@A_FARMAUAH

TEMA 5: INTERFERONES
CITOCINAS
Las citocinas son proteínas que regulan la función de las células que las producen y/u otras células, sean
del mismo tipo o diferentes. Son los agentes responsables de la comunicación intercelular, inducen la
activación de receptores específicos de membrana, funciones de proliferación y diferenciación celular,
quimiotaxis, crecimiento y modulación de la secreción de inmunoglobulinas,... Son producidas,
fundamentalmente, por los linfocitos y los macrófagos activados, aunque también pueden ser
producidas por leucocitos polinucleares y células endoteliales, epiteliales y del tejido conjuntivo. Según
la célula que las produzca se denominan linfocinas (linfocito), monocinas (monocitos) o interleucinas
(células hematopoyéticas). Juegan un importante papel en la inmunidad, inflamación, remodelado de
tejidos y desarrollo embrionario.

En cuanto a su peso molecular:

INTRODUCCION A LOS INTERFERONES

Los interferones (IFNs), son proteínas producidas por las células eucariotas en respuesta a infecciones
virales, tumores y otros inductores biológicos.

Los interferones son capaces de promover un “estado antiviral” en células adyacentes.

Los interferones son una amplia familia de proteínas y exhiben otras muchas actividades relacionadas
con la inmunidad (modulan la respuesta inflamatoria, inhiben o estimulan el crecimiento celular,
producen o inhiben apoptosis y modulan otros muchos componentes del sistema inmune).

FUNCIONES:

- Antiviral
- Activación de células natural killer
- Proliferación de células T y memoria celular
- Intercambio de tipo de anticuerpo en células B
- Supervivencia de células T
- Apoptosis
- Angiogénesis
- Activación y maduración de DC.

TIPOS:

1. Interferones tipo I (18):

a. primer subgrupo (α), 13 polipéptidos glicosilados estructuralmente relacionados,
denominados genéricamente IFN-α (IFN-α1, IFN-α2…). La principal fuente son los
fagocitos mononucleares pCDs (interferón leucocitario).
b. El segundo subgrupo (β) de IFN tipo I, se trata de un solo producto génico
(glicoproteína) y se le denomina IFN-β. También son de tipo I, menos conocidos, IFN-ε,
IFN-κ, IFN-τ y IFN-ω). Su fuente natural son los fibroblastos (interferón del fibroblasto),
también pCDs y macrófagos. Otros muchos tipos de células pueden sintetizar ambos
tipos de interferones.

Funciones biológicas de los IFN tipo I:

o Inhibición de la replicación viral.

o Inhibición de proliferación celular.
 o Aumento del potencial lítico de las células NK.
o Modulación de la expresión del MHC (tipo I).

2. Interferones tipo II: El interferón-γ (IFN- γ) es una glicoproteína homodimérica con distinto
grado de glicosilación (21-24 kD). Lo producen las células cooperadoras T CD4+ y la mayoría de
las T CD8+, también células NK, CDs, macrófagos…
Funciones biológicas de los IFN tipo II:
o Induce estado antiviral y es antiproliferativo (diferente receptor que IFN I).
o Potente activador de los fagocitos mononucleares.
o Actúa sobre los linfocitos T y B para promover su diferenciación.
o Aumenta la expresión del MHC (tipo I y II).
o Activa neutrófilos.
o Estimula la actividad citolítica de las células NK, en mayor medida que IFN I.
o Activador de las células endoteliales

INTERFERONES COMO ANTIVIRALES

Los interferones con actividad antiviral son principalmente los de tipo I (ALFA Y BETA)

Funciones:

- Inducen a resistencia contra la replicación viral en todas las células

- Aumentan la expresión de ligandos para receptores en células natural killer
- Activa las células natural killer para matar células infectadas por virus
INTERFERON COMO ANTITUMORAL

Los interferones tipo 1 son los que tienen un papel fundamental como antitumorales. Entre sus
funciones encontramos:

- Inhibición de la proliferación de tumores: se consigue disminuyendo:

o C-myc
o Ciclinas y cdk
o Actividad telomerasa
Aumenta además la actividad de p53.
- Promueve la apoptosis de las células tumorales
o Aumentando TRAIL, Fas, citocromo C
o Disminuyendo XIAP
- Inhibe la angiogénesis tumoral
 o Disminuye VEGF y bFGF
o Aumenta los inhibidores de la angiogénesis ISGs
- Inhibe la migración del tumor disminuyendo la adhesión célula-celula y la adhesión célula-ECM
- Desencadena muchas respuestas antitumorales como:
o Activación de células T, natural killer y DC
o Inhibición de células T reguladoras y MDSC.
o Aumentan además las citoquinas antitumorales y la actividad de las células inmunes.

RESUMEN:

Papel positivo de los interferones de tipo I (IFN-Is) en la respuesta antitumoral. Los IFN-Is pueden
mejorar la respuesta antitumoral de múltiples maneras.

a) Los IFN-Is inhiben la proliferación de células tumorales mediante la regulación a la baja de la

expresión de algunos protooncogenes que promueven la proliferación celular, la regulación al alza de la
expresión de genes supresores de tumores, la reducción de la expresión de ciclina y cdk, y la inhibición
de la sobreactivación de la telomerasa.

b) Los IFN-Is promueven la apoptosis de las células tumorales a través de las vías extrínseca e intrínseca.
En la vía extrínseca de la apoptosis, los IFN-Is regulan al alza la expresión de TRAIL y Fas. En la vía
intrínseca, los IFN-Is promueven la liberación de citocromo c y SMAC e inhiben XIAP.

c) Los IFN-Is inhiben la angiogénesis tumoral al disminuir la producción de los factores de crecimiento
endotelial VEGF y bFGF y aumentar la transcripción de los inhibidores de la angiogénesis.

La exposición a interferones de tipo 1 altera la función de las células diana dentro del microambiente
tumoral (TME) de tal forma que promueve los efectos antitumorales (EN NEGRO) o contrarresta estos
efectos (EN ROJO):

- Células dendríticas:
o Maduración, presentación de antígenos y migración
o reduce la diferenciación y genes inmunosupresores
- Macrófagos:
o Polarización M1
- Natural killer:
o Activación, indirectamente promueve la reputación de células al ambiente micro
tumoral.
- CD4+ T
o Fenotipo Th1
o reducción de Cantidad
- CD8+ T
o Diferenciación, expansión y viabilidad
o Función efectora
o agotamiento
- B
o Diferenciación
o Moléculas coestimulatorias
o Respuesta de anticuerpos
- Treg
o Disminuye la proliferación y suprime la actividad y el reclutamiento al microambiente
tumoral (TME)
o Aumenta la actividad bajo inflamación cronica
- MDSC
o Maduración
 o Disminuye la actividad supresora
o Expresa checkpoints inmunes
o Fomenta el reclutamiento al TME
- Neutrófilos
o Sufre una polarización hacia el fenotipo anti-tumores
o Reduce el reclutamiento al TME y la migración a nichos pre-metastasicos
o Induce apoptosis
- Tumores
o Efectos antiproliferativos
o Apoptosis
o Inmunogenicidad
o Genes pro-supervivencia, tumorigenicos e inmunosupresivos

La exposición a INF tipo II altera la función del tumor y de las células inmunes del TME de tal forma que
promueve los efectos antitumorales (EN NEGRO) o contrarresta estos efectos (EN ROJO):

- Células dendríticas:
o Presentación de antígenos
o Moléculas coestimulantes
o Liberación de citoquitas
o Cambio de inminogenico a tolerogenico
- Macrófagos:
o Polarización M1
o Presentación antigénica
o Actividad citolítica
- Natural killer:
o Indirectamente promueve el reclutamiento de células al ambiente micro tumoral.
o Indirectamente inhibe la función citolitica
- CD4+ T
o Fenotipo Th1
- CD8+ T
o Diferenciación y proliferación
o Función efectora
o Apoptosis
- B
o Expansión
o Cambios en el repertorio de Ig
- Treg
o Disminuye la proliferación, diferenciación y activación
o Aumenta la actividad bajo inflamación crónica
o Indirectamente promueve el reclutamiento de células al ambiente micro tumoral.
- MDSC
o Maduración
o Disminuye la función granulocítica de MDSC y la función de supervivencia
o Promueve la actividad inmunosupresora
- Tumores
o Efectos antiproliferativos → muerte celular
o Inmunogenicidad
o Genes supresores de tumores
o Marcadores imunosupresores
o Supervivencia
INTERFERON EN EL TRATAMIENTO DE ESCLEROSIS MULTIPLE

Mecanismo:

1. INFbeta disminuye la activación de las células T en la periferia

2. INFbeta disminuye la adhesión y la penetración de las células T en la barrera hematoencefálica
3. INFbeta disminuye la presentación de antígenos
4. INFbeta promueve la producción de citoquinas antiinflamatorias como IL-10 por las células Th2
5. INFbeta disminuye la liberación de citoquinas por la celula Th1
6. INF beta disminuye la proliferación de las células B.
7. INFbeta disminuye el daño a transeúntes

PRODUCCION DE INTERFERONES

INTERFERONES RECOMBINANTES
Debemos de tener en cuenta en concepto de recombinación estudiado en el tema 1.
Fases de la producción de interferones recombinantes:

- Desarrollo: con el gen de interés y el vector clonador formamos un plásmido que se inserta en
una bacteria, levadura o célula mamífera según lo visto en el concepto de recombinación del
tema 1. Se produce a gran escala obteniendo un banco celular que contenga el gen deseado en
su DNA.
- Fase ascendente: pasamos estas células por el biorreactor para producir una expansión celular,
es decir, un aumento en su producción. Esto nos permitirá posteriormente recolectar el
producto de interés mediante centrifugación.
- Fase descendente: rompemos las células, y esa ruptura junto con el sobrenadante celular pasan
por un cromatógrafo o ATPS para capturar el producto de interés, seguido de un dispositivo
SEC con ultrafiltración para obtener el producto mas puro posible.
- Llenado y finalización: una vez obtenido nuestro producto y purificado, lo formulamos y
realizamos test de estabilidad. Si todo concluye correctamente, pasamos a la fase de
almacenamiento y transporte para la final comercialización del producto biofarmacéutico.

Los vectores bifuncionales usados están basados en: SV-40, adenovirus y papilomavirus sobre todo.

Los hospedadores pueden ser:

- Células CHO (ovario de hamster chino)

- Células COS (riñón de mono verde)
- Células BHK (riñón de cria de hámster)

Esta tecnología puede usarse para suprimir la expresión de tumores. Esto se hace usando como gen de
interés aquel que expresa el IFN-lambda. Fabricamos el plásmido con este gen y lo insertamos en células
tumorales. Si la célula tumoral secreta IFN-lambda, el tumor se desarrollará.

MODIFICACIONES DE INTERFERONES RECOMBINANTES

1. GLICOSILACION

A la hora de elaborar el plásmido, si el producto esta glicosilado o no depende del plásmido utilizado. Si
usamos una planta o bacteria NO estará glicosilado pero si usamos una célula mamífera o una levadura
si lo estará.
Este o no este glicosilado, se procede con el desarrollo del producto biofarmacéutico de la misma
manera: purificamos la proteína y/o realizamos mas modificaciones, seguido de la formulación del
producto, empaquetamiento y comercialización.

2. PEGILADO

El PEG es un compuesto de alto peso molecular con estructura polimerizada de etilenglicoles, es decir,
poliéter. La fórmula estructural general del PEG se representa como HO-(CH2 -CH2 -O)n -H. El PEG es
soluble en agua, metanol, benceno y diclorometano, y es insoluble en éter dietílico y hexano.

La adición de la estructura PEG a otro compuesto de alto peso molecular, como una proteína, se
denomina "pegilación". Los perfiles farmacocinéticos de las proteínas pegiladas y su actividad dependen
de la estructura y las características del PEG, la química utilizada para conjugar el PEG con su proteína
diana y el número y la posición de los sitios de unión.

Los interferones tienen los inconvenientes de las proteínas: presentan una rápida degradación
enzimática y aclaramiento plasmático, por lo que se requieren administraciones repetidas que
ocasionan fluctuaciones en sus valores plasmáticos y que limitan o disminuyen su utilidad clínica. La
pegilación de interferón conlleva la unión de la molécula de interferón a una cadena de polietilenglicol
que le confiere:

- una absorción sostenida

- mayor vida media en suero
- menor aclaramiento sistémico

Con esto se consiguen concentraciones séricas sostenidas, lo que

permite una presión continua sobre el virus y una administración
más cómoda.
 3. FUSION GENETICA

Se realizo la fusion de un interferón alfa con un gen HSA (albumina), llamado Albuferon. Se demostró
que el Albuferon se mantenía en sangre mucho mas tiempo que el interferón recombinante alfa e
incluso que el interferón alfa pegilado.