliamente distribuidas en el reino vegetal
encontrándose en gimnospermas, angiospermas monocotiledóneas como maíz,
avena, trigo y arroz y angiospermas dicotiledóneas dentro de las cuales se
encuentran las leguminosas. Aunque muchas plantas dicotiledóneas contienen
suficientes cantidades de globulinas 7S y 11S, unas pocas contienen
predominantemente leguminas o vicilinas. Las semillas de soya (Glycine max),
haba (Vicia faba), arveja (Pisum sativum) y otras leguminosas contienen los dos

13
tipos de globulinas. Las de fríjol (Phaseolus vulgaris) y Psophocarpus
tetragonolobus contienen solamente o predominantemente vicilinas y semillas de
los miembros de Brassicaceae contienen principalmente globulinas 11S. En
especies vegetales que contienen ambas globulinas, la razón entre las leguminas
y las vicilinas varía entre cultivares: desde 0.5 hasta 1.7 en soya, de 0.2 hasta 1.5
en arveja y de 0.3 hasta 0.5 en fríjol (12, 37 ,42).
Muchas proteínas de almacenamiento han sido caracterizadas a nivel molecular
de modo que se conocen sus estructuras. También se conoce el mecanismo por el
cual ellas son sintetizadas, procesadas y transportadas a la vacuola central, así
como detalles de la organización y estructura de los genes que codifican para
ellas y la naturaleza de las secuencias de DNA que regulan su expresión (38).

3.2.1 PROTEINAS DE ALMACENAMIENTO EN Canavalia ensiformis

En C. ensiformis se ha reportado la presencia tanto de leguminas como de

vicilinas siendo más abundante la fracción de vicilinas (13-15). La vicilina de
Canavalia ensiformis fue descrita inicialmente como una proteína amorfa a la que
se denominó Canavalina (43). Posteriormente se mostró que al tratar dicha
proteína con enzimas proteolíticas, los productos de la proteólisis se asociaban
constituyendo una proteína que podía ser aislada en forma cristalina, a la cual se
denomino también Canavalina (44).
En 1982, Smith et al (14) sometieron la vicilina nativa de Canavalia ensiformis a
digestión con tripsina, denominando “Precanavalina” a la proteína nativa y
“Canavalina” a la molécula modificada proteolíticamente y caracterizaron
bioquímicamente cada una de ellas. La proteína nativa o “Precanavalina” tiene
una Mr de aproximadamente 142.000 Da (45) y constituye cerca del 50 % de la
proteína soluble total (14). Es un trímero constituido por unidades estrechamente
relacionadas pero no necesariamente idénticas en secuencia con una Mr de 47-
+2
50 kDa (14, 15, 41) y un ión Zn (14), las cuales no se encuentran unidas por
enlace disulfuro (43). La molécula modificada proteolíticamente o “Canavalina”,

14
está constituida por una única subunidad que contiene, en forma altamente
asociada, los fragmentos que resultan de hidrolizar la “Precanavalina” con tripsina.

El modelo de la estructura tridimensional de la proteína nativa o “Precanavalina‟‟

de Smith, se construyó teniendo en cuenta el estudio cristalográfico de su derivado
proteolítico y la secuencia deducida de la proteína nativa (34,41).Cada subunidad
del trímero está compuesta de dos dominios estructurales altamente similares
(Fig.1).Cada dominio consiste de dos elementos: un β-barril compacto constituido
por 8 láminas β con una topología de “swiss roll‟‟ con preponderancia de
aminoácidos hidrofóbicos y un “loop” extendido constituido por varias α-hélices
cortas. El volumen interior de los β- barriles no está completamente obstruido pero
no parece lo suficientemente espacioso o accesible para contener varias
moléculas de agua. Cada dominio tiene una masa molecular de aproximadamente
21 kDa y la interfase entre ellos involucra cadenas laterales de las láminas β y
cuatro puentes salinos.

FIGURA 1
ELEMENTOS DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE LA
SUBUNIDAD DE LA GLOBULINA 7S DE Canavalia
ensiformis.
Tomada de Ko,T.P. et al. Pag. 740 Fig. 4 (41)

15
Los dominios se encuentran acoplados a través del contacto de extensas
superficies hidrofóbicas complementarias (Fig.2). El área de contacto entre ellos
resulta en un denso “core‟‟ hidrofóbico en el centro de la proteína.

FIGURA 2
INTERFACE ENTRE LOS DOS DOMINIOS DE LA
SUBUNIDAD DE LA GLOBULINA 7S DE Canavalia
ensiformis.
Tomada de Ko,T.P. et al. Pag. 737 Fig. 9 (41)

3 subunidades se ensamblan para generar el trímero de la molécula nativa

(Fig.3). La interfase entre las subunidades está constituida por elementos α- hélice
de los “loops”, un lado del “core‟‟ β-barril y seis puentes salinos. La superficie
interna del canal del trímero está compuesta predominantemente de cadenas
hidrofóbicas (41,46).

FIGURA 3
DIAGRAMA ESQUEMATICO GENERADO POR
COMPUTADOR DEL TRIMERO DE LA GLOBULINA 7S DE
Canavalia ensiformis.
Tomada de Ko,T.P. et al. Pag. 740 Fig. 13 (41)

16
El uso de los términos “Canavalina” para describir los productos del rompimiento
proteolítico de la vicilina nativa de canavalia ensiformis y “Precanavalina” para
referirse a la proteína nativa, es confuso, puesto que la proteólisis de la
“Precanavalina” no ocurre en forma análoga a la de las preproteínas en sistemas
animales, en donde se usa esta terminología para describir una remoción
cotranslacional de secuencia. Por lo tanto, el nombre trivial de “Canavalina” debe
usarse para referirse únicamente a la vicilina nativa de Canavalia ensiformis
extraída de semillas maduras, en concordancia con los nombres triviales usados
para las vicilinas de otras leguminosas (15) y no para referirse a sus productos de
hidrólisis.
En este trabajo se denomina “Fracción de vicilina” o vicilina a la proteína de
reserva nativa más abundante, extraída de semillas maduras de Canavalia
ensiformis, en lugar de utilizar el término “Precanavalina” ó “Canavalina”.

3.3 INTERACCIONES LECTINA-PROTEINA DE ALMACENAMIENTO

En 1979, Gansera et al. publicaron que en las semillas de Pisum sativum,

Canavalia ensiformis, Vicia faba y Ricinus comunis, se encuentran proteínas que
se asocian a sus respectivas lectinas. Dichas proteínas fueron llamadas “lectin-
binders‟‟.
En Pisum sativum y Canavalia ensiformis, las “lectin-binders‟‟ son proteínas
simples, que no se parecen a las glicoproteínas de membrana que se unen a las
lectinas y se encuentran en animales y plantas. La “lectin-binder‟‟ de arveja (Pisum
sativum) (PsL1-binder) es una glicoproteína, mientras que la “lectin-binder‟‟ de
Canavalia (Con A-binder) no contiene azúcares. La interacción PsL-PsL-binder es
abolida por soluciones buffer de pH ácido ó por glucosa, mientras que la
interacción Con A-Con A-binder es disociada por soluciones buffer ácidas,
azúcares (α-metilmanósido y glucosa) y aún por bajas concentraciones de NaCl.
En este último aspecto, el complejo Con A-Con A binder difiere del complejo PsL-

1
PsL: Lectina de Pisum sativum

17
PsL binder, el cual permanece unido aún a altas concentraciones de NaCl. Por lo
tanto, aparentemente la Con A y la Con A binder interactúan por fuerzas
electrostáticas débiles mientras que la PsL y la PsL-binder lo hacen por fuerzas
electrostáticas altas.
La disociación del complejo Con A-Con A binder por glucosa o α-metilmanósido
podría ser explicada por cambios conformacionales causados en la lectina por
dichas sustancias, mientras que en el caso del complejo PsL-PsL binder, la
disociación originada por la glucosa puede deberse a la unión del azúcar a la
lectina (47).

De otro lado, en un trabajo publicado por Wenzel y Rudiger (16), se citan los
resultados de investigaciones previas, en los cuales se observa que las lectinas de
semilla madura de lenteja (Lens culinaris) y arveja (Pisum sativum) interactúan con
subpoblaciones de proteínas de almacenamiento de la misma fuente.
En arveja (Pisum sativum) una fracción de proteína de almacenamiento constituida
por una mezcla de legumina y vicilina no glicosilada, se une a la lectina
únicamente por interacciones iónicas a bajos valores de pH; mientras que una
fracción adicional menor, constituida por vicilina glicosilada, interactúa con la
lectina a través de su sitio de unión del azúcar.
Einhoff et al. (13) por su parte, demuestran que en varias especies de
leguminosas (Canavalia ensiformis, Lens culinaris, Pisum sativum, Glycine max,
Sophora japonica, Wisteria floribunda y Phaseolus vulgaris), las proteínas de
almacenamiento presentes en los cuerpos proteicos de las semillas, se unen
específicamente a las lectinas aisladas de la misma semilla y dicha unión puede
ser disociada por aumento de la fuerza iónica o por azúcares:
En Pisum sativum y Lens culinaris, la fracción que contiene leguminas y vicilinas y
carece de carbohidratos, interactúa con la lectina correspondiente y dicha
interacción es disociada por una fuerza iónica alta, mientras que en la fracción de
vicilinas con bajo contenido de carbohidratos (3-4 %), la interacción con la lectina
es disociada por glucosa.

18
En Glycine max, Sophora japonica y Wisteria floribunda, la interacción de la lectina
con la fracción de proteínas de almacenamiento, constituida fundamentalmente
por leguminas, es disociada únicamente por fuerza iónica alta.
En Phaseolus vulgaris, la mayor parte de la proteína de almacenamiento
pertenece a la familia de las vicilinas y su interacción con la lectina es disociada
por NaCl.
En Canavalia ensiformis, la interacción de la lectina (Con A) con la fracción de
proteína de almacenamiento constituida mayoritariamente por leguminas es
disociada por fuerza iónica alta.
Los resultados presentados muestran como las proteínas de almacenamiento
aisladas de las semillas de diferentes leguminosas interactúan con sus
correspondientes lectinas, en unos casos a través del residuo de carbohidrato de
la proteína de almacenamiento glicosilada y en otros a través de fuerzas
electrostáticas de mayor o menor intensidad.
Como es ampliamente conocido, las lectinas son frecuentemente usadas para
purificar o caracterizar glicoproteínas. Sin embargo, estas interacciones aunque
son completamente efectivas y específicas, son accidentales en la naturaleza y
no tienen ningún significado biológico. El hecho de que las lectinas se unan a
proteínas de almacenamiento de la misma planta, hace que estas últimas puedan
ser consideradas como las compañeras potenciales de las lectinas en su medio
natural. Este hecho posiblemente puede contribuir a la discusión del papel
fisiológico de las lectinas (47).
Por otra parte, con el fin evaluar si la interacción entre las proteínas de
almacenamiento y las lectinas observada “in vitro‟‟ podría ser importante “in vivo‟‟,
Wenzel et al. (4) realizaron un seguimiento de le biosíntesis de las proteínas de
almacenamiento y la lectina junto con los cambios morfológicos intracelulares que
ocurren durante el desarrollo de la semilla de arveja (Pisum sativum),
encontrándose que las proteínas aparecen en el siguiente órden :
Vicilina-Lectina-Convicilina-Legumina
La aparición de la vicilina coincide con la formación de glóbulos de proteína en la
vacuola, por lo que parece razonable asumir que dichos glóbulos consisten

19
principalmente de vicilina. Más adelante, inmediatamente después del comienzo
de la síntesis de la lectina, estos glóbulos se aplanan y comienzan a adherirse a la
membrana de la vacuola. Posiblemente en esta etapa la lectina interactúa con el
residuo de carbohidrato de la vicilina glicosilada como lo hace “in vitro‟‟, actuando
como una clase de “goma‟‟ entre la vicilina glicosilada y la membrana de la
vacuola, lo cual podría explicar la estrecha adherencia de los glóbulos de proteína
a la membrana.Después, aparece la proteína de almacenamiento menor, la
convicilina, la cual no interactúa con la lectina.Posteriormente, cuando las grandes
vacuolas desaparecen a favor de varias vesículas más pequeñas que son los
cuerpos proteicos, aparece la legumina. Finalmente, los cuerpos proteicos se
encuentran uniformemente llenos con proteína. Desde esta etapa hasta la
maduración completa no ocurren mayores cambios (4).
Estos resultados han conducido a proponer que una de las funciones biológicas de
la lectina de arveja y probablemente de otras lectinas, sea la de ayudar a la
deposición de las proteínas de almacenamiento, durante el desarrollo de la semilla
(4,16).

3.4 PROTEINAS EN LA SEMILLA DE Canavalia ensiformis E INTERACCION

DE ALGUNAS DE ELLAS CON LA Con A

En la semilla de Canavalia ensiformis además de las lectinas y las proteínas de

almacenamiento ya descritas en los numerales 3.1.1 y 3.2.1, se encuentran
presentes otras proteínas como canatoxina (48), concanavalina B (49-51), ureasa
(52), asparaginil endopeptidasa (53) y varias glicosidasas (54-60), además de un
polipéptido de Mr 65.000 Da (61).
La canatoxina es una proteína tóxica, que inhibe la acumulación de Ca +2
catalizada por la Ca+2-ATPasa (48).
La concanavalina B (Con B) es una proteína presente en cantidades considerables
en extractos acuosos de Canavalia ensiformis. Esta cristaliza fácilmente a partir de
soluciones crudas, como largas agujas hexagonales y sus propiedades físicas y
químicas no corresponden a las de las clásicas proteínas de almacenamiento

20
leguminas o vicilinas. Los estudios de caracterización muestran que la proteína es
un monómero de 33-33.8 kDa y no presenta carbohidratos unidos covalentemente.
La molécula contiene un ión zinc unido firmemente y une específicamente
nucleótido coenzimas como NADPH y FMN (49,50).
La Con B exhibe una alta homología de secuencia con las quitinasas de las
plantas que pertenecen a la familia de las glicosil hidrolasas. No obstante, en esta
proteína no se pudo detectar actividad de quitinasa (50).
La estructura tridimensional de la Con B se ha determinado por critalografía y
difiere claramente de la estructura de la Con A (49,50).
La asparaginil endopeptidasa es una enzima que pertenece a la familia de
proteasas a cisteina. Casi todos los enlaces peptídicos sobre el lado carboxilo de
los residuos de aspargina son susceptibles a la enzima, exceptuando aquellos
residuos que se encuentran en el NH2 terminal o en una segunda posición a partir
del NH2 terminal; tampoco son susceptibles a la acción de la enzima los residuos
de asparagina N-glicosilados. Los enlaces peptídicos, del lado carboxilo, de
cualquier otro residuo de aminoácido no son hidrolizados. Estas propiedades
prometen una alta utilidad de la enzima en el análisis de secuencia de proteínas
(53).
Entre las glicosidasas de jack bean se encuentran : α-D-manosidasa (54-60), β-N-
acetil D-glucosaminidasa (13,52,59,60), N-glicanasa (52,62), β-galactosidasa
(13,54,59,60), β-glucosidasa (57) y α-galactosidasa (13,57,60).
La α-D-manosidasa es una proteína tetramérica que contiene N-acetil--
glucosamina y un oligosacárido manosilado (56). La proteína está constituída por
dos tipos de subunidades con Mr de 68 y 45 kDa y se ha reportado que ambas
subunidades son glicosiladas (55). Sin embargo, los resultados obtenidos al tratar
la proteína con endoglucosaminidasa H indican que probablemente únicamente la
subunidad pesada esté glicosilada (56).
La N-glicanasa es la enzima responsable de la remoción del N-glicano del
precursor de la Con A para su conversión en lectina activa. La deglicosilación de la
enzima, por PNGasa F, indica la presencia de N-glicósidos en su estructura (62).

21
La α-D-manosidasa de jack bean, a pesar de ser una glicoproteína manosilada,
cuando está en su forma nativa funcional no se une a la Con A; mientras que en
su forma desnaturalizada, la subunidad pesada se une a la Con A a través de la
unión de residuos de manosa por parte de la lectina (55). Estos resultados fueron
125
obtenidos incubando la α-manosidasa con I-Con A luego de electroforesis en
condiciones nativas en el primer caso y desnaturalizantes en el segundo. El
análisis de los resultados sugiere que en la enzima nativa el oligosacárido puede
estar estéricamente impedido para interactuar con la Con A; mientras que la
desnaturalización puede inducir algún cambio conformacional en la proteína
haciendo posible su interacción con la Con A (56). No obstante, cuando la enzima
se pasa a través de una columna de Con A-Sepharosa, aproximadamente el 30%
de la proteína es retenida y se desprende de la columna con metil α-D-manósido,
indicando alguna forma de interacción entre la lectina inmovilizada y la enzima
funcional (56).
Por otra parte, Einhoff et al (60) reportan la participación de fuerzas iónicas en la
unión de la α-D-manosidasa a Con A.
Estos estudios muestran interacción entre la Con A y la α-D-manosidasa de la
semilla de jack bean, pero es incierta la forma como dicha interacción se lleva a
cabo.
La Con A interactúa “in vitro‟‟ con otras glicosidasas de la misma semilla. En la
interacción con α-galactosidasa y N-glicanasa interviene el sitio de unión del
azúcar de la lectina (60,62) mientras que en la interacción con β-N-acetil
glucosaminidasa participan fuerzas iónicas (60).
De otro lado, en la fracción soluble de los extractos de jack bean se ha detectado
un polipéptido de Mr 65.000, que no corresponde a la subunidad pesada de la α-D-
Manosidasa, el cual se une a una columna de Con A-Sepharosa y es eluído
específicamente de ella con metil α-manósido. Este mismo polipéptido no es
125
detectado por I-Con A después de una electroforesis desnaturalizante
(61).Estos resultados indican que la Con A reconoce al polipéptido en su forma
nativa, pero no lo hace cuando está desnaturalizado; al contrario de lo que sucede
con la subunidad pesada de la α-D-manosidasa.

22
Los anteriores resultados muestran la interacción “in vitro” de la Con A con
algunos polipéptidos naturalmente presentes en la semilla de Canavalia
ensiformis, pero en ningún caso se presenta un análisis sobre el posible
significado “in vivo” de dichas interacciones.

4. MATERIALES Y METODOS

4.1 MATERIAL VEGETAL

Las semillas maduras de C. ensiformis fueron colectadas en el Municipio de

Silvania, Cundinamarca. Las semillas fueron lavadas, secadas al aire a
temperatura ambiente y molidas en un molino eléctrico hasta obtener un polvo
fino. La harina obtenida se desengrasó con disolvente 10-20, se secó a
temperatura ambiente y se utilizó como material de partida para la extracción de
Con A y la fracción de vicilina.

4.2 EXTRACCION Y PURIFICACION DE LA Con A

La extracción de la Con A se llevó a cabo con base en la metodología descrita por

Melgarejo (63).100 g de harina desengrasada fueron extraídos dos veces con
NaCl 1% en presencia de PMSF 1mM,EDTA 2.5 mM, EGTA 2.5 mM, Leupeptina
10 mM ajustado a pH 7.0 (1:10 p/v).El extracto salino se centrífugo (12.000 g, 20
min,4°C) y el sobrenadante se saturó con sulfato de amonio al 50-70%.La proteína
precipitada fue colectada por centrifugación (39.000 g, 18 min, 4°C) , resuspendida
en NaCl 1% y dializada exhaustivamente contra la misma solución. Una alícuota
de esta fracción (7.5 ml (6.6 mg)) se aplicó a una columna (1.5x90 cm) de
Sephacryl S-500 equilibrada con NaCl 1%. Después de la elución del primer pico
con NaCl 1%, se añadió glucosa 0.2 M. El pico eluído con esta solución fue
dializado contra NH4HCO3 50 mM, cuantificado por el método modificado de
Bradford (64) utilizando como estandar una muestra pura de Con A, analizado por
electroforesis (65) utilizando como patrón Con A comercial y congelado a –20°C.
Durante el proceso de extracción y purificación se monitoreó la actividad

23
eritroaglutinante con eritrocitos de conejo siguiendo la metodología descrita por de
Navarro et al. (66).

4.3 BIOTINILACION DE Con A

La Con A fue biotinilada con base en la metodología descrita por Wu et al (67),

con algunas modificaciones. La lectina se disolvió en PBS pH 7.2 y se le adicionó
la biotina-X-NHS, en una proporción 1:2 (p/p) lectina-biotina. La reacción se dejó
durante 12 horas a temperatura ambiente y enseguida se adicionó de nuevo
biotina, manteniendo las condiciones iniciales de reacción. La lectina marcada se
dializó exhaustivamente contra Tris-HCl 20 mM, pH 7.2, NaCl 150 mM, CaCl2 1
mM, MnCl2 1 mM (TBS) y se concentró por centrifugación en Nanosep 10 kDa. La
marcación de la lectina se verificó por DOT-BLOT de acuerdo al siguiente
procedimiento:
En una microplaca (10 μL) se realizaron diluciones seriadas en TBS de la Con A
biotinilada a partir de una concentración inicial de 450 μg/ml (2.25 μg) y
aplicando un factor de dilución de 2. Sobre una membrana de nitrocelulosa se
aplicaron 5 μL de cada una de las diluciones, TBS como control negativo y una
muestra de Salvia bogotensis biotinilada (0.5 μg) como control positivo. La
membrana se dejó una noche a temperatura ambiente y se bloqueó con BSA
(1.3% p/v en TBS) 1 hora a temperatura ambiente en agitación. Se adicionó
streptavidina –peroxidasa (0.5 μg/ml en TBS), se dejó 1 hora a 37°C y se reveló
con DAB (0.5 mg/ml en TBS) en presencia de H2O2 al 0.03%, durante 5 min. La
reacción de revelado se detuvo por lavados sucesivos con agua destilada.
Después de cada una de las etapas, excepto la de bloqueo, se lavó 3 veces (5
min) con tween 20-TBS 0.1% (v/v).
La lectina biotinilada fue alicuotada y congelada a –20 °C. La actividad
eritoaglutinante de la lectina marcada se evaluó por el método descrito por de
Navarro et al. (66), empleando eritrocitos de conejo.

24
4.4 EXTRACCION DE VICILINA

El extracto crudo de la fracción de vicilina se preparó a partir de la harina

desengrasada, con base en los métodos descritos por Wenzel et al (4) y Morita et
al (68). La muestra (20 g) fue homogenizada con 100 ml de Tris-HCl 50 mM, pH
8.0, NaCl 100 mM, NaN3 0.02% y 2 pastillas de inhibidor de proteasas Complete
TM
. La extracción se realizó durante 5 horas a 4°C con agitación y luego se
centrifugó (39.000 g, 20 min, 4°C) para remover el material insoluble. El residuo se
extrajo una vez más durante una noche con el buffer de extracción (1:5 p/v). Los
sobrenadantes provenientes de la primera y segunda extracción (S1 y S2) se
unieron y se concentraron por ultrafiltración a través de una membrana PM 10
(Amicón) a 4°C en atmósfera de nitrógeno. El extracto concentrado se ajustó a pH
5.0 con ácido acético 1 M, se dejó en reposo una noche a 4°C y se centrifugó
(39.000 g, 20 min, 4°C). Al sobrenadante (S3), correspondiente a la fracción de
lectinas, se le ajustó el pH a 7.0 y se congeló a –20°C para posterior análisis. El
residuo, correspondiente a la fracción de proteínas de reserva, se suspendió en
buffer Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, NaCl 200 mM, NaN3 0.02% durante 1 hora a 4°C.
El pH se ajustó a 8.0 con NaOH 1M y se centrifugó (39.000 g, 30 min, 4°C) .El
sobrenadante (S4) se colectó y el residuo se resuspendió de nuevo en el buffer de
suspensión y se centrifugó. El sobrenadante proveniente de la resuspensión (S 5)
se reunió con S4 y se concentró por ultrafiltración a través de una membrana de
Amicón PM 10 a 4°C en atmósfera de nitrógeno. El extracto concentrado de
proteínas de almacenamiento se ajustó a pH 6.4 con HCl 2M y se dejó en reposo
una noche a 4°C. El precipitado formado, correspondiente a la fracción de
legumina, fue retirado por centrifugación y el pH del sobrenadante fue luego
ajustado a 4.8, con lo que se logró la precipitación de la fracción de vicilina, la cual
fue colectada por centrifugación (39.000 g, 20 min, 4°C). La fracción de vicilina
fue suspendida y homogenizada durante 1 hora a 4°C en buffer de fosfatos 100
mM, pH 8.0, NaCl 0.1M, NaN3 0.02% (PBS) y dializada contra la misma solución.
Esta fracción se clarificó (39.000 g, 30 min, 4°C) y el sobrenadante dializado
contra NH4HCO3 50 mM constituyó la fracción cruda de vicilina, la cual fue

25
cuantificada por el método modificado de Bradford (64) utilizando BSA como
estandar, analizada por electroforesis (65), alicuotada y almacenada a – 70°C.

De cada uno de los sobrenadantes obtenidos durante el proceso de extracción de

la vicilina, se separó una alícuota, la cual fue dializada exhaustivamente contra
NH4HCO3 50 mM. A cada una de ellas se le determinó el contenido de proteína
(64), la actividad eritroaglutinante (66) y el perfil electroforético (65).

4.5 ANALISIS POR MALDI-TOF-PMF

Las bandas obtenidas por PAGE-SDS de la fracción cruda de vicilina fueron

cortadas y lavadas con agua y ACN (69). Las proteínas fueron reducidas con
DTT y alquiladas con iodoacetamida en carbonato de amonio y luego sujetas a
digestión con tripsina toda la noche a 37°C de acuerdo a Backstrôm et al (70).
Después de la digestión en el gel con tripsina, la muestra se cargó sobre una
micropipeta tip (C18 Zip Tip; Millipore, Bredford, MA), se lavó 10 veces con 10
mL of TFA 0.1% y se eluyó con 1mL de ACN 50%/TFA 0.1%. El análisis se llevo
a cabo utilizando ácido α-ciano -4-hidroxicinámico como matriz (10 mg/ml en ACN
50%/TFA 0.1% v/v), mezclando volúmenes iguales de muestra y matriz y
colocando 1 ml de la mezcla sobre una placa de muestreo estándar MALDI de
acero inoxidable con 96 pozos. El análisis de los péptidos se llevo a cabo en un
espectrómetro de masas de tiempo de vuelo Voyager- DE STR de Applied
Biosystems (Framingham, MA), equipado con un láser de nitrógeno (337 nm;
ancho de pulso: 3 ns; frecuencia de repetición: 20 Hz). Los datos de masa
recolectados durante el análisis por MALDI-TOF-MS fueron procesados y
cargados en el software de búsqueda Mascot (http://www.matrixscience.com/)
usando los siguientes parámetros: (i) tipo de investigación: peptide mass finger
print; (ii) enzima: tripsina; (iii) modificaciones fijas: carbamidometilación de
cisteinas; (iv) modificaciones variables: oxidación de metioninas; (v) valores de
masas: monoisotópicos; (vi) masa proteica: no restringida; (vii) tolerancia masa del
péptido: Â ± 100 ppm; (ix) estado de carga del péptido: 1+; (x) máximos
rompimientos erróneos: uno. Los péptidos fueron identificados comparando sus

26
espectros de masas con los mapas peptídicos, calculados por el software, de
proteínas catalogadas en la base de datos NCBI nr para plantas verdes.

4.6 PURIFICACION DE VICILINA

4.6.1 CROMATOGRAFIA EN SEPHADEX G-75

La fracción cruda de vicilina (2.5 mg en 1.25 ml) se clarifico por centrifugación y la

solución se aplicó a una columna (1x26 cm) de Sephadex G-75 equilibrada con
PBS. Los picos eluídos con el buffer de equilibrio fueron dializados
exhaustivamente contra NH4HCO3 50 mM, cuantificados (64) y analizados por
electroforesis (65).

4.6.2 CROMATOGRAFIA EN DEAE SEPHADEX A-50

A una columna de DEAE Sephadex A-50 (1x12 cm) equilibrada con buffer de
fosfatos 15 mM, pH 8.0, NaCl 0.2M y NaN 3 0.02%, se le aplicaron 2.0 ml (4 mg)
de la fracción cruda de vicilina previamente dializada contra el buffer de equilibrio y
clarificada por centrifugación. La elución se realizó con un gradiente lineal de NaCl
desde 0.2 M hasta 2.0 M, a una velocidad de flujo de 18 ml/hora. Los picos eluídos
fueron dializados contra NH4HCO3 50 mM, cuantificados (64) y analizados por
electroforesis (65).

4.6.3 CROMATOGRAFIA EN DEAE SEPHADEX A-50 CON LEUPEPTINA

El anterior proceso cromatográfico se repitió en idénticas condiciones

experimentales, incluyendo leupeptina 10 µM en los buffers de equilibrio y elución.

27
4.6.4 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD EN Con A SEPHAROSA 4B

A 5.0 g de Sepharosa 4B activada con BrCN se acoplaron 144 mg de Con A de

acuerdo a la metodología descrita (71,72). El soporte se equilibró con TBS-NaN3
0.02% y sobre este se sembraron 3.8 mg de la proteína eluída de la columna de
DEAE Sephadex A -50 que contenía leupeptina. La solución de proteína aplicada
a la columna fue previamente dializada contra el buffer de equilibrio en presencia
de leupeptina 10 µM y clarificada por centrifugación. La elución se realizó a una
velocidad de flujo constante de 18 ml /hora, empleando como eluyentes: A: TBS-
NaN3 0.02%- leupeptina 10 µM. B: Buffer A- etilén glicol 33%( v/v). C: Me α-D-Man
0.3M - buffer B. La proteína eluída con C (fracción pura de vicilina) fue dializada
contra NH4HCO3 50 mM, cuantificada (64) y analizada por electroforesis (65).
La elución de las proteínas de cada una de las columnas cromatográficas se
siguió midiendo la absorción a 220 y 280 nm y cuando fue necesario se evaluó la
presencia de Con A por su actividad eritroaglutinante (66).

4.7 ELECTROFORESIS

La electroforesis (PAGE–SDS) se realizó a temperatura ambiente en geles de

poliacrilamida al 12% (8 x 5 cm) de 0.75 mm de grosor, empleando el método de
Laemmli en condiciones no reductoras (65). Los geles fueron fijados y teñidos con
azul de coomassie R–250 al 0.2 % (p/v) en ácido acético al 3.2 % (v/v). Las
muestras de proteína se desnaturalizaron por calentamiento a 90°C durante 5
minutos. Cuando fue necesario el análisis de la fracción de vicilina en condiciones
reductoras, se incluyó 2-mercapto etanol en el buffer muestra.
La densitometría de los geles se realizó en un analizador de imágenes UV Gel
Doc 1000 de BIO RAD, empleando el programa de software “Molecular Analyst”
versión 1.5 de BIO RAD.

28
4.8 DETERMINACION DE α-MANOSIDASA EN LA VICILINA

La actividad de α-manosidasa en la fracción pura de vicilina se determinó de

acuerdo a la metodología descrita por Li et al (54), empleando 43-258 µg de
proteína y siguiendo la hidrólisis del sustrato durante 1 hora de reacción.

4.9 DETECCION DE CARBOHIDRATOS EN LA VICILINA

A la fracción pura de vicilina obtenida de la cromatografía de afinidad se le realizó

PAGE-SDS según Laemmli (65), en ausencia de agente reductor, junto con una
muestra de ovoalbúmina empleada como control positivo de glicosilación y el
marcador de pesos moleculares. Las proteínas fueron sembradas sobre el gel en
el siguiente orden: Fracción pura de vicilina (8.3μg), ovoalbúmina (6 μg) y
marcador de pesos moleculares. Esta secuencia de aplicación se repitió dos veces
más con el fin de tener tres grupos de proteínas para realizar posteriormente los
siguientes tratamientos: A: Determinación de carbohidratos en muestras oxidadas;
B: Determinación de carbohidratos en muestras no oxidadas; C: Control de
transferencia a la membrana de nitrocelulosa.
Una vez finalizada la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a una
membrana de nitrocelulosa empleando una cámara de transferencia semiseca
(Trans-blot SD Semi-dry transfer cell.Bio Rad), siguiendo básicamente la
metodología descrita por Hossenlopp y Binoux (73) con algunas modificaciones.
Después de la electroforesis el gel fué sumergido en el buffer de transferencia
(Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20% (v/v), SDS 0.038%) durante 10 min. La
membrana de nitrocelulosa y las almohadillas empleadas para formar el sándwich
fueron hidratadas con el buffer de transferencia durante 45 min, se armó el
sándwich, se removieron las burbujas de aire y de acuerdo a las dimensiones del
gel se aplicaron 2 mA/cm2 a corriente constante.
Después de la transferencia el gel se tiño con azul de coomassie R-250 y la
membrana de nitrocelulosa se lavó con agua desmineralizada, se secó al aire y se

29
dividió en tres segmentos: A, B y C, de acuerdo con los tres grupos de proteínas
sembradas originalmente en el gel para los diferentes tratamientos a realizar.
Sobre el segmento A se procedió a detectar los carbohidratos presentes en las
proteínas, por oxidación con metaperiodato de sodio y posterior incubación con
hidrazina biotinilada (74), streptavidina-peroxidasa y DAB, de acuerdo con la
siguiente metodología: La membrana de nitrocelulosa se incubó con
metaperiodato de sodio 30 mM en buffer acetato 100 mM pH 5.5 y posteriormente
con hidrazina biotinilada 25x10-5 mM en buffer acetato 100 mM pH 5.5. Después
del tratamiento con la hidrazina biotinilada, la membrana se bloqueó con BSA
(1.3% p/v en PBS) y se incubó con streptavidina-peroxidasa (0.5 μg/mL en PBS).
Cada una de las incubaciones se realizó durante 1 hora, a temperatura ambiente,
con agitación suave en la oscuridad . Después de cada tratamiento la membrana
se lavó con PBS 3 veces (5 min) .El revelado se realizó con DAB (0.5 mg/ml en
TBS) en presencia de H2O2 al 0.03%, durante 5 min a temperatura ambiente.
El segmento B de la membrana de nitrocelulosa no fue sometido al proceso de
oxidación con metaperiodato de sodio. En su lugar, se incubó con buffer acetato
100mM pH 5.5 y el tratamiento posterior fue idéntico al realizado con el segmento
A.
El segmento C de la membrana de nitrocelulosa (control de transferencia) se
reveló con rojo Ponceau (0.5% p/v en ácido acético 1% v/v).

4.10 DETERMINACION DEL PORCENTAJE DE CARBOHIDRATOS EN LA

VICILINA

El porcentaje de carbohidratos en la fracción pura de vicilina se determinó por el

método de Dubois (75) estandarizado a escala micro por Almanza (76).

4.11 DEGLICOSILACION ENZIMATICA DE LA VICILINA

La deglicosilación enzimática de la fracción pura de vicilina se llevó a cabo con N-

Glicosidasa F (PNGasa F) con base en la metodología descrita por Tarentino et al.

30
(77), con algunas modificaciones. La mezcla de reacción enzimática contenía 50
μg de proteína nativa, β mercapto etanol 10mM, Tris-HCl 50 mM pH 8.6 y PNGasa
F en un volumen total de 100 μL. Se utilizaron 120, 500 y 1200 miliunidades de
PNGasa F .La mezcla se incubó a 37°C durante 18 horas y posteriormente la
enzima se inactivó por enfriamiento a 0°C durante 1 hora. Las muestras de
proteína tratadas enzimáticamente se dializaron exhaustivamente contra
NH4HCO3 50 mM a 0°C, se liofilizaron y se analizaron por PAGE-SDS (65). Como
control del protocolo de deglicosilación se utilizó ovoalbúmina, la cual fue sometida
al mismo tratamiento empleado con la fracción de vicilina.
La ausencia de carbohidratos en las proteínas tratadas con PNGasa F se
determinó transfiriéndolas a una membrana de nitrocelulosa y oxidándolas con
metaperiodato de sodio seguido de incubación con hidrazina biotinilada,
streptavidina-peroxidasa y DAB, de acuerdo con la metodología ya descrita.

4.12 AISLAMIENTO DE LOS FRAGMENTOS DE HIDROLISIS ASOCIADOS A

LA VICILINA

Para aislar los fragmentos de proteólisis de la vicilina que se encuentran

asociados a esta fracción, se cromatografió la muestra eluída en el primer pico de
la cromatografía en Sephadex G-75, sobre una columna de Con A Sepharosa 4B,
siguiendo el procedimiento ya descrito para la cromatografía de afinidad en este
soporte. La fracción no retenida (fragmentos de proteólisis) eluída con el eluyente
A fue dializada contra NH4HCO3 50 mM, cuantificada (64) y analizada por
electroforesis (65).

4.13 ESTUDIO DE LA INTERACCION ENTRE LA VICILINA Y LA Con A

4.13.1 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD EN Con A SEPHAROSA 4B

Esta cromatografía corresponde al último paso empleado para la purificación de la

vicilina (4.6.4).

31
4.13.2 ELLSA

4.13.2.1 INTERACCION Con A- VICILINA

La interacción de la fracción pura de vicilina con la Con A se evaluó empleando el

método de Osinaga (78), con algunas modificaciones, el cual se denominó
“Enzyme-linked lectino sorbent assay" (ELLSA). En todas las etapas, a excepción
de la inicial de sensibilización y la final de revelado, el buffer empleado fue TBS.
Sobre los pozos de una microplaca Nunc Maxisorp F-18 se colocaron 4.3 ó 2.15
μg de la fracción pura de vicilina disuelta en un volumen total de 100 μl de buffer
carbonato 0.1 M pH 9.6. Se incubó 3 horas a 37°C, 12 horas a 4°C y se bloqueo
durante 1 hora a 37 °C con BSA (1.3% p/v) empleando 200 μl/pozo.
Posteriormente, sobre uno de los pozos se adicionaron 10.12 μg de Con A
biotinilada, se llevó a un volumen de 100 μl y a partir de esta solución se realizaron
diluciones seriadas empleando un factor de dilución de 5. Se incubó 1 hora a
37°C, se retiró la lectina no fijada y se adicionó a cada pozo 100 μl de
streptavidina–peroxidasa (0.5 μg/ml) dejando la reacción 1 hora a 37°C.
Finalmente se retiro la streptavidina-peroxidasa y se reveló empleando 100
μl/pozo de ABTS (0.3 mg/ml) en buffer citrato pH 5.0, en presencia de H2O2 al
0.03%. La reacción de revelado se dejó durante 1 hora a temperatura ambiente
en la oscuridad y se leyó la absorbancia a 415nm.
Después de cada uno de los tratamientos, a excepción del de bloqueo, se
realizaron tres lavados con tween 20 (0.1 % v/v).
En este ensayo se realizaron dos controles. Uno contenía todos los reactivos
empleados en las diferentes etapas, sin adicionar la vicilina ni la Con A y en el
otro se colocó la vicilina, la cual fue sometida al mismo tratamiento de las
muestras, pero se omitió la incubación con la lectina biotinilada.

32
4.13.2.2 INTERACCION DE LOS FRAGMENTOS DE PROTEÓLIS DE LA
VICILINA CON LA Con A

La interacción de la Con A con los fragmentos de proteólisis provenientes de la

fracción de vicilina, se evaluó por el método de ELLSA descrito en el numeral
anterior, empleando 4.3 μg de dichos fragmentos y lectina biotinilada en un rango
de 0.32 a 8.08 µg.

4.13.3 DOT-BLOT

Para estudiar la interacción de la Con A con la fracción de vicilina por el método

de DOT-BLOT, inicialmente se ensayaron diferentes tiempos de incubación con la
lectina. Se emplearon tres membranas de nitrocelulosa y sobre cada una de ellas
se colocaron 4.3 μg de cada una de las siguientes proteínas: fracción pura de
vicilina, ovoalbúmina y BSA. La ovoalbúmina se empleó como control positivo de
la interacción con la Con A y la BSA como control negativo de la interacción. Cada
una de las membranas fue sometida al siguiente tratamiento: Se dejó una noche a
temperatura ambiente, se bloqueó con tween 20 (2% v/v) en TBS 1 hora a
temperatura ambiente en agitación y posteriormente se incubó con de Con A
biotinilada (20 μg/ml en TBS) 1, 24 y 36 horas respectivamente a 37°C. Se
adicionó streptavidina-peroxidasa (0.5 μg/ml en TBS), se dejó 1 hora a 37°C y se
reveló con DAB (0.5 mg/ml en TBS) en presencia de H2O2 al 0.03%, durante 5
min. La reacción de revelado se detuvo por lavados sucesivos con agua destilada.
Después de cada una de las etapas previas al revelado, se realizaron 3 lavados
de 3 min cada uno, el primero con tween 20 (0.1% v/v) en TBS y luego dos
empleando únicamente TBS.
Una vez seleccionado el mejor tiempo de incubación, se repitió el ensayo de
interacción Con A-vicilina, realizando paralelamente un control en el cual la
membrana de nitrocelulosa se incubó con TBS en lugar de lectina biotinilada.

33
4.13.4 WESTERN LIGAND BLOTTING (WLB)

Para el estudio de la interacción Con A-vicilina por WLB, inicialmente se

ensayaron diferentes tiempos de transferencia de la fracción de vicilina a la
membrana de nitrocelulosa. Los tiempos ensayados fueron 10, 20, 22, 24,26, 28 y
30 min a corriente constante, empleando 2.15, 4.3 y 10 µg de vicilina. La
transferencia se realizó de acuerdo a la metodología descrita en el numeral 4.9.
Una vez establecido el tiempo de transferencia, se procedió a realizar el WLB de
acuerdo con la siguiente metodología:
ELECTROFORESIS
En un gel de poliacrilamida del 12% se aplicaron las siguientes muestras de
proteína: fracción pura de vicilina (4.3 μg), ovoalbúmina (2.0 μg) y marcador de
pesos moleculares (GIBCO.BRL): Esta secuencia de aplicación se repitió dos
veces más, con el fin de tener tres grupos de proteínas para realizar
posteriormente los siguientes tratamientos:
A: Interacción con la Con A biotinilada.
B: Control (incubación con TBS).
C: Control de transferencia a la membrana de nitrocelulosa.
La electroforesis se realizó según Laemmli (65), en ausencia de agente reductor.
TRANSFERENCIA A LA MEMBRANA DE NITROCELULOSA
Una vez efectuada la transferencia, siguiendo la metodología descrita en el
numeral 4.9, la membrana se lavó con agua desmineralizada, se secó al aire y se
dividió en tres segmentos A, B y C, de acuerdo con los tres grupos de proteínas
sembradas originalmente en el gel para los diferentes tratamientos a realizar.
INCUBACION CON EL LIGANDO (Con A biotinilada)
El segmento A se bloqueó con BSA (1.3% p/v en TBS) durante 1 hora a
temperatura ambiente en agitación y posteriormente se incubó con la lectina
biotinilada (20 μg/ml en TBS-BSA 0.1% p/v) durante 24 horas a 37°C. Se adicionó
streptavidina-peroxidasa (0.5 μg/ml en TBS), se dejó 1 hora a 37°C y se reveló

34
con DAB (0.5mg/ml en TBS) en presencia de H2O2 al 0.03% durante 5 min a
temperatura ambiente.
Después de la transferencia y de cada uno de los tratamientos, a excepción del de
revelado, la membrana se lavó una vez con tween 20 (0.1% v/v) en TBS 3 min y
dos veces con TBS 3 min.
El segmento B se trató de la misma forma que el segmento A, omitiendo la
incubación con la lectina biotinilada. En su lugar, se incubó con TBS-BSA 0.1%
(p/v).
El segmento C, se reveló con rojo Ponceau (0.5% p/v en ácido acético 1% v/v).

4.14 EFECTO DE LA DEGLICOSILACION DE LA VICILINA Y LA

PREINCUBACION DE Con A CON METIL α-D-MANOSIDO SOBRE LA
INTERACCION

El efecto de la deglicosilación de la vicilina y la preincubación de la lectina con Me

α-D-Man sobre la interacción Con A-vicilina, se evaluó por el método de ELLSA
siguiendo la metodología descrita en el numeral 4.13.2.1.
Para el estudio de la interacción vicilina deglicosilada-Con A biotinilada, se
colocaron en cada uno de los pozos 4.3 μg de vicilina deglicosilada y la
concentración inicial de Con A biotinilada a partir de la cual se realizaron las
diluciones seriadas fue de 100 μg/ml.
Para estudiar el efecto de la preincubación de la Con A con Me α-D-Man, se
preparó una solución 0.5 M del carbohidrato con la lectina biotinilada disuelta en
TBS y se incubó 1 hora a temperatura ambiente antes de realizar el ensayo de
ELLSA.
En el estudio de la interacción vicilina glicosilada-Con A biotinilada/manosa, se
colocaron en cada uno de los pozos 4.3 μg de la fracción pura de vicilina
glicosilada y la concentración inicial de Con A biotinilada previamente incubada
con manosa, a partir de la cual se realizaron las diluciones seriadas, fue de 100
μg/ml. El TBS utilizado para realizar las diluciones seriadas contenía Me α-D-Man
0.5 M.

35
Cada uno de los ensayos anteriores se realizó por duplicado y como control se
evaluó paralelamente la interacción vicilina glicosilada-Con A biotinilada sin
manosa, empleando 4.3 μg de la fracción pura de vicilina glicosilada y una
concentración inicial de lectina de 100 μg/ml.

4.15 EXTRACCION Y PURIFICACION DE LA CEL-II

La extracción de la CEL-II se llevo a cabo junto con la Con A de acuerdo al

procedimiento descrito en 4.2 y posteriormente se purificó siguiendo la
metodología descrita por Melgarejo (63). La proteína precipitada al 50-70% con
sulfato de amonio se dializó contra NaCl 1% y se fraccionó sobre Sephacryl S-
200 (2.5 x 148 cm) obteniéndose cuatro picos (1 a 4) de los cuales únicamente el
pico 3 aglutinó eritrocitos humanos A+. Este pico fue dializado exhaustivamente
contra bicarbonato de amonio 20 mM pH 8.0, se liofilizó y finalmente se redisolvió
en NaCl 1% para aplicarlo a una columna de fenil Sepharosa 4B equilibrada con
NaCl 1%. Después de la elución de la proteína no retenida con NaCl 1%, se
realizó un gradiente lineal de acetonotrilo (ACN) 0-50% (v/v) en NaCl al 1%. El
pico eluído con el gradiente se dializó contra bicarbonato de amonio 50 mM, se
cuantificó por el método modificado de Bradford (64) utilizando como patrón una
muestra de la lectina II de Dioclea lemanni (DLL-II), se analizó por electroforesis
(65) y se congeló a -20ºC. Durante el proceso de extracción y purificación se
monitoreó la actividad eritroaglutinante con eritrocitos humanos A+ siguiendo la
metodología descrita por de Navarro et al (66).
La elución de proteínas de las columnas cromatográficas se siguió midiendo la
absorción a 220 y 280 nm.

4.16 BIOTINILACION DE LA CEL-II

La CEL-II fue biotinilada siguiendo el procedimiento empleado con la Con A

(numeral 4.3), empleando buffer de fosfato 20 mM pH 7.2, NaCl 150 mM (PBS). La
lectina marcada se dializó exhaustivamente contra PBS y la marcación se verificó

36
por DOT-BLOT, de acuerdo al procedimiento descrito en 4.3, utilizando PBS para
realizar las diluciones seriadas a partir de una concentración inicial de lectina de
5230 µg/ml. Como control positivo de la marcación se emplearon dos muestras de
lectina biotinilada (0.94 y 1.88 µg) y como control negativo se utilizó PBS. La
actividad eritoaglutinante de la lectina marcada se evaluó por el método descrito
por de Navarro et al. (66), empleando eritrocitos humanos A+ .

4.17 ESTUDIO DE LA INTERACCION ENTRE LA VICILLINA Y LA CEL-II

4.17.1 ELLSA

La interacción de la fracción pura de vicilina con la CEL-II se evalúo inicialmente

por el método de ELLSA, empleando la metodología descrita en el numeral
4.13.2.1 utilizando como buffer PBS en lugar de TBS. La cantidad inicial de lectina
biotinilada fue de 3.75 µg en un volumen de 100 µL y a partir de esta solución se
realizaron diluciones seriadas empleando un factor de dilución de 2.
En este ensayo se realizaron dos controles. Uno contenía todos los reactivos
empleados en las diferentes etapas, sin adicionar la vicilina ni la CEL-II y en el
otro se colocó la vicilina, la cual fue sometida al mismo tratamiento de las
muestras, pero se omitió la incubación con la lectina biotinilada.

4.17.2 DOT-BLOT

4.17.2.1 ESTUDIO DE LA INTERACCION POR DOT-BLOT EMPLEANDO

BSA COMO BLOQUEADOR

Para estudiar la interacción de la CEL-II con la vicilina por el método del DOT-
BLOT , inicialmente se realizó el siguiente procedimiento, el cual se llevo a cabo
por duplicado: sobre una membrana de nitrocelulosa se colocaron 4.3 y 2.15 µg de
la fracción pura de vicilina y luego la membrana se sometió al siguiente

37
tratamiento: se dejó una noche a temperatura ambiente, se bloqueó con BSA al
1.3% p/v en PBS una hora a temperatura ambiente en agitación y posteriormente
se incubó con CEL-II biotinilada (40 µg/ml en PBS) una hora a 37ºC. Se adicionó
streptavidina –peroxidasa (0.5 µg/ml en PBS), se dejó una hora a 37ºC y se reveló
con DAB (0.5 mg/ml en PBS) en presencia de peróxido de hidrógeno al 0.03%,
durante 5 minutos. La reacción de revelado se detuvo por lavados sucesivos con
agua destilada.
Después de cada una de las etapas previas al revelado, se realizaron 3 lavados
de 3 minutos cada uno, el primero con tween 20 (0.1% v/v) en PBS y luego dos
empleando únicamente PBS.
Paralelamente se realizó un control en el cual la membrana de nitrocelulosa se
incubó con PBS en lugar de lectina biotinilada.

4.17.2.2 ESTUDIO DE LA INTERACCION POR DOT-BLOT EMPLEANDO

TWEEN 20 COMO BLOQUEADOR

La interacción CEL-II-vicilina se evaluó nuevamente por el método del DOT-BLOT

siguiendo el procedimiento indicado en 4.17.2.1, con las siguientes variaciones: el
bloqueo se realizó con tween 20 (2% v/v), se incubó con la lectina biotinilada
durante 24 horas y sobre la membrana de nitrocelulosa se colocaron 4.3 µg de
BSA como control positivo y 4.3 µg de la fracción pura de vicilina.

4.17.3 ESTUDIO DE LA INTERFERENCIA DE LA BSA EN LA MEDIDA DE LA

INTERACCIÓN DE LA VICILINA CON LA CEL-II

La interferencia de la BSA en la medida de la interacción CEL-II-vicilina se evaluó

por el método de ELLSA de acuerdo al procedimiento descrito en 4.17.1,
empleando 4.3 µg de vicilina y partiendo de una mayor cantidad de lectina
biotinilada (7.85 µg). Además, se incluyó un nuevo control el cual contenía BSA y
lectina biotinilada, pero no la vicilina. Este control fue sometido al mismo
tratamiento de las muestras.

38
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1 EXTRACCION, PURIFICACION Y BIOTINILACION DE Con A

La cromatografía del extracto de la semilla de Canavalia ensiformis sobre

Sephacryl S-500 produjo un primer pico cuando se eluyó con NaCl 1% (Fig. 4, pico
1) y la adición de glucosa 0.2 M provocó la elución de un segundo pico (Fig. 4,
pico 2), el cual aglutinó eritrocitos de conejo (Anexo 1) y mostró por PAGE-SDS
una sola banda a 30 kDa (Fig. 5 y 6, carriles 2, 3, 4) correspondiente a la proteína
madura (9), lo que indicó que la Con A se encontraba pura y podía ser utilizada
para los estudios de interacción. La Con A comercial utilizada como patrón, mostró
bandas adicionales cerca de 18 y 14 kDa correspondientes al procesamiento post-
translacional de la proteína (9) (Fig.5 y 6, carril 5).

3.0

220 nm
280 nm
2.5

2.0
ABSORBANCIA

1.5

1.0
Glc 0.2 M

NaCl
0.5 1%

1
2
0.0
100 200 300 400 500
ml
FIGURA 4

CROMATOGRAFIA EN SEPHACRYL S-500 DE Canavalia ensiformis

FRACCION 50 - 70 % SULFATO DE AMONIO

39
 kDa
94.0
67.0

43.0

30.0

20.1

14.4

1 2 3 4 5
FIGURA 5
PAGE-SDS: PICO 2 ELUIDO DE LA COLUMNA DE
SEPHACRYL S-500
Carril 1: Patrones de peso molecular
Carriles 2, 3 Y 4: Pico 2 eluído con Glc 0.2 M
Carril 5: Con A patrón
Tinción: Azul de Coomassie R-250

kDa
94.0

67.0

43.0

30.0

20.1

14.4

1 2 3 4 5

FIGURA 6
PAGE-SDS: PICO 2 ELUIDO DE LA COLUMNA DE
SEPHACRYL S-500
Carril 1: Patrones de peso molecular
Carriles 2, 3 Y 4: Pico 2 eluído con GLc 0.2 M
Carril 5: Con A patrón
Tinción: Plata

40
Luego de la biotinilación la proteína mostró por DOT-BLOT una señal apreciable
sobre la membrana de nitrocelulosa hasta 0.2x10-2 μg (Fig. 7), aglutinó eritrocitos
de conejo y produjo una alta absorbancia por el método de ELLSA (Anexo 2), lo
cual indicó una marcación efectiva sin modificar la actividad de la lectina y
evidenció que la lectina biotinilada es una herramienta funcional de alta
sensibilidad para los ensayos de interacción con la vicilina.

µgx10-2

TBS 1.8

µgx10-2

225 0.9

113
0.4

56
0.2

28 0.1

14 0.05

7
0.03

Control
3.5
positivo

FIGURA 7
MARCACION DE LA Con A CON BIOTINA

5.2 EXTRACCION DE VICILINA

El perfil electroforético de los sobrenadantes de la primera y segunda extracción

mostró bandas a 60 y 50 kDa (Fig.8, carriles 2,3,4), correspondientes a legumina
y vicilina, para cuyas subunidades se reportan pesos moleculares de 50-67 y 45-
55 kDa respectivamente (15,37,39).Se observaron además las tres bandas
características de la Con A a 30 , 17 y 14 kDa, correspondientes a la proteína
madura y a los fragmentos α y β resultantes del procesamiento post-translacional

41
de la proteína (9). La actividad eritroaglutinante de estos extractos confirmó la
presencia de la lectina.
El análisis por densitometría mostró que la banda correspondiente a la fracción de
vicilina corresponde a un 50 % de la proteína soluble total aplicada al gel, mientras
que la banda de la Con A constituye un 28% de la proteína total. Estos resultados
concuerdan con lo reportado para canavalia ensiformis (9, 10, 14, 62, 79, 80).
El sobrenadante obtenido después de la precipitación a pH 5.0 (sobrenadante
S3) mostró bandas a 30, 17 y 14 kDa (Fig.8, carril 5), lo que indicó como se
esperaba, la presencia de la Con A que se confirmó por su actividad
eritroaglutinante.
Los sobrenadantes S4 y S5, provenientes de la suspensión de las proteínas de
reserva en Tris-HCl 50 mM, presentaron predominantemente la banda
correspondiente a la fracción de vicilina a 50 kDa, la de la legumina a 60 kDa y
una banda débil alrededor de 25 kDa (Fig.8, carril 6; Fig.9, carril 2), pero no

kDa

94

67
60 60
43 50 50

30 30 30
25

20.1
17 17

14.4 14 14

1 2 3 4 5 6

FIGURA 8
PAGE – SDS: EXTRACCION DE VICILINA
Carril 1: Patrones de peso molecular
Carril 2: Sobrenadante S1
Carril 3: Sobrenadante S2
Carril 4: Sobrenadantes S1+S2
Carril 5: Sobrenadante S3
Carril 6: Sobrenadante S4

42
 kDa
94

67
60
50 50
43

30
25 25 25

20.1

14.4

1 2 3 4
FIGURA 9
PAGE – SDS: EXTRACCION DE VICILINA
Carril 1: Patrones de peso molecular
Carril 2: Sobrenadante S5
Carril 3: Sobrenadantes S4 +S5
Carril 4: Fracción cruda de vicilina

presentaron las bandas características de la Con A, lo que indicó que la

precipitación a pH 5.0 con acido acético 1M eliminó la lectina de la fracción de
proteínas de reserva, lo que se corroboró por la ausencia de actividad
eritroaglutinante .

Al unir los sobrenadantes S4 y S5 y concentrarlos por ultrafiltración ( S4 + S5 )

(Fig.9, carril 3), se intensificó la banda alrededor de 25 kDa, que se observaba
como una banda débil en el sobrenadante S4, debido probablemente a
degradación proteolítica ocurrida durante el proceso de ultrafiltración.

La fracción cruda de vicilina (Fig.9,carril 4) obtenida por precipitación a pH 4.8,

presentó predominantemente una banda a 50 kDa correspondiente a la vicilina
(34), proteínas contaminantes de alto peso molecular (por encima de 60 kDa) y
dos bandas adicionales alrededor de 24 y 25 kDa correspondientes a fragmentos
de proteólisis de la vicilina (37).

43
El tratamiento de la fracción cruda de vicilina con 2–mercapto etanol al 10 % p/v,
para realizar la electroforesis, no afectó la Mr de la banda a 50 kDa (Fig.10,
carriles 1 y 2), lo que mostró que esta proteína no contiene subunidades unidas
por enlace disulfuro, lo que corresponde a una característica estructural típica de
las vicilinas (12).
La espectrometría de Masas (MALDI-TOF-PMF) realizada a las bandas de 50 y
24,25 kDa, de la fracción cruda de vicilina (Fig.10, carril 1) confirmó que la banda
alrededor de 50 kDa corresponde a la vicilina de Canavalia ensiformis y las dos
alrededor de 24 y 25 kDa a sus fragmentos de hidrólisis (Anexo 2A).

kDa

94

67

43

30

20.1

14.4

1 2 3
FIGURA 10
PAGE-SDS: EFECTO DEL MERCAPTO ETANOL (ME)
SOBRE LA FRACCION DE VICILINA
Carril 1: Fracción cruda de vicilina sin ME
Carril 2: Fracción cruda de vicilina con ME
Carril 3: Patrones de peso molecular

44
5.3 PURIFICACION DE LA VICILINA

La cromatografía de la fracción cruda de vicilina sobre Sephadex G-75 produjo

un solo pico definido (Fig.11, pico 1) y tres más no resueltos de baja intensidad
(Fig.11, picos 2, 3, 4) cuando se eluyó con PBS. La adición de Glc 0.2 M no
provocó elución de proteína de la columna, indicando como se esperaba, la
ausencia de Con A. La electroforesis del pico 1 (Fig.12, carril 1), mostró la banda
correspondiente a la vicilina (alrededor de 50 kDa), las de algunos de los
contaminantes de mayor peso molecular y además la banda alrededor de 25 kDa,
lo cual indicó que esta cromatografía no permitía obtener la vicilina en el grado de

45
pureza requerido para los estudios de interacción. La banda alrededor de 25 kDa
se incrementó con respecto a la de la vicilina, lo que sugirió una posible
degradación proteolítica de esta .El perfil electroforético del pico 2 (Fig.12, carril 2)
fue igual al del pico 1. En la electroforesis del pico 3 (Fig.12, carril 3) la banda
correspondiente a la vicilina fue muy débil y adicionalmente se observó la banda
alrededor de 25 kDa más otras de menor tamaño, lo que corroboró la posible
proteólisis de la vicilina durante el proceso cromatográfico.

kDa
97.4
66

36

29

18.4
14.3

1 2 3 4
FIGURA 12
PAGE – SDS: PICOS ELUIDOS DE LA COLUMNA DE SEPHADEX G-75

Carril 1: Pico 1
Carril 2: Pico 2
Carril 3: Pico 3
Carril 4: Patrones de peso molecular

Smith et al (14), demostraron que durante el proceso de germinación , la vicilina

de C.ensiformis sufre rompimiento proteolítico obteniéndose fragmentos de 24, 13
y 12 kDa, indicando esto que la vicilina es sensible a la acción de proteasas que
se encuentran presentes naturalmente en la semilla de C.ensiformis, lo que
explica los resultados obtenidos en la cromatografía sobre Sephadex G-75.

46
Dada la posibilidad de que en C. ensiformis este presente la proteasa a cisteína
C2, detectada en soya (81), la cual es inhibida por leupeptina, se decidió intentar
la purificación de la vicilina por cromatografía sobre DEAE- Sephadex A – 50 con y
sin leupeptina 10 µM en los buffers de equilibrio y elución, con el fin de establecer
si era posible evitar la proteólisis de la vicilina durante su purificación, empleando
dicho inhibidor.
Los perfiles de elución obtenidos en ambos casos fueron muy similares (Figs. 13 y
14) eluyéndose la mayoría de la proteína al comienzo del gradiente. El análisis por
PAGE-SDS mostró en el primer pico eluído de la columna sin leupeptina (Fig. 13,
pico 1; Fig. 15, carril 3), una banda de baja intensidad correspondiente a la
vicilina (ca 50 kDa) y una banda ancha alrededor de 14 kDa. El pico
correspondiente, eluido de la columna que contenía leupeptina presentó
únicamente dos bandas: una fuerte de 50 kDa correspondiente a la vicilina y otra
cerca de 25 kDa (Fig.15,carril 2), pero no se observaron cambios en la proporción
de la banda de la vicilina como sucedió cuando se realizaron las cromatografías
sobre Sephadex G-75 y DEAE- Sephadex A-50 sin leupeptina, donde los controles
electroforéticos mostraron que la banda de 50 kDa disminuyó apreciablemente de
proporción (Fig. 12,carril 1;Fig.15, carril 3, respectivamente). Estos resultados
confirmaron que las bandas observadas alrededor de 25 kDa en la fracción cruda
de vicilina (Fig.9, carril 4) correspondían a fragmentos de proteólisis provenientes
de la vicilina y explicaron el resultado obtenido en el control electroforético de la
muestra S4 + S5 concentrada por ultrafiltración (Fig. 9, carril 3), donde también se
observó la aparición de la banda alrededor de 25 kDa.
El segundo pico eluído de las columnas de intercambio iónico (Figs. 13 y 14, pico
2) presentó un patrón electroforético similar al del primer pico en cada caso
(resultado no mostrado), lo cual puede explicarse si se tiene en cuenta que la
fracción de vicilina está constituida por una familia de proteínas (16,37) las cuales
pueden presentar pequeñas diferencias de carga al pH al cual se realizó la

47
|

1
2

CROMATOGRAFIA DE LA FRACCION CRUDA DE VICILINA

EN DEAE SEPHADEX A-50 SIN LEUPEPTINA

A: Aplicación de la muestra.
1 y 2: Picos eluídos de la columna con el gradiente de NaCl 0.2-2.0 M

48
cromatografía y por lo tanto desprenderse de la columna a diferente concentración
de NaCl.
Es de anotar que la cromatografía de la fracción cruda de vicilina sobre DEAE-
Sephadex A–50 en presencia de leupeptina eliminó las proteínas contaminantes
de alto peso molecular presentes en dicha fracción, como se observa en el control
electroforético de la cromatografía (Fig.15, carriles 1 y 2), pero no eliminó los
fragmentos de proteólisis alrededor de 25 kDa, los cuales según el análisis por
densitometría constituyen el 30 % de la proteína total (Fig. 15, carril 2).

kDa

97

66

45

24
14

1 2 3 4
FIGURA 15
PAGE-SDS: PICOS ELUIDOS DE LAS COLUMNAS DE
DEAE SEPHADEX A-50

Carril 1: Fracción cruda de vicilina aplicada a las columnas de

DEAE Sephadex A-50 con y sin Leupeptina 10 µM
Carril 2: Pico 1 eluído de la columna de DEAE Sephadex A-50
que contiene Leupeptina
Carril 3: Pico 1 eluído de la columna de DEAE Sephadex A-50
sin Leupeptina
Carril 4: Patrones de peso molecular

Dado que Marcus et al 1989 (80) eluyeron la vicilina de Canavalia ensiformis de

una columna de Con A-Sepharosa empleando metil α-D-manósido en el buffer de
elución, se intentó utilizar este sistema para purificar la fracción de vicilina. La
cromatografía sobre Con A-Sepharosa, del pico 1 eluído de la columna de

49
Sephadex A-50 con leupeptina, produjo un pico mayoritario al incluir Me α-D-Man
en el buffer de elución (Fig. 16, pico 2), obteniéndose por electroforesis una
banda predominante alrededor de 50 kDa correspondiente a la vicilina y una tenue
alrededor de 25 kDa (Fig. 17, carriles 1 y 2) .El análisis densitométrico de esta
muestra reveló que la banda de 50 kDa corresponde al 93 % de la proteína total
aplicada al gel y la de 25 kDa al 7%; relación que se mantuvo aún cuando se
sobrecargó el gel con proteína para realizar la electroforesis (Fig.18, carril 5), lo
que indicó que esta cromatografía disminuyó los fragmentos de proteólisis
asociados a la fracción de vicilina, pero no los eliminó totalmente. Estos resultados
confirman la ocurrencia natural de proteólisis en las vicilinas generando péptidos
de menor tamaño que se asocian no covalentemente a los oligómeros puros (37).

50
 kDa

66

45

36

29

24

14.2

1 2 3
FIGURA 17
PAGE-SDS: PICO 2 ELUÍDO DE LA COLUMNA
DE CON A SEPHAROSA 4B (FIG. 16)

Carriles 1 y 2: Pico eluído con buffer C

Carril 3: Patrones de peso molecular

kDa

66.0

45.0

29.0

20.1

14.2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
FIGURA 18
PAGE-SDS: PICO 2 ELUÍDO DE LA COLUMNA DE Con A
SEPHAROSA 4B (2.15 – 80 µg)

Carril 1: 2.15 µg Carril 6: 3 µg

Carril 2: 4.3 µg Carril 7: 15 µg
Carril 3: 5 µg Carril 8: 20 µg
Carril 4: 10 µg Carril 9: 40 µg
Carril 5: 80 µg Carril 10: Patrones de peso molecular

51
Con el fin de comparar estos resultados con los descritos en la literatura para la
vicilina de Canavalia ensiformis se cita lo siguiente:
El perfil electroforético de la vicilina (Precanavalina) obtenida por Smith (14),
muestra además de la banda a 49 kDa, correspondiente a la vicilina, dos bandas
de mayor peso molecular y varias bandas por debajo de 49 kDa (Fig. 2, referencia
21). Samour et al (15), obtienen por PAGE-SDS una banda predominante a 47
kDa y dos de mediana intensidad, una de ellas con Mr por debajo de 47 kDa y la
otra alrededor de 25 kDa (Fig. 2a, referencia 15). Einhoff (13), aunque sólo
describe para dicha proteína cuatro bandas a 50, 48, 24 y 23 kDa, en la fotografía
correspondiente se observa un mayor número de bandas (Fig. 3, referencia 13) y
Derbyshire (12) describe la presencia de 3 bandas a 56, 43 y 23 kDa.
Con base en lo anterior se puede concluir que la preparación de vicilina obtenida
en este trabajo es de alta pureza, puesto que su perfil electroforético muestra
predominantemente la banda de 50 kDa que corresponde a la vicilina y constituye
el 93 % de la proteína total y adicionalmente sólo una banda débil cerca de 25 kDa
correspondiente a los fragmentos de proteólisis, los cuales constituyen sólo el 7%
de la proteína total (Fig.17, carriles 1 y 2). A esta muestra se le denominó fracción
pura de vicilina ó vicilina pura.
Dado el alto grado de pureza de la preparación de vicilina obtenida en este
trabajo, lo cual no se había logrado hasta el momento de acuerdo con lo reportado
en la literatura (12-15), se quizo evaluar si en ella era posible detectar actividad
de α- manosidasa, puesto que Smith et al (14) reportaron actividad de α-
manosidasa en la vicilina (Precanavalina) de Canavalia ensiformis, a pesar de
que la muestra de proteína empleada para evaluar dicha actividad enzimática
mostró, de acuerdo con los autores, una contaminación no mayor al 5 %. Por otra
parte, McPherson et al (82) mencionan la presencia de una substancial actividad
de α-manosidasa en la vicilina purificada de Canavalia ensiformis.
Empleando 43 μg de la fracción pura de vicilina y siguiendo el curso de la reacción
enzimática durante 30 minutos no fue posible detectar actividad de α-manosidasa,
por lo que se decidió aumentar la cantidad de proteína en la mezcla de reacción y
el tiempo de seguimiento de la misma, con el fin de poder detectar la actividad en

52
caso de que solo se tuviesen trazas de la enzima en la proteína aislada, ó que su
actividad fuese muy baja.
Utilizando 129 y 258 μg de proteína no se detectó una actividad significativa de α-
manosidasa en la fracción pura de vicilina, aún 1 hora después de iniciada la
reacción (Fig.19, Anexo 3).
La imposibilidad de detectar actividad de α-manosidasa en la fracción pura de
vicilina y la ausencia de las bandas características de la enzima a 64-68 y 44-49
kDa (14, 15, 55, 56) en el control electroforético (Fig.17, carriles 1 y 2), indicaron la
ausencia de esta proteína, lo que corroboró la pureza de la fracción de vicilina e
indicó que esta podía ser utilizada para los estudios de interacción. Este resultado
concuerda con lo reportado por Samour et al (15) quienes demostraron que la α-
manosidasa y la vicilina de Canavalia ensiformis son proteínas no relacionadas.

53
5.4 DETECCION DE CARBOHIDRATOS EN LA VICILINA

Los resultados de la detección de carbohidratos en la fracción pura de vicilina se

muestran en la Figura 20. La banda correspondiente a la vicilina reveló con DAB
(Fig.20, segmento A, carril 1), al igual que la ovoalbúmina empleada como control
positivo de glicosilacion (Fig.20, segmento A, carril 2) y las proteínas glicosiladas
del patrón de pesos moleculares (BSA, ovoalbúmina y lisozima Fig.20, segmento
A, carril 3) (83-85). Los tratamientos control (Fig.20, segmentos B y C), mostraron
que la oxidación y la transferencia fueron adecuados. Adicionalmente, la tinción
con azul de coomassie del gel transferido no reveló la presencia de proteína
residual en el gel (resultado no mostrado). Estos resultados indicaron que la
vicilina está glicosilada y que con la metodología utilizada no se presentaron falsos
positivos.

Da
215.060
99.570
71.420

44.210

28.450

19.225

14.095

1 2 3 1 2 3 1 2 3
A B C
FIGURA 20
DETERMINACION DE LA PRESENCIA DE CARBOHIDRATOS EN LA
FRACCION PURA DE VICILINA
A : Muestra: Proteínas oxidadas
B : Control: Proteínas no oxidadas
C : Control de transferencia

A, B y C Carril 1: Fracción pura de vicilina: 8.3 µg

Carril 2: Ovoalbúmina (control positivo): 6.0 µg
Carril 3: Patrones de peso molecular preteñidos

54
La presencia de carbohidratos en la fracción pura de vicilina fue corroborada por
el método de Dubois (75) estandarizado a escala micro por Almanza (76),
encontrándose un contenido de carbohidratos del 4% (Anexo 4), valor cercano al
reportado para la fracción de vicilina de P. vulgaris y G. max (4.5-5.5% y 4.8-5%
respectivamente) (12).

Las vicilinas aisladas de leguminosas son proteínas frecuentemente glicosiladas

(12,37,41 ). Sin embargo, la literatura no describe la presencia de carbohidratos
en la vicilina de C. ensiformis, a excepción de Samour (15) quien hace referencia
a un exiguo contenido de carbohidratos en dicha fracción. Por lo tanto, estos
resultados demuestran por primera vez la presencia de glicósidos en la vicilina
de Canavalia ensiformis y confirman la presencia de una glicoproteína en la
semilla madura de C. ensiformis, potencialmente capaz de interactuar con la Con
A “in vivo” a través de los sitios de unión del carbohidrato en la lectina, al contrario
de lo propuesto por Marcus et al (79), quienes no detectaron glicoproteínas
receptoras de la Con A en la semilla madura de C. ensiformis.

5.5 DEGLICOSILACION ENZIMATICA DE LA VICILINA

Tarentino et al (77), lograron remover totalmente los carbohidratos de ribonucleasa

β, transferrina humana y fetuina nativas, empleando 6 miliunidades de PNGasa F
en 100 μL de mezcla de reacción. Sin embargo, en este trabajo fue necesario
realizar varios ensayos para establecer las condiciones de deglicosilación de la
fracción pura de vicilina. Con 120 y 500 miliunidades de la enzima en la mezcla de
reacción no se logró la deglicosilación de dicha fracción, debido probablemente a
su diferente susceptibilidad a la deglicosidación (77). Al emplear 1.200
miliunidades de PNGasa la fracción de vicilina mostró un aumento de la
migración electoforética (Fig.21 carril 3) con respecto a la muestra no tratada
enzimáticamente (Fig.21, carriles 1, 2, 4, 5), indicando esto que la proteína fue
deglicosilada. Un resultado similar se obtuvo con la ovoalbúmina empleada como
control de deglicosilación, la cual presentó una movilidad electroforética
ligeramente mayor en el caso de la muestra tratada enzimáticamente (Fig.21, carril

55
6), con respecto a la no tratada (Fig.21, carriles 7 y 8).Estos resultados se
corroboraron transfiriendo las proteínas a una membrana de nitrocelulosa, sobre
la cual se determinó la presencia de carbohidratos. En los carriles
correspondientes a la fracción de vicilina y la ovoalbúmina tratadas
enzimáticamente no se detectó la presencia de carbohidratos, mientras que en las
bandas de las proteínas no deglicosiladas se observó la presencia de
carbohidratos (resultados no mostrados).

Da
99.570

44.210

28.450

19.225

14.095
1 2 3 4 5 6 7 8 9
FIGURA 21
DEGLICOSILACION ENZIMATICA DE LA FRACCION PURA DE VICILINA
Carriles 1, 2, 4, 5: Fracción pura de vicilina glicosilada
Carril 3 : Fracción pura de vicilina deglicosilada
Carril 6 : Ovoalbúmina deglicosolada
Carriles 7, 8: Ovoalbúmina glicosilada
Carril 9 : Patrones de peso molecular preteñidos

La deglicosilación de la fracción pura de vicilina con PNGasa mostró N-

glicosilación de la proteína, lo cual corresponde al tipo de glicosilación
normalmente presente en las vicilinas (38) y sugiere que la vicilina aislada en este
trabajo corresponde a una de las isoformas a las que hace referencia Smith (14),
la cual está glicosilada. Esto es consistente con el hecho de que el corazón de
oligosacáridos de las globulinas 7S puede ser modificado posttranslacionalmente,
durante el transporte intracelular de la proteína, bien sea por remoción o adición

56
de residuos de azúcares, tal como sucede en la vicilina de Phaseolus vulgaris
(Phaseolina), la cual presenta subunidades con diferentes patrones de
glicosilación (38).

5.6 AISLAMIENTO DE LOS FRAGMENTOS DE PROTEOLISIS ASOCIADOS A

LA VICILINA

Para aislar los fragmentos de proteólisis asociados a la vicilina, se escogió el pico1

eluído de la columna de Sephadex G-75 (Fig.11), puesto que su perfil
electroforético mostró una alta proporción de la banda alrededor de 25 kDa, la cual
corresponde a los fragmentos de proteólisis de la vicilina (Fig. 12, carril 1).La
cromatografía de este pico, sobre Con A Sepharosa 4B, produjo un perfil de
elución como el que se muestra en la Figura 22 .El pico 2 de la Figura 22 mostró
por PAGE-SDS la banda correspondiente a la vicilina alrededor de 50 kDa, la de
los fragmentos de proteólisis cerca de 25 kDa y contaminantes de alto peso
molecular (Fig.23,carriles1, 2); mientras que la electroforésis del pico 1 mostró
únicamente la banda de 25 kDa correspondiente a los fragmentos de proteólisis
asociados a la fracción de vicilina (Fig.24, carriles 1,2 y 3), lo que indicó que esta
última muestra podía ser utilizada para evaluar la interacción entre los fragmentos
de proteólisis y la Con A.

57
 1,6
280 nm
1,4 220 nm

1,2

1,0

ABSORBANCIA
0,8

A
0,6

0,4 B C

1
0,2
2
0,0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
ml
FIGURA 22

CROMATOGRAFIA EN Con A SEPHAROSA 4B DEL PICO 1 DE FIG.11

A : TBS-AZIDA 0.02%-Leupeptina 10 uM
B : A + Etilénglicol 33% (V/V)
C : -D-Me-Man + B

kDa
170
130
100
72
55

40

33

24

17

11

1 2 3
FIGURA 23
PAGE – SDS: PICO 2 ELUIDO DE LA COLUMNA DE
CON A SEPHAROSA 4B (FIG. 22)
Carril 1: Pico 2 (20 µg)
Carril 2: Pico 2 (40 µg)
Carril 3: Patrones de peso molecular

58
 kDa
66

55

45

36

29

24

20

6.5

1 2 3 4 5
FIGURA 24
PAGE – SDS: PICO 1 ELUÍDO DE LA COLUMNA DE CON A SEPHAROSA 4B
(FIG. 22)
Carriles 1, 2 y 3: Pico 1
Carril 4: Anhidrasa Carbónica
Carril 5: Patrones de peso molecular

5.7 ESTUDIO DE LA INTERACCION ENTRE LA VICILINA Y LA Con A

5.7.1 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

Ensayos preliminares mostraron que la vicilina aplicada a la columna de Con A-

Sepharosa 4B no eluyó con glucosa 0.2-0.4 M, ni con Me α-D-Man 0.1-0.4M, lo
que sugirió que probablemente se estaban presentando interacciones
hidrofóbicas entre la Con A y la fracción de vicilina, por lo que se decidió incluir
etilén glicol en el buffer de elución.
Los resultados de la cromatografía sobre Con A- Sepharosa 4B utilizando el etilén
glicol en el buffer de elución (Fig.16) mostraron que la vicilina eluyó únicamente
cuando se adicionó a la columna Me α-D-Man 0.3M-etilénglicol al 33% (v/v)
(Fig.16, pico 2), obteniéndose por electroforesis una sola banda a 50 kDa (Fig.17,
carriles 1,2,) que corresponde a la vicilina, lo que indicó la retención de la

59
proteína en la columna por la participación conjunta de fuerzas hidrofóbicas y
reconocimiento de una estructura glicosídica en la vicilina por parte de la lectina.
La participación de fuerzas hidrofóbicas en la interacción entre la Con A y la
vicilina de C. ensiformis no es sorprendente, puesto que se ha demostrado que la
interacción entre lectinas y glicoconjugados presentes en la naturaleza no está
restringida al reconocimiento específico de una estructura glicosídica en el ligando
(3). Además, la presencia en la Con A de sitios de unión no polares de varias
afinidades (3), podría facilitar dicha interacción con la vicilina.

5.7.2 ELLSA

5.7.2.1 INTERACCION Con A- VICILINA

El ensayo de ELLSA mostró interacción entre la fracción pura de vicilina y la Con

A en un rango de 0.32-8.08 μg de Con A, empleando 2.15 µg de vicilina (Fig.25,
Anexo 5). Al duplicar la cantidad de vicilina empleada para el ensayo (4.3 μg) la
absorción a 415 nm aumentó casi el doble (Fig.25, Anexo 5), lo que confirmó la
interacción entre las dos proteínas, e indicó que en este último caso una mayor
cantidad de lectina se fijo a la vicilina.

60
Si se considera que en C. ensiformis la Con A constituye cerca del 20% de la
proteína total (9,10) y la vicilina el 50% (34), entonces la relación Con A: vicilina es
aproximadamente 1:2.5, o sea que la Con A corresponde a un 40% de proteína
con respecto a la fracción de vicilina.
En el ensayo en el que se utilizaron 4.3 µg de vicilina y 1.62 µg de Con A (20.2
μg/ml (Fig.25, Anexo 5) la lectina corresponde a un 37.7% con respecto a la
vicilina, es decir que las proteínas están aproximadamente en la misma
proporción en la que se encuentran “in vivo‟‟ en la semilla, lo que le confiere al
resultado obtenido un mayor significado para la interpretación del posible papel
fisiológico de la Con A. En dicho caso, la magnitud de la interacción fue
considerable como se deduce de la absorbancia medida (0.864) (Fig.25), lo que
permite proponer que la interacción Con A-vicilina detectada y evaluada “in vitro”,
por el método de ELLSA, es significativa y representativa de la situación “in
vivo”.
Con base en estos resultados, los estudios posteriores de interacción por DOT-
BLOT y WLB se realizaron empleando 4.3 µg de vicilina y 20 µg/ml de lectina
biotinilada.
Los resultados obtenidos por el método de ELLSA, confirmaron la interacción Con
A-vicilina evidenciada en la cromatografía de afinidad.

5.7.2.2 INTERACCION DE LOS FRAGMENTOS DE PROTEÓLIS DE LA VICILINA

CON LA Con A

Dado que la fracción pura de vicilina contiene un 7% de fragmentos de proteólisis,

se quiso evaluar si dichos fragmentos interactuaban con la Con A. Empleando 4.3
µg de los fragmentos de proteólisis y lectina en un rango de 0.32-8.08 µg, no se
detectó una interacción significativa (Fig.26, curva B, Anexo 6); lo que indicó que
la interacción hallada entre la fracción pura de vicilina, que contiene un 7% de
fragmentos de proteólisis, y la Con A (Fig.26, curva A, Anexo 6) se debe
únicamente a la vicilina.

61
5.7.3 DOT-BLOT

Al ensayar diferentes tiempos de incubación para el estudio de interacción por

DOT-BLOT, empleando 4.3 µg de la fracción pura de vicilina y 20 μg / ml de
lectina biotinilada, la interacción entre dichas proteínas fue evidente entre 1-36
horas obteniéndose una buena intensidad de la señal a las 24 horas (Fig.27), por
lo que se seleccionó este tiempo de incubación para el estudio de la interacción
Con A-vicilina por DOT-BLOT.
Los resultados del DOT-BLOT a las 24 horas de incubación (Fig.28) mostraron
detección únicamente de vicilina y ovoalbúmina (Control positivo) sin que se
presentaran falsos positivos, lo que confirmó la interacción Con A-vicilina
detectada por los métodos de ELLSA y cromatografía de afinidad.
La BSA no presentó interacción con la Con A (Fig.28), sugiriendo que las
interacciones hidrofóbicas que se dan entre la vicilina y la Con A (detectadas en la
cromatografía de afinidad), no son interacciones proteína-proteína inespecíficas,
pero este aspecto requiere posterior confirmación.

62
 Vicilina Vicilina
Vicilina (4.3 µg) (4.3 µg)
(4.3 µg)

NH4HCO3 NH4HCO3
(2.6 µl) (2.6 µl)
NH4HCO3
(2.6 µl)

Ovoalbúmina Ovoalbúmina
(4.3 µg) (4.3 µg)
Ovoalbúmina
(4.3 µg)

BSA BSA
(4.3 µg) (4.3 µg)
BSA
(4.3 µg)

A B
FIGURA 28
1h 24h 36h
DOT-BLOT Con A – VICILINA
FIGURA 27
Tiempo de incubación: 24 horas
DOT-BLOT Con A – VICILINA
A: Muestra: incubada con Con A biotinilada (20 μg/ml)
DETERMINACION DEL TIEMPO DE INCUBACION B: Control: incubado con TBS

5.7.4 WESTERN LIGAND BLOTTING

Con el fin de poder comparar los resultados de este ensayo con los obtenidos por
los métodos de ELLSA y DOT-BLOT, fue necesario establecer el tiempo
requerido para transferir totalmente la fracción de vicilina a la membrana de
nitrocelulosa.
Empleando 10 y 20 minutos para el proceso de transferencia, la fracción de vicilina
no transfirió totalmente a la membrana de nitrocelulosa, puesto que a pesar de
que se observa la banda correspondiente a la vicilina sobre la membrana de
nitrocelulosa (Fig.29, membranas A y B), en el gel aún permanece proteína sin
transferir en cada uno de los casos (Fig.30, geles A y B). A los 30 minutos de
transferencia no quedó proteína residual en el gel (Fig.30, gel C), pero sobre la
membrana de nitrocelulosa no se detectó la banda correspondiente a la vicilina
(resultado no mostrado), indicando esto que con 30 minutos de transferencia la
vicilina atravesó la membrana de nitrocelulosa y por lo tanto el tiempo óptimo de
transferencia debía estar comprendido entre 20 y 30 minutos.

63
 kDa

66

45
36

29

1 2 3 4 1 2 3
A B
FIGURA 29
DETERMINACION DEL TIEMPO DE TRANSFERENCIA DE LA FRACCION PURA DE
VICILINA A MEMBRANAS DE NITROCELULOSA (10 – 30 MINUTOS)

A: 10 minutos Carril 1: Patrones de peso molecular

Carril 2: Vicilina 2.15 µg
Carril 3: Vicilina 4.30 µg
Carril 4: Vicilina 10.0 µg

B: 20 minutos Carril 1: Vicilina 2.15 µg

Carril 2: Vicilina 4.30 µg
Carril 3: Vicilina 10.0 µg

kDa

66.0

45.0

1 2 3 4 1 2 3 1 2 3
A B C
FIGURA 30

DETERMINACION DEL TIEMPO DE TRANSFERENCIA DE LA FRACCION PURA DE VICILINA

GELES TRANSFERIDOS (10 – 30 MINUTOS)

A: 10 minutos Carril 1: Patrones de peso molecular

Carril 2: Vicilina 2.15 µg
Carril 3: Vicilina 4.30 µg
Carril 4: Vicilina 10.0 µg

B: 20 minutos Carril 1: Vicilina 2.15 µg

Carril 2: Vicilina 4.30 µg
Carril 3: Vicilina 10.0 µg

C: 30 minutos Carril 1: Vicilina 2.15 µg

Carril 2: Vicilina 4.30 µg
Carril 3: Vicilina 10.0 µg

64
El resultado de la transferencia a los 22, 24, 26 y 28 minutos se muestra en las
Figuras 31 y 32, en las cuales se aprecia que 28 minutos a corriente constante
fueron suficientes para transferir totalmente 2.15 y 4.3 µg de vicilina a la
membrana de nitrocelulosa, puesto que en esta se observa la banda de la vicilina
con una buena intensidad en cada uno de los casos (Fig.31, membrana D, carriles
2 y 3) y no quedaron residuos de proteína en el gel (Fig.32, gel D, carriles 2 y 3).

kDa
66.0

45.0

29.0
24.0

20.1

14.2

1 2 3 1 2 1 2 3 1 2 3
A B C D
FIGURA 31
DETERMINACION DEL TIEMPO DE TRANSFERECIA DE LA
FRACCION PURA DE VICILINA
A MEMBRANAS DE NITROCELULOSA (22 – 28 MINUTOS)

A: 22 minutos Carril 1: Patrones de peso molecular

Carril 2: vicilina 2.15 µg
Carril 3: vicilina 4.30 µg
B: 24 minutos Carril 1: vicilina 2.15 µg
Carril 2: vicilina 4.30 µg
C: 26 minutos Carril 1: vicilina 2.15 µg
Carril 2: vicilina 4.30 µg
Carril 3: Patrones de peso molecular
D: 28 minutos Carril 1: Patrones de peso molecular
Carril 2: vicilina 2.15 µg
Carril 3: vicilina 4.30 µg

65
 1 2 3 1 2 1 2 3 1 2 3
A B C D
FIGURA 32
DETERMINACION DEL TIEMPO DE TRANSFERECIA DE LA
FRACCION PURA DE VICILINA
GELES TRANSFERIDOS (22 – 28 MINUTOS)

A: 22 minutos Carril 1: Patrones de peso molecular

Carril 2: vicilina 2.15 µg
Carril 3: vicilina 4.30 µg
B: 24 minutos Carril 1: vicilina 2.15 µg
Carril 2: vicilina 4.30 µg
C: 26 minutos Carril 1: vicilina 2.15 µg
Carril 2: vicilina 4.30 µg
Carril 3: Patrones de peso molecular
D: 28 minutos Carril 1: Patrones de peso molecular
Carril 2: vicilina 2.15 µg
Carril 3: vicilina 4.30 µg

Con base en el resultado anterior y los obtenidos por los métodos de ELLSA y
DOT-BLOT se estableció que las condiciones más adecuadas para realizar el
estudio de la interacción Con A-vicilina por WLB, empleando Con A biotinilada
como ligando, son las siguientes: fracción pura de vicilina: 4.3 μg; lectina
biotinilada: 20 μg / ml; tiempo de incubación con la lectina: 24 horas.
En el Western, la Con A reconoció sobre la membrana de nitrocelulosa a la
ovoalbúmina utilizada como control positivo de interacción, así como a la
ovoalbúmina del marcador de pesos moleculares (Fig.33A, carriles 2 y 3) pero no
se detectó interacción entre la vicilina y la Con A (Fig.33 A, carril 1).
Los tratamientos control mostraron que la incubación de la membrana con TBS no
produjo falsos positivos (Fig. 33 B) y que las proteínas transfirieron a la membrana
de nitrocelulosa (Fig.33 C) sin dejar proteína residual en el gel (resultados no
mostrados).

66
En el western, La Con A no interactúo con otras proteínas como la fosforilasa b,
BSA, anhidrasa carbónica y β-lactoglobulina, presentes en el marcador de pesos
moleculares (Fig.33A, carril 3), lo que refuerza la propuesta de que las
interacciones hidrofóbicas que ocurren entre la vicilina y la Con A no son
inespecíficas.
La interacción entre la vicilina y la Con A fue detectada por cromatografía de
afinidad, DOT-BLOT y ELLSA, métodos en los cuales ambas proteínas se
encuentran en forma nativa. Sin embargo, por el método de WLB la interacción no
fue detectada, debido probablemente al proceso de desnaturalización al que se
sometió la proteína de reserva para realizar la electroforesis, lo que insinúa el
requerimiento de la estructura nativa de la vicilina para interactuar con la Con A.
De acuerdo con Irimura y Kawashima (83), la unión de lectinas a glicoproteínas
está influenciada por una variedad de factores diferentes a la estructura del
carbohidrato, siendo al parecer, particularmente significativo el arreglo espacial de
la cadena del carbohidrato sobre la glicoproteína. En el caso de la interacción
vicilina-Con A por WLB, pudo haber sucedido que la alteración de la estructura
nativa de la proteína de reserva, hubiese afectado el arreglo espacial del
carbohidrato y por lo tanto su reconocimiento por parte de la lectina.

A B C
FIGURA 33
WESTERN LIGAND BLOTTING Con A - VICILINA

A : Membrana de nitrocelulosa incubada con Con A y revelada con DAB

B : Membrana de nitrocelulosa incubada con TBS y revelada con DAB
C : Membrana de nitrocelulosa revelada con rojo Ponceau

En A , B, y C: Carril 1: Fracción pura de vicilina : 4.3 µg

Carril 2: Ovoalbúmina : 2.0 µg
Carril 3: Patrones de peso molecular preteñidos

67
5.7.5 EFECTO DE LA DEGLICOSILACION DE LA VICILINA Y LA
PREINCUBACION DE LA LECTINA CON METIL α-D- MANOPIRANOSIDO

Al evaluar por el método de ELLSA la interacción entre la Con A y la fracción pura

de vicilina deglicosilada se observó que la interacción prácticamente desapareció
(Fig.34, curva A, Anexo 7) con respecto al resultado obtenido en el caso Con A-
vicilina glicosilada (Fig.34, curva C, Anexo 7), lo que indicó el requerimiento del
residuo glicosídico de la vicilina para la interacción con la lectina. De otro lado, la
preincubación de la lectina con Me α-D-Man inhibió la interacción con la vicilina
glicosilada (Fig.34, curva B, Anexo 7), lo cual confirmó la participación del residuo
glicosídico de la vicilina en la interacción con la Con A.

El hecho de que la deglicosilación de la fracción de vicilina ó la preincubación de la

lectina con el carbohidrato hayan inhibido la interacción entre las proteínas,
sugiere que las posibles interacciones hidrofóbicas Con A-vicilina dependen de la
presencia del oligosacárido unido a la vicilina. Esto hace pensar que las
interacciones hidrofóbicas se ven “facilitadas” una vez que ha ocurrido el
reconocimiento del residuo glicosídico de la vicilina por parte de la lectina. Es
conocido que en la Con A ocurre un cambio conformacional inducido por la
ocupación del bolsillo de unión del carbohidrato (62). Tal cambio conformacional
podría regular la interacción hidrofóbica entre la Con A y la vicilina.

68
Los resultados obtenidos en este ensayo, junto con los obtenidos por WLB, en
donde la desnaturalización de la vicilina afectó su reconocimiento por parte de la
Con A, permiten sugerir que las interacciones hidrofóbicas y el reconocimiento
Con A-glicósido ocurren en forma sinergística. Esto muestra, por primera vez, la
intervención conjunta de interacciones hidrofóbicas y residuos glicosídicos en la
interacción lectina-vicilina.
La existencia de un “sitio hidrofóbico” en Con A cercano al sitio de unión del
carbohidrato (18) apoya la interpretación de los resultados
Del conjunto de los resultados obtenidos en este estudio sobre la interacción
entre la vicilina y la Con A de la semilla de C. ensiformis, se puede postular que
probablemente la Con A interviene en el proceso de deposición de la vicilina
mediante la participación de fuerzas hidrofóbicas proteína-proteína además del
reconocimiento del residuo glicosídico de la vicilina por parte de la lectina, lo que
constituiría un importante papel biológico para la lectina “in vivo”.

69
El hecho de que en varias especies de leguminosas como Pisum sativum, Lens
culinaris y Phaseolus vulgaris, las vicilinas se unan específicamente a las lectinas
aisladas de la misma semilla (13,16), fortalece el significado biológico de los
resultados obtenidos en este trabajo.
Adicionalmente, el requerimiento del residuo glicosídico de la vicilina para la
interacción con la lectina, sugiere que el significado fisiológico de la glicosilación
de las vicilinas podría ser el de ayudar a su empaquetamiento en el cuerpo
protéico a través del reconocimiento de su estructura glicosídica por parte de la
lectina.

5.8 EXTRACCION, PURIFICACION Y BIOTINILACION DE LA CEL-II

El fraccionamiento de extracto de la semilla de Canavalia ensiformis en Sephacryl

S-200 produjo tres picos no resueltos cuando se eluyó con NaCl 1% (Fig.35, picos
1,2 y 3) .La adición de glucosa 0.2 M provocó la elución de un cuarto pico (Fig.35,
pico 4) el cuál, como se esperaba, correspondió a la Con A puesto que aglutinó
eritrocitos de conejo y no eritrocitos humanos y por PAGE-SDS presentó las
bandas características de la Con A a 30 y 18 kDa correspondientes a la proteína
madura y al fragmento α resultante del procesamiento posttranslacional (Fig.36).

70
 kDa

66.0

45.0

29.0

18.4
14.2

1 2
FIGURA 36
PAGE – SDS: PICO 4 ELUIDO DE LA
COLUMNA DE SEPHACRYL S-200
Carril 1: Pico 4
Carril 2: Patrones de peso molecular

71
El pico 3 de la cromatografía en Sephacryl S-200 (Fig.35) aglutinó eritrocitos
humanos A+, pero no eritrocitos de conejo, como es característico de la CEL-II
(11). Este pico, fue posteriormente cromatografiado sobre una columna de fenil
sepharosa y la proteína retenida se eluyó con un gradiente de acetonitrilo (Fig.37,
pico 2). La proteína eluída con el gradiente aglutinó eritrocitos humanos A+ pero
no eritrocitos de conejo (Anexo 1) y presentó una sola banda a 30 kDa (Figs. 38 y
39) correspondiente a los monómeros de la CEL-II (11).

2,5
220 nm
280 nm
1
2,0

1,5
ABSORBANCIA

1,0 2

MeCN
0,5 0-50%

0,0
0 100 200 300 400 500
ml
FIGURA 37

CROMATOGRAFIA EN FENIL SEPHAROSA DEL PICO 3 DE FIG.35

72
 kDa
94.0

67.0

43.0

30.0

20.1

14.4

1 2
FIGURA 38
PAGE-SDS: PICO ELUIDO DE LA COLUMNA
DE FENIL SEPHAROSA
Carril 1: Pico 2 eluído con gradiente de MeCN
Carril 2: Patrones de peso molecular
Tinción: Azul de Coomassie R-250

kDa
94.0

67.0

43.0

30.0

20.1

14.4

1 2
FIGURA 39
PAGE-SDS: PICO ELUIDO DE LA COLUMNA DE
FENIL SEPHAROSA
Carril 1: Patrones de peso molecular
Carril 2: Pico 2 eluído con gradiente de MeCN
Tinción: Plata

73
Luego de la biotinilación, la CEL-II mostró una señal apreciable por DOT-BLOT
hasta 2.6x10-2 μg (Fig.40), aglutinó eritrocitos humanos A+ y produjo una alta
absorbancia por el método de ELLSA (Anexo 2), lo cual indicó una marcación
efectiva sin modificar su actividad. Este resultado, junto con el obtenido por PAGE-
SDS (Figs. 38 y 39) indicó que la lectina se encontraba pura y funcional y por
tanto podía ser utilizada para los estudios de interacción.

µgx10-2

PBS 21

µgx10-2
1.308 10

654 5

327 2.6

164 1.3

82
CONTROLES
POSITIVOS

41

FIGURA 40
MARCACION DE CEL-II CON BIOTINA

5.9 ESTUDIO DE LA INTERACCION ENTRE LA VICILINA Y LA CEL II

5.9.1 ELLSA

Por el método de ELLSA se detectó una baja interacción entre la fracción pura de
vicilina y la CEL-II en el ensayo en que se utilizó la más alta cantidad de lectina
(1.9 μg) y 2.15.µg de vicilina (A a 415 nm = 0.146, Fig.41, curva A. Anexo 8). La
magnitud de dicha interacción no se incrementó al duplicar la cantidad de vicilina

74
(Fig.41, curva B. Anexo 8), lo que indicó que el aumento de esta no favoreció la
fijación de una mayor cantidad de lectina. En el rango de 0.06-0.94 μg de CEL-II,
no hubo una interacción significativa con la vicilina empleando 2.15 ó 4.3 μg de
esta fracción y entre 0.94 y 1.9 μg de lectina, la interacción fue aproximadamente
igual en ambos casos (Fig.41, Anexo 8).
Dado que la interacción sólo fue apreciable cuando se emplearon 1.9 µg (37.5
µg/ml) de CEL-II y 2.15 ó 4.3 µg de vicilina, se decidió utilizar para el estudio
posterior de interacción por DOT-BLOT, 40 µg/ml de CEL-II biotinilada y
únicamente 4.3 µg de vicilina.

5.9.2 DOT-BLOT

5.9.2.1 DOT-BLOT EMPLEANDO BSA COMO BLOQUEADOR

Para confirmar la interacción CEL-II-vicilina, detectada por el método de ELLSA,

se procedió a realizar el estudio por DOT-BLOT.

75
El Tratamiento con DAB mostró un revelado total de la membrana que fue
incubada con CEL-II biotinilada (Fig. 42, membrana A) y ausencia de revelado en
el control incubado con PBS (Fig.42, membrana B), lo que indicó que
posiblemente la CEL-II biotinilada se unía a la BSA empleada como bloqueador.
Para corroborar este hecho, se realizaron dos controles:
En el primero, la membrana de nitrocelulosa se incubó con BSA y enseguida se
trató con CEL-II biotinilada, streptavidina peroxidasa y DAB. En el segundo, se
omitió la incubación con la lectina.
En el segundo control (Fig.43 membrana B), el tratamiento con DAB no produjo
revelado sobre la membrana de nitrocelulosa, mientras que en el primero se
obtuvo un revelado total de la membrana (Fig.43 membrana A), lo que comprobó
que la CEL-II se unió a la BSA.

Vicilina Vicilina
(4.3µg) (4.3µg)

Vicilina Vicilina
(2.15µg) (2.15µg)

NH4HCO3 NH4HCO3
(2.6µl) (2.6µl)

NH4HCO3 NH4HCO3
(1.3µl) (1.3µl)

A B
FIGURA 42
DOT-BLOT CEL-II - VICILINA EMPLEANDO BSA COMO
BLOQUEADOR
A: Muestra: Incubada con CEL-II biotinilada (40 μg/ml)
B: Control: Incubado con PBS

76
 A B
FIGURA 43
CONTROL DE LA INTERFERENCIA DE LA BSA EN LA
INTERACCION CEL-II – VICILINA POR DOT-BLOT
A: Membrana incubada con BSA, CEL-II biotinilada y SP
B: Membrana incubada con BSA y SP
Revelador en A y B: DAB

Estos resultados mostraron interferencia de la BSA en la evaluación de la

interacción CEL-II-vicilina, por lo que fue necesario ensayar otro agente
bloqueador para realizar el estudio de interacción por DOT-BLOT.

5.9.2.2 EFECTO DEL TWEEN 20 COMO AGENTE BLOQUEADOR

En la figura 44 (membrana A) se observa ausencia de revelado en una membrana

que fue secuencialmente incubada con tween 20 (2% (v/v), CEL-II biotinilada,
streptavidina peroxidasa y DAB, indicando esto un adecuado bloqueo y ausencia
de interferencia por parte del tween 20. Adicionalmente, en la membrana B se
aprecia claramente la señal producida por 0.38 μg de CEL-II biotinilada en una
membrana de nitrocelulosa bloqueada con tween 20 (2% v/v).

77
 CEL-II Biotinilada
(0.38 µg)

A B
FIGURA 44
EFECTO BLOQUEADOR DEL TWEEN 20 (2% V/V)

A: Membrana incubada con tween 20 (2% v/v), Cel-II

biotinilada y SP
B: Señal producida por la CEL-II – biotinilada sobre una
membrana bloqueada con tween 20
Revelador en A y B: DAB

Con base en estos resultados, se procedió a realizar el estudio de interacción por

DOT-BLOT empleando tween 20 como bloqueador.

5.9.2.3 BOT-BLOT EMPLEANDO TWEEN 20 COMO BLOQUEADOR

Los resultados del BOT-BLOT a las 24 horas de incubación (Fig. 45) mostraron
detección de vicilina y BSA (control positivo) sin que se presentaran interferencias
ni falsos positivos, lo que confirmó la interacción CEL-II–vicilina detectada por el
método de ELLSA. La baja intensidad de la señal obtenida sobre la muestra de
vicilina indicó, al igual que por el método de ELLSA, una baja interacción CEL-II-
vicilina.

78
 BSA BSA
(4.3 µg) (4.3 µg)

Vicilina Vicilina
(4.3 µg) (4.3 µg)

NH4HCO3 NH4HCO3
(2.6 µl) (2.6 µl)

A B
FIGURA 45
DOT- BLOT CEL- II – VICILINA EMPLEANDO TWEEN 20 COMO
BLOQUEADOR
A: Muestra: Incubada con CEL-II biotinilada (40 µg/ml)
B: Control: Incubado con PBS

5.9.3 ESTUDIO DE LA INTERFERENCIA DE LA BSA EN LA MEDIDA DE

LA INTERACCION CEL-II VICILINA POR EL METODO DE ELLSA

Dado que los resultados del estudio de interacción por BOT-BLOT mostraron que
la CEL-II se unía a la BSA, se hizo necesario evaluar nuevamente la interacción
CEL-II-vicilina por el método de ELLSA; puesto que era factible que la señal de
interacción detectada en dicho estudio se debiera total o parcialmente a la unión
de la lectina (CEL-II) a la BSA y no a la fracción de vicilina.
Las curvas A y B de la Figura 46 (Anexo 9) corresponden a las interacciones
CEL-II-vicilina en presencia de BSA y CEL-II-BSA respectivamente. Los valores de
absorbancia en cada caso, indican que gran parte de la señal obtenida en la curva
A corresponde a la interacción CEL-II-BSA. La absorbancia neta debida

79
únicamente a la interacción CEL-II-vicilina (Fig.46, curva C. Anexo 9) muestra una
baja interacción entre las proteínas.
Los anteriores resultados confirman la unión de la CEL-II a la BSA y una baja
interacción entre la lectina CEL-II y la fracción pura de vicilina de Canavalia
ensiformis.

Al comparar la interacción de las lectinas CEL-II y Con A con la fracción pura de

vicilina (Fig.47), se aprecia que la interacción CEL-II-vicilina (Fig.47, curva B,
Anexo 10) es significativamente menor a la interacción Con A- vicilina (Fig.47,
curva A, Anexo 10).Si se tiene en cuenta que en el ensayo de interacción CEL-II-
vicilina, la interacción está altamente favorecida debido a que se utilizó una alta
proporción de lectina con respecto a la que se encuentra naturalmente en la

80
semilla (Anexo 11), entonces la baja interacción detectada “in vitro” difícilmente
podría ser significativa “in vivo”.

El conjunto de los resultados obtenidos en el estudio de la interacción CEL-II-

vicilina sugieren que probablemente la lectina CEL-II no participa en el proceso de
deposición de la vicilina de Canavalia ensiformis. No obstante, cabe la posibilidad
de considerar que la CEL-II actúe en una forma dinámica, de modo que una
pequeña cantidad de lectina se una también a una pequeña cantidad de vicilina y
ayude a transportarla y/o depositarla dentro del organelo, mediante la repetición
de este proceso de unión y transporte y/o deposición. Este proceso tendría
concordancia con la poca cantidad de CEL-II presente en la semilla e indicaría que
las lectinas CEL-II y Con A participan de diferente forma en el proceso de
deposición de la vicilina. Sin embargo, para evaluar esta posibilidad es necesario
realizar más estudios sobre la interacción CEL-II-vicilina.

81
La evidente diferencia hallada en las interacciones Con A-vicilina y CEL-II-vicilina,
podría atribuirse al hecho de que la Con A y la CEL-II son lectinas de diferente
tipo. La CEL-II posee características que la distinguen de las clásicas lectinas a
Man/Glc, como la Con A, lo cual indicaría una diferencia funcional entre ellas (11),
como lo sugieren los resultados obtenidos en este trabajo.

6. CONCLUSIONES

1. Las lectinas Con A y CEL-II de la semilla de Canavalia ensiformis se

obtuvieron puras y mantuvieron su funcionalidad, lo que permitió su
utilización para los estudios de interacción.

2. El proceso de purificación de la fracción de vicilina de la semilla de

Canavalia ensiformis, desarrollado en este trabajo, permitió obtener la
proteína con un grado de pureza muy superior al descrito previamente en la
literatura, conteniendo predominantemente vicilina correspondiente al 93 %
de la proteína total y adicionalmente solo un 7% de fragmentos de
proteólisis. La ausencia de actividad de α-manosidasa en esta fracción
confirmó el grado de pureza de la preparación, el cual fue adecuado para
los estudios de interacción.

3. La presencia de carbohidratos en la fracción pura de vicilina fue puesta en

evidencia por cromatografía de afinidad sobre Con A-Sepharosa y
corroborada por los métodos de Dubois, oxidación de residuos glicosídicos
de glicoproteínas seguido de la detección de los productos de oxidación y
deglicosilación enzimática. Esto muestra, por primera vez, la presencia de
glicósidos en la fracción de vicilina de Canavalia ensiformis y permite
postular que en la semilla madura de Canavalia ensiformis se encuentra
presente una proteína potencialmente capaz de interactuar “in vivo” con la
Con A a través de los sitios de unión del carbohidrato en la lectina.

82
4. La vicilina aislada de la semilla madura de Canavalia ensiformis en este
trabajo, interactúa con la Con A mediante la participación de fuerzas
hidrofóbicas proteína-proteína, además del reconocimiento por parte de la
Con A de estructuras glicosídicas en la vicilina.

5. La desaparición de la interacción Con A-vicilina, al deglicosilar la vicilina ó

preincubar la lectina con metil α-D-manopiranósido, indica el requerimiento
del residuo glicosídico de la vicilina para la interacción.

6. La desaparición de la interacción Con A-vicilina como consecuencia de la

desnaturalización de la vicilina, evidencia el requerimiento de la estructura
nativa de la vicilina para la interacción.

7. La desaparición de la interacción Con A-vicilina al desnaturalizar ó

deglicosilar la vicilina, permite sugerir que las interacciones hidrofóbicas y
el reconocimiento Con A-glicósido ocurren en forma sinergística.

8. Las interacciones hidrofóbicas Con A-vicilina probablemente se ven

favorecidas una vez que ha ocurrido el reconocimiento del residuo
glicosídico de la vicilina por parte de la Con A.

9. Los fragmentos de proteólisis de la vicilina que se encuentran asociados a

dicha fracción, no participan en la interacción con la Con A.

10. Al emplear la Con A y la vicilina aproximadamente en la misma proporción

en la que se encuentran en la semilla, la magnitud de la interacción entre
estas proteínas fue considerable, lo que permite proponer que la interacción
detectada y evaluada “in vitro” es significativa y representativa de la
situación “in vivo”.

83
11. Del conjunto de los resultados obtenidos en el estudio de la interacción Con
A-vicilina, se puede proponer que probablemente la lectina Con A
interviene en el proceso de deposición de la vicilina en las semillas de
Canavalia ensiformis, mediante la participación de fuerzas hidrofóbicas
proteína-proteína además del reconocimiento del residuo glicosídico de la
vicilina por parte de la Con A.

12. Los resultados obtenidos en este trabajo sobre la interacción Con A-

vicilina en Canavalia ensiformis, son consistentes con el mecanismo
propuesto para la deposición de las vicilinas en P.sativum y permiten
sugerir que la interacción de las lectinas con el residuo glicosídico de las
vicilinas glicosiladas podría ser un proceso generalizado en las semillas de
las leguminosas mediando la deposición de las proteínas de
almacenamiento en el cuerpo protéico, constituyendo esto un importante
papel fisiológico de las lectinas y una posible explicación de la razón por la
cual las lectinas y las proteínas de reserva se encuentran en el mismo
organelo subcelular en las semillas de leguminosas.

13. Del conjunto de los resultados obtenidos en el estudio de la interacción

CEL-II-vicilina, se puede proponer que probablemente la lectina CEL-II, a
diferencia de la Con A, no participa en el proceso de deposición de la
vicilina en las semillas de Canavalia ensiformis, lo que sugeriría diferentes
funciones fisiológicas para las dos lectinas.

7. PERSPECTIVAS

Continuar con el estudio del mecanismo de deposición de las vicilinas,

empleando como modelo la semilla de Canavalia ensiformis. Para este
estudio sería importante, en primer lugar, establecer la posible
participación de las proteínas integrales de tonoplasto, para lo cual seria
necesario aislar las membranas del cuerpo protéico de la semilla, retirar las

84
proteínas periféricas de la membrana y posteriormente realizar estudios de
interacción: Con A-membrana del cuerpo protéico y vicilina- membrana del
cuerpo protéico. Los resultados que se obtengan permitirán determinar si
las proteínas integrales de la membrana del cuerpo protéico (proteínas
integrales de tonoplasto) participan en el proceso de deposición de las
vicilinas, bien sea por interacción directa tanto con la lectina como con la
vicilina ó únicamente con la lectina, la cual a su vez se une a la vicilina, de
acuerdo con lo obtenido en el presente estudio. Esta investigación
contribuiría, de un lado, a la elucidación del mecanismo de deposición de
las proteínas de reserva y de otro, al conocimiento de la organización de
lectinas y proteínas de reserva dentro del cuerpo protéico. Este estudio
seria además, un aporte al conocimiento del papel fisiológico de las
proteínas integrales de tonoplasto.
Estudiar las posibles interacciones CEL-II-proteínas integrales de
tonoplasto, con el fin de de establecer si es factible o no considerar la
posible participación dinámica de la CEL-II en el proceso de deposición de
las vicilinas.
Estudiar las posibles interacciones: Con A-Leguminas, CEL-II-Leguminas
y proteínas integrales de tonoplasto-Leguminas, con el fin de evaluar si el
mecanismo de deposición de las leguminas podría proceder en forma
similar o diferente al de las vicilinas.
Realizar la caracterización de la isoforma glicosilada de la vicilina de
Canavalia ensiformis aislada en este trabajo, mediante la determinación del
peso molecular, composición de aminoácidos, punto isoeléctrico y
secuencia amino terminal.
Liberar el glicósido de la vicilina glicosilada, aislarlo por cromatografía y
determinar su estructura empleando varias técnicas cómo degradación
enzimática, unión a lectinas, espectrometría de masas y resonancia
magnética nuclear.

85
8. BIBLIOGRAFIA

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 ANEXO 1
FUNCIONALIDAD BIOLÓGICA DE LAS LECTINAS Con A y CEL-II

ACTIVIDAD ERITROAGLUTINANTE ²
CONCENTRACIÓN ³ TÍTULO
LECTINA
mg/ml ¹ AGLUTINACIÓN ERITROCITOS ESPECÍFICO
µg/100µl
CONEJO A+
Con A 0.65 21.67 4+ 0 1575.4 (+1)

CEL-II 0.58 19.3 0 +3 441.4 (+1)

1. La concentración se determinó por el método modificado de Bradford (64).

2. La actividad eritroaglutinante se determinó de acuerdo a la metodología
descrita por de Navarro et al (66), empleando eritrocitos de conejo y eritrocitos
humanos A+ .
3. Título específico: mayor dilución de lectina en la que se observa aglutinación,
dividido por la concentración de proteína (mg/ml) de la muestra evaluada.

Los eritrocitos humanos (A+) fueron obtenidos del Laboratorio Clínico de la

Universidad Nacional y los eritrocitos de conejo fueron suministrados por el
Laboratorio de Hematología de la Facultad de Veterinaria.
 ANEXO 2
CONCENTRACIÓN, EFECTIVIDAD DE LA MARCACIÓN Y FUNCIONALIDAD
BIOLÓGICA DE LAS LECTINAS MARCADAS CON BIOTINA

EFECTIVIDAD DE LA
LECTINA CONCENTRACIÓN MARCACIÓN ² ³ACTIVIDAD ERITROAGLUTINANTE
BIOTINILADA mg/ml ¹ A µg/100 µl AGLUTINACIÓN
µg/ml
415 nm
Con A (a) 2.25 50.0 1,135 22.5 4+

Con A (b) 0.79 50.0 1,119 23.7 4+

CEL-II (a) 0.19 37.5 1,773 19 3+

CEL-II (b) 5.23 39.2 1,611 20.92 3+

1. La concentración se determinó por el método modificado de Bradford (64).

2. La efectividad de la marcación se evaluó por el método de ELLSA.
3. La actividad eritroaglutinante se determinó de acuerdo a la metodología
descrita por de Navarro et al (66), empleando eritrocitos de conejo para evaluar la
Con A y eritrocitos humanos A+ para la CEL-II.
(a) y (b) se refieren a procesos de biotinilación realizados en ocasiones
diferentes.

Los eritrocitos humanos (A+) fueron obtenidos del Laboratorio Clínico de la

Universidad Nacional y los eritrocitos de conejo fueron suministrados por el
Laboratorio de Hematología de la Facultad de Veterinaria.
 ANEXO 2A
RESULTADOS DE LA BÚSQUEDA POR MASCOT PARA LA IDENTIFICACIÓN
DE LAS PROTEÍNAS CORRESPONDIENTES A LAS BANDAS DE
50, 25 Y 24 kDa (Fig.10, carril 1)

Base de datos: NCBI nr 20080403 (6388671 secuencias; 2180845802 residuos)

Taxonomía: Plantas verdes (477253 sequencias)

PROTEÍNAS MASA
BANDA DESCRIPCIÓN SCORE*
ACCEDIDAS (Da)
Precursor de Canavalina
50 kDa 1705573 50.410 200
(Canavalia ensiformis )
Precursor de Canavalina
115561 50.373 188
(Canavalia gladiata )
Cadena B de Canavalina
442706 20.666 125
(Canavalia ensiformis )
Cadena A de Canavalina
442705 20.989 67
(Canavalia ensiformis )
Precursor de Canavalina
24 +25 kDa 1705573 50.410 196
(Canavalia ensiformis )
Mezcla Cadenas A+B
442706 de Canavalina 193
+ 442705 (Canavalia ensiformis )
Precursor de Canavalina
115561 50.373 185
(Canavalia gladiata )
Cadena B de Canavalina
442706 20.666 113
(Canavalia ensiformis )
Cadena A de Canavalina
442705 20.989 82
(Canavalia ensiformis )
Resultado:
Banda de 50 kDa (Fig.10, carril 1): Vicilina de Canavalia ensiformis.
Bandas de 24 y25 kDa (FIg.10, carril 1): Fragmentos de proteólisis de la vicilina de
Canavalia ensiformis.

NCBI: NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION.

* Score significativo: Mayor de 69.

Análisis: página siguiente

ANÁLISIS:

El espectro de masas (PMF) de la banda de 50 kDa fue comparado con el del Precursor

de Canavalina de Canavalia ensiformis y Canavalia gladiata y con el de las cadenas A y

B de Canavalina de Canavalia ensiformis. El score de 200 obtenido con el Precursor de

Canavalina de Canavalia ensiformis, indica que la banda de 50 kDa presenta un patrón

característico de péptidos igual al del Precursor de Canavalina de Canavalia ensiformis,

lo que confirma que esta banda corresponde a la vicilina de Canavalia ensiformis.

El espectro de masas (PMF) de la mezcla de las bandas de 24 y 25 kDa fue comparado

con el del Precursor de Canavalina de Canavalia ensiformis y Canavalia gladiata, con

el de la mezcla de las cadenas A y B de Canavalina de Canavalia ensiformis y con el de

cada una de las cadenas A y B de Canavalina de Canavalia ensiformis . Los valores de

score más altos se obtuvieron con el Precursor de Canavalina de Canavalia ensiformis

y con la mezcla de las cadenas A y B de Canavalina de Canavalia ensiformis, lo que

indica que las bandas de 24 y 25 kDa corresponden a las cadenas A y B de Canavalina

de Canavalia ensiformis, es decir, a los fragmentos de proteólisis de la vicilina.

 ANEXO 3
ACTIVIDAD DE α-MANOSIDASA EN LA FRACCIÓN PURA DE VICILINA
FIGURA 19

ENSAYO 1* ENSAYO 2**

Tiempo (Seg.)
ABSORBANCIA ABSORBANCIA
400 nm 400nm
0.001 0.005 0
0.004 0.007 300
0.006 0.008 600
0.006 0.007 900
0.011 0.005 1200
0.008 0.010 1500
0.014 0.007 1800
0.014 0.009 2100
0.014 0.005 2400
0.020 0.012 2700
0.021 0.010 3000
0.014 0.012 3300
0.014 0.012 3600

*En el ensayo 1 se utilizaron 129 µg de la fracción pura de vicilina ( 30 veces más

cantidad de proteína que la utilizada para los ensayos de interacción).

**En el ensayo 2 se utilizaron 258 µg de la fracción pura de vicilina (60 veces más
cantidad de proteína que la utilizada para los estudios de interacción)

La Figura 19 se elaboró con los datos resaltados en azul, correspondientes al

ensayo 2.
 ANEXO 4
DETERMINACIÓN DEL % DE CARBOHIDRATOS EN LA VICILINA DE Canavalia ensiformis
METODO DE DUBOIS A ESCALA MICRO (76)

ENSAYOS 1 Y 2

CURVA DE CALIBRACIÓN I: ABSORBANCIA A 492 nm Vs µg DE CARBOHIDRATO

STOCK DE GLUCOSA: 1µg/ ml

CARBOHIDRATO A -1 A -2 A -3
(µg) 492 nm 492 nm 492 nm
0 0.004 0.016 0.028
2 0.078 0.085 0.079
5 0.185 0.190 0.186
10 0.299 0.377 0.392
15 0.469 0.509 0.502
20 0.617 0.698 0.728
25 0.953 0.877 0.840

Regresion lineal: b =0.0069; m = 0.03421; γ = 0.99376

VICILINA CARBOHIDRATO % DE
ENSAYO A 492 nm
(µg) (µg)* CARBOHIDRATO

1 98.63 0.143 3.98 4.04

2 100 0.152 4.24 4.24

*µg de carbohidrato obtenidos al interpolar en la curva de calibración I

 ANEXO 4
DETERMINACION DEL % DE CARBOHIDRATOS EN LA VICILINA DE Canavalia ensiformis
METODO DE DUBOIS A ESCALA MICRO (76)

ENSAYO 3
CURVA DE CALIBRACION II : ABSORBANCIA A 492 nm Vs µg DE CARBOHIDRATO

STOCK DE GLUCOSA: 0.5 µg/ ml

CARBOHIDRATO A -1 A -2 A -3
(µg) 492 nm 492 nm 492 nm
0 0.016 0.018 0.038
1 0.050 0.048 0.056
2.5 0.101 0.097 0.107
5 0.166 0.190 0.189
7.5 0.263 0.269 0.284
10 0.371 0.391 0.333
12.5 0.450 0.405 0.421

Regresion lineal: b =0.02084; m = 0.03312; γ = 0.9947

VICILINA CARBOHIDRATO % DE
ENSAYO A 492 nm
(µg) (µg)** CARBOHIDRATO

3 99.5 0.146 3.78 3.8

**µg de carbohidrato obtenidos al interpolar en la curva de calibración II

RESULTADOS DE LOS ENSAYOS 1, 2 Y 3

% DE
% DE CARBOHIDRATO
ENSAYO
CARBOHIDRATO PROMEDIO EN LA
VICILINA

1 4.04
2 4.24 4.03 ≈ 4.0
3 3.80
 ANEXO 5
INTERACCIÓN Con A-VICILINA
(METODO DE ELLSA)
FIGURA 25

INTERACCIÓN CON 2.15 µg DE VICILINA :

Ensayo 1 Ensayo 2 *A promedio Con A ¹

A 415 nm A 415 nm 415 nm µg
0 0.024 0.012 0.0026
0 0 0 0.013
0.022 0.030 0.026 0.065
0.092 0.119 0.106 0.32
0.406 0.435 0.421 1.62
0.705 0.892 0.799 8.08

INTERACCIÓN CON 4.3 µg DE VICILINA :

Ensayo 1 Ensayo 2 **A promedio Con A ¹

A 415 nm A 415 nm 415 nm µg
0 0 0 0.0026
0 0 0 0.013
0.024 0.015 0.02 0.065
0.218 0.203 0.211 0.32
0.857 0.870 0.864 1.62
1,192 1,527 1.36 8.08

% Con A **A promedio *A promedio

Con A ¹ Con A¹
respecto a 415 nm 415nm
4.3 µg de vicilina µg µg / ml
4.3 µg vicilina 2.15 µg vicilina
0.06 0 0.012 0.0026 0.032
0.3 0 0 0.013 0.16
1.5 0.02 0.026 0.065 0.81
7.4 0.211 0.106 0.32 4.04
37.7 0.864 0.421 1.62 20.2
187.9 1.36 0.799 8.08 101

1.En todos los ensayos se empleó Con A (a) ( ver Anexo 2).

La Figura 25 se elaboró con los datos resaltados en azul, correspondientes al

promedio de cada una de las determinaciones.
 ANEXO 6
INTERACCIÓN Con A-VICILINA y Con A-FRAGMENTOS DE PROTEÓLISIS
(METODO DE ELLSA)
FIGURA 26

CURVA A: INTERACCIÓN ConA-VICILINA

Con A * Con A *
A 415 nm µg µg / ml
0.393 0.32 4

0.931 1.60 20

1,648 8.00 100

La curva A de la Figura 26 se elaboró con los datos resaltados

en azul.

CURVA B: INTERACCIÓN Con A-FRAGMENTOS DE PROTEÓLISIS

ENSAYO 1 ENSAYO 2 A 415 nm Con A * Con A *

A 415 nm A 415 nm PROMEDIO µg µg / ml
0.019 0.007 0.013 0.32 4

0.026 0.025 0.026 1.60 20

0.157 0.213 0.185 8.00 100

* Para todos los ensayos se empleó Con A (b) (ver Anexo 2).
La curva B de la Figura 26 se elaboró con los datos resaltados
en azul.
 ANEXO 7
FIGURA 34

II : INTERACCIÓN Con A-VICILINA DEGLICOSILADA

CURVA A

ENSAYOS 1 Y 2

Con A* Con A * ENSAYO 1 ENSAYO 2

µg µg / ml
A 415 nm A 415 nm

0.32 4 0.010 0.009

1.6 20 0.029 0.019
8 100 0.090 0.084

PROMEDIO DE LOS ENSAYOS 1 Y 2

Con A *
A 415 nm
µg

0.0095 0.32
0.0240 1.6
0.0870 8

*Para los ensayos 1 y 2 se empleó Con A (b) (ver Anexo 2).

La curva A de la Figura 34 se elaboró con los datos

resaltados en azul, corespondientes al promedio de los
Ensayos 1 Y 2.
 ANEXO 7
FIGURA 34

III : INTERACCIÓN Con A / Man*-VICILINA GLICOSILADA

CURVA B

ENSAYOS 1 Y 2

Con A* * Con A * * ENSAYO 1 ENSAYO 2

µg µg / ml
A 415 nm A 415 nm

0.32 4 0.032 0.020

1.6 20 0.047 0.037
8 100 0.157 0.220

PROMEDIO DE LOS ENSAYOS 1 Y 2

Con A * *
A 415 nm
µg

0.026 0.32
0.042 1.6
0.189 8

** En los Ensayos 1 y 2 se empleó Con A (b) ver Anexo 2.

La curva B de la Figura 34 se elaboró con los datos resaltados en

azul corespondientes al promedio de los Ensayos 1 Y 2.

*Con A / Man : Con A preincubada con α-D-Me- Man.

 ANEXO 7

EFECTO DE LA DEGLICOSILACIÓN DE LA VICILINA

Y LA PREINCUBACIÓN DE LA LECTINA CON α- D- Me-Man
(METODO DE ELLSA)
FIGURA 34

I : INTERACCIÓN Con A-VICILINA GLICOSILADA

CURVA C

ENSAYOS 1 Y 2

Con A * Con A * ENSAYO 1 ENSAYO 2

µg µg / ml
A 415 nm A 415 nm

0.32 4.04 0.218 0.203

1.62 20.2 0.857 0.870
8.08 101 1,192 1,527

ENSAYOS 3 Y 4

Con A ** Con A ** ENSAYO 3 ENSAYO 4

µg µg / ml
A 415 nm A 415 nm
0.32 4 0.175 0.229

1.60 20 0.902 0.782

8.00 100 1,126 1,165

PROMEDIO DE LOS ENSAYOS 1, 2, 3 Y 4

Con A
A 415 nm
µg

0.206 0.32
0.854 1.60
1,253 8.00

* En los Ensayos 1 y 2 se empleó Con A (a) (ver Anexo 2).

** En los Ensayos 3 y 4 se empleó Con A (b) (ver Anexo 2).

La curva C de la Figura 34 se elaboró con los datos resaltados en azul

correspondientes al promedio de los ensayos 1, 2, 3 y 4.
 ANEXO 8
INTERACCIÓN CEL-II-VICILINA
(METODO DE ELLSA)
FIGURA 41

CURVA A: INTERACCIÓN CON 2.15 µg DE VICILINA

CEL-II * CEL-II * ENSAYO 1

µg / ml µg A 415 nm
1.2 0.060 0.000
2.3 0.115 0.000
4.69 0.235 0.000
9.38 0.469 0.018
18.75 0.938 0.042
37.5 1,875 0.146

CURVA B: INTERACCIÓN CON 4.3 µg DE VICILINA

ENSAYO 1 ENSAYOS 2 Y 3
CEL-II * CEL-II * ENSAYO 1 CEL-II ** CEL-II ** ENSAYO 2 ENSAYO 3
µg / ml µg A 415 nm µg / ml µg A 415 nm A 415 nm
1.2 0.060 0.000 ___ ___ ___ ___
2.3 0.115 0.000 2.5 0.125 0.035 0.025
4.69 0.235 0.000 4.9 0.250 0.041 0.035
9.38 0.469 0.000 9.8 0.490 0.044 0.042
18.75 0.938 0.039 19.6 0.980 0.062 0.057
37.5 1,875 0.160 39.2 1,960 0.148 0.142

Los datos resaltados en azul muestran que entre 0.9 y 2.0 µg de CEL-II la
magnitud de la interaccion con la vicilina es aproximadamente igual e
independiente de si se emplean 2.15 ó 4.3 µg de vicilina.
* En el Ensayo 1 en cada caso se empleó CEL-II (a) (ver Anexo 2).
** En los Ensayos 2 y 3 se empleó CEL-II (b) ( ver Anexo 2).
Para la elaboración de la Figura 41 se emplearon los datos del Ensayo 1 en
cada caso, los cuales se resumen en la siguiente tabla:

A 415 nm A 415 nm
2.15 µg de 4.3 µg de CEL-II *
vicilina vicilina µg
(CURVA A) (CURVA B)
0.000 0.000 0.060
0.000 0.000 0.115
0.000 0.000 0.235
0.018 0.000 0.469
0.042 0.039 0.938
0.146 0.160 1,875
 ANEXO 9
INTERFERENCIA DE LA BSA EN LA MEDIDA DE LA INTERACCIÓN CEL-II-VICILINA
(METODO DE ELLSA)
FIGURA 46

CURVA A: INTERACCIÓN CEL-II-VICILINA EN PRESENCIA DE BSA

ENSAYO 1 ENSAYO 2 A 415 nm CEL-II * CEL-II *

A 415 nm A 415 nm PROMEDIO µg µg / ml
0.035 0.025 0.030 0.125 2.5
0.041 0.035 0.038 0.250 4.9
0.044 0.042 0.043 0.490 9.8
0.062 0.057 0.060 0.980 19.6
0.148 0.142 0.145 1,960 39.2
0.210 0.243 0.227 3,930 78.5

La curva A de la Figura 46 se elaboró con los datos resaltados

en azul.

CURVA B: INTERACCIÓN CEL-II-BSA

ENSAYO 1 ENSAYO 2 A 415 nm CEL-II * CEL-II *

A 415 nm A 415 nm PROMEDIO µg µg / ml
0.022 0.007 0.015 0.125 2.5
0.039 0.035 0.037 0.250 4.9
____ 0.029 0.029 0.490 9.8
0.050 0.043 0.047 0.980 19.6
0.078 0.067 0.073 1,960 39.2
0.101 0.093 0.097 3,930 78.5

La curva B de la Figura 46 se elaboró con los datos resaltados

en azul.

CURVA C : INTERACCIÓN NETA CEL-II-VICILINA

ENSAYO 1 ENSAYO 2 A 415 nm CEL-II * CEL-II *

A 415 nm A 415 nm PROMEDIO µg µg / ml
0.013 0.021 0.017 0.125 2.5
0.002 0.000 0.001 0.250 4.9
____ 0.013 0.013 0.490 9.8
0.012 0.014 0.013 0.980 19.6
0.070 0.075 0.073 1,960 39.2
0.109 0.150 0.130 3,930 78.5

La curva C de la Figura 46 se elaboró con los datos resaltados

en azul.
* Para las curvas A, B y C se empleó CEL-II (b) (ver Anexo 2).
 ANEXO 10
INTERACCIÓN CEL-II-VICILINA Y Con A-VICILINA
(METODO DE ELLSA)
FIGURA 47

CURVA A: INTERACCIÓN Con A-VICILINA

A PROMEDIO Con A
415 nm µg
0.206 0.32
0.854 1.60
1,253 8.00

Los datos de la curva A de la Figura 47 corresponden al promedio de 4 ensayos ( ver

Anexo 7 , curva C ).

CURVA B : INTERACCIÓN CEL-II-VICILINA

A PROMEDIO CEL-II
415 nm µg
0.017 0.125
0.001 0.250
0.013 0.490
0.013 0.980
0.073 1,960
0.130 3,930

Los datos de la curva B de la Figura 47 corresponden a la interaccion neta CEL-II-vicilina

( ver Anexo 9 , curva C ).
 ANEXO 11
PROPORCIÓN CEL-II-VICILINA EN EL ESTUDIO DE INTERACCIÓN
(METODO DE ELLSA)

Melgarejo et al. (11) aislaron de la semilla de Canavalia ensiformis 2131.9 mg de

proteína total, a partir de la cual se obtuvieron 10.6 mg de la lectina CEL-II pura. Esto
indica que la lectina CEL-II corresponde aproximadamente al 0.5% de la proteína total
de la semilla. Si de otro lado se considera que en C. ensiformis la vicilina constituye
cerca del 50% de la proteína total (34), entonces la relación CEL-II: Vicilina en la semilla
es aproximadamente 1:100, es decir que la CEL-II corresponde a un 1% de proteína con
respecto a la fracción de vicilina.

En el ensayo de interacción CEL-II-Vicilina en el que se emplearon 4.3 µg de vicilina y

CEL-II en un rango de 0.125-3.93 µg (Figuras 46 y 47, Anexos 9 y 10), la lectina
corresponde a un 2.9-91.4% con respecto a la vicilina, es decir que la lectina se
encuentra en una proporción mucho mayor a la que se encuentra “in vivo” en la
semilla.