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DISEÑO DE FERMENTADORES O BIORREACTORES

Un fermentador es un recipiente que permite el crecimiento de microorganismos en un medio de
cultivo de composición adecuada o la actividad de enzimas y en el que se pueden controlar parámetros
tales como la temperatura, pH, aireación, etc… y de esta manera obtener un crecimiento máximo del
microorganismo y, por lo tanto, una óptima producción del compuesto de interés, o que la enzima
realice su función en condiciones óptimas.

Biocatalizador: enzimas, microorganismos, células o estructuras subcelulares que aseguran el

funcionamiento óptimo en el biorreactor

Otros servicios:

- Agua fría y caliente

- Vapor de agua
- Electricidad
- Aire comprimido
- Almacén de sustratos

El fermentador se diseña a medida del proceso y fomenta la optimización para brindar una actividad
metabólica adecuada al microorganismo y por tanto un crecimiento celular máximo.

Tipos de fermentadores:

- En torre
- Conico o cilindrico
- Ciclonal
- “air lift” o aire ascendente

Pueden ser para enzimas (inmovilizadas) o para microorganismos (a veces inmovilizados) ya sean
aerobios o anaerobios. Se lleva a cabo en una planta piloto o puede ser un fermentador de producción.

Aspectos a tener en cuenta en el diseño del fermentador:

- Mínimo consumo de energía.

- Control de pH, temperatura, espumas.
- Facilidad para la obtención de muestras, limpieza, mantenimiento.
- Materiales baratos en su construcción.
- El recipiente y el sistema de aireación/agitación.

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RECIPIENTE:

- Construidos en cristal o acero

- Superficies lisas
- Debe soportar repetidas esterilizaciones
- El control de la temperatura se puede hacer mediante camisas y/o serpentines

Sistema de 3 fases:

- Fase líquida: sales disueltas, sustratos y metabolitos.

- Fase sólida: células individuales, micelio, sustratos insolubles o productos del metabolito que
precipitan.
- Fase gaseosa: reservorio para el suministro de O2, eliminación del CO2 o ajuste del pH con amonio
gaseoso

SISTEMA DE AIREACIÓN/AGITACIÓN

Es importante porque sirve para:

- Incrementar la tasa de transferencia de calor entre el medio y las superficies de refrigeración.

- Incrementar la transferencia de productos metabólicos desde la célula al medio.
- Que no se produzcan agregados celulares.
- Homogeneizar los nutrientes, oxígeno y biomasa en el interior de la fermentación.
- Incrementar la transferencia de oxígeno desde las burbujas al medio (burbujas pequeñas)

La velocidad y el tipo de agitación puede afectar a la producción: micelios o filamentos.

Este sistema puede ser de dos tipos:

- De burbujeo: Se usa en fermentadores en los que la relación altura/diametro es 5/1. No se usa

cuando la biomasa es filamentosa
- Mecánico : Tiene componentes estructurales. Sus estructuras principales son:
o Agitador propiamente dicho.
o Eje de agitación.
o Deflectores.
o Sistemas de aireación.

FERMENTACIONES EN SUSTRATOS SOLIDOS (FSS)

EL SALTO DE ESCALA
El escalado es el paso desde la producción en el laboratorio hasta la producción industrial.

Matraz → fermentador de laboratorio → planta piloto → fermentador de producción

Dificultades:

- Un problema es de ingeniería, es decir el diseño del fermentador. Debe conocerse la biología del
microorganismo para prever como afecta a la producción el cambio de volumen de trabajo y de
operación.
- Otro problema es el sistema de aireación/agitación.

Es necesario cuando se trata de un proceso nuevo o de una fermentación que se realiza en una planta
nueva. También cuando se trata de mutantes con mayor rendimiento (10-20%).

TECNOLOGIA DE LA FERMENTACION
ESTERILIZACION DE MATERIALES

La contaminación es un problema ya que disminuye la producción al encontrarse la biomasa

contaminada y además provoca el desplazamiento en fermentaciones continuas. También produce
problemas en la extracción ya que degrada el producto cuando el virus lo lisa. Por ello es necesario:

- Usar inóculos no contaminados

- Esterilizar el medio de cultivo
- Esterilizar el fermentador y cañerías
- Esterilizar los materiales que se añadan al fermentador durante la producción
- Mantener la esterilización durante la fermentación

La esterilizacion se puede hacer con:

- Procesos físicos
O Calor (Seco / Húmedo)
O Irradiación (UV / Ionizantes)
O Filtración (Filtros absolutos / filtros profundos)
- Agentes químicos
O Gases
O Líquidos
QUE USAR EN CADA ESTERILIZACION:

- Esterilización del fermentador y cañerías → CALOR HUMEDO

- Esterilización de aditivos durante la fermentación → CALOR HUMEDO, continuo o discontinuo, Y
FILTRACION
- Esterilización del aire de entrada y salida → FILTRACION

1. CALOR

Es el método mas usado. Las endosporas bacterianas son las más resistentes al tratamiento por calor.

Se debe tener en cuenta:

- Tipo de calor:
o Húmedo: mata por la desnaturalización de los componentes celulares
▪ Tindalización: Es un método de esterilización por calentamiento intermitente con
objeto de matar células vegetativas y endosporas (al dejarlas germinar). Calentar a
80ºC 30’. Incubar 24 h a 35º C. Volver a repetir este proceso de 3 a 5 días sucesivos.
▪ Vapor de agua: Es un método de esterilización por calentamiento y presión. Las
temperaturas alcanzadas a distintas presiones son: 1 at (121ºC); 1,5 at (126ºC) y 2 at
(134ºC). Se usa el AUTOCLAVE.

o Seco: mata por la oxidación de los componentes celulares. Sirve para esterilizar material de
vidrio, metales, objetos termoestables.
▪ Flameado
▪ Incineración
▪ Hornos pasteur: 160ºC 2h; 170ºC 1h; 180ºC 30’.
- Tiempo de aplicación
- Temperatura alcanzada.

CINETICA DE MUERTE POR CALOR HUMEDO:

El tiempo de reducción decimal (D) es el tiempo necesario para reducir la población en un 90% a una
temperatura dada. Relacionado con este valor está el valor Z, que es la variación de temperatura
necesaria para variar D en un valor de 10.

Hay que tener en cuenta que sería muy laborioso calcular todas las constantes y hacer los cálculos para
los distintos tipos de microorganismos. Por eso se usa Geobacillus stearothermophilus.

METODOS DE ESTERILIZACION INDUSTRIAL:

- DISCONTINUO
La temperatura máxima que se puede alcanzar es de 121º
Tiene un alto gasto de energía
Los nutrientes se deterioran más fácilmente que en el método continuo

Se puede realizar de dos formas:

o Directa
▪ Inyectando vapor de agua directamente en el medio.
▪ Mediante resistencias eléctricas.
o Indirecta:
▪ Inyectando vapor de agua en camisas y serpentines

- CONTINUO
No tiene un alto gasto de energía
Los nutrientes no se deterioran
La temperatura máxima que se puede alcanzar es de 140-144º
La instalación es más costosa.
Se puede realizar de dos formas:
o Por intercambio de calor
 o Por inyección de vapor

Restricciones de uso:
o No se usa cuando las partículas insolubles del medio de cultivo son 1 a 2 mm.
o No se usa si el medio es muy rico en almidón.
o Si el medio es rico en sales pueden darse precipitaciones en las tuberías, disminuyendo en
gran medida la efectividad

2. RADIACION

Actúan destruyendo o dañando el ADN. La eficiencia depende de la longitud de onda, intensidad y

duración.

a. UV
Se utiliza para desinfectar superficies, aire y algunos líquidos, pero tiene una capacidad de
penetración muy baja y es absorbida por el cristal.
Es un tipo de radiación que es peligrosa ya que daña la piel y los ojos por exposición directa
a la misma
b. IONIZANTES: Rayos X y ϒ
Se llaman ionizantes porque al interactuar con la materia producen la ionización de los
átomos de la misma, es decir radicales libres.
Penetran en la materia más.
Más caros de usar y presentan problemas de seguridad.
Generalmente se usan para tratar alimentos o materiales de plástico de laboratorio.

SUSTRATOS PARA LA FERMENTACION INDUSTRIAL

Elementos necesarios para la síntesis de material celular y de productos metabólicos.

Los medios de cultivo están adaptados al proceso y puede haber distintos medios para distintas etapas.
Este medio de cultivo condiciona el diseño del fermentador, el rendimiento de la producción y la
aparición de problemas.

En la fermentación industrial se utilizan sustratos complejos. Por ello tenemos una serie de
requerimientos:

- Optimamente equilibrado
- Composición adaptada
- Evitar la represión catabólica
- Recuperación del producto.
Se debe realizar una fermentación de prueba previa para analizar la relación costes del material vs
rendimiento del producto.

Se necesita:

1. Fuente de carbono
a. Glucosa y sacarosa
b. Melaza
c. Extracto de malta
d. Almidón y dextrinas
e. Líquidos sulfíticos de papeleras
f. Celulosa
g. Aceites vegetales
h. Metanol
i. Etanol
j. Alcanos
2. Fuente de nitrógeno
a. Inorgánicas: sales de amonio, nitratos
b. Orgánicas: proteínas, aminoácidos, urea
c. Residuos:
i. líquido de maceración del maíz (4% de N2)
ii. extractos de levadura
iii. peptonas(carne, caseína, gelatina, queratina, semillas de cacahuete, etc)
iv. harinas de semillas (soja: antibióticos)
v. Pharmamedia®: semilla de algodón, baja temperatura
3. Agua: se trata de un recurso continuo ya que su composición es constante y se puede reciclar.
Aguas residuales → fangos activados → coagulación/floculación → filtración con arena →
ozonización → Filtro de carbón activo biológicamente granulado → agua procesada limpia
4. Minerales: (K+ , Mg++ , Ca++ , Fe++) interacciones entre los minerales.
5. Fosforo Pi [0,300 mM]
a. estimula metabolismo primario
b. inhibe fosfatasas (metabolitos secundarios)
c. exceso de Pi: NADPH2 factor limitante
6. Factores de crecimiento: existen concentraciones óptimas.
7. Tampones: control del pH
8. Precursores, inhibidores, inductores: permiten manipular la fermentación.
a. Precursores: propionato, glicina, acido antracilico, cianidas, etc
b. Inhibidores: bisulfito de sodio, bromoamida, penicilina, metales alcalinos…

c.
Inductores: pueden ser químicos o naturales.
Ej: maltosa, acido fenilacetico, celulosa, pectinas…
9. Oxigeno: Su disponibilidad viene condicionada por el tipo del metabolismo del
microorganismo, sistema de aireación/agitación.
10. Antiespumantes: Son tensoactivos (alcoholes, ésteres, siliconas, sulfonatos etc…). Se añaden
en el momento apropiado. Se busca que:
▪ Sean rápidos
▪ Actúen a bajas concentraciones
▪ Efecto duradero
▪ No tóxicos
▪ No den problemas en el “downstream processing”
▪ Baratos
▪ Esterilizables
A la hora de realizar una fermentación industrial debemos tener en cuenta:

- Solubilidad de los componentes del medio

- Luz
- Temperatura
- Fase gaseosa
- Etapa: crecimiento/producción de metabolito

SISTEMAS DE FERMENTACION

1. DISCONTINUO (“BATCH”)
Es un sistema cerrado.
La producción implica acabar una
fermentación, limpiar el
fermentador, inocular, iniciar una
nueva fermentación….
La cinética es la típica de un
microorganismo en un medio de
cultivo.
Se duplica la biomasa:

La velocidad de crecimiento
alcanzada (µ) depende de:
▪ Microorganismo
▪ Temperatura
▪ Ph
▪ Actividad del agua
▪ Concentración de nutrientes. Se estudia con la ecuación de
Monod
Se puede aumentar la producción mediante un mecanismo de crecimiento diauxico. Se observa
una curva de crecimiento bifásica debido a la utilización secuencial de distintas fuentes de
carbono. El metabolismo del organismo es selectivo para
uno de los sustratos (se usa la fuente de carbono que
permite un crecimiento más rápido) y cuando la agota,
comienza a metabolizar el otro. En bacterias lácticas, por
ejemplo, se produce un crecimiento diaúxico en medios
de cultivo que contienen una mezcla de glucosa y lactosa.
VENTAJAS:
▪ Corta duración
▪ Menor probabilidad de contaminación
▪ Fácil de controlar
▪ Separación por lotes
INCONVENIENTES:
▪ Los productos se mezclan con los nutrientes, toxinas, reactivos, etc
▪ Menos productivo
 2. DISCONTINUO ALIMENTADO (“FEED-BATCH”)
Es un sistema cerrado.
Los nutrientes se van añadiendo a intervalos a lo largo del proceso para evitar efectos de
represión catabólica.
VENTAJAS:
▪ Permite extender la duración del cultivo
▪ Se puede usar para activar o inactivar genes, cambiando el sustrato
▪ Permite optimizar la producción modificando la alimentación
INCONVENIENTES:
▪ Se acumulan toxinas e inhibidores
▪ Aumenta las posibilidades de contaminación
▪ Puede llevar a una densidad celular demasiado elevada, dificultando el downstream

3. CONTINUO
Es un sistema abierto, es decir, se va añadiendo un volumen de medio al fermentador y se va
retirando, al mismo tiempo, igual volumen de medio.
Se distinguen dos tipos de sistemas continuos:
a. De flujo de tapón
La cinética de crecimiento de la biomasa es igual a lo que ocurre en el sistema
discontinuo.
V1→ V2 V1=V2
b. De mezcla completa
Semejante a un quimiostato o
turbidostato. Suelen ser
fermentadores pequeños.
La variación de la biomasa en estas
condiciones sería la siguiente:

siendo D la velocidad de dilucion.

Pueden ocurrir 3 casos:
1. µ > D→ la variación de la
biomasa es positiva
2. µ = D → la variación de la
biomasa es cero. Se denomina ESTADO ESTACIONARIO
3. µ < D → la variación de la biomasa es negativa
VENTAJAS:
▪ Máxima productividad
▪ Reduce el tiempo de limpiado y el manejo del sistema
▪ Permite un estado constante para estudios metábolicos
INCONVENIENTES:
▪ Difícil mantener una densidad celular constante en periodos largos
▪ No se pueden obtener lotes individuales
▪ Se incrementa el riesgo de contaminación

TRANSFERENCIA DE O2

El oxígeno es indispensable para la mayoría de las fermentaciones, lo que lo convierte también en un

factor limitante.
La [SatO2] en medio acuoso es baja, por lo que debemos tener un suministro continuo de O2 (aire). Esto
hay que tenerlo en cuenta a la hora de diseñar el biorreactor y la fermentación. Este suministro
continuo de O2 tambien es necesario para cubrir las necesidades del organismo.

Sin embargo, el O2 tiene varias limitaciones:

O Es poco soluble en agua

O La solubilidad disminuye en presencia de otros ingredientes
O La solubilidad disminuye al aumentar la temperatura
O La adición de antiespumantes reduce la solubilidad hasta en un 50%

La solubilidad se justifica con la LEY DE HENRY: a una Tª cte, la cantidad de gas disuelta en un líquido es
directamente proporcional a la Pa que ejerce ese gas sobre el líquido.

Es necesario conocer y calcular que cantidad de oxígeno va a estar disponible para la biomasa. Es decir
la transferencia de oxígeno.

La transferencia de oxigeno desde la burbuja hasta el microorganismo es la siguiente:

La ecuacion matematica que lo define es:

Como no se puede calcular Kl y a por separado, se calculan juntas, constituyendo el Kla (coeficiente de
transferencia de oxígeno).

Kla: capacidad de aireación del fermentador y que influye en la velocidad de transferencia. Depende del
fermentador (diámetro, capacidad, rpm, sistema de aireación, velocidad de flujo), del medio de cultivo
(densidad, viscosidad, antiespumante), de las condiciones de fermentación (Tª) y del µorganismo.

El Kla se puede calcular por diferentes métodos:

- Medida directa de la velocidad de transferencia de oxígeno.

- Mediante la medida de crecimiento microbiano
- Método del consumo de oxígeno
La velocidad de transferencia es la pendiente de la tangente en cada
punto.
La pendiente va disminuyendo, con lo que la velocidad también, ya que
(C*-Cl) disminuye.

o METODO ESTATICO:
Se burbujea Nitrógeno, hasta eliminar el oxígeno, y luego se
vuelve a burbujear el oxígeno.

o METODO DINAMICO:
Se para la entrada del aire durante la fermentación lo que implica consumo de oxígeno por
los microorganismos.
Llegando a un punto crítico se vuelve a airear.
Concentración crítica de O2 : velocidad específica de absorción de O2 que permite la
respiración.
Tramo A-B, es la velocidad de consumo de oxígeno: “x QO2”
La formula de la velocidad de transferencia es en condiciones
de fermentación:

PRODUCTIVIDAD

Rendimiento: indica la cantidad de producto que se obtiene del sustrato.

Productividad específica: es la producción obtenida por unidad de tiempo. Se puede obtener de datos
experimentales o de modelos matemáticos.

Durante el proceso de fermentación siempre hay dos etapas:

- T1: No obtenemos producto (preparación + fase latencia)

- T2 : se obtiene producto progresivamente hasta un límite

OPTIMIZACION DE LA PRODUCCION:

- EN UN SISTEMA DISCONTINUO:
O
O La pendiente de 1 es la productividad maxima mientras
que la pendiente de 2 es la
productividad total
O Se optimiza disminuyendo t1
- En un sistema continuo
O Se optimiza aumentando t2
PARAMETROS MONITORIZADOS EN UNA FERMENTACION

Monitorizamos parámetros como la temperatura, la presión, la velocidad de agitación, el volumen de

liquido, la viscosidad aparente…

La monitorización puede ser:

1. MANUAL: nosotros mismos medimos los parametros cuando queremos

2. AUTOMATICA: es el propio sistema el que mide los parametros

En una monitorizacion automatica es necesario el tratamiento de la señal.

Vemos dos gráficos:

▪ El primero se trata de un sistema de ON/OFF para controlar la temperatura. Cuando la

temperatura alcanza el mínimo establecido, se enciende automáticamente el
calefactor para aumentarla hasta que alcanza el máximo. Una vez ha alcanzado el
máximo se apaga automáticamente para disminuir la temperatura y así
sucesivamente. Este sistema no es optimo ya que hay mucha desviación de la
temperatura.
▪ En el segundo grafico si encontramos un sistema optimo ya que no hace falta esperar
al mínimo o máximo de temperatura para activar el sistema ON/OFF. El aparato
prevee la variación de temperatura y activa el sistema antes, disminuyendo la
oscilación de temperatura que disminuye la optimidad.

Otras variables que pueden influir:

- Medida: variable física, química o biológica. Método analítico e instrumentos.

- Seguimiento: información constante sin intervención ni alteración.
- Modelado: descripción de relaciones entre causa y efecto, mediante calibración o experiencia.
- Control: tomar información, procesarla y aplicarla para ajustar variables.
RECORDAMOS EL ESQUEMA DE PRODUCCION INDUSTRIAL:

[Link]ón o upstream

[Link]ón o downstream

[Link] del producto

Ya hemos terminado el punto 1. Fermentación. Vamos a comenzar el punto 2. Extracción:

EXTRACCION Y PURIFICACION DE PRODUCTOS

El “downstream” pretende obtener un producto de alta calidad lo más rápido posible con una alta
eficiencia y utilizando el menor equipo y productos de extracción (>calidad, <tiempo y equipo).

ESQUEMA GENERAL DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN:

En primer lugar procederemos a la separación de sustancias insolubles, seguido de la extracción. luego

utilizaremos métodos de concentración y purificación para obtener el producto final.

la separación se plantea desde que se diseña la fermentación para evitar en todo lo posible problemas
durante dicho proceso.

La selección del método que se quiera emplear depende de:

- el producto final que queramos

- su concentración
- productos laterales presentes
- estabilidad del material biológico
- grado de purificación necesario. esto va a depender de los métodos de concentración y purificación.

1. ELIMINACIÓN DE COMPUESTOS INSOLUBLES:

a. métodos gravitacionales
i. centrifugación:
es un proceso que se da en continuo.
puede ser en cubo, multicámara, de decantación o separador de placas.
ii. Floculación:
células 1-10 µm.
Sales orgánicas, polielectrolito orgánico o hidrocoloide mineral.
Ayuda a que las células se adhieran entre sí y precipiten permitiendo eliminar
sustancias insolubles.
b. métodos de acción superficiales
i. adsorción
ii. intercambio iónico
iii. flotación: Las partículas sólidas insolubles se introducen dentro de una
burbuja de gas formando conjuntos y haciendo que coagulen facilitando la
separación.
 c. métodos mecánicos
i. filtración:
Este proceso que se da en continuo.
puede ser estática, a contracorriente, en casete, de tambor o rotatorio de
discos.
También existe la ultrafiltración, para partículas de 0.001 - 0.1 µm.
ii. diálisis
iii. ósmosis inversa
d. métodos eléctricos
i. electroforesis
ii. electrodiálisis
iii. electroosmosis

2. EXTRACCION LIQUIDO- LIQUIDO

3. CROMATOGRAFIA
Separación de solutos de un líquido cuando este se eluye a través de una matriz sólida.
Depende de la hidrofobicidad (adsorción), intercambio iónico, filtración y afinidad.
4. CRISTALIZACIÓN
Es un método de concentración. Se suele utilizar para ácidos orgánicos y aminoácidos.
Ej: acido citrico
5. PRECIPITACION
Se puede utilizar para precipitaciones selectivas de sustancias.

6. DESECACION
Puede ser el último estado en el proceso de extracción.
▪ Desecador de tambor
▪ Desecador de gas
7. EXTRACCION DE PRODUCTOS INTRACELULARES