Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Departamento de Bioquímica
Laboratorio de Sistemas de Control de Calidad en el Laboratorio Clínico
Verificación de la linealidad de un método espectrofotométrico
Alumno: Rosales Ocampo Iván
Equipo: 3 Sección: 1
Grupo: AQM2
Docentes:
• Carreño Duran Luis Ramón
• Colin Tovar María del Carmen Mercedes
• Hernández Olicon Aura Patricia
• Quiroz González Héctor Javier
Fecha de realización: 29 de abril del 2024
Fecha de entrega: 06 de mayo del 2024
Introducción
La espectrofotometría es una técnica crucial en el ámbito del laboratorio clínico,
empleada con frecuencia para determinar la concentración de diferentes mensurandos
presentes en muestras biológicas. Sin embargo, la aplicación de esta técnica no es
suficiente; es imprescindible asegurar que los resultados obtenidos sean precisos y
fiables. Para ello, uno de los aspectos fundamentales a considerar es la verificación de
la linealidad del método espectrofotométrico.
La importancia de la linealidad radica en su impacto directo en la exactitud de los
resultados obtenidos. Si un método no es lineal, las concentraciones calculadas pueden
ser incorrectas, pudiendo subestimarse o sobrestimarse las concentraciones de ciertas
sustancias, lo que podría llevar a diagnósticos erróneos o a la implementación de
tratamientos inadecuados.
Es importante destacar que la linealidad no solo se limita a la relación entre la
concentración del analito y la señal medida, sino que también abarca la evaluación de
otros parámetros, como la robustez del método ante posibles interferencias o la
estabilidad de la respuesta a lo largo del tiempo.
Un método se considera lineal si la relación entre las concentraciones de las muestras y
los valores reales del analito sigue una trayectoria que puede representarse por una línea
recta que pasa por el origen.
Sin embargo, en la práctica, es común encontrar situaciones donde la relación entre la
concentración y la señal medida no es estrictamente lineal. En tales casos, se pueden
aplicar transformaciones matemáticas a los datos para corregir cualquier desviación de
la linealidad y garantizar la precisión de las mediciones.
Objetivos
• Verificar la linealidad en la determinación de la glucosa mediante el método de
glucosa oxidasa
• Aplicar criterio del CLSI-EP6
Fundamento
Determinación de glucosa (GOD-POD)
La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de glucosa a ácido glucónico. El
peróxido de hidrógeno (H2O2), producido se detecta mediante un aceptor cromogénico
de oxígeno, fenol-ampirona en presencia de peroxidasa (POD).
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de glucosa
presente en la muestra ensayada
Métodos
Bitácora de resultados Fecha: 29 de abril del 2024
Corrida analítica
Determinación de: Glucosa Método: Glucosa oxidasa
Unidades: mg/dL
Blanco utilizado: Reactivo de Glucosa Oxidasa
Longitud de onda seleccionado: 505 nm
Datos del estándar:
Estándar utilizado:
Tabla 1. Concentraciones obtenidas mediante ecuación de la recta
Concentración
Concentración
Dilución Absorbancia calculada %Error
teórica (mg/dL)
(mg/dL)
1 276 0.671 172 -37.80
2 221 0.443 125 -43.37
3 166 0.302 96 -41.95
4 111 0.146 65 -41.86
5 56 0.023 39 -29.59
Cálculos de concentración
• Utilizando ecuación de la recta obtenida*
𝑦 = 0.0049𝑥 − 0.1702
*Considerar que para la ecuación se removió el punto de la concentración 200 mg/dL de
glucosa
𝑦 + 0.1702 0.671 + 0.1702
∴𝑥= = = 172 𝑚𝑔/𝑑𝐿
0.0049 0.0049
Cálculo de porcentaje de error
𝑉. 𝑜𝑏𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜 − 𝑉. 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜
%𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 = ∗ 100
𝑉. 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜
172 − 276
∴ %𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 = ∗ 100 = −37.80%
276
Figura 1. Concentración teórica contra absorbancia obtenida
Figura 2. Concentración corregida mediante el cálculo de ecuación de la recta contra la
absorbancia obtenida
Figura 3. Concentración teórica contra concentración corregida mediante el cálculo de
ecuación de la recta
Tabla 2. Concentraciones obtenidas por Factor proporcionado
Concentración
Concentración
Dilución Absorbancia calculada %Error
teórica (mg/dL)
(mg/dL)
1 276 0.671 212 -23.06
2 221 0.443 140 -36.57
3 166 0.302 96 -42.43
4 111 0.146 46 -58.38
5 56 0.023 7 -87.00
Cálculos de concentración
• Utilizando Factor*
𝐴 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
∗ [𝐸𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟] = 𝑚𝑔/𝑑𝐿
𝐴 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟
*Considerar A del estándar igual a 0.316 y una concentración de 100 mg/dL
0.671
∴ ∗ 100 = 212 𝑚𝑔/𝑑𝐿
0.316
Cálculo de porcentaje de error
𝑉. 𝑜𝑏𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜 − 𝑉. 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜
%𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 = ∗ 100
𝑉. 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜
212 − 276
∴ %𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 = ∗ 100 = −23.06%
276
Figura 4. Concentración teórica contra concentración corregida mediante el cálculo de
factor
Figura 5. Concentración corregida mediante el cálculo de factor contra la absorbancia
obtenida
Linealidad
Tabla 3. Concentraciones para muestra SCB
Concentración
Concentración
calculada por
Muestra SCB Absorbancia calculada por
ecuación
factor (mg/dL)
(mg/dL)
1 1.244 289 394
2 1.299 300 411
3 0.983 235 311
4 1.242 288 393
5 1.196 279 378
Promedio 1.192 278 377
Figura 6. Concentración calculada de la muestra SCB con la ecuación de la recta contra
la absorbancia obtenida
Figura 7. Concentración calculada de la muestra SCB con el factor contra la
absorbancia obtenida
Limite de detección y cuantificación
Tabla 4. Datos del blanco
Absorbancia
0.010 0.012
0.008 0.008
0.009 0.007
0.011 0.009
0.008 0.009
Promedio 0.009
Desviación estándar 0.0015
Pendiente 0.9166
Para calcular los limites
𝑥 + 10𝑠 0.009 + 10(0.0015)
𝐿𝐶 = = = 0.026
𝑚 0.9166
𝑥 + 3𝑠 0.009 + 3(0.0015)
𝐿𝐷 = = = 0.015
𝑚 0.9166
Discusión
Para la verificación de la linealidad de un método espectrofotométrico se realizó una
marcha de trabajo similar a la realizada en la práctica anterior. Esto se hizo así para poder
seguir verificando el método de la glucosa oxidasa. De esta manera, se repitió el
procedimiento, el mismo analista realizó las determinaciones, se empleó el mismo
espectrofotómetro y los cálculos se realizaron con la ecuación de la recta obtenida de la
práctica pasada para tener una secuencia sobre la verificación del método.
Para empezar, se realizaron diluciones entre el control 1 (C1) y el control 3 (C3) para así
obtener un estándar de concentración conocida. Sin embargo, al calcular dichas
concentraciones y comparándolas con las concentraciones teóricas, el porcentaje de
error es alto. Esto indica fallas al momento de pipetear, ya que dicho error es negativo, lo
cual se puede interpretar como falta de volumen.
Estos porcentajes de error se presentan tanto en el método de calculo empleando la
ecuación de la recta como el factor, siendo este ultimo un calculo adicional donde se
proporcionaron los datos para así obtener resultados mas confiables.
Sin embargo, al obtener dichos porcentajes de error, se estaría hablando meramente de
un error por parte del analista y que no está relacionado directamente con la metodología.
Así mismo, el coeficiente de correlación (r) es cercano a 1 y, en las gráficas donde se
comparan las concentraciones teóricas y corregidas, la pendiente es cercana a 1, por lo
que se podría decir que el método sí presenta linealidad.
Esto puede verse reflejado en los resultados obtenidos de la muestra SCB, donde al
realizar el calculo tanto con la ecuación de la recta como con el factor, el coeficiente de
correlación es 1. Aunque aquí la pendiente no es cercana a 1, es en la gráfica con las
concentraciones obtenidas por factor que no hay un intercepto en y.
Si bien los resultados pueden considerarse buenos, es importante mencionar que existen
puntos críticos en la técnica realizada por parte del analista. Dichos puntos críticos se
basan principalmente en la técnica de pipeteo.
Así mismo, si el analista incrementa el error que se presenta en el método, es importante
considerar las condiciones del reactivo de trabajo, los controles y la muestra empleada
para las determinaciones correspondientes. Esto es mencionado ya que si las
condiciones de almacenamiento o la caducidad de los productos (en caso del reactivo de
trabajo y controles) no son las adecuadas, los resultados obtenidos no son confiables y
se está adicionando un error importante en la evaluación de la linealidad del método.
Por otro lado, el limite de detección y el limite de cuantificación nos permite conocer las
concentraciones mínimas para que el mensurando pueda ser detectado y cuantificado
respectivamente, siendo este ultimo al que se le atribuye la imprecisión o precisión de la
determinación.
Conclusiones
• El método de la glucosa oxidasa se considera lineal
• Se deben tomar acciones correctivas con respecto a la técnica de pipeteo
• El mejor método para tratar los datos es por Factor
Pregunta extra
• Criterio CLIA para Glucosa oxidasa en la pagina de Westgard
El TEa para la determinación de glucosa en plasma o suero es de +/- 6%
Referencias
• Lobato, B. M. (2018). Gestión de calidad y verificación de métodos analíticos en
un laboratorio de investigación bajo normativa de Buenas Prácticas de Laboratorio
(Doctoral dissertation, Universidad de Extremadura).
• Guglielmone, R., de Elías, R., Kiener, O., Collino, C., & Barzón, S. (2011).
Verificación de métodos en un laboratorio acreditado y planificación del control de
calidad interno. Acta bioquímica clínica latinoamericana, 45(2), 335-347.
• Pérez-Espinoza, M., & Brambila, E. (2005). Preparación y evaluación de un equipo
de reactivos para la determinación de glucosa (glucosa oxidasa/peroxidasa).
Bioquimia, 30(4), 110-117.
• Hernandez-Olicón, A; Martínez-Reyes, C; Carreño-Duran, L; Colín-Tovar, M.
(2024) Manual de Prácticas de Sistemas de Control de calidad en el laboratorio
clínico. 76-84
