Introducción a la microbiología

Reporte de práctica 2 : ESTUDIO EXPERIMENTAL.

OBSERVACIÓN DE NÓDULOS DE RHIZOBIUM EN
LEGUMINOSAS

SEMESTRE ENERO – JULIO 2024

6to semestre CNE y S- B
DOCENTE: FRANCISCA GARCIA ESPINOSA
Alumno: Yolanda Violeta del Carmen López Navarro

Objetivo: El alumno realizará el experimento con una leguminosa muy abundante, el

trébol (Trifolium pratense) para observación de bacterias fijadoras de nitrógeno.
MARCO TEORICO

La simbiosis entre las bacterias del género Rhizobium y las leguminosas es fundamental
para la fijación de nitrógeno, un proceso crucial para la fertilidad del suelo y la
productividad agrícola. Los nódulos formados en las raíces de las leguminosas son
estructuras donde Rhizobium convierte el nitrógeno atmosférico en amonio, que las
plantas pueden usar. Este ensayo examina la formación de nódulos, cómo se observan en
el laboratorio y los métodos de fijación utilizados.

Formación de Nódulos de Rhizobium

El proceso de formación de nódulos inicia cuando las raíces de la leguminosa secretan

flavonoides que atraen a las bacterias Rhizobium. En respuesta, las bacterias producen
factores Nod que inducen la formación de pelos radiculares deformados, permitiendo la
entrada de las bacterias. Dentro de la raíz, las bacterias se diferencian en bacteroides que
fijan nitrógeno, formando nódulos visibles.
Los nódulos son críticos para la simbiosis, proporcionando un entorno anaeróbico
necesario para la actividad de la enzima nitrogenasa. Esta enzima convierte el nitrógeno
atmosférico en amonio, un nutriente esencial para las plantas. La eficiencia de la fijación
de nitrógeno y la formación de nódulos depende de factores genéticos y ambientales,
incluyendo la compatibilidad entre la cepa de Rhizobium y la especie de leguminosa.

Observación de Nódulos en el Laboratorio

En el laboratorio, los nódulos se observan mediante varias técnicas que permiten su

identificación y caracterización. Los pasos comunes incluyen:

1. Colecta de Muestras: Las raíces de las plantas leguminosas se extraen

cuidadosamente y se lavan para eliminar el suelo. Se seleccionan nódulos visibles,
generalmente de color rosado o rojizo, que indican actividad nitrogenasa.

2. Fijación de Nódulos: Los nódulos se fijan utilizando métodos como la fijación con
formalina-acético-alcohol (FAA) o glutaraldehído, lo que preserva su estructura para
el análisis posterior.

3. Sección y Tinción: Los nódulos fijados se cortan en secciones finas utilizando un

micrótomo. Luego, se tiñen con colorantes específicos, como safranina y verde
rápido, para diferenciar las estructuras internas y las bacterias.

4. Microscopía: Las secciones teñidas se observan bajo un microscopio óptico o

electrónico. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) y la microscopía
electrónica de barrido (SEM) proporcionan imágenes detalladas de la interacción
entre las células de la planta y las bacterias.
Tipos de Fijación en Nódulos

La fijación de los nódulos implica mantener la integridad estructural y funcional de los

tejidos para un análisis detallado. Los métodos de fijación incluyen:

1. Formaldehído: Utilizado para la preservación general de los tejidos, manteniendo la

estructura celular.
2. Glutaraldehído: Proporciona una fijación más fuerte, ideal para la microscopía
electrónica.
3. Paraformaldehído: Común en la fijación de muestras para inmunocitoquímica,
preservando las proteínas y las estructuras antigénicas.
4. Alcoholes: Como el etanol y el metanol, utilizados para deshidratar y preservar tejidos
antes del análisis.

La relación simbiótica entre Rhizobium y las leguminosas es esencial para la fijación de

nitrógeno, beneficiando tanto a las plantas como al suelo. La formación y observación de
nódulos en el laboratorio son pasos cruciales para entender esta simbiosis. Los métodos
de fijación y las técnicas de observación detalladas permiten un análisis profundo de la
estructura y función de los nódulos, proporcionando información valiosa para mejorar la
eficiencia de esta interacción en la agricultura sostenible.

Formación de Nódulos de Rhizobium en Leguminosas

La formación de nódulos en las raíces de las leguminosas es un proceso complejo que

involucra varias etapas, facilitadas por una estrecha interacción entre la planta y las
bacterias del género Rhizobium. A continuación, se describe cómo se forman estos
nódulos:

1. Reconocimiento y Atracción: Las raíces de las leguminosas liberan compuestos

químicos llamados flavonoides en el suelo. Estos compuestos son detectados por
las bacterias Rhizobium, que en respuesta producen factores Nod
(lipochitooligosacáridos) específicos.

2. Infección: Los factores Nod inducen la curvatura y el crecimiento de los pelos

radiculares de las raíces. Las bacterias Rhizobium se adhieren a estos pelos
radiculares y comienzan a infectarlos, formando un tubo de infección que penetra
en las células de la raíz.

3. Formación del Tubo de Infección: A medida que las bacterias se multiplican, el tubo
de infección se extiende hacia el interior de la raíz, permitiendo que las bacterias
invadan las células corticales de la planta.

4. Diferenciación en Bacteroides: Dentro de las células corticales, las bacterias se

diferencian en bacteroides, las formas activas de *Rhizobium* que fijan nitrógeno.
Las células de la planta se dividen y diferencian para formar el nódulo.
 5. Desarrollo del Nódulo: El nódulo comienza a desarrollarse como una estructura
especializada, donde las bacterias fijan nitrógeno atmosférico (N₂) y lo convierten
en amonio (NH₄⁺), una forma de nitrógeno que la planta puede utilizar para su
crecimiento.

6. Mantenimiento de la Simbiosis: La planta suministra compuestos orgánicos

(productos de la fotosíntesis) a las bacterias, mientras que estas proveen nitrógeno
fijado. Esta relación simbiótica es regulada por señales químicas entre la planta y
las bacterias, asegurando una cooperación efectiva.

Este proceso de formación de nódulos es crucial para la fijación biológica de nitrógeno,

que es vital para la fertilidad del suelo y la productividad de las leguminosas. Los nódulos
pueden ser observados como protuberancias en las raíces de las plantas y son esenciales
para su nutrición en suelos pobres en nitrógeno.

MATERIALES

- 2 portaobjetos limpios y secos

- 1 Microscopio
- Colorantes para tinción de Gram
- 1 Charola de tinción y varillas
- 1 Plancha de calentamiento
- 1 Termómetro 100 oC
- 1 Cristalizador
- 1 Mechero Bunsen
- 1 Pinzas de disección
- 1 Espátula - 1 Mechero
- Guantes de calentamiento REACTIVOS:
- 1 Piceta con agua destilada
- Ácido acético glacial que contengan un 0.1% de cloruro sódico. (Gotero)

MATERIAL A TRAER POR EQUIPO:

- Trébol del suelo (preferiblemente de una zona húmeda, para obtener las raicillas
completas) Ver imagen más adelante, traer unos tres tréboles con raíz y nódulos.
- Una tapa para el cristalizador (De vidrio, peltre, o aluminio)
- Material de seguridad personal y limpieza, servilletas
- Un exacto para cortar nódulos
 DIAGRAMA DE FLUJO

PROCEDIMIENTO

Procedimiento I. Aislamiento, observación de Rhizobium en un nódulo

1. Toma de muestra:

a. Tomamos un trébol del suelo (preferiblemente de una zona húmeda, para

obtener las raicillas completas).

b. Aislamos varios nódulos (fig. 18-3) y los depositamos sobre un portaobjetos

de vidrio

2. Procesamiento del nódulo:

a. Con la ayuda de unas pinzas o una espátula, lo trituramos y

homogeneizamos en una mínima cantidad de agua, procediendo a su
fijación y tinción

Procedimiento II. Determinación de leghemoglobina Se basa en la formación de cristales

romboédricos de color marrón sobre la leghemoglobina (hemocromógeno). Método
microcristalográfico basado en el método de Teichmann.
1. Preparación de nódulos sobre el portaobjetos (similar a la descrita para realizar una
tinción de Gram).

a) Arranca una planta de leguminosa con sus raíces.

b) En las raicillas finas, verás nódulos en forma de pequeñas verrugas.

c) Con pinzas, desprende un nódulo y lávalo para quitarle la arena.

d) Parte el nódulo con un bisturí o un exacto sobre un portaobjetos, agregando

una gota de agua.

e) Seca la preparación a la llama del mechero y colócala en la charola de

tinción. Teñir por Gram

2. Colocar sobre baño de agua a 60 °C, con la tapa cerrada (1 min). Serán los
vapores los que calienten la muestra.

3. Cubrir la muestra evaporada con unas gotas de acido acético glacial que
contengan un 0,1% de cloruro sódico.

4. Dejar evaporar en el baño y volver a repetir el paso 3

5. Repetir pasos 3 y 4 dos veces más.

6. Observar al microscopio: la leghemoglobina cristalizará como clorhidrato de

hematina (cristales romboédricos de color café).
OBSERVACIONES

Aplastamos en nódulo y retiramos los

pedazos más grandes
Procedimos a teñir la muestra con tincion
de gram

Después del teñido y lavado, dentro del

cristalizador pusimos agua y la muestra
sobre una base y calentamos hasta 60°

Una vez a 60° bajamos la temperatura a

10 grados y agregamos el ácido acético

Tapamos el cristalizador y dejamos

evaporar el ácido
Repetimos el procedimiento dos veces
más
 Al observar en el microscopio la muestra
encontramos unos cuantos cristales col
color café
Concluimos que tuvimos problemas con
el teñido

CONCLUSIÓN

En esta práctica de laboratorio sobre la observación de nódulos de *Rhizobium* en

leguminosas, se logró identificar con éxito los cristales cafés buscados dentro de los
nódulos, indicativos de la actividad de la enzima nitrogenasa y la fijación de nitrógeno.
Estos resultados confirman la presencia de una simbiosis efectiva entre *Rhizobium* y las
leguminosas, esencial para la nutrición de las plantas y la mejora de la fertilidad del suelo.

El proceso de fijación de las muestras fue crucial para la obtención de resultados claros.
Primero, las raíces con nódulos fueron cuidadosamente extraídas y lavadas para eliminar
cualquier residuo de suelo. Posteriormente, se fijaron utilizando una solución de formalina-
acético-alcohol (FAA) para preservar su estructura. Las muestras fijadas fueron
seccionadas en cortes finos y tratadas con una solución de ácido acético, lo que facilitó la
cristalización y la formación de los cristales cafés.

La observación bajo el microscopio de las secciones teñidas permitió visualizar claramente

los cristales, confirmando la actividad biológica de los bacteroides en el interior de los
nódulos. Este procedimiento detallado y minucioso fue fundamental para el éxito del
experimento, permitiendo una clara identificación de las estructuras y procesos
involucrados.

En resumen, la práctica no solo demostró la capacidad de *Rhizobium* para formar

nódulos y fijar nitrógeno, sino que también resaltó la importancia de técnicas adecuadas
de fijación y preparación de muestras para estudios microbiológicos. Estos resultados
aportan un conocimiento valioso sobre la interacción simbiótica entre bacterias y plantas, y
su aplicación potencial en la agricultura sostenible.
BIBLIOGRÁFIAS

Nódulos de Rhizobium (universidad de navarra)( españa)(2020) San francisco

del rincón (mexico)(25 mayo 24)
[Link]

Desarrolo de los treboles (revista cientifica mexicana) ( mexico)(2017) San francisco del
rincón (mexico) (25 mayo 24)
[Link]