Expresión Génica

RT-qPCR

BM 2024

Turno 3
Mariela Chertoff
Soledad Porte Alcón
Lucas Cozza
Objetivo:

Medición de la expresión del gen UGA4

Técnica:

RT-PCR (RetroTranscripción - Polymerase Chain Reaction)

1) Visualización del RNA

- 26 S
- 18 S

- 5,8 S
-5S

Tenemos RNA, esta integro, podemos seguir!!!!!

Día 2

1) Degradación del DNA

2) Retrotranscripción

3) PCR Clásica
RT-PCR: Estrategia de la RT
Las estrategias para la amplificación mediante RT-PCR varían según los primers
que se usan para la síntesis de la primera cadena de cDNA (RetroTranscripción)

Oligo dT: Para retrotranscribir todos los

mRNAs presentes en la muestra. Los
extremos 5’ de genes muy largos se
pueden perder

Específico: Se retrotranscribe el gen

de interés y otros que tengan la
misma secuencia (splicing
alternativos, familia conservada)

Random: Se retrotranscribe todo el

RNA de mi muestra (también sin
poly-A). Se obtienen fragmentos de Una vez obtenido el cDNA por alguno
mRNAs, independientemente de de estos protocolos, se utiliza como templado
la longitud de los genes. para una reacción de PCR estándar
 PCR: Polymerase chain reaction
Reacción en cadena de la polimerasa
Es una técnica que permite producir millones de copias de una región
específica de DNA a partir de una pequeña muestra

• Inventada en 1985 por Kary B. Mullis

• Premio Nobel de Química, 1993

Amplificación en
ciclos de temperatura
 ¿Qué necesitamos para hacer una PCR?
*DNA molde o templado:
contiene la región que queremos amplificar.

forward * Primers: Secuencias cortas de DNA

(oligonucleótidos) que delimitan la zona que queremos
reverse amplificar. Deben ser complementarios a los extremos de
la región a amplificar. Se sintetizan in vitro. A partir de su
T°2 región 3’, la DNA Pol inicia la síntesis en dirección 5’->3’.
T°2 T°1 Para que se posicionen los primers hay que desnaturalizar
el DNA molde aumentando la T°.

*dNTPs: dATP, dCTP, dGTP y dTTP. Buffer

Mezcla de los 4 deoxirribonucleótidos trifosfato que componen el DNA.

*DNA Polimerasa T°3

* Cambios controlados de temperatura para lograr separar y unir las cadenas

 94°C x 1 min
Qué sucede en cada ciclo de PCR? 54°C x 45 seg 40 ciclos
72°C x 2 min

1 minute 94°C

T° annealing
reverse depende del
contenido de CG y
forward
AT de los primers

Tiempo de
extensión depende
de la longitud del
producto y de la
DNA polimerasa
DNA pol
 Pasos de amplificación en la PCR
La reacción de PCR necesita repetidos cambios de temperatura que permitan pasos de:
1) desnaturalización, 2) apareamiento y 3) síntesis del DNA que se está copiando.

Desnaturalización del DNA templado 94°C x 3 min 1 vez

(antes del 1er ciclo)

Desnaturalización del DNA templado y copias 94°C x 1 min

Apareamiento/Annealing de los primers al templado 54°C x 45 seg 40 ciclos
Síntesis/Extensión de las copias de DNA 72°C x 2 min

Síntesis/Extensión para completar las copias

72°C x 10 min 1 vez
que eventualmente hubieran quedado incompletas
(después del
último ciclo)
Cambios de temperatura

DNA templado
buffer
Mg++
dNTPS
DNA Pol
primers

Peltier: Diferencia de temperatura debida a un voltaje

eléctrico. Sucede cuando una corriente se hace pasar por
dos metales o semiconductores conectados por dos
“junturas de Peltier”. La corriente propicia una transferencia
de calor de una juntura a la otra: una se enfría en tanto que
otra se calienta.
 Importancia de los controles

• Control negativo (sin cDNA)

– controla la contaminación de los reactivos

• Control No RT (sin transcriptasa reversa)

– detecta el DNA contaminante

• Control positivo
– controla el buen funcionamiento de reactivos y primers
– especialmente importante cuando se trata de mostrar la ausencia de
expression de un gen

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Templados para PCR Nombre de la técnica

DNA genómico
Clásica (se observa en gel de agarosa)
DNA plasmídico PCR
Otros DNAs En Tiempo Real o qPCR
(se analiza mediante gráficos)

Clásica (se observa en gel de

agarosa)
cDNA RT-PCR
(Reverse Transcription-PCR) En Tiempo Real o qPCR
(se analiza mediante gráficos)
RT

RNA
 PCR: selección de condiciones óptimas

Enzima
Leer las especificaciones del fabricante
* Conc. muy alta: productos no específicos
* Conc. muy baja: bajo rendimiento

Cantidad de DNA molde

DNA genómico: 50-500 ng (vf rx: 50uL)
Vector: 0.1-2 ng (vf rx: 50uL)
*Mucho DNA: productos inespecíficos
*Poco DNA: bajo rendimiento

Número de ciclos
25-35 ciclos: OK
 PCR: selección de condiciones óptimas

[Mg2+]: complejos con dNTPs, primers y DNA molde (afecta annealing;

epecificidad; fidelidad y actividad de la DNApol).

Incluído o no en el buffer de PCR.

* Conc muy baja: bajo rendimiento.

* Conc muy alta: productos no específicos y errores de incorporación.

Diseño de primers, Temperatura y tiempo de annealing

30-45 seg; Tº: 5ºC por debajo de la Tm más baja del par de primers.
* Tºann alta: más específico (menos rendimiento)
* Tºann baja: productos no específicos (los primers se aparean inespecíficamente)
 Características de los primers

Longitud:
18-24 nt

Tm (Tº melting): Tº a la cual la mitad de las bases del primer están apareadas con el DNA molde.

Tm = 2(A+T) + 4(G+C)

Tm aumenta con la longitud del primer y el contenido (G+C)

Tm: 55º-70ºC - 2 primers: Tm similares

Tº annealing depende de la Tm de los primers Tann ≈ Tm – 5°C

Tann > 50ºC.

 Diseño de primers
Cadena + Fw gen Rev
5’-AGTCTCGAGATGCGTAGAGCTC--810bp--CCGATCGATCGCTAACGTCGTCG-3’

5’ 3’ Taq
3’ 5’
La Taq Pol tiene dirección 5’->3’ e inicia la síntesis desde el 3’-OH del primer
Fw Rev
Cadena +
5’-AGTCTCGAGATGCGTAGAGCTC--810bp-- -CCGATCGATCGCTAACGTCGTCG-3’
5’-GAGATGCGTAGAGCT-3’--> <--3’-CTAGCTAGCGATTG-5’
3’-TCAGAGCTCTACGCATCTCGAG---810bp-- GGCTAGCTAGCGATTGCAGCAGC-5’
Cadena -
Los primers se escriben siempre 5’—3’

El forward queda igual a la cadena +

5’-GAGATGCGTAGAGCT-3’

5’-GTTAGCGATCGATC-3’
El Reverse se escribe inverso
y complementario a la cadena +
 Amplifica ADN a partir de un templado

Los primers son necesarios para amplificar una zona específica,

PCR aún cuando la muestra es muy compleja (gran variedad de
secuencias de ADN)

La cantidad de producto de PCR obtenido se

correlaciona con la cantidad de templado en la muestra
Templados para PCR Nombre de la técnica

DNA genómico
Clásica (se observa en gel de agarosa)
DNA plasmídico PCR
Otros DNAs En Tiempo Real o qPCR
(se analiza mediante gráficos)

Clásica (se observa en gel de

agarosa)
cDNA RT-PCR
(Reverse Transcription-PCR) En Tiempo Real o qPCR
(se analiza mediante gráficos)
RT

RNA
 Visualización de los productos de PCR
Geles de agarosa - Bromuro de etidio
 RT-PCR

No se ven
Se ven diferencias
diferencias

Cic 30

Gen A Cic 20

No Trat

Tratado
PCR 30 ciclos
 PCR clásica Real time PCR

Buffer (+MgCl2) Buffer (+MgCl2)

cDNA cDNA
dNTPs dNTPs
Pimer mix UGA4 Primer mix UGA4
+ Primer mix TBP1 (o Primer mix TBP1)
Taq Taq
SYBR green

Electroforesis en Gráficos
gel agarosa
(bromuro de
etidio)
 Real Time-PCR (qPCR)

Se necesita un termociclador (con lector de fluorescencia) asociado a una PC.

Se utiliza para cuantificar una reacción de PCR
Mide el aumento del DNA a medida que se amplifica (en tiempo real).
Detección y cuantificación del producto de PCR mediante una sonda fluorescente que se une
al DNA o un agente intercalante. Esta señal fluorescente aumenta en proporción directa al
aumento del producto de PCR y se registra a lo largo del tiempo.
 Conexión a PC
registro Filtros

Luz Halógena threshold

Muestras

Peltier
(Termociclador)
La PCR amplifica exponencialmente

Curvas teóricas:
 Real Time PCR
Se grafican unidades arbitrarias de fluorescencia en función del
número de ciclo
Threshold: umbral de detección

Ct (threshold cycle): ciclo en el cual cada muestra llega al umbral

Control de eficiencia
Real Time-PCR: curva de calibración
Amplificación de un producto X a partir de distintas cantidades de DNA inicial conocidas (plásmido). En
este caso: 6 réplicas por c/cantidad de DNA  CT.
log

30
27
20 25
 23 
El número de copias aumenta en forma exponencial: 2n
Se asume que la eficiencia es del 100%

21 22 23 24 2n Xn = 2n

X4-2 = 24
2 4-2= 4
22 4 veces más en ciclo 4 que en el 2
 CtB=20

CtA=23

¿De cual hay

más en la
muestra?
 CÁLCULOS:

XCt = 2Ct,x

Método del dCt

Veces de cambio de gen A con respecto a gen B = 2dCt

dCt = CtgenA –CtgenB

23 20
23 = 8 veces más B que A

o también:

dCt = CtgenA – CtgenB

23 27
2-4 = 1/16 veces más B que A
o 24 = 16 veces más A que B
Los valores de Ct son válidos para cada ensayo y no se pueden comparar con otras PCRs.
CALCULOS:

Método del ddCt

Veces de cambio de gen A por tratamiento (T) con respecto a gen B = 2-ddCt
En los sistemas biológicos “B” es el gen de referencia y no debe modificarse
por el tratamiento “T” . El valor de Ct del gen de referencia sirve para normalizar
el valor de Ct de “A”. Corrige variaciones biológicas no específicas o errores técnicos
durante la preparación de la muestra.

ddCt = (CtA – CtB)T – (CtA – CtB)noT

Ej: ddCt = (CtA – CtB) T – (CtA – CtB) noT

24.2 18.1 28.1 19.3
6.1 - 8.8
= -2.7  2 -(-2.7) = 6.5

El tratamiento induce 6.5 veces la expresión del gen A

 A: gen de interés
B: gen de referencia
XA 2Ct,A T: tratamiento con GABA
noT: sin GABA
=
XB 2Ct,B

A/B = 2 (Ct,A-Ct,B) = 2dCt

Para ver la relación entre una condición /tratamiento y el control

(A/B) T 2-(dCtT-CtnoT) = 2-ddCt

=
(A/B) noT

-ddCt = (CtA – CtB) T – (CtA – CtB) noT

 Desarrollo del Trabajo Práctico

PCR clásica para TPB

cDNA de RNA (+ GABA)

PCR Tiempo Real

PCR clásica TBP

cDNA de RNA (control)

PCR Tiempo Real

Análisis de las ventajas y desventajas de cada técnica

 Cuál es tu objetivo?

Presencia/ Comparación Cuantificación

Ausencia cuantitativa absoluta

Preguntas SI/NO:

- Se expresa el gen X?

- Hay una mutación en

el gen Y?

-Hay una deleción o

Inserción en el gen Z?