EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LOS METABOLITOS

DE EXTRACTOS DE SEMILLAS DE Mammea americana SOBRE

Enterococcus faecalis.
ESTUDIO IN VITRO.

EDUARDO COVO MORALES

ANTONIO DÍAZ CABALLERO
NATALIA FORTICH MESA
DONOVAN RODRÍGUEZ SIERRA
LIZETH JOHANNA YANES MIRANDA

UNIVERSIDAD DE CARTAGENA
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE POSTGRADO Y EDUCACIÓN PERMANENTE
DEPARTAMENTO DE INVESTIGACIÓN
ESPECIALIZACIÓN EN ENDODONCIA
CARTAGENA-BOLÍVAR
2017
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LOS METABOLITOS
DE EXTRACTOS DE SEMILLAS DE Mammea americana SOBRE
Enterococcus faecalis.
ESTUDIO IN VITRO
TRABAJO DE INVESTIGACIÓN REALIZADO PARA OBTENER EL TÍTULO DE
ESPECIALISTA EN ENDODONCIA

Investigador principal
EDUARDO COVO MORALES
Odontólogo y Especialista en Endodoncia. Pontificia Universidad Javeriana.
Magíster en Microbiología. Universidad de Cartagena.

Co- investigadores Estudiantes

LIZETH YANES MIRANDA
DONOVAN RODRÍGUEZ SIERRA
Estudiantes IV año. Especialización en Endodoncia.

Co-investigador
ANTONIO DÍAZ CABALLERO
Odontólogo. Universidad de Cartagena. Especialista en Periodoncia.
Pontificia Universidad Javeriana. Magíster en Educación. Universidad del
Norte. Doctor en Ciencias Biomédicas. Universidad de Cartagena.

Asesor metodológico
NATALIA FORTICH MESA
Odontóloga. Pontificia Universidad Javeriana. Especialista en Endodoncia.
Universidad de Cartagena. Magíster en Epidemiología Clínica. Universidad
Nacional de Colombia.

UNIVERSIDAD DE CARTAGENA
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE POSTGRADO Y EDUCACIÓN PERMANENTE
DEPARTAMENTO DE INVESTIGACIONES
ESPECIALIZACIÓN EN ENDODONCIA
CARTAGENA-BOLÍVAR
2017

8
2
 NOTA DE ACEPTACIÓN
_____________________________
_____________________________
_____________________________
_____________________________

_______________________
FIRMA DEL PRESIDENTE DEL JURADO

______________________
FIRMA DEL JURADO

______________________
FIRMA DEL JURADO

Cartagena, 14 de Junio de 2017.

3
 AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a Dios, a nuestra familia y a todas las personas que nos han
ayudado de manera desinteresada en la elaboración de este proyecto.

Se agradece la colaboración de los integrantes del Grupo de Investigación en

Química de Medicamentos de la Universidad de Cartagena; entre ellos al Docente
Harold Gómez Estrada, quien colocó a nuestra disposición su Laboratorio de
Fitoquímica donde Cristian Paternina Castro, Químico Farmacéutico, concentró los
extractos de las semillas de Mammea Americana. A Leonor Cervantes Hoyos,
Magíster en Microbiología y estudiante de Doctorado en Ciencias Biomédicas,
quien realizó las pruebas de cada uno sobre Enterococcus Faecalis en el
Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la
Universidad de Cartagena. A su vez, al grupo de Investigación en Genética y
Biología molecular de la Universidad de Cartagena donde Jeison Reyes, Químico
Farmacéutico y estudiante de Maestría en Microbiología de la Universidad de
Cartagena ayudó a ejecutar la primera fase de las extracciones: maceración del
material vegetal.

Al Investigador principal y Docente Eduardo Covo Morales, al Director y Docente

Antonio Díaz Caballero y a la Asesora metodológica y Docente de Investigación
Natalia Fortich de la Facultad de Odontología de la Universidad de Cartagena por
su apoyo y colaboración durante el desarrollo del proyecto.

4
 TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN
1. INTRODUCCIÓN ..............................................................................................I
2. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA .........................¡Error! Marcador no [Link]
3. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................... VIII
4. OBJETIVOS .................................................................................................... IX
4.1 Objetivo general ........................................................................................ IX
4.2 Objetivos específicos ............................................................................... IX
5. MARCO TEÓRICO........................................................................................... X
5.1 PARTE FITOQUÍMICA .............................................................................. X
5.1.1 Estudios etnobotánicos ....................................................................... X
5.1.2 Productos naturales ........................................................................... XI
5.1.3 Extracto ............................................................................................ XII
5.1.4 Métodos de extracción ..................................................................... XIII
5.1.5 Identificación preliminar de metabolitos secundarios ...................... XIV
[Link] Principales metabolitos en las plantas ........................................... XV
[Link] Principales pruebas fitoquímicas para la identificación de XVIII
metabolitos ........................................ ..…......……………………………....XXVIII
5.1.6 Género Mammea ............................................................................. XIX
[Link] Metabolitos secundarios aislados del género Mammea..................XX
5.1.7 Mammea americana L....................................................................... XX
[Link] Descripción botánica................………………………………….……..XXI
[Link] Distribución geográfica de M. Americana en Colombia................XXII
[Link] Usos del fruto de M. americana…………………………………….XXIII
[Link] Semillas de M. americana ........................................................... XXIII
5.2 PARTE MICROBIOLÓGICA ................................................................ XXIV
5.2.1 Género Enterococcus ..................................................................... XXIV
[Link] Resistencia antimicrobiana del género Enterococcus. .............. XXV
5.2.2 Enterococcus faecalis ..................................................................... XXVI
[Link] Enterococcus faecalis y la infección en endodoncia ........ ……XXVII
5.2.3 Método de dilución en caldo ............................................................ XXIX
6. METODOLOGÍA ......................................................................................... XXX
6.1 Recolección del material vegetal..........................................................XXXI

5
 6.2. Preparación de los extractos y fraccionamiento ................................ XXXI
6.3. Caracterización fitoquímica ............................................................ XXXII
6.4. Actividad antimicrobiana................................................................. XXXIII
6.4.1 Preparación de las soluciones. ................................................... XXXIII
6.4.2 Microorganismo de estudio ........................................................ XXXIII
6.4.3 Condiciones de los cultivos ........................................................ XXXIII
6.4.4 Actividad antibacteriana ............................................................. XXXIV
6.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO……………………………………………...XXXIV
6.6 CONSIDERACIONES ÉTICAS………………………………….……..XXXIV
7. RESULTADOS .......................................................................................... XXXV
7.1 Obtención de los extractos de semillas de M. americana............... XXXV
7.2 Tamizaje fitoquímico preliminar de semillas de M. Americana..... XXXVI
7.3 Evaluación de la actividad antibacteriana de extractos de semillas de
[Link]..............................................................................................XXXVI
8. DISCUSIÓN ................................................................................................... XL
8.1 Tamizaje fitoquímico preliminar de semillas de M. americana............. XL
8.2 Actividad antibacteriana de semillas de M. americana ....................... XLI
9. CONCLUSIONES ...................................................................................... XLIV
10. RECOMENDACIONES O PROSPECTIVA ................................................ XLV
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANEXOS DE TABLAS
ANEXO DE FIGURAS

6
 LISTA DE TABLAS
Página
Tabla 1 Tamizaje fitoquímico preliminar de las semillas de
XXXVI
Ambrosia cumanensis Kuhn…………………………………..
Tabla 2 Porcentajes de inhibición del control positivo
XXXVII
(Kanamicina)…………………………………………………...
Tabla 3 Porcentajes de inhibición de las concentraciones del XXXVIII
control negativo (DMSO)…………………………………….
Tabla 4 Porcentajes de inhibición de las concentraciones de los
diferentes tipos de extractos………………………………..… XXXVIII
Tabla 5 Concentraciones mínimas inhibitorias de los extractos de
las semillas de M. americana…………………………………. XXXIX
Tabla 6 Datos crudos de las absorbancias del control positivo
(Kanamicina)……………………………………………………. LIII
Tabla 7 Datos crudos de las absorbancias del control negativo
(DMSO)…………………………………………………………. LIII
Tabla 8 Datos crudos de las absorbancias de los extractos de
semillas de M. americana del primer ensayo……………….. LII
Tabla 9 Datos crudos de las absorbancias de los extractos de LIV
semillas de M. americana del segundo ensayo……………
Tabla 10 Datos crudos de las absorbancias de los extractos de LIV
semillas de M. americana del tiempo cero…………………..

7
 LISTA DE FIGURAS

Página
Figura 1. Estructuras y nomenclatura de cumarinas extraídas de M.
americana (Mammea cumarinas)…………………………... XX

Figura 2. Dibujo lineal de Mammea americana L……………………… XXI

Figura 3. Distribución geográfica de Mammea americana L………… XXII

Figura 4. Actividad inhibitoria del control positivo

XLII
(Kanamicina)……………………………………………………

Figura 5. Efecto del DMSO sobre el crecimiento de E. faecalis…….. XLIII

Figura 6. Inhibición de los extractos de semillas de M. americana

frente a E. faecalis…………………………………………… XLIII

8
 ÍNDICE DE ABREVIATURAS

AcOEt (Acetato de etilo)

CHCl3 (cloroformo)

cm (centímetros)

DMSO (Dimetilsulfóxido)

DNA (Ácido desoxirribonucleico)

EtOH (Etanol)

FDA (Food and Drug Administration) (Administración de Drogas y Alimentos)

g (gramos)

MBC (concentración mínima bactericida)

mg (miligramos)

MIC (concentración mínima inhibitoria)

Min (minutos)

mL (mililitros)

mm (milímetros)

m.s.n.m (metros sobre el nivel del mar)

OMS (Organización mundial de la salud)

pH (potencial de hidrógeno)

PN (Productos naturales)

TLC (Inglés: Thin Layer Chromatography) (cromatografía en capa fina)

UFC (Unidades formadoras de colonias)

9
UV (Ultravioleta)

μg (microgramos)
o
C (grados centígrados)

2
 GLOSARIO

CONDUCTO RADICULAR: parte de la cavidad pulpar correspondiente a la

porción radicular de los dientes; en los que presentan más de una raíz se inicia en
el piso y termina en el foramen apical. Tiene forma cónica con la base mayor
dirigida hacia el piso y el vértice hacia la porción apical, forma similar a la de la
raíz.

DROGA VEGETAL: es la parte de la planta medicinal utilizada en terapéutica.

FRACCIONAMIENTO: acción y efecto de fraccionar. En este contexto se utiliza la

separación de subextractos de un extracto total (generalmente etanólico).

IRRIGANTES ANTIMICROBIANOS: son sustancias con un amplio espectro de

actividad antimicrobiana, entre estos se encuentra la clorhexidina, el hipoclorito de
sodio, el ácido cítrico, entre otros.

MACERAR: mantener sumergida alguna sustancia sólida en un líquido a

temperatura ambiente, con el fin de ablandar o extraer de ella las partes solubles.

METABOLITOS: son todas aquellas sustancias que resultan del metabolismo de

un ser vivo.

MICRODILUCIÓN: la disminución de una concentración de una disolución

añadiendo disolvente. El término microdilución se utiliza para denominar
disoluciones que son pequeñas generalmente en el orden de micromililitros.

NECROSIS: Degeneración de un tejido por muerte de sus células.

PLANTA MEDICINAL: es cualquier planta que en uno o más de sus órganos

contiene sustancias que pueden ser utilizadas con finalidad terapéutica o que son
precursores para la semisíntesis químico-farmacéutica.

POLARIDAD: la propiedad que tienen los agentes físicos de acumularse en los

polos de un cuerpo o de polarizarse. En el texto se entiende este término como la

I
polarización que tienen los diferentes metabolitos presentes en el extracto
etanólico en los diferentes solventes utilizados en la extracción, lo cual está
estrechamente relacionado con la solubilidad de estos.

PRINCIPIOS ACTIVOS: son las sustancias responsables de la acción

farmacológica.

RECIDIVA: Reaparición de una enfermedad algún tiempo después de padecida.

II
 RESUMEN

Introducción: Enterococcus faecalis es un microorganismo patógeno involucrado

en numerosas infecciones de la cavidad oral y por consiguiente en el fracaso de
procedimientos odontológicos, posiblemente por su alto grado de resistencia
químico-mecánica y a múltiples fármacos. Actualmente existe un notable interés
en la etnobotánica que investiga productos naturales como alternativa para nuevos
antimicrobianos. Objetivo: el presente estudio tuvo como objetivo determinar la
actividad antibacteriana de diversos extractos de semillas de Mammea americana
frente a Enterococcus faecalis. Materiales y métodos: para la obtención de los
extractos se utilizó el material vegetal seco previamente triturado, el cual fue
macerado en frío utilizando como solvente etanol durante 48 horas, el cual se
concentró a presión reducida y a partir de este se obtuvieron cuatro (4) extractos
orgánicos adicionales con solventes de diferentes polaridades. Luego de obtener
los extractos se solubilizaron en DMSO y se midió la actividad antimicrobiana
utilizando la técnica de microdilución en caldo en placas de 96 pozos en un
intervalo de concentración de 50 a 500mg/L, utilizando kanamicina como control
positivo y DMSO como control negativo. Resultados: al analizar los resultados del
ensayo se observó que los extractos hexanoico y clorofórmico mostraron los más
altos porcentajes de inhibición con una concentración mínima inhibitoria de 100 y
200mg/L respectivamente. Conclusión: en este trabajo se concluyó que los 4
tipos de extractos son candidatos para próximos estudios de fraccionamiento y
aislamiento de metabolitos secundarios con posible actividad antibacteriana frente
a E. faecalis.

Palabras clave: Mammea americana, Enterococcus faecalis, actividad

antibacteriana.

III
 1. INTRODUCCIÓN

La cavidad oral humana es una zona altamente colonizada por microorganismos

tales como virus, protozoos, hongos, arqueas y bacterias, siendo estos últimos los
principalmente señalados como causantes de enfermedades infecciosas. Muchas
especies de bacterias se han aislado de la boca, la mayoría inocuas. Sin embargo,
los microorganismos orales son los responsables de dos enfermedades comunes
en los seres humanos: la caries dental y la enfermedad periodontal 1.

La caries dental es una enfermedad muy prevalente en el mundo. Una opción para
tratar dientes ampliamente destruidos por caries dental es la realización de
tratamientos de endodoncia. Aun cuando estas terapias tienen un pronóstico
favorable en la mayoría de los casos, la literatura señala que existe la posibilidad
de fracaso.2 Una vez que el conducto radicular se infecta coronariamente, la
infección progresa apicalmente hasta que los productos bacterianos o las
bacterias Están en posición de estimular los tejidos periapicales, lo que conduce a
periodontitis apical. Los microorganismos y sus productos (endotoxinas) están
estrechamente relacionados con la etiología de las lesiones pulpares y
periapicales. Los conductos radiculares con infecciones primarias contienen una
alta carga bacteriana, pero La preparación del conducto radicular ha demostrado
ser capaz de reducir los porcentajes bacterianos en al menos el 95%. Las
infecciones endodónticas tienen una naturaleza polimicrobiana, con las bacterias
anaerobias obligadas dominando la microbiota en infecciones primarias. La
microbiota del conducto radicular incluye más de 700 especies bacterianas
diferentes que todavía no se han identificado a nivel de especie. Además de las

1
CHINSEMBU, K. Plants and other natural products used in the management of oral infections and
improvement of oral health. En: Acta Trópica. February, 2016. Vol 154, p. 6-18.

2
SOUZA, M; DALLA, D; GABRIELLI, E. et al. Effectiveness of final decontamination protocols against
Enterococcus faecalis and its influence on bond strength of filling material to root canal dentin. En:
Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. March 2017. Vol. 17, p. 92-97.

I
bacterias, otros microorganismos como las levaduras pueden ser Encontrado en
los canales radiculares con necrosis pulpar. Los principales microorganismos que
se aislan antes de un tratamiento de conducto radicular incluyen varillas
anaeróbicas Gram-negativas, Cocos anaeróbicos Gram-positivos, varillas
anaerobias y facultativas Gram-positivas, (especies sacarolíticas como muchos
tipos De Prevotella y especies asacarololíticas como Porphyromonas, además
Tannerella forsythia, Dialister, Fusobacterium, Spirochetes), especies de
Lactobacillus, y Gram-positivos Streptococcus facultativo. Los anaerobios
obligatorios generalmente son erradicados por el tratamiento endodóntico; Por el
contrario, las bacterias facultativas Como Streptococcus, Enterococcos, y
Lactobacilos son capaces de sobrevivir a la instrumentación quimio-mecánica del
conducto radicular;3 sin embargo dentro de las numerosas especies bacterianas
existentes, una de las más frecuentemente encontradas en dientes con necrosis
pulpar (sin historia previa de endodoncia) y más aislada en aquellos con recidiva
de infección (dientes con indicación de retratamiento) es Enterococcus faecalis4.

Enterococcus faecalis (E. faecalis) es un microorganismo anaerobio facultativo

altamente resistente a los procedimientos químico-mecánicos convencionales2.
Así mismo, ha adquirido un perfil multifármaco-resistente a fármacos
betalactámicos (penicilinas y cefalosporinas), tetraciclinas, macrólidos5,
aminoglicósidos (gentamicina y estreptomicina), lincosamidas (clindamicina) y
glucopéptidos (vancomicina).6 Esto lo ha convertido en una emergencia sanitaria

3
BORZINI L, CONDÓ R, DE DOMINICIS P, CASAGLIA A, CERRONI L, Root canal irrigations: Chemical agents and
plant extracts against Enterococcus faecalis. En: The Open Dentistry Journal. 2016, Vol. 10, p. 692-703.
4
SOUZA, M; DALLA, D; GABRIELLI, E. et al. Effectiveness of final decontamination protocols against
Enterococcus faecalis and its influence on bond strength of filling material to root canal dentin. En:
Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. March 2017. Vol. 17, p. 92-97.
5
JAIN, H; MULAY, S; MULLANY, P. Persistence of endodontic infection and Enterococcus faecalis: Role of
horizontal gene transfer. En: Gene Reports. 2016. Vol.5, p.112-116.
6
VELÁZQUEZ, N; VIGUERAS, J; ESCALONA, G. et al. Resistance to linezolid in methicillin-resistant
Staphylococcus aureus and Enterococcus with high-level resistance to aminoglycosides in a third-level
o
pediatric hospital. En: Bol. Med. Hosp. Infant. Mex. 2010. Vol.67, N .1, p.19-26.

II
que ha encendido alarmas en la comunidad científica impulsándola a buscar
nuevas alternativas quimio-mecánicas o antibacterianas, que permitan la
descontaminación y eliminación de E. faecalis de la cavidad oral.

El uso de plantas con fines curativos se remonta a muchos años atrás y guarda
relación con la flora existente en cada territorio. A pesar de ser utilizadas desde la
antigüedad y de generación en generación, hoy día son objeto de múltiples
investigaciones científicas en las que se han demostrado experimentalmente
algunas de las acciones atribuidas. Esto brinda la oportunidad de encontrar
nuevos agentes activos, a partir de una fuente de materia prima renovable 7.

Desde este punto de vista, la investigación de plantas medicinales es un potencial

enfoque viable para el descubrimiento de nuevos agentes bioactivos para resolver
problemas generalizados de salud pública8 específicamente relacionados con
sustancias antiinfecciosas. Este hecho puede evidenciarse en que alrededor del
5% de los medicamentos antiinfecciosos aprobados entre 1981 y 2002,
provinieron de fuentes naturales, muchos aislados a partir de plantas.98

Extractos de diversas plantas han demostrado efecto antibacteriano sobre

Enterococcus faecalis y la planta objeto de investigación; Mammea americana, es
una de ellas.9 Con este estudio se pretende evaluar la actividad antibacteriana de
los diferentes metabolitos que se obtengan de extractos de las semillas del fruto
de esta planta sobre E. Faecalis con el fin de identificarlos como potenciales

7
REMÓN, H; ALARCÓN, A; ALMEIDA, M. et al. Tamizaje fitoquímico y actividad antibacteriana de los extractos
secos de tinturas al 20 % de Mammea americana L. En: Rev Cubana Plant Med [online]. 2012. Vol.17, No.4,
p.300-307.
8
SHARMA, A; FLORES, R; CARDOSO, A. et al. Antibacterial activities of medicinal plants used in Mexican
traditional medicine, En: Journal of Ethnopharmacology. 2016. p.0378-8741.
9
SÜLSEN, V; CAZORLA, S; FRANK, F. et al. Natural Terpenoids from Ambrosia Species Are Active In Vitro and In
o
Vivo against Human Pathogenic Trypanosomatids. En: PLoS Neglected Tropical Diseases. 2013. Vol.7, N .10,
p.2494.
9 VEROTTA, L; LOVAGLIO, E; VIDARI, G et al. 4-Alkyl-and 4-phenylcoumarins from Mesua ferrea as promising
multidrug resistant antibacterials. En: Phytochemistry. 2004. Vol.65, No.21, p.2867-79.

III
agentes antimicrobianos. La obtención de resultados positivos en los ensayos será
el primer paso para la síntesis de una sustancia capaz de eliminar esta bacteria de
los conductos radiculares a la vez que permita abrir campo a nuevas
investigaciones con otras plantas y bacterias que participen activamente en el
desarrollo de patologías endodónticas.

En este estudio in vitro se realizaron pruebas de CMI (concentración mínima

inhibitoria) de extractos de semillas de Mammea americana sobre E. Faecalis,
midiendo y comparando lo observado en cada extracto y en los controles
utilizados.

Los resultados de este estudio propenderán para una futura eliminación y/o control
de Enterococcus Faecalis mediante el uso de estos metabolitos como irrigante
durante la preparación biomecánica previniendo la formación de lesiones
periapicales y recidivas en los tratamientos.

IV
 2. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

Enterococcus faecalis durante los últimos años se ha identificado como uno de los
microorganismos causantes de infecciones bucales (incluyendo las recidivantes)10.
Adicionalmente, este microorganismo ha generado un amplio espectro
multifármaco-resistente11,12, situación que se extiende a irrigantes utilizados en
endodoncia como hipoclorito de sodio (NaOCl), clorhexidina13 e hidróxido de
calcio14.

Por consiguiente, la investigación sobre alternativas para eliminar o controlar el

crecimiento de E. faecalis tiene importancia sanitaria y científica. El crecido
interés por los productos naturales de origen vegetal como solución a problemas
médicos y odontológicos existentes. Históricamente los productos naturales
demostraron ser una fuente amplia para el descubrimiento de nuevos agentes
antibacterianos.

Los estudios etnobotánicos establecieron criterios de inclusión y exclusión para la

selección del material vegetal de partida. Teniendo en cuenta que Mammea
americana es utilizada en etnobotánica con diferentes fines entre los que se
destaca su uso antiinfeccioso, existen algunos estudios que han demostrado la
actividad antibacteriana de esta planta. La mayoría se han centrado en extractos

10
SOUZA. Op. Cit., p.4
11
JAIN. Op. Cit., p.113-114
12
VELÁZQUEZ. Op. Cit., p.19

13
ASNAASHARI, M; ASHRAF, H; RAHMATI, A. et al. comparison between effect of photodynamic therapy by
LED and calcium hydroxide therapy for root canal disinfection against Enterococcus faecalis: A randomized
controlled trial. En: Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2016. [Link]/10.1016/[Link].2016.12.00.

14
JINGLEI, M; ZHONGCHUN, T; JUNQI, L. et al. The effects of sodium hypochlorite and chlorhexidine irrigants
on the antibacterial activities of alkaline media against Enterococcus faecalis. En: Archives of Oral Biology.
o
2015. Vol.60, N 7, p.1075-1081.

V
obtenidos a partir de las hojas y la corteza pero pocos son los que indican una
actividad antibacteriana de las semillas.

Mammea americana es un árbol nativo de las Antillas y del norte de Sudamérica 15

que pertenece a la familia Guttiferae16. Se utiliza ampliamente en la curación de
diversas enfermedades debido a su efecto antiparasitario e insecticida. Para estos
fines, se utiliza el látex de la semilla contra Aedes aegypti, que elimina las larvas
de este vector17. Se ha confirmado el efecto de la fruta para tratar la anemia,
mientras que la resina y la decocción de la corteza se emplean contra parásitos,
infecciones micóticas y eczemas18.

Diversos estudios in vitro han reportado la efectividad antibacteriana de extractos

de muchas partes de M. americana frente a microorganismos. Según Finnegan et
al (1973), algunas xantonas y benzofenonas aisladas de los aceites de la semilla
de esta planta mostraron actividad antibacteriana19; así mismo, Frame et al (1998),
informaron que un extracto etanólico de la hoja proporciona actividad inhibitoria
contra Mycobacterium tuberculae20.

15
RAPONDA, A; FORESTIÈRES, G; SILLANS, R. et al. Les plantes utiles du Gabon [Essai d'inventaire et de
concordance des noms vernaculaires et scientifiques des plantes spontanées et introduites, description des
espèces, propriétés, utilisations économiques, ethnographiques et artistiques]. En: Fondation Raponda
Walker-Centre culturel français de Libreville; Sépia. 1961.
16
CORREA, M. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Rio de Janeiro. 1994.
17
BANTAR, C; SARTORI, B; VESCO, E. et al. A hospitalwide intervention program to optimize the quality of
antibiotic use: impact on prescribing practice, antibiotic consumption, cost savings, and bacterial resistance.
En: Clinical infectious diseases. 2003. Vol.37, No.2, p.180-186.
18
PADILLA, L; CAPÓ, T; HERNÁNDEZ, A et al. Efecto diurético y toxicidad aguda del Orthosiphon aristatus
Blume (te de riñón). En: Revista Cubana de Plantas Medicinales. 1996. Vol.1, No3, p.26-30.
19
FINNEGAN, R; MERKEL, K; PATEL, J. Constituents of Mammea americana L. XII: Biological data for xanthones
and benzophenones. En: Journal of pharmaceutical sciences. 1973. Vol.62, N o.3, p.483-5.
20
FRAME, A; RÍOS, E; DE JESÚS, L. et al. Plants from Puerto Rico with anti-Mycobacterium tuberculosis
o
properties. En: Puerto Rico health sciences journal. 1998. Vol.17, N .3 p.243-52.

VI
Un componente activo principal, Mammea A/AA, ha sido aislado de la corteza del
tallo y del núcleo de la semilla de Mammea africana por Verotta et al (2004),
quienes encontraron que este compuesto inhibe el crecimiento de Enterococcus
faecalis21.

Yasunaka et al (2005) evaluaron 32 extractos de 22 plantas medicinales

mexicanas de 15 familias diferentes para determinar su actividad antibacteriana
contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus. El extracto de la cáscara del fruto
de Mammea americana L. (Clusiaceae) resultó altamente activo contra
Staphylococcus aureus22. A su vez, Remón et al. (2012) reportaron que los
extractos secos de las hojas y corteza del fuste de Mammea americana mostraron
actividad antibacteriana in vitro también frente a Staphylococcus aureus23.

De la misma forma, Canning et al en 2013, identificaron y aislaron el compuesto

Mammea A/AA de la corteza de esta planta, el cual presentó actividad inhibitoria
específica sobre cepas de Streptococcus pneumoniae, Clostridium difficile, y
Campylobacter jejuni24.

En un estudio experimental realizado en la Universidad de Cartagena, se evaluó el

efecto antibacteriano del extracto etanólico de la semilla de Mammea americana
contra Porphyromonas gingivalis y Streptococcus mutans. Se detectó actividad
bactericida y bacteriostática frente a S. mutans, según la concentración del
extracto, y sólo actividad bacteriostática contra P. gingivalis25.

21
VEROTTA, Op Cit. p. 2867.
22
YASUNAKA, K; ABE, F; NAGAYAMA, A. et al. Antibacterial activity of crude extracts from Mexican medicinal
plants and purified coumarins and xanthones. En: Journal of ethnopharmacology. 2005. Vol.97, No.2, p.293-
299.
23
REMÓN, Op Cit., p. 302.
24
CANNING et al. Antibacterial and cytotoxic activity of isoprenylated coumarin mammea A/AA isolated from
Mammea africana. En: Journal of ethnopharmacology. 2013. Vol.147, No1, p.259-62.
25
HERRERA, A; OSPINA F, FANG, L. et al. Susceptibility of Porphyromonas gingivalis and Streptococcus mutans
to Antibacterial Effect from Mammea americana. En: Advances in pharmacological sciences. 2014.

VII
En un trabajo de tesis en la Universidad de Cartagena, se evaluó la actividad
antibacteriana in vitro del extracto etanólico de Mammea americana contra
Enterococcus faecalis26 y Fusobacterium nucleatum. El extracto presentó una
actividad antibacteriana considerable frente a E. faecalis y F. nucleatum. Las fases
oleosa y etanólica del extracto de Mammea americana demostraron actividad
bacteriostática sobre Enterococcus faecalis a 500 ppm.

En el presente estudio, se evaluó la actividad antibacteriana de los diferentes

metabolitos obtenidos de extractos de la semillas de Mammea americana frente a
Enterococcus faecalis, con el fin de establecer si estos son fuente alternativa que
pueda ser utilizada en la prevención y tratamiento de enfermedades infecciosas
generadas por esta bacteria; de lo anterior surge la siguiente pregunta:

¿Existe un efecto antibacteriano de los metabolitos obtenidos de extractos de las

semillas de Mammea americana sobre la cepa de Enterococcus Faecalis ATCC
(51299)?

26
COVO, Eduardo; DÍAZ, Antonio; FRANCO, Angélica et al. Evaluación del efecto antibacteriano del extracto
de mammea americana sobre cepas de Enterococcus faecalis y Fusobacterium nucleatum. Trabajo de grado
Posgrado de Endodoncia. Cartagena: Universidad de Cartagena. Facultad de Odontología, 2016. 78 p.

VIII
 3. JUSTIFICACIÓN

Actualmente, el gran reto para los países ricos en biodiversidad de especies

vegetales como Colombia, es poder vincular y convertir el conocimiento de los
recursos biológicos de las comunidades rurales en compuestos, procesos,
métodos, herramientas o productos útiles como parte de su aprovechamiento en
beneficio de la comunidad. Es por esto que en este estudio se seleccionó una
especie vegetal de especial importancia: Mammea americana, presente en gran
parte del territorio colombiano, teniendo como antecedente diferentes estudios
reportados sobre sus propiedades.

El presente estudio es de gran importancia en endodoncia, ya que evalúa si los

metabolitos obtenidos de extractos de las semillas de M. americana poseen, in
vitro, efecto antibacteriano sobre E. faecalis, bacteria encontrada en un porcentaje
significativo en casos de fracaso endodóntico. Adicionalmente, esta investigación
tiene importancia clínica por proponer una nueva sustancia que coadyuve a la
desinfección de los conductos radiculares siendo esta, objetivo o fuente para el
aislamiento e identificación de metabolitos con actividad antibacteriana contra E.
faecalis.

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la actividad antibacteriana de los metabolitos obtenidos de extractos de

las semillas de Mammea americana frente a la cepa Enterococcus faecalis ATCC
(51299).

IX
 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

4.2.1. Determinación de la actividad antibacteriana de los diferentes metabolitos

obtenidos de extractos de la semilla de Mammea americana frente a E.
faecalis ATCC (51299).
4.2.2 Obtención y caracterización fitoquímica de los metabolitos obtenidos de
extractos de la semilla de Mammea americana.

X
 5. MARCO TEÓRICO

5.1 MARCO CONCEPTUAL

5.1.1 PARTE FITOQUÍMICA

[Link] Estudios etnobotánicos

Muchas especies de plantas medicinales en un gran número de países en

desarrollo constituyen alternativas a la medicina convencional, especialmente en
comunidades de bajos recursos donde no tienen acceso a los servicios de salud.
Es debido a esta situación, entre otras razones culturales, que un número de
plantas medicinales nativas de zonas tropicales han tenido un valor significativo
para las comunidades indígenas, debido a sus propiedades curativas27.

El uso cultural de las plantas con fines medicinales es el objetivo de la

etnofarmacología vegetal, en donde una comunidad ha establecido el uso de una
planta y lo reconocen ampliamente como inocuo y eficaz28. Vale aclarar que a
pesar de su uso cultural, esto no garantiza en lo absoluto las propiedades
medicinales que se le asignan. Desde este punto de vista, es importante estudiar
las plantas usadas por las comunidades, no solo porque contribuyen a validar los
usos atribuidos, sino también para buscar alternativas en el manejo de patologías,
específicamente de enfermedades infecciosas.

La importancia de los estudios etnobotánicos de plantas medicinales radica en que

son el punto de partida en la búsqueda de fuentes de nuevas moléculas y
principios activos a partir de recursos naturales, circunstancia extrapolable al

27
GONZÁLEZ, A; SØRENSEN, M; y THEILADE, I. Uso y valoración de las especies de plantas medicinales nativas
e introducidas en Campo Hermoso y Zetaquira, Boyacá, Colombia. En: Diario de Etnobiología y etnomedicina.
2013. Vol.9, p 23.
28
RODRÍGUEZ, C y OPORTO, G. Estudio etnobotánico de especies medicinales utilizadas por la comunidad de
la vereda campo alegre del corregimiento de siberia – cauca Colombia. En: Revista de ciencias. 2013. Vol.17,
No.2, p.35-49.

XI
desarrollo de derivados sintéticos y semisintéticos para la manufactura de
medicamentos29.

5.1.2 Productos naturales (PN)

Los productos naturales han demostrado históricamente su valor como fuente
potencial de moléculas con actividad terapéutica, representando hoy día, una
reserva importante para la identificación de nuevas drogas. En las últimas
décadas, la industria farmacéutica se ha centrado principalmente en las bibliotecas
de compuestos sintéticos como fuente de descubrimiento de fármacos 30. Sin
embargo, a pesar de esta situación, ha disminuido el número de nuevos
medicamentos que llegan al mercado, renovando el interés científico en los
fármacos de origen natural.
Aunque la complejidad intrínseca en el descubrimiento de fármacos a base de
productos naturales requiere enfoques interdisciplinarios altamente integrados, los
avances científicos, tecnológicos y las tendencias de investigación, indican
claramente que los productos naturales serán fuente importante de nuevos
medicamentos en el futuro31.
Lo anterior puede verse reflejado en que cerca del 50 por ciento de los
medicamentos aprobados por la FDA fueron PN o derivados de estos32. Según el
Boletín de la Organización Mundial de la Salud (OMS), alrededor del 65% de la
población mundial, se basa en las plantas medicinales como su fuente de atención
primaria. Se ha estimado que alrededor del 39% de los medicamentos
desarrollados desde 1980, provienen de productos naturales, de sus derivados o

29
RODRÍGUEZ. Op. Cit., p36
30
ATANASOV, A; WALTENBERGER, B; FERSCHY, E. et al. Descubrimiento y el reabastecimiento de productos
naturales farmacológicamente activos de origen vegetal: Una revisión. En: Los avances de la biotecnología,
Vol.33, No.8, p.1582-1614.
31
Ibid. p.1583
32
Gu, J; Gui, Y; Chen, L; Yuan, G. et al. The use of natural products such as the chemical library of drug
o
discovery and the Pharmacology Network . En: PLoS ONE, 2013, Vol.8, N .4, p.e62839.

XII
sus análogos; además de afirmarse, que aproximadamente el 25% de los
medicamentos usados actualmente se derivan de plantas33.

En la investigación de plantas existen diferentes enfoques para seleccionar el

material de partida, entre otros, el género o familia donde se ha reportado
aislamiento de compuestos con la actividad biológica de estudio y estudios
etnobotánicos. Cabe señalar que las familias de las plantas con efecto
antimicrobiano, poseen una distribución ubicua. Esto significa que las plantas de
todas las regiones del mundo pueden ser fuente natural para el descubrimiento de
antimicrobianos, por lo que pueden generar un amplio campo de investigación34.

La odontología actual no es ajena al uso potencial de productos de origen natural

aún más cuando de irrigantes o antibacterianos orales se trata. A continuación se
presentan algunas de las sustancias más relevantes que pueden ofrecer una
alternativa a los principales irrigantes en el campo (hipoclorito de sodio,
clorhexidina).

Uncaria tomentosa
Conocido comúnmente como "garra del gato" debido a las pequeñas espinas
curvadas en el vástago en la juntura de la hoja, ofrece propiedades anti-
inflamatoria, antiviral, antibacteriana, antioxidante, y la acción inmunomoduladora.
Su toxicidad es baja cuando es utilizado correctamente, siendo esta una ventaja
importante de los tratamientos de plantas medicinales sobre métodos más
convencionales. Herrera et al. han evaluado la actividad antimicrobiana de Uncaria
tomentosa contra E. Faecalis, S. Aureus y C. Albicans. 2% de gel de Uncaria
tomentosa y gel de clorhexidina al 2% tenían una actividad antimicrobiana similar

33
POOJARY, M; VISHNUMURTHY, K; VASUDEVA, A. Extraction, characterization and biological studies of
phytochemicals from Mammea suriga. En: Journal of Pharmaceutical Analysis. June 2015. Vol. 5, no.3, p.182-
189.
34
RAMIREZ, L. Metodologías para evaluar in vitro la actividad antibacteriana de compuestos de origen
o
vegetal. En: Scientia et Technica. 2009. Vol.15, N .42, p. 263-268.

XIII
a S. Aureus, mientras que la clorhexidina es más efectiva contra E. faecalis y C.
albicans. U. Tomentosa contiene triterpenos, esteroides vegetales y glicoides,
estos compuestos pueden estar relacionados con su actividad antimicrobiana.

Vinagre de manzana
El vinagre de manzana ha sido indicado como un agente antiséptico debido a sus
propiedades medicinales, con su uso como una solución auxiliar en el sistema
quimiomecánico en la preparación de los canales radiculares que ha mostrado
buenos resultados en comparación con NaOCl y EDTA. Se ha evaluado la eficacia
del vinagre de manzana en la microbiota endodóntica, mostrando una buena
acción bactericida contra microorganismos asociados con irrigaciones
endodónticas, como S. Aureus y E. Faecalis.

Propóleos
Presenta acciones anti-inflamatorias y antimicrobianas. Duarte et al. demostraron
su influencia en la reducción de la producción de ácido por S. mutans en el biofilm
dental, además de su acción inhibitoria sobre la actividad F-ATPasa De S. mutans.
Ferreira et al. evaluaron la actividad antimicrobiana in vitro del propóleos contra las
bacterias anaeróbicas, como Prevotella Nigrescens, Fusobacterium nucleatum y
Enterococcus faecalis. El análisis microbiológico no reveló diferencias entre
grupos irrigados con propóleo y grupos tratados con otros medicamentos
intracanales tales como el Hidróxido cálcico.

Aceites esenciales
Los aceites esenciales obtenidos a partir de plantas conocidas y usadas desde
hace siglos (especias, medicinales y plantas aromáticas) se prueban cada vez
más por su actividad antibacteriana y antifúngica. La actividad antimicrobiana de
los aceites esenciales están estrictamente conectados a su composición química,
que está influenciada por numerosos factores incluyendo la procedencia de la
planta, la parte de la planta utilizada, la etapa de desarrollo de la planta, las

XIV
condiciones climáticas y de crecimiento (Temperatura, suelo, fertilizantes, etc.), así
como las condiciones de destilación y almacenamiento. 35

5.1.3 Extractos

Los extractos vegetales se definen como un concentrado obtenido por tratamiento

a material vegetal con solventes orgánicos, tales como etanol, éter, entre otros.
Están constituidos por una mezcla de metabolitos secundarios de la planta y por
sustancias inertes producidas de la totalidad o de partes de ella, fresca o seca.

Tipos de extractos
Existen diferentes tipos de extractos entre los que encontramos:
Extractos fluidos: son aquellos en los que el volumen de líquido del extracto es
igual al volumen de la planta seca que se haya usado.

Extractos blandos: son a los que se les ha retirado el agua parcialmente hasta
tener una consistencia de ungüento.

Extractos secos: son aquellos a los que se les ha retirado en su totalidad el agua
y su apariencia es la de un polvo muy fino36.

5.1.4 Métodos de extracción

Para lograr una extracción eficiente de los metabolitos presentes en una planta se
requiere un sistema de solventes adecuado, que se selecciona dependiendo del
propósito del investigador. En primer lugar, se pueden seleccionar dependiendo de
la polaridad del tipo de metabolito que se desea aislar, pero cuando no se tiene
certeza de un tipo de metabolito en particular, se procede a obtener diferentes
tipos de extractos de diferentes polaridades con el fin de estudiarlos.

Generalmente, se utiliza la extracción con solventes orgánicos de bajo punto de

ebullición y de baja reactividad; inicialmente se puede partir de etanol debido a su
35
BORZINI, Op. Cit., p. 693.
36 o
OLAYA, J y MENDEZ, J. Guía de plantas y productos medicinales. En: Serie ciencia y tecnología. 2003. N 116,
p.11.

XV
capacidad para arrastrar o recuperar la mayoría de metabolitos secundarios. Los
extractos son evaporados bajo presión reducida o liofilizados en caso de
extracciones con agua37. Estas extracciones se diferencian de las soluciones
verdaderas en que están presentes sustancias en suspensión.

Los métodos de extracción se basan en las diferentes solubilidades de los

diferentes compuestos encontrados en el material vegetal. Para sustancias de
baja polaridad (lípidos, terpenos y terpenoides), se utilizan como solventes: éter de
petróleo o hexano; para sustancias medianamente polares: cloroformo; para
sustancias polares: acetato de etilo; y para sustancias de alta polaridad: etanol o
metanol.

Los principales métodos de extracción son:

Continua en soxhlet: el material seco se sitúa en un recipiente inferior, el vapor

del solvente asciende al condensador y gotea sobre el material vegetal.

Por reflujo: el material vegetal y el solvente se colocan en un balón, el cual tiene

acoplado un refrigerante; se calienta, el solvente evaporado se condensa y vuelve
a mezclarse con el material vegetal.

Maceración en frío: el material se mezcla con el solvente triturado continuamente

en frío38.

5.1.5 Identificación preliminar de metabolitos secundarios

El tamizaje fitoquímico o “Screening” fitoquímico es una de las etapas iniciales de

la investigación fitoquímica, que permite determinar cualitativamente los
principales grupos de constituyentes químicos presentes en una planta y, a partir

37
ÁVALOS, A y PÉREZ, E. Metabolismo secundario de plantas. 2009, Serie fisiología vegeta. En: Reduca
(biología). Vol.2 No.3, p.119-145.
38
Ibid. p.122-140

XVI
de allí, orientar la extracción y/o fraccionamiento de los extractos para el
aislamiento de los grupos de mayor interés 39.

El tamizaje fitoquímico consiste en la extracción de la planta con solventes

apropiados y la aplicación de reacciones de coloración. Debe permitir la
evaluación rápida, con reacciones sensibles, reproducibles y de bajo costo. Los
resultados del tamizaje fitoquímico constituyen únicamente una orientación y
deben interpretarse en conjunto con los resultados del “Screening” farmacológico.
Así, cuando una planta revela acción sobre un sistema durante el tamizaje
farmacológico y presencia de alcaloides en el tamizaje fitoquímico, es probable
que la acción farmacológica se deba a la fracción alcaloidal. Esta puede ser
aislada y sometida a pruebas más específicas40.

[Link] Principales metabolitos identificados en las plantas

Alcaloides: Comprenden una gran familia de más de 15.000 metabolitos

secundarios que contienen nitrógeno y se encuentran en aproximadamente el 20%
de las especies de plantas vasculares. En estas sustancias, el átomo de nitrógeno
está formado en parte por un anillo heterocíclico que contiene átomos de nitrógeno
y de carbono. Como grupo, los alcaloides son los más conocidos por sus
impresionantes efectos farmacológicos sobre los animales vertebrados41.

Taninos: Son compuestos fenólicos poliméricos que se unen a proteínas

desnaturalizándolas. El nombre de tanino procede de la antigua práctica de utilizar
extractos vegetales para convertir la piel animal en cuero (en el curtido, se unen al
colágeno aumentando su resistencia al calor, al agua y a microorganismos).
Existen dos categorías: taninos condensados y taninos hidrolizables. Estas

39
SHARAPIN, N; MACHADO, L; SOUZA, E. et al. Fundamentos de la tecnología de productos fitoterapéuticos,
En: Área de ciencia y tecnología del Convenio Andrés bello & Red Iberoamericana de Productos
Fitoterapéuticos (RIPROFITO) del Subprograma X del CYTED. 2000. p.198.
40
Ibid. p.198
41 o
TAIZ, L. Fisiología vegetal. En: Publicaciones de la universitat de jaune. 2006. Vol.2, N .10, p.554.

XVII
sustancias son de sabor astringente y tienen la propiedad común de curtir la piel,
haciéndola imputrescible e impermeable al fijarse a sus proteínas42.

Glicósidos: Más correctamente heterósidos; son compuestos que presentan en

su estructura, una parte formada por una o más moléculas de azúcar y otra
denominada aglicón o aglicona. Los glicósidos se clasifican de acuerdo a la
naturaleza de su aglicona en: esferoidales, triterpénicos, flavonoides,
antraquinónicos, cumínicos, cianógenos, etc. Desde el punto de vista terapéutico,
las sustancias de más interés son los glucósidos cardiotónicos43.

Glicósidos cardiotónicos

Los glucósidos cardíacos (CRGs) son metabolitos naturales de los cuales

pequeñas dosis pueden afectar los músculos del corazón de una manera
específica.

Su efecto (cardiotónico) ya era conocido en el antiguo Egipto hace más de 3000

años y se han utilizado en el tratamiento de enfermedades cardíacas durante más
de 200 años. CRGs forman un grupo bien definido con estructuras homogéneas.
Comprenden el núcleo de aglicona y un resto de azúcar (a menudo un
oligosacárido). Los glucósidos cardiotónicos pueden ser de dos tipos: cardenólidos
y bufadienólidos44.

Saponinas: Son generalmente conocidas como compuestos no volátiles que

están ampliamente distribuidos en la naturaleza. El nombre "Saponina" se deriva
de la palabra latina "sapo", que refleja sus propiedades surfactantes: capacidad de
formar espumas estables en forma de jabón en soluciones acuosas. La naturaleza
anfifílica de las saponinas y la combinación de un hidrofóbico aglicona

42
DOMINGO, D y LÓPEZ, M. plantas con actividad antimicrobiana. En: [Link] Quimiterap. España. 2003.
o
Vol.16, N .4, p.385-393.
43
SHARAPIN. Op. Cit., p.83
44
BARTNIK, M y FACEY, P. Chapter 8 - Glycosides, In Pharmacognosy, edited by Simone Badal and Rupika
Delgoda, En: Academic Press, Boston, 2017, p.144.

XVIII
(sapogenina), unida a la cadena o cadenas hidrofílicas de azúcar, distinguen estos
compuestos de otros glucósidos. La estructura química de la sapogenina define la
clasificación de las saponinas como esteroides o triterpenoides45.

Flavonoides: Son compuestos polifenólicos sintetizados en las plantas a través

del metabolismo fenilpropanoide o vía acetato-malonato. Se han reportado más de
diez mil variantes estructurales de flavonoides. El término "flavonoide" describe
generalmente una amplia colección de productos naturales formados por
estructuras C6-C3-C6 que forman un 2-fenil-benzo-alfa-pireno (cromano) que
consiste en dos anillos de benceno (A y B) unidos a través de un anillo
heterocíclico de pirano (C). Estos son un grupo de compuestos estructuralmente
relacionados, divididos por el grado de hidroxilación, metoxilación, prenilación,
glicosilación y fijación del anillo B en C-2 (más frecuentemente) o posición C-346.

Cumarinas. Las cumarinas deben su nombre de clase a "Coumarou", el nombre

de la haba tonka (Dipteryx odorata Willd., Fabaceae), del que fue aislado el
coumarin en 1820. El núcleo cumarínico consiste en un anillo de pirona unido a
un anillo de benceno. Las cumarinas son 1,2-benzopironas (benzo-2-pironas,
cromeno-2-onas) y se clasifican en: cumarinas simples, furanocumarinas,
piranocumarinas y las cumarinas sustituidas con pirona (benzocumarinas y
furanobenzocumarinas) con benceno o benzofurano respectivamente47. Las
cumarinas son unos de los metabolitos que han destacado en la planta M.
americana.

Triterpenos y esteroles. Los triterpenos son el grupo biológicamente versátil de

terpenos; se componen de subunidades de isopreno y consisten en
aproximadamente 30.000 compuestos identificados. En relación con el número de
unidades isoprenoides, los terpenos se subdividen en: monoterpenos (C10),
sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterpenos (C25), triterpenos (C30) y

45
Ibid. p.136
46
Ibid. p.117
47
Ibid. p.111

XIX
tetraterpenos (C40), donde el esqueleto de carbono es acíclico, contiene
estructuras mono-, bi-, tri-, tetra- y pentacíclicas, respectivamente. Los términos
triterpenos y triterpenoides se usan frecuentemente para describir el mismo
compuesto C30-terpeno. Mientras que el triterpeno se usa como un término
colectivo para describir los terpenos naturales. La expresión más amplia
triterpenoide cubre también productos naturales de degradación, por ejemplo
iononas, así como derivados naturales y sintéticos tales como: alcoholes
terpénicos, aldehídos, cetonas, ácidos, ésteres, epóxidos y productos de
hidrogenación48.

Los esteroides poseen una estructura de ciclopentaperhidrofenantreno total o

parcialmente reducido, a veces con grupos metilo en C-10 y C-13. Sin embargo, la
columna vertebral de la cadena lateral en C-17, su longitud y la estereoquímica de
algunos de sus centros quirales, conducen a diferentes esqueletos de esteroides.
Desde el descubrimiento de la limonina en 1960, muchos esqueletos de
limonoides naturales han sido caracterizados. La ocurrencia de las últimas
modificaciones estructurales proporciona diversas columnas vertebrales de
limonoides con 26 carbonos, justificando por qué esta clase de compuestos se
llama tetranortriterpenoides49.

[Link] Principales pruebas fitoquímicas para la identificación de

metabolitos secundarios 50

Ensayos de Mayer y de Wagner: permiten identificar alcaloides; se procede de la

forma descrita para el ensayo de Dragendorff, hasta obtener la solución ácida. Si

48
MUFFLER, k; LEIPOLD, D; SCHELLER, M. et al. Biotransformation of triterpenes, En: Process Biochemistry.
o
2011. Vol.46, N 1, p.2.

49
PERGAUD, L y KUETE, V. 4-Triterpenes and Steroids from the Medicinal Plants of Africa, In Medicinal Plant
Research in Africa. En: Elsevier, Oxford. 2013. p.135.

50
JÁTIVA, Cumanda. Texto básico de Farmacognosia y Productos Naturales. En: Riobamba CDR-XEROX 2000.
p.56- 59.

XX
al añadir 2 o 3 gotas de la solución reactiva de Mayer o Wagner respectivamente,
se observa opalescencia, turbidez definida, precipitado coposo, entonces se
considera positiva la presencia de este tipo de metabolito. En el caso de alcaloides
cuaternarios y/o aminoácidos libres, estos sólo se encontrarán en el extracto
acuoso. Para considerar su presencia debe observarse la aparición de turbidez
definida o precipitado coposo en todos los casos, ya que la aparición de
opalescencia puede dar un resultado falso, pues puede provenir de una extracción
incompleta de bases primarias, secundarias o terciarias.

El ensayo de Baljet: permite reconocer en un extracto la presencia de

compuestos con agrupamiento lactónico, en particular cumarinas; aunque hay
otros compuestos lactónicos que pueden dar también positivo en este ensayo. En
estas condiciones se considera la presencia de esta familia de compuestos por la
aparición de una coloración y un precipitado.

Ensayo de Bornträguer: Si la fase acuosa alcalina se colorea de rosado a rojo, el

ensayo se considera positivo. Se utiliza para la identificación de quinonas.

Ensayo de Liebermann – Burchard: Se utiliza para identificar triterpenos y/o

esteroides debido a que ambos tipos de productos poseen un núcleo de
androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6.

Ensayo de Shinoda: Permite reconocer la presencia de flavonoides. El ensayo se

considera positivo cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja,
carmelita o rojo, intensos en todos los casos.

Ensayo de Antocianidinas: permite identificar en los extractos la existencia en

estas estructuras de secuencia C6-C3-C6 del grupo de los flavonoides. La
aparición de un color rojo a marrón en la fase amílica es indicativa de un ensayo
positivo. La presencia de estructuras tipo polisacárido, que forman un coloide
hidrófilo de alto índice de masa que aumenta la densidad del agua de donde se
extrae, denota la presencia de mucílagos.

XXI
Ensayo de espuma: permite reconocer la presencia de saponinas, tanto del tipo
esteroidal como triterpénicas.

5.1.6 Género Mammea

El género Mammea pertenece a la familia Clusiaceae y se compone de 70

especies que crecen en las regiones tropicales de todo el mundo. Muchas de las
especies del género Mammea se usan en la medicina tradicional para el
tratamiento de diversas enfermedades tales como fiebre, dolores estomacales e
infecciones microbianas51.

Los estudios fitoquímicos de miembros del género Mammea reportan una serie de
compuestos cumarínicos del tipo Mammea. Se ha informado en la literatura que
39 cumarinas del tipo Mammea han sido previamente aisladas e identificadas de
diversas partes de Mammea americana52.

51
MAGADULA, J; MASIMBA, P; TARIMO, R. et al. Mammea-type coumarins from Mammea usambarensis
Verdc. En: Biochemical Systematics and Ecology. 2014. Vol.56, p.65.
52
Ibid. p.56

XXII
 [Link] Metabolitos secundarios aislados del género Mammea.

En este género, los metabolitos que han mostrado y a los cuales se les ha
atribuido la mayoría de las actividades biológicas son las cumarinas. Según la
revista SciFinder database, del género Mammea se han aislado aproximadamente
120 tipos de cumarinas. Entre estos metabolitos se han reportado distintos tipos
de actividades biológicas entre las que se encuentran insecticidas, antivirales y
antioxidantes. Para estos, se ha propuesto una nomenclatura que se basa
brevemente en el nombre 'mammea'' seguido por una primera letra que indica la
sustitución en C-4 (carbono cuatro). Una segunda letra indica si el grupo acilo está
en C-6 (carbono seis) o C-8 (carbono ocho). Una tercera letra está relacionada
con el tipo de sustituyentes acilo. Cuando el sustituyente prenilo ha sido
posteriormente ciclado, la tercera letra va seguida del prefijo ciclo y una cuarta
letra que indica el tipo de heterociclo implicado 53, como se indica en la figura 1.

era
Sustitución en C-4 1 letra Sustitución en C-6 o C-8 3era letra
R1 = fenilo Mammea A R2/R3 = 3-metilbutilico A
R1 = propil Mammea B 2-metilbutilico B
R1 = 1-acetoxipropil Mammea e butinilo C
2-metilpropinilo D
Posición del grupo acilo 2da letra Si la ciclación del grupo prenilo Ciclo+4ª letra
R2 = Acilo A 2,2-dimetilcromene ciclo D
R2 = Acilo B 3-hidroxy-2,2-dimetildropirane ciclo E
2-(1-hidroxy-1metiletil) ciclo F
dihidrofurano
Figura 1.
Estructuras y nomenclatura de cumarinas extraídas de M. americana (Mammea
cumarinas)54.

5.1.7 Mammea americana L.

53
DANG, B; GUITTON, Y; FREUZE, I; GROVEL, O. et al. Dereplication of Mammea neurophylla metabolites to
isolate original 4-phenylcoumarins. En: Phytochemistry Letters. 2015. Vol 11, p.61-68.
54
Ibid. p.64

XXIII
Árbol de hoja perenne que alcanza una altura de 18 a 21 mts. Tiene un tronco
corto con una corona oval. La fruta es de unos 300 a 500 g en peso. Es una fruta
redonda ovoide, similar en forma y tamaño a una naranja (aproximadamente 7,7-
9,8 cm de longitud y 10,9-8,6 cm de diámetro)55.

A pesar de que la manzana mamey comúnmente se considera una drupa, en

realidad es una baya. La corteza es de color rojizo, cubierta de manchas
marrones, dura, gruesa, coriácea, arrugada y tiene aproximadamente 4 mms de
espesor. La fruta contiene una gran semilla única rodeada por una capa fina de
carne amarilla. El endocarpio, que es también amarillo, es de aproximadamente 2-
5 mm, grueso y fusionado con la testa56.

Cuando la fruta está completamente madura, la carne es apetitosamente fragante.

Su sabor es similar al del albaricoque, melocotón o frambuesa roja, pero algunas
variedades se caracterizan por un aroma ácido. Frutas demasiado ácidas o
demasiado dulces son consideradas de baja calidad57.

Descripción botánica

Taxonomía

Reino Plantae

Phylum Magnoliophyta
A
Clase Magnoliopsida

Orden Theales

Familia Clusiaceae

Género Mammea

Epíteto específico americana Figura 2. Dibujo lineal de Mammea americana

58 L. (A) semilla. Tomado de Trópicos
Autor L.
([Link]

55
YAHIA, E y GUTTIERREZ, F. 20 - Mamee apple (Mammea americana L.). En: Woodhead Publishing Series in
Food Science, Technology and Nutrition, Woodhead Publishing. 2011. p.475.
56
Ibid. p.475
57
Ibid. p.475
58
(JBMB) Jardín Botánico de Missouri Biblioteca. En: Flora brasiliensis illustration. 1840-1906. Vol. XII, Part I,
Plate 79.

XXIV
 [Link] Distribución geográfica de M. americana en Colombia

La planta se encuentra distribuida en gran parte del territorio colombiano, logrando

crecer en ambientes desde el nivel del mar hasta zonas superiores a los 1500
msnm; se ha reportado su presencia en los departamentos de Bolívar, Antioquia,
Caldas, Cundinamarca y Guajira. Figura 2.

Región Biogeográfica

Andes, Llanura del

Caribe, Pacífico, Valle
del Magdalena.

Elevación

100 - 1670 m.

Departamentos

Antioquia, Bolívar,
Caldas, Cundinamarca,
La Guajira.

Distribución Global

Nativa de las Antillas,

cultivada en zonas
tropicales.

Figura 3. Distribución geográfica de Mammea americana L. tomado de: Celis, M. 2017-1-

09. Mammea americana L. En Bernal, R., S.R. Gradstein & M. Celis (eds.). 2015. En: Catálogo de
plantas y líquenes de Colombia. Instituto de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de
Colombia, Bogotá. [Link]

XXV
 [Link] Usos del fruto de Mammea americana L.

Atendiendo a los reportes populares realizados, se ha demostrado que la planta

M. americana se utiliza ampliamente en la curación de diversas enfermedades
debido a su efecto antiparasitario e insecticida. Para estos fines, se utiliza el látex
de la semilla contra el Aedes aegypti, que elimina las larvas de ese vector. Por
otra parte, se ha confirmado el efecto de la fruta para tratar la anemia, mientras
que la resina y la decocción de la corteza se emplean contra los parásitos,
infecciones micóticas y eczemas. La infusión de sus hojas es un antifebrífugo 59.

[Link] Semillas de M. americana L.

Las infusiones de las semillas pulverizadas se usaron con frecuencia como

insecticidas para eliminar las garrapatas y los ácaros en los animales domésticos y
en los seres humanos. Los usos del mamey en la medicina popular han incluido
las semillas de esta planta en el tratamiento de las infecciones del cuero
cabelludo, diarrea, problemas oculares y digestivos. La mameína y las cumarinas
relacionadas han sido objeto de investigación para determinar su actividad
farmacológica60. Existen pocos estudios de la semilla de esta planta; según la
literatura, del aceite de la semilla se ha aislado el floroglucinol 61.

5.2 PARTE MICROBIOLÓGICA

5.2.1 Género Enterococcus

Son microbios bien adaptados como comensales de los tractos gastrointestinales

de los organismos de hombre a insectos. Han surgido a lo largo de las últimas
décadas como causantes de infecciones nosocomiales. Esta evolución se debe,

59
REMÓN. Op Cit., p. 302
60
FRANCIS, J. Mamey, mammea-apple. Department of Agriculture, Forest Service. En: Southern Forest
Experiment Station. 1989. p. 334-337.
61
TOMA, W; HIRUMA, C; GUERRERO, R. et al. Preliminary studies of Mammea americana L. (Guttiferae)
bark/latex extract point to an effective antiulcer effect on gastric ulcer models in mice. En: Phytomedicine.
o
2005. Vol. 12, N . 5, p.345-350.

XXVI
en parte, a su resistencia intrínseca a las duras condiciones de entornos
hospitalarios, resultando a menudo en su concurrencia con otros microbios
resistentes a los antibióticos. En hospitales y entornos agrícolas, los enterococos
han servido como punto de recogida para los factores de resistencia a antibióticos,
y con la aparición en los 80 de cepas resistentes a la vancomicina, pocos
tratamientos bactericidas permanecen. Se piensa que han comenzado a transferir
genes con Staphylocuccus aureus resistentes a meticilina y a adquirir su
resistencia. Como resultado, los enterococos resistentes a múltiples fármacos se
han convertido en una preocupación principal de salud pública62.

Los Enterococcus son células esféricas u ovoides, de tamaño 0,6-2,0×0,6-2,5 µm.

Son cocos grampositivos, no formadores de endosporas. Se presentan en forma
de pares o de cadenas cortas. Son no mótiles, con excepción de las especies E.
gallinarum y E. casseliflavus. Son anaerobios facultativos, quimiorganótrofos, con
metabolismo fermentativo. Fermentan un amplio rango de carbohidratos con
producción principalmente de L (+)- ácido láctico, pero no de gas, y producen un
pH final de 4,2-4,6. Presentan requerimientos nutricionales complejos. Son
catalasa negativos o, más comúnmente, débilmente positivos. Crecen usualmente
en un caldo de cultivo entre 10ºC y 45ºC, aunque el crecimiento óptimo es a 37ºC.
Pueden crecer a pH 9,6, con 6,5% de NaCl y con 40% de bilis. Usualmente
fermentan la lactosa. Portan el antígeno D del grupo Lancefield y poseen el
carbohidrato C. Sobreviven después del calentamiento a 60ºC durante 30 min63.

Microbiológicamente, los enterococos son clasificados como: cocos grampositivos,

anaerobios facultativos, catalasa negativos y la mayoría aglutinan con anticuerpos
específicos para el grupo D de Lancefield. Debido a estas características, durante
62
HEIMER, S; MORRISON, R; GILMORE, M. Chapter 39 - The Enterococci, In Molecular Medical Microbiology
(Second Edition), edited by Yi-Wei Tang, Max Sussman, Dongyou Liu, Ian Poxton and Joseph Schwartzman, En:
Academic Press, Boston. 2015. p.717-730.

63
DIAZ, M; RODRIGUEZ, C; ZHURBENKO, R. Aspectos fundamentales sobre el género Enterococcus como
patógeno de elevada importancia en la actualidad. En: Revista Cubana Higiene y Epidemiologia [online]. 2010.
o
Vol.48, N .2, p.149.

XXVII
un largo período de tiempo, fueron considerados Streptococcus; estudios
genéticos posteriores evidenciaron diferencias con este género, por lo cual, en
1984, los enterococos constituyeron un nuevo género llamado Enterococcus,
integrado por múltiples especies. Las especies de enterococos con importancia
clínica para el hombre son:64

 E. faecalis
 E. faecium
 E. durans
 E. avium
 E. casseliflavus
 E. gallinarum
 E raffinosus, E malodoratus, E. hirae
 E mundtii, E solitarius, E pseudoavium.

[Link] Resistencia antimicrobiana del género Enterococcus.

El género Enterococcus representa un desafío terapéutico debido a su resistencia

intrínseca, de carácter cromosómico y no transferible, a varios antibióticos,
incluyendo cefalosporinas, meropenem, ertapenem, penicilinas resistentes a
penicilinasa, cotrimoxazol, aminoglucósidos y clindamicina.

La mayoría de los genes que codifican resistencia intrínseca residen en los

cromosomas. Además de la resistencia intrínseca, poseen gran capacidad para la
adquisición de mecanismos de resistencia y de genes de virulencia, ya sea a
través de plásmidos, transposones conjugativos, intercambio cromosómico o
mutaciones65.

64
ORTEGA, L. Enterococos: actualización. En: Revista habana ciencias médicas [online]. 2010. Vol.9, No.4,
p.507-515.
65
Ibid. p.512

XXVIII
Debido a que los enterococos son más resistentes a los agentes antimicrobianos,
las opciones terapéuticas son más limitadas. Las cepas multirresistentes
de Enterococcus se están convirtiendo en una amenaza, ya que algunas son
resistentes a todos los antimicrobianos disponibles. Es por esto, que el control de
la diseminación de estos microorganismos es indispensable.

5.2.2 Enterococcus faecalis

E. faecalis es un coco Grampositivo, anaerobio facultativo, inmóvil y no

esporulado. El tamaño de cada célula oscila entre 0,5 y 0,8 micrómetros y es
habitante normal del tracto gastrointestinal humano. Esta bacteria ha atraído
recientemente la atención de diversos investigadores porque ha sido identificada
como una causa frecuente de infecciones periapicales persistentes66.

La temperatura óptima de crecimiento in vitro de este microorganismo es de 35ºC,

no obstante, se ha observado crecimiento entre 10ºC y 45ºC. Todas las cepas
pueden crecer en medios que contengan esculina, la cual hidrolizan en presencia
de sales biliares al 40% (medio agar bilis-esculina). Casi todas las cepas son
homofermentativas, siendo el ácido láctico el producto final principal de la
fermentación de la glucosa; no producen gas y no contienen enzimas
citocrómicas. E. faecalis posee una pared celular con antígenos del grupo D, la
cual es un ácido lipoteicoico que se encuentra asociado con la membrana
citoplasmática de la bacteria y que contiene residuos de glicerol. Además, posee
gran cantidad de mureína y ácido teicoico67.

Una característica notable de E. faecalis la constituye su capacidad para sobrevivir

y crecer en microambientes que pudieran ser tóxicos para muchas bacterias;
particularmente en zonas con altas concentraciones de sales (6,5% de Cloruro de
Sodio), temperaturas extremas (15-60ºC); también puede resistir la acción de
66
PARDI, G; GUILARTE, C; CARDOZO, E. et al. "Detección de Enterococcus faecalis en dientes con fracaso en el
o
tratamiento endodóntico". En: Acta odontol. venez [online]. 2009. Vol.47, N .1, p.112.
67
Ibid. p.112

XXIX
colorantes como Azul de Metileno al 0,1%. Esta capacidad de resistencia por parte
de E. faecalis en microambientes tóxicos está relacionada con su capacidad de
supervivencia en los conductos radiculares de dientes tratados endodónticamente,
con nutrientes limitados68.

[Link] Enterococcus faecalis y la infección en endodoncia

El objetivo final del tratamiento de endodoncia es eliminar el tejido pulpar enfermo
del sistema de conductos radiculares, proporcionar un ambiente adecuado para la
cicatrización y prevenir la periodontitis apical. Los microorganismos son la causa
principal de las enfermedades pulpares y periapicales. Una buena compactación
del material de relleno dentro del conducto radicular y un sellado apical hermético
que impida cualquier fuga microbiológica, son cruciales para el éxito de un
tratamiento de endodoncia. La periodontitis apical es causada por bacterias; es
tratada mediante limpieza y desinfección químico-mecánica del canal, para
posteriormente ser rellenado, sellándolo apical y coronalmente para prevenir la
reinfección69. Sin embargo, en la literatura se describen dos hechos que están
estrechamente relacionados con la infección de esta zona. Algunos autores citan
la penetración de bacterias en el canal radicular y otros autores indican la
supervivencia de estas a los procedimientos químico-mecánicos de
descontaminación de los canales radiculares.

Las infecciones endodónticas pueden subcategorizarse como primarias y

persistentes. Las infecciones primarias mayormente se producen por
microorganismos anaerobios gramnegativos, mientras que las infecciones
persistentes son causadas por bacterias grampositivas facultativas70.

Los Enterococcus son bacterias grampositivas que hacen parte de la flora habitual
que se encuentra en la boca, el tracto gastrointestinal humano y el tracto genital

68
Ibid. p.112
69
SAVADKOUHI, S; BAKHTIAR, H; ARDESTANI, S. In vitro and ex vivo microbial leakage assessment in
o
endodontics: A literature review. En: Int Soc Prevent Communit Dent. 2016. Vol. 6, N .6, p.510.
70
Ibid. p.510

XXX
de la mujer. Son una causa bien conocida de fracaso endodóntico, así como
causantes de algunas enfermedades sistémicas como infecciones del tracto
urinario, infecciones de heridas quirúrgicas, bacteriemia y endocarditis
bacteriana. Han desarrollado una alta resistencia a agentes antimicrobianos y
poseen numerosos factores de virulencia tales como sustancias de agregación,
proteína de superficie, gelatinasa, producción de superóxido extracelular,
polisacáridos capsulares y la determinante resistencia a los antibióticos. Los
enterococos son reconocidos como potenciales patógenos humanos, causando el
12% de todas las infecciones hospitalarias. En las infecciones recurrentes de
endodoncia, la especie que se ha aislado con mayor frecuencia es Enterococcus
faecalis71. Su supervivencia a largo plazo en el sistema del conducto radicular
podría ser el resultado de su capacidad de adherirse a la dentina e invadir los
túbulos dentinales, formar comunidades organizadas en biofilms, que pueden
contribuir a la resistencia bacteriana y persistencia después de los diferentes
procedimientos antimicrobianos intracanales. Este microorganismo tiene la
capacidad de sobrevivir en un ambiente en el que no hay nutrientes disponibles y
en los que la comensalidad con otras bacterias es mínima. Por lo tanto, es
probable que las bacterias dentro de los túbulos dentinarios sobrevivan a la
instrumentación quimio-mecánica y a la medicación intracanal con lo que pueden
colonizar los túbulos y reinfectar el canal de la raíz ya obturada.72

La frecuente presencia de Enterococcus faecalis en los canales radiculares donde

el tratamiento de endodoncia ha fallado sugiere que este es un patógeno
oportunista, cuya persistencia en los canales representa un problema terapéutico
significativo73.

71
JAIN, H; MULAY, S; MULLANY, P. Persistence of endodontic infection and Enterococcus faecalis: Role of
horizontal gene transfer. En: Gene Reports. 2016. Vol. 5, p.114.
72
BORZINI, Op. Cit. p. 700.
73
Ibid. p.114

XXXI
 5.2.3 Método de dilución en caldo.

El método de dilución en agar o en caldo como test de susceptibilidad microbiana

es utilizado para determinar la concentración mínima bactericida (MBC) y la
concentración mínima inhibitoria (MIC). La MIC es definida como la concentración
más baja de sustancia que puede inhibir el crecimiento visible de un
microorganismo después de incubar por 24 horas. La MBC es la concentración
más baja que puede prevenir su crecimiento después de subcultivar en un medio
libre del compuesto evaluado. Estas variables son una herramienta para investigar
nuevos antimicrobianos74. En la técnica de dilución en caldo, son utilizados tubos o
microplacas (microdilución) que contienen concentraciones crecientes del extracto
vegetal. El organismo en estudio es inoculado en los diferentes tubos o pozos de
las microplacas y la MIC es determinada después de la incubación75.

74
RAMIREZ, L. Metodologías para evaluar in vitro la actividad antibacteriana de compuestos de origen
o
vegetal. En: Scientia et Technica. 2009. Vol.15, N 42, p.264.
75
Ibid. p.265

XXXII
 6. METODOLOGÍA

6.1 TIPO DE ESTUDIO

Se realizó un estudio de intervención experimental in vitro para evaluar la
efectividad antibacteriana de los metabolitos de extractos de la semilla de
Mammea americana sobre E. faecalis mediante un ensayo de microdilución en
caldo.

-Modelo biológico

Colonias de E. faecalis ATCC 51299 disponibles en el Laboratorio de

Investigaciones del grupo Genética y Biología molecular, Facultad de Medicina -
Universidad de Cartagena.

-Criterios de inclusión y exclusión

-Criterios de inclusión

 Presencia y disminución de turbidez en las muestras con cada extracto

cuando se compara con la del control de crecimiento.

-Criterios de exclusión

 Ausencia de turbidez en el control de crecimiento.

-Operacionalización de variables

Variables Indicadores Unidad de medida Nivel de Tipo de

medición variable
Extracto Concentración μg/mL De razón Cuantitativa
-Continua
Independiente

XXXIII
Concentración Peso/volumen µg/mL o mg/mL De razón Cuantitativa
mínima
inhibitoria Ausencia o -Continua
(CMI) presencia de
actividad Nominal Cualitativa
antibacteriana. -Nominal
Dependiente

-Objeto de estudio: Actividad antibacteriana de los metabolitos de extractos de la

semilla de Mammea americana contra E. faecalis.

-Unidad de análisis:

 Concentración mínima inhibitoria (CMI).

6.1 Recolección del material vegetal

Las semillas de Mammea americana fueron extraídas de la fruta (Mamey)

obtenida del mercado local de Barranquilla-Atlántico, en la costa caribe
colombiana. (Fig. 7).

6.2 Preparación de los extractos y fraccionamiento

La obtención de los extractos y el análisis fitoquímico se realizó en el laboratorio

del Grupo de Investigación en Química de Medicamentos de la Universidad de
Cartagena. Los extractos orgánicos de diferentes polaridades objeto de estudio se
obtuvieron empleando la metodología propuesta por Beltrán et al., 201376. La
cáscara de las semillas fue removida y su núcleo triturado al máximo posible con
ayuda de instrumentos de cocina. (Fig. 7). Se tomaron 500 gramos de material
vegetal triturado, seco (Fig. 8) y se sometieron a maceración usando como
solvente etanol (Fig. 9). Después de su filtrado (Fig. 9) se procedió a concentrar el

76
BELTRÁN, C; DÍAZ, F; GOMEZ-ESTRADA H. Tamizaje fitoquímico preliminar de especies de plantas
o
promisorias de la costa atlántica colombiana. En: Rev Cubana Plant Med, Ciudad de la Habana. Vol. 18, N
4, p. 624.

XXXIV
extracto etanólico en un rotaevaporador automático (HEIDOLPH Fig. 10), hasta un
volumen aproximado de 10 y 20 mL de los que se separó 1mL para la posterior
actividad biológica. El extracto restante fue mezclado con alúmina (MERK) y
absorbido por ésta en una proporción 1/8 extracto: alúmina, utilizando un mortero
hasta obtener un polvo seco (Fig. 11). Posteriormente se dejó secar en una
incubadora (BINDER Fig.12) a 45º C durante 24 horas para evaporar el solvente
restante presente en el extracto. A partir del anterior extracto en alúmina, se
obtuvieron los extractos orgánicos de diferentes polaridades (Fig.13) efluyendo
cada uno de los solventes por la columna de cromatografía abierta en orden
creciente de polaridad. Los solventes fueron hexano, diclorometano, acetato de
etilo y metanol de grado analítico. (Fig. 14).

6.3 Caracterización fitoquímica de los extractos de M. americana

Los procesos de caracterización de los extractos se realizaron por medio de

pruebas microquímicas, según lo descrito por Beltrán77. El tamizaje fitoquímico de
los principales grupos de metabolitos secundarios en los extractos de las plantas
estudiadas se realizó de la siguiente forma: determinación de alcaloides (ensayo
de Dragendorff, taninos (ensayo de cloruro férrico), cumarinas (ensayo de NaOH
(Bornträger), KOH), flavonoides (ensayo de Shinoda y citrobórico), triterpenos
(Salkowski), saponinas (vainillina-ácido sulfúrico), y glicósidos cardiotónicos
(ensayo de Kedde, Raymond-Marthoud y Keller-Kiliani). Todas estas pruebas se
realizaron utilizando la técnica de cromatografía en capa fina sobre cromatoplacas
de Sílica gel 60 F254 (MERK) con soporte de aluminio (20x20 cm, 0.2 mm de
espesor). Todos los solventes utilizados fueron en grado analítico y los reactivos
de identificación se prepararon al momento de realizar los ensayos para minimizar
errores por degradación de las soluciones reactivo. Finalmente se utilizó una
lámpara UV (=254 nm y 365 nm) (Fig.15), ácido sulfúrico al 10% en metanol,
vainillina y reactivos de revelación universales o específicos dependiendo del
grupo de compuesto a evaluar.

77
Ibid. p.626

XXXV
 6.4 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

6.4.1 Preparación de las soluciones

Diez miligramos de los extractos se pesaron y disolvieron en 1 mL de

Dimetilsulfóxido al 99% (DMSO Fig.16), hasta obtener una solución madre de
10.000 mg/L. A partir de la solución madre se realizaron diluciones intermedias
hasta llegar al intervalo de concentraciones a evaluar de 500-400-300-200-100-50
mg/L (Fig. 17). Como control se utilizó Kanamicina, a la cual se le determinó la
concentración efectiva e inhibitoria media y como control negativo se utilizó
DMSO, al cual se le determinó la concentración inhibitoria media.

6.4.2 Microrganismo de estudio

La actividad antimicrobiana fue evaluada usando la bacteria Grampositiva

Enterococcus faecalis ATCC (51299), la cual se adquirió en el Laboratorio de
Investigación de Microbiología de la Facultad de Medicina, Universidad de
Cartagena.

6.4.3 Condiciones de los cultivos

Las cepas bacterianas se mantuvieron en tubos de agar Mueller Hinton (MERK)

inclinados a 4ºC previa su reactivación. Para la prueba de actividad antibacteriana,
los cultivos bacterianos fueron preparados en un tubo con caldo Mueller Hinton
(MERK Fig.18), e incubados a 37°C en una incubadora Gemmyco, LAB incubator
modelo IN-010 (Fig.19). El inóculo se preparó a las 24 horas de incubación y la
densidad óptica fue ajustada a la escala 0.5 de McFarland equivalente a 1x10 8
UFC/mL.

6.4.4 Actividad antibacterial

La actividad antimicrobiana se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la

Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Cartagena, se evaluó la
actividad utilizando el método de dilución en caldo en placas de 96 pozos, lo que

XXXVI
permitió determinar también la concentración mínima inhibitoria. Las muestras de
bacterias se inocularon en caldo Mueller Hinton ajustadas a escala 0.5 McFarland.
Luego, 100μL de las suspensiones microbianas y 100μL de las diluciones de los
extractos en caldo Mueller-Hinton, se transfirieron a las microplacas. Alícuotas de
200μL se incubaron durante 24 horas a 37°C (bacterias) (Fig. 20). La
concentración mínima inhibitoria fue evaluada con la ayuda del espectrofotómetro
Multiskans ascent (Thermo Scientific, Germany) (Fig. 21) a una longitud de onda
de 620 nm a las 0 y 24 horas. El ensayo se realizó dos veces en dos días distintos
por triplicado para cada concentración.

6.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los resultados se presentan como la media ± SEM. El nivel de significación

estadística se determinó usando análisis unidireccional de la varianza (ANOVA)
con GraphPad Prism software 6.0. Las diferencias entre las medias de los
ensayos obtenidos para concentración se evaluaron por análisis de la varianza
(ANOVA) y el test de Tukey’s como Post-Test. Esta última fue utilizada para
realizar las comparaciones con el grupo control. Para todos los casos, los valores
de p<0.05 se consideran significativos.

6.6 CONSIDERACIONES ÉTICAS

Tomando en cuenta lo establecido en el artículo 67 de la Resolución 008430 de

1993 del Ministerio de Salud de Colombia, donde se disponen los reglamentos y
estatutos a seguir en investigaciones con microorganismos patógenos o material
biológico que pueda contenerlos, se tuvo en cuenta y se incluyó el proyecto como
grupo de riesgo uno: en el cual los microorganismos representan un escaso riesgo
para el individuo y para la comunidad, por tal motivo pueden ser manipulados en
laboratorios tipo básico de microbiología.

XXXVII
 7. RESULTADOS

7.1 Obtención de los extractos de M. americana

Empleando la metodología propuesta por Beltrán78, se obtuvieron los extractos

orgánicos de diferentes polaridades, partiendo de un extracto etanólico adsorbido
en Sílica gel empaquetado en una columna de cromatografía abierta. Se efluyeron
cuatro solventes en orden creciente de polaridad por la columna y se obtuvieron
los siguientes extractos: Extracto hexanoico, clorofórmico, acetato de etilo y
metanol; incluyendo el extracto etanólico, se obtuvieron 5 extractos. El extracto
etanólico de consistencia semilíquida, poseía un color anaranjado-café, color que
permaneció en el extracto hexanoico y clorofórmico; los extractos acetato de etilo
y metanólico presentaron un color café. Se calcularon los porcentajes de
rendimiento de los extractos mediante las siguientes fórmulas:

Para el extracto etanólico (total):

𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜

% 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑥 100
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙 𝑠𝑒𝑐𝑜

Para los extractos orgánicos:

𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜

% 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑥 100
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑒𝑡𝑎𝑛ó𝑙𝑖𝑐𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜

De las semillas de M. americana, se pesaron 1088.13g de material seco y se

obtuvieron 86.14g de extracto etanólico con un porcentaje de rendimiento de
7.91%. A partir de este se obtuvieron los extractos orgánicos con los siguientes
pesos: hexanoico 34.82g; clorofórmico 32.21g; acetato etilo 13.22g; metanólico
14.76g, con porcentajes de rendimiento de 40.42%, 37.39%, 15.34%, 17.34%
respectivamente.

78
Ibid. p.626

XXXVIII
 7.2 Tamizaje fitoquímico preliminar de las semillas de M. americana

Mediante el tamizaje fitoquímico preliminar se logró identificar la presencia de los

metabolitos presentes en el extracto total y en los extractos de diferentes
polaridades. Los resultados del Screening fitoquímico se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Tamizaje fitoquímico preliminar de la especie Mammea americana.

Nombre M. americana EtOH Hex CHCl3 AcOEt MeOH

planta

TLC TLC TLC TLC TLC

Metabolito Prueba

Alcaloides Dragendorff + + + - -

Ballet - - - - -
Glucósidos Raymond-
cardiotónicos Marthoud - - - - -
Tricloruro de
antimonio - - - - -
Cumarinas NaOH + + + - -
volátiles KOH + + + - -
Reactivo
Flavonoides citrobórico + + +
Taninos Cloruro férrico + - - + +
Vainillina-ácido
sulfúrico - - - + +
Saponinas Tricloruro de
antimonio - - - + +
Triterpenos
y/o Salkowski + + + - -
esteroides
EtOH (extracto etanólico), He (extracto hexanoico), CHCl3 (extracto clorofórmico),
AcOEt (extracto acetato de etilo), Me (extracto metanólico).
Presencia ( + ); Ausencia (-) Dudoso (+/-)

7.3 Evaluación de la actividad antibacteriana de extractos de semillas

de M. americana

En este experimento, la capacidad antimicrobiana es medida a través de un

equipo de Multiskans ascent para las lecturas de las placas de 96 pozos.
Inicialmente se determinaron los porcentajes de inhibición de los controles. Para el

XXXIX
control positivo, (Kanamicina) en un intervalo de concentración de 50-100-200-
300-400-500mg/L, los valores de los porcentajes de inhibición se muestran en la
Tabla 2. Para el control negativo, se evaluó el efecto que tiene el DMSO en el
crecimiento de la cepa bacteriana para lo cual se evaluó un intervalo amplio de
concentraciones (25-50-100-200-300-400-500mg/L); los resultados de los
porcentajes de inhibición se muestran en la Tabla 3. Para la actividad
antibacteriana de los extractos, se determinaron los porcentajes de inhibición de
cada una de las concentraciones de los extractos; para esto, a las absorbancias
de los ensayos a las 24 horas, se les restó la absorbancia del blanco (medio de
cultivo). Este valor se dividió entre la absorbancia del control de crecimiento
(medio de cultivo +cepa) y por último este valor resultante se multiplicó por 100.

En la Tabla 5 se muestran las concentraciones mínimas inhibitorias de los

extractos de las semillas de M. americana, obtenidas a partir de las
concentraciones mínimas de los dos ensayos de actividad antibacteriana, en la
cual también se muestra el porcentaje de inhibición promedio para cada extracto
con su desviación estándar.

Tabla 2. Porcentajes de inhibición del control positivo.

Concentración Porcentaje de
(mg/L) inhibición (%)
50 84,83
100 92,18
200 98,07
300 98,54
400 99,41
500 99,93

XL
 Tabla 3. Porcentajes de inhibición de las concentraciones de DMSO.

Concentración Porcentaje de
(mg/L) inhibición (%)

50 0,04

100 0,39

200 0,66

300 0,74

400 0,78

500 0,97

Tabla 4. Porcentajes de inhibición de las concentraciones de cada uno de los

diferentes tipos de extractos.

Extracto etanólico
Concentración Porcentajes de inhibición (%) Desviación
(mg/L ) Ensayo 1 Ensayo 2 Promedio estándar
50 28,64 28,14 28,39 0,36
100 54,86 53,85 54,36 0,71
200 51,93 50,34 51,13 1,12
300 48,49 48,07 48,28 0,30
400 52,01 50,67 51,34 0,95
500 59,97 61,98 60,97 1,42
Extracto hexanoico
Porcentajes de inhibición (%) Desviación
Concentración
Ensayo 1 Ensayo 2 Promedio estándar
50 30,07 29,31 29,69 0,53
100 56,95 54,94 55,95 1,42
200 55,70 56,03 55,86 0,24
300 54,52 52,76 53,64 1,24
400 54,10 55,19 54,65 0,77
500 73,87 73,20 73,53 0,47
Extracto clorofórmico
Porcentajes de inhibición (%) Desviación
Concentración
Ensayo 1 Ensayo 2 Promedio estándar
50 25,63 25,71 25,67 0,06
100 61,64 62,14 61,89 0,36
200 71,78 75,80 73,79 2,84
300 65,16 68,51 66,83 2,37
400 61,89 62,73 62,31 0,59
500 68,09 65,08 66,58 2,13

XLI
 Extracto de acetato de etilo
Porcentajes de inhibición (%) Desviación
Concentración
Ensayo 1 Ensayo 2 Promedio estándar
50 39,03 36,60 37,81 1,72
100 37,69 39,87 38,78 1,54
200 45,98 47,32 46,65 0,95
300 48,74 49,16 48,95 0,30
400 39,78 42,80 41,29 2,13
500 55,03 52,76 53,89 1,60
Extracto metanólico
Porcentajes de inhibición (%) Desviación
Concentración
Ensayo 1 Ensayo 2 Promedio estándar
50 30,40 26,30 28,35 2,90
100 43,30 44,56 43,93 0,89
200 40,12 39,61 39,87 0,36
300 39,11 37,69 38,40 1,01
400 36,26 35,51 35,89 0,53
500 41,21 40,03 40,62 0,83

Tabla 5. Concentraciones mínimas inhibitorias de los extractos de las

semillas de M. americana.

Concentración mínima Porcentaje de inhibición

Tipo de extracto
inhibitoria (mg/L) promedio
Etanólico 100 54,36±0,71
Hexanoico 100 55,95±1,42
Clorofórmico 200 73,79±2,84
Acetato de etilo 300 48,95±0,30
Metanólico 100 43,93±0,89

XLII
 kanamicina
105,00
100,00
95,00
90,00
85,00
80,00 kanamicina
75,00

Figura 4. Actividad inhibitoria del control positivo (Kanamicina)

1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
DMSO
0,20
0,00

Figura 5. Efecto del DMSO sobre el crecimiento de E. faecalis.

XLIII
 120

100

80

E. etanol
60
E. hexanoico
E. cloroformico
40
E. acetato de etilo
E. metanolico
20
Control (+)

0 Control (-)
50mg/L 100mg/L 200mg/L 300mg/L 400mg/L 500mg/L

Figura 6. Inhibición de los extractos de semillas de M. americana frente a E.

faecalis.

Los resultados de la actividad antimicrobiana de los extractos de las semillas de

M. americana frente a E. faecalis no han sido descritos para la especie
colombiana.

XLIV
 8. DISCUSIÓN

8.1 Tamizaje fitoquímico preliminar de semillas de M. americana

Mediante la tamización fitoquímica de las semillas de M. americana se determinó

la presencia de alcaloides, cumarinas, flavonoides, triterpenos y esteroides para
los extractos: etanólico, hexanoico, y clorofórmico; presencia de saponinas en los
extractos: etanólico, acetato de etilo y metanólico; y presencia de taninos para los
extractos: etanólico, acetato de etilo y metanólico. No se logró determinar la
presencia de glucósidos cardiotónicos en ninguno de los extractos (Tabla 1), datos
que concuerdan con los descritos por Remón et al79, quienes reporta la presencia
de alcaloides, cumarinas, taninos y flavonoides en tinturas de extractos de M.
americana. No obstante en el tallo de la planta, los resultados también se
relacionan con los reportados por Manzano et al80 en los que reportan alcaloides,
flavonoides en extractos etanólicos y acuosos, taninos en extractos acuosos
(extracto polar) en las semillas de esta planta. Por último, los datos del tamizaje
también coinciden con los reportados por Beltrán et al81 quienes reporta la
presencia de cumarinas, taninos, flavonoides, triterpenos y esteroides en el
extracto etanólico de semillas de M. americana.

Esta variedad de metabolitos identificados y reportados por la literatura justifica la

utilidad de esta planta en la cura de diversas afecciones. Se ha demostrado
científicamente la presencia de taninos y fenoles como responsables de la posible
actividad antibacteriana de esta especie de planta, ampliamente distribuida en la
región82. Se comprueba, además, la ausencia de glucósidos cardiotónicos en los
extractos de las semillas de esta especie.

79
REMÓN. Op. Cit., p.304
80
MANZANO, P; ORELLANA, T; CATAGUA, D. Tamizaje fitoquímico y evaluación de la actividad antimicrobiana
de los extractos alcohólico y etéreo de la semilla de Mammea americana de ecuador. En: Yachana. 2012. Vol.
4, No. 1, p.1
81
BELTRAN. Op. Cit., p.626
82
REMÓN. Op. Cit., p.306

XLV
Es muy importante resaltar la presencia de cumarinas debido a que a estos
metabolitos han sido muy estudiados en esta planta, se han aislado y se les ha
atribuido sus propiedades biológicas. Una de las cumarinas que más ha sido
estudiada y aislada de las semillas de M. americana es la Mameína (4n - propil -
5,7 - dihidroxi - 6 isopentil - 8 - isovaleril - cumarina)83.

Además cabe destacar que la Mameína y las cumarinas relacionadas han sido
objetivo de investigaciones para determinar su actividad farmacológica, ya que el
mamey en la medicina popular se ha incluido en el tratamiento de infecciones del
cuero cabelludo, boca, diarrea, problemas oculares y digestivos84.

8.2 Actividad antibacteriana de extractos de semillas de M. americana

Todos los metabolitos obtenidos del extracto de la semilla presentaron actividad

antimicrobiana frente a E. faecalis, sin embargo se evidencia mayor inhibición con
los extractos hexanoico y clorofórmico, observada a las 24 horas. En el extracto
etanólico también se evidenció un porcentaje superior al 50%, observado a las 24
horas, pero haciendo la salvedad que este es el extracto total. Es un extracto
crudo, más complejo en composición ya que se parte de este para la obtención de
los demás extractos orgánicos (Hex, CHCl 3, AcOEt, MeOH).

Para los controles se puede evidenciar que el control positivo (Kanamicina) tiene
porcentajes altos de inhibición, incluso en la concentración más baja del intervalo
de concentración de trabajo, como se puede observar en la Fig 4. En cuanto a los
efectos que el DMSO puede llegar a producir sobre el crecimiento, se evidenció
que dentro de las concentraciones de trabajo no afecta el crecimiento de la cepa
bacteriana (Fig 5). Las concentraciones mínimas inhibitorias variaron de acuerdo
al tipo de extracto y en su porcentaje de inhibición (Tabla 5).

Los extractos que evidenciaron mayor inhibición bacteriana fueron el hexanoico

(IMC de 200mg/L, con porcentaje de inhibición de 55,95%) y el clorofórmico (IMC

83
REMON. Tamizaje fitoquímico de Mammea americana L. En: Revista ciencia. 2011. p.3.
84
Ibid. p.3

XLVI
de 200mg/L, con un porcentaje de inhibición de 73,79%), en los cuales están
presentes los siguientes metabolitos: alcaloides, cumarinas, flavonoides,
triterpenos y esteroides. El extracto etanólico evidenció una actividad inhibitoria,
datos que se pueden relacionar con los reportados por Remón et al85, donde se
evidenció actividad inhibitoria del extracto etanólico de las semillas de M.
americana frente a Staphylococcus aureus (ATCC 29737); además comprueba la
existencia de la variedad de metabolitos (alcaloides, cumarinas, taninos y
flavonoides) presentes en la semilla de esta planta que se relacionan con los
encontrados en este estudio.

De la misma forma Manzano86 et al, evaluaron la actividad antibacteriana de los

extractos etanólicos de semillas de M. americana, describiendo que este extracto
etanólico posee un efecto inhibitorio para las bacterias gramnegativas (E. Coli,
Pseudomonas spp, Salmonella spp).

En los análisis estadísticos de la actividad antimicrobiana de los extractos de

semillas de M. americana frente a E. faecalis, se encontraron diferencias
significativas inferiores al 5% (Tabla 4), observada a las 24 horas de incubación.

85
REMON. Op. Cit., p.305-306
86
MANZANO. Op. Cit, p.3

XLVII
 9. CONCLUSIONES

Los concentrados obtenidos del extracto de las semillas de M. americana

revelaron una variedad de metabolitos secundarios, entre los que se resaltan las
cumarinas, en su mayoría reportadas como responsables de su actividad
biológica.

Todos los extractos de la semilla de Mammea americana evaluados en este

trabajo mostraron actividad inhibitoria frente a Enterococcus faecalis. Se destacan
los extractos hexanoico (IMC 100mg/L) y clorofórmico (IMC 200mg/L) como los
metabolitos con mayor actividad inhibitoria.

XLVIII
 RECOMENDACIONES O PROSPECTIVA

Por los efectos biológicos que han sido reportados para esta planta, se sugiere
realizar estudios más profundos de fraccionamiento, aislamiento e identificación de
metabolitos, que permitan seleccionar esta planta como una biblioteca para la
identificación de compuestos con actividad antibacteriana, así como emitir un
criterio más profundo sobre su eficacia, como forma de constatar sus usos en la
medicina natural y tradicional.

En lo posible realizar estudios con muestras in vivo, utilizar otros medios de

cultivo, diferentes tipos de bacterias, evaluar la actividad antibacteriana de los
diferentes extractos sobre un biofilm.

XLIX
 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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LV
 ANEXOS DE TABLAS

Tabla 6. Datos crudos de las absorbancias del control positivo (Kanamicina)

Measurement count: 1 Filter: 620

1 2 3 4 5 6
A 0,16 0,102 0,051 0,048 0,041 0,037
B 0,166 0,103 0,052 0,047 0,04 0,036
C 0,165 0,1 0,053 0,049 0,041 0,036

Tabla 7. Datos crudos de las absorbancias del control negativo (DMSO)

Measurement count: 1 Filter: 620

1 2 3 4 5 6
A 0,89 0,887 0,885 0,884 0,884 0,882
B 0,889 0,886 0,884 0,883 0,883 0,881
C 0,89 0,887 0,884 0,884 0,883 0,882

Tabla 8. Datos crudos de las absorbancias de los extractos de semillas de M.

americana del primer ensayo.

Measurement count: 1 Filter: 620

1 2 3 4 5 6
A 0,393 0,303 0,343 0,498 0,754 0,879
B 0,389 0,305 0,344 0,497 0,752 0,874
C 0,389 0,303 0,344 0,498 0,754 0,872
D 0,399 0,37 0,469 0,561 0,648 0,701
E 0,398 0,371 0,469 0,562 0,647 0,709
F 0,398 0,371 0,497 0,563 0,647 0,709
G 0,44 0,372 0,492 0,683 0,864 0,943
H 0,439 0,371 0,495 0,685 0,865 0,945
A 0,441 0,37 0,467 0,697 0,864 0,942
B 0,397 0,461 0,577 0,663 0,864 0,9
C 0,399 0,459 0,575 0,66 0,867 0,901
D 0,399 0,461 0,575 0,662 0,867 0,901
E 0,434 0,461 0,581 0,682 0,785 0,879
F 0,439 0,469 0,583 0,681 0,787 0,878
G 0,439 0,469 0,583 0,683 0,787 0,88

LVI
Tabla 9. Datos crudos de las absorbancias de los extractos de semillas de M.
americana del segundo ensayo.

Measurement count: 1 Filter: 620

1 2 3 4 5 6
A 0,394 0,308 0,348 0,498 0,758 0,867
B 0,391 0,308 0,3499 0,499 0,759 0,866
C 0,392 0,307 0,352 0,501 0,759 0,868
D 0,401 0,378 0,479 0,571 0,643 0,709
E 0,401 0,377 0,474 0,568 0,643 0,709
F 0,402 0,381 0,478 0,568 0,643 0,709
G 0,455 0,369 0,468 0,673 0,86 0,884
H 0,434 0,37 0,469 0,675 0,861 0,881
A 0,43 0,368 0,469 0,677 0,862 0,882
B 0,407 0,451 0,57 0,661 0,854 0,909
C 0,409 0,453 0,57 0,66 0,853 0,909
D 0,408 0,451 0,571 0,659 0,855 0,911
E 0,454 0,461 0,584 0,687 0,789 0,88
F 0,455 0,462 0,584 0,689 0,789 0,886
G 0,452 0,461 0,585 0,687 0,79 0,885

Tabla 10. Datos crudos de las absorbancias de los extractos de semillas de

M. americana del blanco (tiempo cero).

Measurement count: 1 Filter: 620

1 2 3 4 5 6
A 0,104 0,121 0,155 0,298 0,567 0,713
B 0,109 0,126 0,153 0,296 0,56 0,718
C 0,106 0,125 0,149 0,284 0,56 0,716
D 0,115 0,195 0,292 0,367 0,46 0,591
E 0,124 0,201 0,312 0,385 0,464 0,607
F 0,121 0,202 0,302 0,391 0,47 0,609
G 0,138 0,219 0,373 0,557 0,721 0,824
H 0,154 0,23 0,385 0,569 0,721 0,842
A 0,14 0,206 0,359 0,523 0,696 0,783
B 0,155 0,215 0,357 0,454 0,616 0,725
C 0,154 0,21 0,356 0,451 0,64 0,708
D 0,158 0,212 0,369 0,468 0,623 0,732
E 0,159 0,239 0,346 0,441 0,532 0,639
F 0,164 0,241 0,343 0,443 0,533 0,658
G 0,158 0,242 0,343 0,435 0,533 0,638

LVII
Nota de anexos de tablas: Las letras representan las absorbancias de cada una
de las concentraciones de los extractos con su réplica de la siguiente forma: A
representa la absorbancia de extracto etanólico, B y C son sus réplicas. D
representa la absorbancia del extracto hexanoico, E y F representan sus réplicas.
G representa la absorbancia del extracto clorofórmico, H y A que se repite son las
réplicas de la lectura del extracto clorofórmico. La segunda B representa las
absorbancias del extracto de acetato de etilo, las segundas C y D representan sus
réplicas. Por último, la segunda letra E representa la absorbancia de las
concentraciones del extracto de acetato de etilo, F y G representan sus réplicas.

Para los controles las letras solo representan las réplicas de cada una de las
concentraciones de control.

LVIII
 ANEXOS DE FIGURAS

Figura 7. Semillas de M. americana e implementos de trituración.

Figura 8. Semillas de M. americana trituradas.

LIX
Figura 9. Proceso de Maceración en frío de las semillas de M. americana en
Etanol y Proceso de filtración.

Figura 10. Rotaevaporador HEIDOLPH.

LX
 A B C

Figura 11. Proceso de absorción del extracto etanólico en Alúmina para la

obtención de los extractos orgánicos. A: concentración del extracto etanólico.
B: secado del extracto. C: mezcla con alúmina.

Figura 12. Incubadora BINDER.

LXI
 A B C D E

Figura 13. Subextractos de las semillas de M. americana. Extractos A: acetato

de etilo. B: hexanoico. C: clorofórmico. D: etanólico. E: metanólico.

C E
A
B D

Figura 14. Solventes de grado analítico. [Link], B. hexano, C. cloroformo,

D. acetato de etilo, E. metanol.

LXII
Figura 15. Lámpara UV con cabina oscura.

A B C D E

Figura 16. DMSO (Dimetilsulfoxido 99,9%). Disolución de los extractos en

DMSO. Dilución del extracto: A: acetato de etilo. B: hexanoico. C: clorofórmico.
D: etanólico. E: metanólico.

LXIII
Figura 17. Preparación de las concentraciones de cada extracto en el medio
de cultivo.

Figura 18. Medios de cultivo para la incubación de Enterococcus faecalis.

LXIV
Figura 19. Incubadora Gemmyco, LAB incubator modelo IN-010.

Figura 20. Incubación de las placas de 96 pozos a 37 oC durante 24 horas.

LXV
Figura 21. Toma de las lecturas en el equipo Multiskans ascent Thermo de
placas de 96 pozos.

LXVI