Microbiología Agrícola - UNS
Junio 2023
ECOLOGIA MICROBIANA DEL
AMBIENTE EDAFICO
Actividad microbiana, abundancia y diversidad de microorganismos
Comisión: Funaro Nicolás, González Artús Sofía, Gonzalez Codony
Rosario, Gonzalez Domínguez Manuela, Gayral Sheila
Objetivo
Determinar la actividad biológica en diferentes muestras de suelo e identificar
y cuantificar los distintos grupos de microorganismos presentes.
Materiales y métodos
Para las dos experiencias a realizar se tomaron muestras de suelo fresco de
distintos sitios del campus de Agronomía a diferentes profundidades. Para cada sitio
muestreado (pinar, bajo y loma) se tomaron dos muestras a 0-5cm y una muestra a
5-10cm de profundidad, cada comisión trabajó con una de dichas muestras para luego
compartir los resultados y realizar el informe. El primer paso fue tamizar el total de la
muestra, luego se tomaron 10g de la misma para determinar contenido de humedad,
otros 10g se apartaron para la experiencia No 2 y por último 100g se utilizaron para la
2.1
estimación de respiración microbiana (Exp. 1).
En la experiencia No 1 se calculó la respiración microbiana del suelo por el
método de desprendimiento de CO2. Este método se basa en capturar el CO2
liberado por los microorganismos, como resultado de la respiración, con una base
fuerte como lo es el NaOH (hidróxido de sodio). El CO2 y el NaOH al combinarse
forman Na2CO3 (carbonato de sodio).
Se colocó la muestra de suelo a utilizar, en nuestro caso fue la del bajo a 0-
2.2
5cm de profundidad, en un frasco de vidrio ancho junto con un frasquito que contenía
30ml de NaOH. Se cerró herméticamente el frasco y fue incubado a temperatura
ambiente por una semana. Además, se realizó un frasco “control” que solo contenía
el frasquito con NaOH, es decir sin muestra de suelo, para realizar luego los cálculos.
Pasado el tiempo de incubación se procedió a medir cuanto NaOH no se había
combinado con CO2, para esto se tomó una alícuota de 10ml de los 30ml utilizados y
se le agrego unas gotitas de BaCl2 (cloruro de bario) para que precipite el Na2CO3 y
evitar que ocurra la reacción inversa. Luego se agregaron gotitas de un indicador de
pH (fenolftaleína) el cual hizo que la2.3muestra tomará una tonalidad fucsia y por último
en la bureta aforada se tituló con HCl hasta llegar a la neutralidad (Imagen 1), indicado
esto por el cambio de color de fucsia a blanco (Imagen 2). El volumen de ácido
gastado fue registrado para luego realizar los cálculos. El mismo procedimiento fue
realizado para el blanco.
Imagen 1. Muestra color fucsia siendo titulada Imagen 2. Muestra ya titulada con HCl
Los cálculos para convertir los ml de HCl gastados en la titulación, en mg de
CO2 liberados por los microorganismos fueron mediante una fórmula que se detalla
en el anexo de este informe. También se corrigieron esos resultados pasándolos a
gramos de suelo en base seca.
3.1
En la segunda experiencia se realizó el conteo e identificación de los
microorganismos del suelo mediante la muestra de 10g del bajo a 0-5cm de
3.2
profundidad. Para la siembra en las cajas de petri se utilizó el método de diluciones
decimales, trabajando finalmente con 5 grados de dilución.
Se procedió a inocular dos cajas de petri TSAD (medio de cultivo Tripteína soja Agar
diluido) con 0,1ml de las diluciones 10-5 y otras dos con 10-4; este medio es utilizado
para propósitos generales, favorece el desarrollo de una gran variedad de
microorganismos aerobios y también anaerobios facultativos y estrictos. Luego se
sembró en dos placas HyL (medio de cultivo para hongos y levaduras) las diluciones
10-2 y 10-3; este es un medio selectivo que tiene pH casi neutro y suprime el
crecimiento bacteriano. También se inoculó con la dilución 10 -3 una placa con medio
de cultivo agar P, el cual es selectivo para pseudomonas y permite la detección y
diferenciación de las mismas por el desarrollo de pigmentos. Por último, se llevó el
tubo 10-3 a shock térmico por 10min (Imagen 3) y luego se sembró una placa de TSAD;
el shock térmico se hace con el fin de destruir las células vegetativas y obtener solo
colonias a partir de las esporas del filo Firmicutes.
Imagen 3. Tubos de dilución en shock térmico
Luego de la incubación de las cajas de petri se procedió a realizar recuentos
de las colonias r-estrategas a las 48hs, K-estrategas a las 144hs y se calcularon las
UFC de heterótrofos aerobios totales en las cajas con TSAD. Esto se realizó para
cada sitio de muestreo y profundidad, unificando luego los resultados. Los cálculos se
encuentran en el anexo4.1de este informe.
En las otras cajas con HyL, Agar P y TSAD con shock térmico se realizaron solo
observaciones buscando características de esos microorganismos que sirvan para su
identificación.
Resultados y discusión
Como podemos observar en la tabla de los resultados finales (Tabla 1) el sitio
del bajo es el que mayor mg de CO2/100g de suelo seco presentó en una semana,
indicando que la actividad biológica de este sitio es mayor con respecto a los demás
sitios, sin embargo, no tenemos un análisis estadístico que pueda afirmar que esas
diferencias son significativas. Esta variación en los mg de CO2 liberados se puede
deber al tipo de vegetación del lugar y el tipo de residuos que deja la misma (fuente
principal de C orgánico que le va a proveer energía a los microorganismos), ya que la
degradación de los compuestos orgánicos por parte de los microorganismos va a
depender de la composición de dicho residuo (grado de lignificación, tamaño de
partícula, etc), además de características físicas, químicas y abióticas.
En el Pinar se observaron valores intermedios en comparación con los demás sitios,
la pinocha es un tipo de residuo ácido con pH entre 4,5 y 5 por lo que este factor va
a tener un importante efecto en el tipo de microorganismos presentes y su velocidad
de crecimiento, además tiene alta permeabilidad por lo que no va a estar disponible
para la mayoría de los microorganismos.
En la loma se observaron los valores más bajos de mg de CO2 liberados esto puede
deberse a la profundidad y tipo de suelo que limita la vegetación del sitio, además un
factor importante es la humedad, al ser una loma el agua va a escurrir sin llegar a
penetrar correctamente y el proceso de degradación se va a dar más lento.
En cuanto a la profundidad se observó que en el Pinar a mayor profundidad mayor
desprendimiento de CO2, esto puede deberse a una mayor concentración de
microorganismos que varía según el tipo de uso del suelo, la vegetación y los residuos
que esta genera. La acumulación en capas sucesivas de residuos difíciles de
degradar, como los del pino, puede hacer que los microorganismos se concentren a
más profundidad donde se encuentran las primeras capas depositadas. En cambio,
en la loma y el bajo se obtuvieron valores mayores de desprendimiento de CO2 a
menor profundidad, lo que se puede deber al tipo de residuo que se degrada
rápidamente, además a mayor profundidad es menor la humedad del suelo y la
presencia de MO.
Tabla 1. Abundancia y actividad biológica en los 3 sitios de estudio
Sitio y Actividad r (UFC/g K (UFC/g Bacterias Hongos y %H
profundidad biológica (mg suelo suelo seco) heterótrofas levaduras bs
de CO2/100g seco) totales (UFC/g suelo
suelo/semana (UFC/g suelo seco)
seco)
Pinar 0-5 19.66 2.6 x106 2.1 x106 4.6 x 106 3.4 x 104 4.7
5-10 33.13 7.6 x 106 2.1 x 106 9.7 x 106 5.6 x 104 4.6
Bajo 0-5 49.55 7.9 x 107 3.2 x 107 1.1 x 108 5.5 x 104 16.3
5-10 68.12 1.4 x 107 2.8 x 106 2.7 x 107 3.3 x 104 11.1
Loma 0-5 11.23 1.1 x 107 2.9 x 106 2 x 107 7.2 x 104 3.1
5-10 4.07 5.1 x 106 6.1 x 105 6.1 x 105 SD 2.7
En cuanto al recuento de organismos y grupos microbianos, también teniendo
en cuenta los resultados de la tabla 1, podemos decir principalmente que la presencia
de bacterias heterótrofas aerobias es, por mucho, mayor que la presencia de hongos
y levaduras en los mismos sitios de estudio.
Los hongos y levaduras suelen encontrarse en el estrato superior del suelo, sin
embargo, en el sitio pinar se pueden observar mayores UFC/g de suelo en la
profundidad de 5-10cm que en la de 0-5cm y esto puede deberse a que los hongos
son más tolerantes a suelos ácidos y la degradación de la pinocha hace que el pH
baje. En cuanto al bajo (Imagen 4) y a la loma la mayor concentración de hongos y
levaduras se encuentra en la superficie, como mencionamos anteriormente esto es
una características de los hongos (su distribución está determinada por la
disponibilidad de carbono orgánico, a mayor profundidad menos carbono orgánico
para degradar), sin embargo, en el bajo podemos agregar que esta mayor
concentración en superficie puede deberse también a la mayor presencia de oxígeno,
ya que las poblaciones de hongos disminuyen en suelos muy húmedos por la falta de
O2 y al encontrarse en el Bajo la acumulación de agua es mayor. En el sitio loma no
se hallaron datos de UFC/g de suelo en la profundidad de 5-10cm para analizar.
Imagen 4. Cultivo de HyL en el bajo a 0-5cm
En cuanto al total de las bacterias heterótrofas, hay una gran diferencia entre
las K- estrategas y las r-estrategas, siendo estas últimas las que presentan mayores
UFC/g suelo en casi todos los sitios y profundidades. Aunque en este caso no hay un
análisis estadístico que lo afirme sabemos que los r-estrategas son organismos
generalistas y con una alta tasa reproductiva (priorizan el destino de la energía a la
reproducción) en comparación con los K-estrategas que tienen una reproducción
demorada. Únicamente en el pinar a los 0-5cm de profundidad se puede ver que el
desarrollo de r-estrategas y K-estrategas es muy similar, esto puede deberse a que
los estrategas K están adaptados a consumir bajas concentraciones de C y por ende
suelen consumir aquellos sustratos más recalcitrantes que no consumen los
estrategas r, como pueden ser los desechos del pino que son más lignificados y
permeables. En el bajo y la loma la cantidad de UFC/g suelo sigue siendo mayor en
las r-estrategas, tanto para la profundidad 0-5 como para 5-10cm, puede deberse a
que en estos sitios la vegetación es mayormente de tipo herbácea, anual y por lo tanto
sus residuos son más simples, menos lignificados y fácilmente disponibles para este
tipo de organismos, los cuales utilizan todo el sustrato para su crecimiento y
reproducción, dejando poco disponible para los K-estrategas.
Se pudo observar también la presencia de pseudomonas en las placas de agar
P sembradas con la dilución 10-3 a partir de la muestra del bajo a 0-5cm de
profundidad. Se observó una colonia de pseudomonas de color amarillo intenso y
filamentosa (Imagen 5). Es interesante la presencia de este género en el suelo, ya
que pueden actuar como solubilizantes de elementos minerales para disponibilidad
de las plantas, aunque también pueden causar enfermedades; pero para determinar
de qué tipo se trata se debería hacer un estudio más detallado de la colonia. También
se observaron otros microorganismos del suelo en la placa.
Imagen 5. Medio de cultivo AP con Pseudomonas
Respecto a la caja de petri TSAD inoculada con la dilución luego de realizarle
el tratamiento de shock térmico, pudimos observar gran presencia de colonias
(Imagen 6). Podemos decir que estas colonias de bacterias pertenecen al filo
Firmicutes, ya que comprende todos aquellos géneros formadores de endosporas,
principalmente Bacillus. Al realizar el shock térmico a la dilución antes de sembrar,
nos aseguramos de que todas las colonias que vayan a formarse sean a partir de las
esporas, ya que las células vegetativas fueron destruidas y las esporas son más
resistentes.
Imagen 6. Cultivo luego de shock térmico
Conclusión
Podemos concluir que la actividad biológica del suelo es mayor en el Bajo, por
el tipo de residuo que deja la vegetación y se encontraron cantidades mayores de
UFC/g de suelo sobre todo en los primeros cm de profundidad, sin importar el sitio,
por la mayor presencia de carbono orgánico. Son predominantes en el suelo los
microorganismos con estrategia de crecimiento r-estrategas y en cuanto a la
presencia de hongos confirmamos que existen en menor cantidad con respecto a las
bacterias. Además, dentro de las bacterias del suelo se pudo identificar la presencia
de Pseudomonas y Firmicutes del género Bacillus que son los mayores esporulantes.
Anexo cálculos TP4
Comisión: 4
Sitio: Bajo
Profundidad: 0-5cm
● Actividad biológica (respiración microbiana)
PROFUNDIDA Vol HCl Muestra Promedio blanco
COMISIÓN SITIO D (ml) (ml) % Humedad bs
4 BAJO 0-5 cm 4.5 7 15.2
6 BAJO 0-5 cm 5.2 18.06
Fórmula: (B-V)*(N*E)*A
C4)
Mg CO2/g suelo húmedo= (7𝑚𝑙 − 4. 5𝑚𝑙) * (0. 3 * 22𝑚𝑔) * 3= 49.5mg CO2
C6)
Mg CO2/g suelo húmedo= (7𝑚𝑙 − 5. 2𝑚𝑙) * (0. 3 * 22𝑚𝑔) * 3= 35.64mg CO2
Materia seca de la muestra
Fórmula: MH / [(%H/100)+1]
C4) 100𝑔/((15. 2/100) + 1)= 86.81 g suelo bs
Mg CO2/100g suelo seco: (100𝑔 * 49. 5𝑚𝑔)/86. 81𝑔= 57.02mg CO2
C6) 100𝑔/((18. 06/100) + 1)=84.7 g suelo bs
Mg CO2/100g suelo seco: (100𝑔 * 35. 64𝑚𝑔)/84. 7𝑔= 42.08 mg CO2
Bajo 0-5cm→ Mg CO2/100g suelo seco= (57.02+42.08)/2= 49.55
● Abundancia (sitio: bajo 0-5cm)
Heterótrofos totales (HT) de cada placa sembrada:
Fórmula:
HT= (48hs) + (144hs)
296 (48hs) + 25 (144hs)= 321HT
Cálculo de r y K-estrategas para cada dilución sembrada en cada muestra:
Fórmula:
r= (48hs + 48hs)/2
k= (144hs + 144hs)/2
Datos:
Sitio Profundidad 48hs 48hs 144hs 144hs
(cm)
Bajo 0-5 296 138 25 23
(296 + 138)/2= 217 r- estrategas
(25 + 23)/2= 24 k- estrategas
Cálculo de HT en la muestra:
Fórmula:
HT= r + k
Sitio Profundidad r k
Bajo 0-5 217 24
217 + 24= 241HT muestra
Cálculo de UFC/g suelo (en suelo húmedo)
Fórmula:
Número de UFC/g= [Número de colonias x (dilución g/ml)] /volumen sembrado (ml)
UFC/g para r-estrategas
Sitio Profundidad Dilución r
Bajo 0-5 10000 217
(217*10000ml/g)/0.1ml=21700000 UFC/g r
Rectificación de los valores de UFC/g en suelo seco:
Fórmula MS:
MS=MH/((%Hbs/100)+1)
Sitio Profundidad (cm) % humedad bs MH g
Bajo 0-5 15.2 10
10g/((15.2%/100)+1)= 8.68g MS
Fórmula para rectificar los valores de UFC/g de suelo húmedo a seco
UFC/g suelo seco= (MHg * UFC/g bh) / g MS
(10g * 21700000 UFC/g ) / 8.68gMS=24998400 UFC/g bs r-estr.
Promedio de las UFC/g en cada sitio donde a la misma profundidad se
realizaron dos muestras.
Sitio Profundidad (cm) UFC/g r
Bajo 0-5 21700000
0-5 132227200
(21700000 UFC/g + 132227200 UFC/g)/2=78612800 UFC/g suelo seco r- estrategas
Bajo 0-5cm → UFC/g suelo seco r-estrategas = 7.8 x 10^7
Nota: Se realizó el mismo procedimiento para el cálculo de K- estrategas, HT y
hongos y levaduras.
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Índice de comentarios
2.1 pueden hacer un subtítulo o simplemente decir cual es el parámentro analizado.
2.2 concetración?
2.3 ¿concetración usada?
3.1 determinó abundancia y diversidad de microorganismos
3.2 Para esto se utilizó...
4.1 informaron recuentos
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