TME-078
Dr. Jorge Vera Garcés
UST – PUERTO MONTT
II SEMESTRE - 2023
Comprender el concepto de hibridación:SONDA
y las variables que influyen en el proceso.
Conocer técnicas que tienen como base la
hibridación.
Técnicas de laboratorio de Biología Molecular que se aplican en:
❖Diagnóstico de enfermedades (Patología Molecular).
❖Pesquisa e identificación de microorganismos patógenos.
❖Análisis de expresión génica en diferentes condiciones.
❖Localización de genes cromosomales, bandeo y cariotipo.
❖Localización de RNAs en tejidos.
❖Comparación filogenética entre individuos.
❖Medicina Forense.
Proceso por el cual dos cadenas de ácidos nucleicos
complementarias se unen y forman una molécula de doble
hebra.
Las cadenas originales pueden
ser DNA o RNA, por lo tanto, los
híbridos pueden ser:
❖ DNA – DNA
❖ DNA – RNA
❖ RNA – RNA (menos frecuente)
La formación de una molécula doble hebra se basa en los procesos de
desnaturalización y renaturalización de ácidos nucleicos.
La temperatura es el agente desnaturante más utilizado y los cambios deben
realizarse de manera gradual, de tal manera de afectar la estructura secundaria
del ácido nucleico, de manera controlada.
Por ser dependiente del grado de complementariedad en la secuencia de las
dos hebras, la formación de un híbrido entre dos moléculas de DNA de
diferente origen (especies) indica que pueden tener:
❖Cierto grado de herencia común.
❖Conexión evolutiva.
❖Cercanía filogenética.
❖Sus RNAs y proteínas codificadas
presentan secuencias y funciones
similares.
La identificación de secuencias específicas (secuencia diana) en una mezcla compleja de
fragmentos de DNA se realiza a través:
❖ Obtención de fragmentos digeridos por enzimas de restricción.
❖ Electroforesis en agarosa.
❖ Transferencia a membranas de nitrocelulosa (Fijación).
❖ Ciclos de desnaturalización alcalina, por temperatura o UV (Si son doble hebra).
❖ Adición de un pequeño fragmento de DNA (oligonucleótido) que contiene la secuencia que
se desea identificar.
❖ Renaturalización.
❖ Lavado.
❖ Revelado.
Los fragmentos pequeños hibridarán más rápido con los fragmentos digeridos que se desean
pesquisar: hibridación de los oligonucleótidos con las secuencias complementarias de la
secuencia diana.
Los oligonucleótidos se denominan
sondas y contienen un sistema de
marcaje para facilitar su detección.
La sonda utilizada puede llevar:
❖ Un isótopo radiactivo (Fósforo-32)
❖ Un grupo fluorescente.
❖ Una enzima acoplada.
❖ Número de pares G-C v/s pares A-T: mayor % GC mayor número de puentes de H.
❖ Grado de complementariedad: menor grado implica mayor número de bases
desapareadas.
❖ Longitud de las hebras: fragmentos largos permiten formar más puentes de H, pero
menor longitud permite una mayor especificidad y menos hibridación cruzada.
❖ Concentración de cationes: su presencia disminuye la repulsión negativa de los grupos
fosfato.
❖ Temperatura: puede afectar la cinética de renaturación.
❖ Formamida: agente químico desnaturante, cuya presencia posterior puede afectar la
formación del híbrido.
Este proceso se ve influenciado por la composición del medio
donde se realiza y la temperatura.
Se relaciona con la exigencia en las condiciones para el
apareamiento de bases.
Uniones erróneas Híbridos con errores de apareamiento
Baja de concentración de sales
Rigor Alta
elevado Alta concentración de
complementarieda
formamida
d de bases
Alta temperatura
El lavado post-hibridación permite eliminar interacciones no deseadas.
Permiten distinguir entre la sonda unida al ácido nucleico y la sonda libre.
❖ Sondas genómicas: fragmentos purificados (DNA o RNA).
❖ Sondas recombinantes: DNA recombinante amplificado en vectores
plasmidiales.
❖ Sondas por PCR: clonamiento acelular por amplificación.
❖ Sondas de RNA (ribosondas): a partir de la transcripción de un DNA
clonado.
❖ Sondas sintéticas: obtenidas por síntesis química de oligonucleótidos.
❖ Por uso de isótopos radiactivos (menos uso actualmente).
❖ Fluorocromos.
❖ Enzimas conjugadas.
La sonda puede ser marcada al momento de sintetizarse, incorporando el
marcador en la secuencia o por incorporación posterior covalente.
La detección puede ser directa o indirecta:
❖ Método directo: marcador está unido a la sonda de manera covalente.
❖ Método indirecto: marcador unido a la sonda (indicador) es detectado
por una proteína que lleva el marcaje.
Para revelar por método
indirecto se utilizan
sistemas enzimáticos
acoplados a fluorescencia
o cromóforos:
Sistema biotina –
digoxigenina reconocidas
por avidina o anticuerpos
anti – digoxigenina
acoplados a fluorocromos
o cromóforos.
En Fase Líquida
Sonda y ácido nucleico están en solución
Condiciones rigurosas de hibridación
Eliminación de la sonda no unida por:
❖Nucleasa S1
❖Precipitación por TCA
❖Cromatografía de adsorción en hidroxiapatita
En Soporte Sólido
Sonda o ácido nucleico están inmovilizados en filtros:
❖Nitrocelulosa (fijación por calor)
❖Nylon (fijación por UV)
Lavados
Remoción de:
❖ Sonda libre.
❖ Híbridos inestables.
❖ Uniones inespecíficas.
Hibridación de colonias bacterianas
Para detección de plasmidios recombinantes, con transferencia de clones
bacterianos desde placas a membranas de nitrocelulosa o nylon, posterior
tratamiento alcalino para desnaturar y luego hibridar.
Hibridación dot y slot blot
Se siembran el DNA o RNA sin purificar en filtros de nitrocelulosa o nylon, en
gotas (dot) o en línea (slot). Se fijan y se desnaturan con álcali para realizar la
hibridación con la sonda.
Hibridación Southern blot
Se usa para detectar secuencias específicas de DNA e implica:
DNA
❖ Digestión.
❖ Electroforesis.
❖ Desnaturalización.
❖ Transferencia.
❖ Hibridación.
❖ Detección.
Aplicaciones: RFLPs
Hibridación Northern blot
Se usa para detectar secuencias específicas de RNA e implica:
❖Electroforesis.
❖Desnaturalización.
❖Transferencia.
❖Hibridación.
❖Detección.
Aplicaciones:
evaluar expresión
génica
Hibridación in situ
Similar a las técnicas inmunohistoquímicas e inmunocitoquímicas
❖ In situ tisular:
Cortes de tejidos, células intactas, cortes incluidos en parafina
Fijación
Sonda de cDNA
Detección por microscopía
de fluorescencia
Aplicación: detección de virus patógenos, células cancerosas, cambios en la expresión
génica etc
❖In situ cromosómica:
Preparaciones de cromosomas en metafase o prometafase, fijados.
Tratamiento con proteasas y desnaturalización por calor, álcali o
formamida.
Sonda marcada con fluorescencia
Detección por microscopía de
fluorescencia
Aplicación: diagnóstico de cromosopatías, genes tumorales, transplantes, virología.
Págs 67 - 78
FUNDAMENTOS Y APLICACIONES DE TÉCNICAS
DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL LABORATORIO.
Depix MS. UST.
