1.

OBJETIVO DEL EXPERIMENTO

El objetivo de este experimento es introducir a los estudiantes en los

principios y práctica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
mediante la amplificación de un fragmento del gen 16S rRNA
bacterianoutilizando para ello la técnica de la PCR.

No es necesario aislar el ADN de bacterias ya que se suministra una

muestra de ADN bacteriano para llevar a cabo las amplificaciones.

2. INTRODUCCION

2.1 PCR

La PCR ha revolucionado la investigación y diagnóstico basado en la Biología

Molecular. La PCR es un proceso simple, exacto y altamente reproducible que
proporciona la ventaja de empezar con una pequeña cantidad de ADN y ser
capaz de amplificarlo de forma que se tenga suficiente para realizar
experimentos.

Se han desarrollado gran cantidad de test diagnósticos, también se ha utilizado

en mapaje y secuenciación de ADN en proyectos de genoma y está siendo
utilizando determinaciones forenses, paternidades, diagnóstico clínico, etc.

En todos los casos se amplifican segmentos de ADN que posteriormente son

sometidos a análisis y estudios varios.

En una reacción de PCR, el primer paso es la preparación de la muestra de ADN

que es extraída de varias fuentes biológicas o tejidos. En la PCR, el ADN o gen
a amplificar se define como “target” (diana) y los oligonucleótidos sintéticos
utilizados se definen como “primers” (cebadores). Un set de 2 cebadores de
entre 20-45 nucleótidos son sintetizados químicamente para que se
correspondan con los extremos del gen a amplificar. Cada cebador se une a
uno de los extremos de cada cadena de ADN y es el punto de inicio de la
amplificación.

Una reacción típica de PCR contiene ADN molde, Taq polimerasa y los 4 dNTPS
en un tampón de reacción apropiado. El volumen total de reacción es de 25-50
l. En el primer paso de la reacción de PCR, las cadenas complementarias
de ADN se separan (desnaturalizadas) la una de la otra a 94ºC, mientras que
la Taq polimerasa permanece estable. En el segundo paso, conocido como
emparejamiento, la muestra es enfriada a una temperatura entre 40-65ºC que
permita la hibridación de los 2 cebadores, cada uno a una hebra del ADN
molde. En el tercer paso, conocido como extensión, la temperatura es elevada
a 72ºC y la Taq polimerasa añade nucleótidos a los cebadores para completar
la síntesis de una nueva cadena complementaria.

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Estos tres pasos, desnaturalización-emparejamiento-extensión, constituye un
ciclo de PCR. Este proceso se repite durante 20-40 ciclos amplificando la
secuencia objeto exponencialmente. La PCR se lleva a cabo en un
termociclador, un instrumento que es programado para un rápido
calentamiento, enfriamiento y mantenimiento de las muestras durante varias
veces. El producto amplificado es luego detectado por separación de la mezcla
de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa.
2.2 ARN ribosómico 16S

Es un polirribonucleótido de aproximadamente 1500 nucleótidos, codificado por

el gen rrs, también denominado ADN ribosomal 16S (ADNr 16S), a partir de
cuya secuencia se puede obtener información filogenética y taxonómica de los
procariotas.

El ARNr se pliega en una estructura secundaria, caracterizada por la presencia

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de segmentos de doble cadena, alternando con regiones de cadena sencilla. En
eucariotas el ARNr 18 S es la macromolécula equivalente. Sus secuencias se
encuentran altamente conservadas, presentando regiones comunes a todos los
organismos, pero contienen variaciones que se concentran zonas específicas.

El análisis de la secuencia de los ARNr 16S de distintos grupos filogenéticos

reveló la presencia de una o más secuencias características que se denominan
oligonucleótidos firma. Se Trata de secuencias específicas cortas que
aparecen en todos los miembros de un determinado grupo filogenético, y
nunca (o sólo raramente) están presentes en otros grupos, incluidos los más
próximos.

La comparación de las secuencias de los ARNr 16S (o de los genes que los
codifican) permite establecer las relaciones filogenéticas existentes entre los
organismos procariotas. En microbiología clínica la identificación molecular
basada en ADNr 16S se utiliza fundamentalmente para bacterias cuya
identificación mediante otro tipo de técnica resulta imposible, difícil o requiere
mucho tiempo.

El método molecular de identificación bacteriana mediante secuenciación

del ADNr 16S incluye tres etapas:

a) Amplificación por PCR del gen a partir de la muestra apropiada. Lo que

haremos en esta práctica.
b) Determinación de la secuencia de nucleótidos del producto de la
PCR. c) Análisis de la secuencia.

La amplificación del ADNr 16S se consigue mediante un termociclador gracias a

la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como sustrato se utiliza
normalmente ADN purificado a partir de un cultivo puro del agente patógeno.
Alternativamente, el ADN podrá obtenerse directamente de la muestra clínica.

En esta práctica vamos a realizar la amplificación del gen ADNr 16S

utilizando unos primers universales que producirán un fragmento de
466 pares de bases, como ADN molde se puede utilizar, bien ADN
bacteriano aislado por los alumnos a partir de algún cultivo
bacteriano, o bien, ADN bacteriano que se suministra como control
positivo.
M1234567

Análisis de PCR de diferentes individuos para la amplificación del gen 16S

rRNA bacteriano.
Se utiliza un gel de agarosa 1.5 % que se tiñe con el DanaBlue de DanaGen-Bioted
para la detección de los productos de la PCR amplificados utilizando ADN

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bacteriano. Marker: DanaMarker Shumman.
Pocillo 1al 6: Amplificación a partir de diferentes muestras.
Pocillo 7: Control negativo.

3. COMPONENTES
Se suministran reactivos suficientes para la realización de 25 PCR
individuales y la realización de 4 geles de electroforesis en agarosa al 1.5 %.

Tampón de electroforesis concentrado 10 X 100 ml

Agarosa 2.5 gr
PCR MIX 700 μl Conservar a -20ºC ADN bacteriano control positivo 75 μl
Conservar a -20ºC

Tampón de electroforesis 10 X para elaborar 2 x 500 ml de Tampón de electroforesis 1 X que

es el Tampón de trabajo.

3.1 PCR MIX

Lista para su uso, que permite amplificar cualquier fragmento a partir de
ADN, de forma que el usuario sólo ha de añadir la muestra del ADN aislado.
Los primers utilizados son los siguientes:
Procariota universal
331F TCC TAC GGG AGG CAG CAG T 19 Nadkarni et al., 2002 797R GGA CTA CCA GGG TAT CTA
ATC CTG TT 25 Nadkarni et al., 2002

4. PRÁCTICA
4.1 Extracción del ADN
El paso previo a cualquier estudio genético suele ser el aislamiento del ADN
genómico, esto se puede llevar a cabo de diferentes formas (métodos caseros, kits
comerciales, etc) y a partir de diferentes muestras (sangre, tejido,bacterias etc).Para
la realización de esta práctica no es necesario la extracción del ADN de los
alumnos ya que suministra una muestra de ADN bacteriano para realizar la
práctica, aunque se puede utilizar ADN bacteriano aislado por los alumnos a partir
de cultivos bacterianos.
4.2 Reacción de la PCR
NOTA: Utilizar siempre puntas con filtro y cambiar de punta cada vez
que se realiza una acción para evitar contaminaciones que puede dar
lugar a falsos resultados.

1. Utilizar 2.5 μl (100-250 ng) del ADN bacteriano para cada reacción de
PCR. IMPORTANTE: preparar un control negativo de amplificación,
para ello colocar 2.5 μl de agua libre de nucleasas en lugar del ADN, esto
sirve para saber si los reactivos, micropipetas o puntas pueden estar
contaminados con ADN.

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 REACTIVOS VOLUMEN

PCR MIX
22.50 μl

ADN bacteriano (100-250 ng)

2.5 μl

Volumen Total
25 μl

2. Mezclar bien.
3. Para aquellos termocicladores que no tengan un “heated lid”, añadir 25
μl de aceite mineral para prevenir la evaporación.

PROGRAMA 16S ARNr

PASO TEMPERATURA TIEMPO

Desnaturalización inicial 95ºC 10 minutos

Ciclos PCR 95ºC 30 segundos

Realizar 35 ciclos 55ºC 30 segundos
72ºC 45 segundos

Extensión final 72ºC 10 minutos

Final 4ºC

4. El producto de la PCR puede ser sembrado directamente en un gel de

agarosa después de la PCR ya que la MIX contiene tampón de carga de color
rojo. 5. Utilizar el método de detección o tinción del ADN que se use en el
laboratorio. Le recomendamos el uso del DANABLUE o GELSAFE,
nuestros métodos no tóxicos.
6. Se ha de obtener un resultado similar al observado en la figura.

Para cualquier duda o consulta adicional, por favor , contacte con

nosotros [email protected]

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OBJETIVO

Preparar gel de agarosa y realizar la electroforesis.

FUNDAMENTO TEÓRICO

El principio de la electroforesis consiste en la migración proporcional de las moléculas a

través de un gel u otro tipo de matriz porosa, según su peso molecular o tamaño;
movimiento generado por el campo eléctrico.

MATERIAL

● Microondas.

● Vaso precipitado de 100ml.

● Varilla.

● Balanza.

● Espátula.

● Hoja de trabajo.

● Matraces aforados de 500 ml y 250 ml.

● Pipeta graduada 10 ml.

● Micropipeta.

REACTIVOS

● Colorantes (safranina, verde malaquita, azul de metileno y violeta de genciana)

● Agarosa (0,5 gramos)

● Tampón al 10x (60 ml)

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PROCEDIMIENTO

Previamente, se debe realizar el tampón de electroforesis que se utilizará para diseñar

el gel de agarosa. Éste gel está formado por 5 ml de tampón concentrado 10x de TBE o
TAE y 45 ml (50 -5ml TAE 10x) de agua destilada (más tarde le añadimos la agarosa).

Co Vo= C1 V1

10. Vo= 1. 50

Vo= 5 ml de TAE 10x

1) Primero encender la balanza con tiempo suficiente para que se ponga en marcha,
limpiar la superficie por si existen restos y la calibrar con un patrón. Colocar encima el
vaso de precipitados y tarar. Con la ayuda de espátula, añadir 0.5 gramos de agarosa.

2) Con el tampón ya diluido, añadir la agarosa.

3) Introducir en el microondas en un intervalo de 10 segundos, de un intervalo a otro

removemos con la varilla. Realizamos este proceso hasta que observemos que está
transparente.

3.1. Este punto se añade cuando se va a visualizar el gel de agarosa en el ultravioleta:

Dejar enfriar la solución de agarosa aproximadamente a 60º. Añadir 4 µl de

GELSAFE a la solución de agarosa. Agitar para mezclar suavemente la solución evitando
la formación de burbujas

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4) Verter la solución de agarosa en el soporte (alrededor de la cuba se le apuesto cinta
adhesiva para que no se salga la solución de agarosa), dejar enfriar y verificar hasta
que se solidifica y se quedan los pocillos marcados.

5) Una vez que el gel se ha enfriado, se debe realizar el tampón de electroforesis:

20 ml de tampón concentrado 10x más 180 ml (200-20 de TAE) de agua destilada.

Co Vo=C1 V1

10 Vo= 1 . 200

Vo= 20 ml TAE de 10x

También realizar los colorantes, utilizando 10 μl de glicerina y 10 μl de cada colorante.

Los colorantes se colocan en tubos eppendorf.

6) Meter la cubeta con el gel de agarosa solidificado (sin la cinta adhesiva) en la cuba
de electroforesis, añadir el tampón de electroforesis poco a poco, una vez sumergido
todo el gel de agarosa se debe quitar el peine.

7) Añadimos con una micropipeta 20 microlitros de glicerina con colorante en los

pocillos del gel de agarosa.

8) Creamos un campo eléctrico, conectando los cables y encendiendo la fuente de

energía.

9) Esperamos el tiempo necesario para que se produzca la migración de los

colorantes en función de su carga.

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INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

PREGUNTAS DE ESTUDIO

1. ¿En función de qué parámetros separa las moléculas de la electroforesis mediante

gel de agarosa?

El gel de agarosa separa las moléculas en función de su tamaño, su carga y su forma.

2. Explique la migración en función de la carga.

Las moléculas de carga negativa migran hacia el electrodo positivo; las moléculas de
carga positiva migran hacia el electrodo negativo.

3. ¿Por qué añadimos glicerol a las soluciones de muestra antes de depositarlas en los
pocillos?

El glicerol proporciona densidad a las muestras, de tal modo que éstas atraviesan la
solución tampón en los pocillos.

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CONCLUSIÓN

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