MICROBIOLOGÍA GENERAL

UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CÓRDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
CARRERA: LICENCIATURA EN TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS

GUÍA DE ESTUDIO

PROFESOR Titular: MSc Benzzo, María Teresita

AÑO: 2008
 INTRODUCCIÓN
CRECIMIENTO MICROBIANO
En cualquier sistema biológico el “crecimiento” puede ser definido como el
aumento ordenado de todas las estructuras celulares y de sus componentes químicos.
Podemos ejemplificar lo anterior diciendo que al colocar una célula bacteriana en un
medio de cultivo nutricionalmente apto, primero aumentará su masa y luego comenzará
a multiplicarse por fisión binaria. Si se continuara en esta forma durante un tiempo
determinado, al cabo de éste se tendrá una población de células idénticas.
Desde el punto de vista microbiológico el crecimiento se refiere a un incremento
en el número de células más que al aumento de masa celular, es decir, se estudia la
población de microorganismos.
Si continuamos con el ejemplo inicial, una forma de describir el crecimiento de
ese microorganismo hasta formar una población, es mediante el “tiempo de
duplicación o tiempo de generación”. Este parámetro se refiere al tiempo necesario
para que una célula o población se duplique. De esta forma, si la célula creciera a su
máxima velocidad, el incremento que se observaría a partir de una célula sería: 2, 4, 8,
16, 32, 64, 128, etc. células. Expresando este aumento como potencias en base 2
tenemos: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, etc. células. Esta notación tiene la ventaja de que los
exponentes en dicha serie representan el número de generaciones que han ocurrido
desde un tiempo inicial (Fig.1). Así, luego de n generaciones, el número de células del
cultivo será 2n. La siguiente ecuación representa lo dicho:

Nt =No 2n

donde No es el número de células iniciales inoculadas en el medio de cultivo y Nt el

número de células luego de n generaciones.

Figura 1: Crecimiento de una población microbiana que se multiplica por fisión binaria
(extraído de
El Tórtora,
tiempo 1992).
de duplicación es muy variable para diferentes tipos de
microorganismos pues depende de factores nutricionales y genéticos. Para muchas
bacterias el tiempo de duplicación oscila entre 30-60 minutos, mientras que para otras
se requieren más de 24 horas. Por ejemplo, Escherichia coli tiene un tiempo de
duplicación de 20 minutos bajo condiciones favorables, por lo cual entre 6-7 hs, la
población se habrá incrementado a un millón de células (veinte generaciones, n=20)
 FASES DE CRECIMIENTO:

Ya se ha estudiado en temas anteriores que un microorganismo crecerá mejor y

a su mayor velocidad si contiene todos los nutrientes necesarios y si los restantes
factores ambientales (temperatura, humedad, atmósfera gaseosa, etc.) están en sus
valores óptimos.
El método de cultivo más simple es el cultivo discontinuo (batch culture) en el
cual el microorganismo crece a partir de una limitada cantidad de medio (líquido) hasta
que se agota un nutriente esencial o se acumulan subproductos tóxicos a niveles que
impida el crecimiento.
En dicho sistema el cultivo pasará por una serie de fases (Fig.2), que se
describen a continuación:

Figura 2: Curva de crecimiento microbiano (extraído de Tórtora, 1992).

FASE DE LATENCIA o DE ADAPTACIÓN (lag phase): Esta fase podría definirse

como un período de ”ajuste” que la célula necesita para reabastecerse de todos los
metabolitos celulares a un nivel compatible con la máxima síntesis celular. Así,
después de la inoculación de la célula en un medio de cultivo, ésta crece en tamaño y
la división celular es escasa o nula. Se produce un incremento de la actividad
metabólica, de los componentes macromoleculares y de la susceptibilidad a los
agentes químicos y físicos. La duración de esta fase dependerá de las condiciones en
que se encuentre el cultivo. Por ejemplo, cuando se parte de un cultivo celular viejo y
con él se inocula el mismo medio de cultivo (nuevo), la adaptación de las células
demandará más tiempo que si se utiliza un cultivo celular joven. De la misma manera,
el empleo de un medio de cultivo distinto en composición, podría modificar dicha fase.
Otro ejemplo ocurre cuando se utiliza un cultivo que contenga esporos los cuales
necesitan un tiempo adicional para germinar. Este período de adaptación en procesos
comerciales, tales como la fermentación, resulta inconveniente no sólo por la pérdida
de tiempo sino también porque se consumen los nutrientes.

FASE DE CRECIMIENTO EXPONENCIAL (log o exponential phase): En esta fase

las células se encuentran en un estado de desarrollo equilibrado. Esto significa que
durante la misma, el tiempo de duplicación es constante. Si se define la velocidad de
crecimiento1 como el cambio en el número de células por unidad de tiempo, durante
este período, las células crecerán a una velocidad máxima constante. Al representar
gráficamente en escala semilogarítmica este crecimiento equilibrado (Fig.3a) como el
logaritmo del número de células en función del tiempo, se obtiene una recta cuya
ecuación es:

logNt = logNo + K/2,303. t

donde log No representa la ordenada al origen siendo No el número de células iniciales;

logNt el número de células luego de un tiempo t y k/2,303 la pendiente de la recta
donde k es la constante de velocidad de crecimiento. Si dicha representación se
realizara en escala aritmética, es decir sin tomar los logaritmos (N=No.10k(t-to)/2,303), se
obtendría una curva de tipo exponencial (Fig. 3b). Por esta razón a las poblaciones
bacterianas que crecen cumpliendo estas ecuaciones se les dice que están en fase
logaritmica o de crecimiento exponencial. En esta etapa ocurre un crecimiento
explosivo del Nº de células pues nacen más células de las que mueren.

FASE ESTACIONARIA (stationary phase): En esta fase las células logran su máxima
concentración, se habla en este punto de cosecha máxima, que se mantendrá
constante por un cierto tiempo dependiendo del tipo de microorganismo, los nutrientes
disponibles y de los parámetros físico-químicos de incubación. Se produce el cese del
crecimiento de las células por agotamiento de los nutrientes disponibles o por
acumulación de los productos tóxicos generados por el metabolismo celular. En esta
fase, representada por la zona de meseta de la fig. 2 nacen tantas células como
mueren. Además la transición entre la fase exponencial y la estacionaria implica un
período de crecimiento desequilibrado, esto es que los diversos componentes celulares
son sintetizados a distintas velocidades con lo cual la composición química celular será
muy diferente a la de la fase exponencial.

FASE DE MUERTE (death or log declive phase): llegado un cierto punto, de seguir
manteniendo en estas condiciones las células y sin reponer más nutrientes,
desaparece el crecimiento y comienza el período de muerte. La muerte se produce
como consecuencia de varios factores entre los que podemos mencionar el

1
La velocidad de crecimiento de un cultivo en un medio líquido (caldo) se expresa como el aumento del número o
del peso de las células en la unidad de tiempo. Si el organismo es unicelular (bacterias, levaduras) se determina el
número de células, mientras que si es pluricelular (hongos filamentosos) el peso. 1
agotamiento de las reservas energéticas celulares. También, al igual que en fase de
crecimiento exponencial, la muerte es una función exponencial, por lo que su
representación en escala semilogarítmica nos dará una recta pero con pendiente
negativa. Esta pendiente es la velocidad de muerte y es muy variable, dependiendo
tanto del ambiente como del microorganismo en particular.
Finalmente cabe advertir que el cultivo microbiano pasa gradualmente de una
fase de crecimiento a la siguiente. Esto significa que no todas las células son idénticas
fisiológicamente al final de una fase dada del crecimiento. Algunas necesitarán de un
determinado tiempo para alcanzar a las otras.

Figura 3: Curva que representa el ritmo exponencial del crecimiento

microbiano. a) En escala semilogarítmica. b) En escala aritmética
(Extraído de Stanier, 1989).

REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO:

Las actividades microbianas son afectadas por las condiciones físico-químicas

del crecimiento. Esto explica su distribución en la naturaleza y permite diseñar métodos
para su control o eliminación. Por otro lado, una determinada condición ambiental
puede ser dañina para una clase de microorganismos y beneficiosa para otra. Hablar
de condiciones adversas significa que los microorganismos las “toleran” pero no crecen
y, por tanto, debe distinguirse entre los efectos que producen sobre la viabilidad y
reproducción de los mismos.
Los requerimientos necesarios para el crecimiento de una población microbiana
pueden dividirse en dos categorías principales: físicos y químicos. Los físicos incluyen
temperatura, pH y presión osmótica, mientras los químicos abarcan: oxígeno, actividad
de agua, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo, elementos traza y factores de crecimiento
orgánico2.

2
Para una mejor comprensión aconsejamos revisar el tema teórico “Metabolismo y Nutrición”
 MEDICION DEL CRECIMIENTO
A fin de facilitar la comprensión y, debido al gran número de procedimientos
existentes para medir el crecimiento, se han agrupado los principales en el Cuadro 1.
Sólo se describirán los fundamentos de los métodos más empleados.

MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Medición de la masa Medición del crecimiento de la población

-Peso húmedo A) Recuento total del Nº B) Recuento de microorganismos viables

de microorganismos
-Peso seco
A.1. RMD B.1. Métodos B.2. Métodos basados en el
-Turbidimetría microbiológicos metabolismo
A.1.1. Rto. en cámara
B.1.1. Recuento en placa B.2.1. Reducción de
A.1.2. Método de Breed -por vertido Colorantes.
-en superficie
B.2.2. Test de
B.1.2. Filtros de bioluminiscencia.
Membrana.

B.1.3. Petrifilm

B.1.4. Dilución en tubo

B.1.5. NMP

Cuadro 1: RMD: Recuento microscópico directo; NMP: Número más probable

MEDICIÓN DE LA MASA:
Peso húmedo: Se determina por pesada luego de la separación de las células
por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra.
La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y
contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido retenida puede ser
importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy empaquetadas puede
contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la
forma y deformación celular. Este inconveniente puede corregirse determinando la
cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular. Por ejemplo,
utilizando soluciones de polímeros no iónicos como el Dextran que pueden ingresar en
el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.
Peso seco: El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que
se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno
a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de
muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de
un gran número de bacterias, lo cual también indica una falta de sensibilidad del
método (un error de 1 mg en la determinación de la masa, equivale aproximadamente a
5000 millones de bacterias).
Además de requerir mucho tiempo, otra desventaja de este método es que
componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede existir
alguna degradación. También la muestra seca puede recobrar humedad durante el
pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.
Turbidimetría: El método de las densidades ópticas es, hasta el momento, el
más adecuado para medir la masa celular. Se basa en el hecho de que las partículas
pequeñas de materia dispersan un haz luminoso que pasa a través de ellas en forma
proporcional a su concentración. Así si se tiene, por ejemplo, una suspensión
bacteriana, ésta dispersará un haz luminoso provocando una reducción en la cantidad
de luz transmitida la que será, a su vez, una medida indirecta de la masa celular (Fig.
4). Esta determinación se realiza dentro del espectro de luz visible (Por ejemplo: a 580
nm de long. de onda).

Figura 4: Esquema que representa el método turbidimétrico o de las

densidades ópticas. (Extraído de Brock, 1999).

Los microorganismos se desarrollan en un medio de cultivo líquido produciendo

cambios en la turbidez del mismo. Estos cambios son medidos con un
espectrofotómetro o un fotómetro en unidades de absorbancia (o densidad óptica).
Graficando las absorbancias registradas en función del tiempo se obtienen las
denominadas curvas de absorbancia. Sin embargo, cada vez que se realicen
determinaciones de este tipo, se requerirá de la utilización en forma simultánea a la
medición de una determinada muestra, de curvas de calibrado o curvas estándar. Es
importante destacar que cuando las bacterias están en fase de crecimiento exponencial
o en fase de muerte, la gráfica semilogarítmica resulta ser una línea recta. En estas
condiciones, si las lecturas de absorbancia son equiparadas con el método de recuento
en placa (ver más adelante) para el mismo cultivo, esta correlación puede ser utilizada
para estimaciones futuras del número de bacterias medidas directamente por
tubidimetría.
 Se considera que aproximadamente 10 a 100 millones de células por mililitro son
necesarias para que una suspensión bacteriana tenga la turbidez adecuada como para
ser detectada por un espectrofotómetro. De ello se desprende que el tiempo necesario
para lograr ese límite de detección dependerá, no sólo de la concentración inicial de
microorganismos, sino también de la velocidad de crecimiento. Esta es la razón por la
cual este método no es aplicable a muestras con bajo número de microorganismos.
En el caso de muestras con alta densidad de células es necesario efectuar
diluciones a los fines de mantener la linealidad entre la absorbancia vs. concentración
de células (A580= 0,2 – 0.8)

MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO DE LA POBLACIÓN: incluye la mayoría de los

métodos que se utilizan. Los agrupamos en:

A) RECUENTO TOTAL DEL Nº DE MICROORGANISMOS

B) RECUENTO DE MICROORGANISMOS VIABLES

El grupo A (Cuadro 1) abarca los “métodos microscópicos o directos”. Estos métodos

no distinguen células vivas de muertas:

A.1) RECUENTO MICROSCÓPICO DIRECTO (RMD)

Da resultados con mayor rapidez que cualquier otro pues no requiere período
de incubación para que las células metabolicen y se multipliquen. Puede emplearse
para ello una cámara de recuento (recuento en cámara) o extender una cantidad de
muestra previamente medida sobre una superficie pre-delimitada en un portaobjeto de
vidrio (método de Breed).

A.1.1) Recuento en CAMARA: se carga adecuadamente una cámara de recuento con

la muestra líquida (si es necesario se realizará una dilución conveniente) y se cuentan
las células al microscopio. Existen diversos modelos de cámaras; uno de los más
usados es la cámara de Neubauer (Fig.5) que se encuentra en un bloque de cristal
atravesado por surcos transversales que delimitan tres superficies rectangulares
centrales (Fig.6). Los dos rectángulos laterales sirven de apoyo al cubre cámara, con
una altura de 0,1 mm mayor que el central, con lo que se obtiene una profundidad de
0,1 mm. La superficie central está dividida por un surco transversal en dos mitades
(cámara de recuento doble), cada una de estas superficies tiene una cuadrícula de
Neubauer o retículo. El retículo de Neubauer consiste en un cuadrado de 3 x 3 mm
dividido en 9 cuadrados grandes, cada uno de 1x1mm (1mm 2) (Fig. 5). Los 4
cuadrados grandes de los ángulos están divididos en 16 cuadrados medianos. El
cuadrado grande central (donde se realiza el recuento) está dividido por líneas triples
en 25 cuadrados medianos, cada uno de los cuales está a su vez dividido en 16
cuadrados chicos. Por lo tanto en el cuadrado grande central que tiene un área de
1mm2 hay 400 cuadrados chicos (25 X 16=400).
Para realizar un recuento primero se aplica el cubreobjetos sobre la cámara. La
adhesión del mismo debe ser perfecta. Una vez adherido el cubreobjetos a la cámara,
se la carga por capilaridad con una pipeta que contenga la muestra líquida en estudio.
La suspensión de la muestra no debe escurrirse por los surcos laterales, ni debe formar
burbujas de aire. Se deja reposar 3 minutos para que sedimenten las células y luego se
procede al recuento (no esperar mas tiempo pues la muestra puede secarse).
 Finalmente se enfoca al microscopio con objetivo de 10x el reticulado central (fig.5) (en
caso de ser necesario y posible puede enfocarse con el objetivo de 45x) y se cuentan
las células en 5 de los 25 cuadrados medianos (4 de los extremos y uno central), es
decir en 80 cuadrados chicos (5x16=80).

Figura 5: Cámara de Neubauer. Esquema del cuadriculado que se debe

observar al microscopio para el recuento de microorganismos.

Figura 6: Esquema que representa la ubicación de dos reticulados en una

Cámara de Neubauer (superior). Vista lateral de la cámara donde se observan los
surcos transversales que delimitan las tres superficies rectangulares centrales
que por diferencia de altura establecen una profundidad de 0,1 mm (inferior).

Cálculo de la concentración de microorganismos: Se utiliza la fórmula:

Nº mo /ml = [Link].
n: es el número de células contadas en 80 cuadrados chicos. (16x5c).
fs: factor de superficie, hay que referir n a los 400 cuadrados chicos
n --------- 80 c. chicos 400
x = n. ------
x --------- 400 c. chicos 80
 fs = 400 = 5
80

fv: factor de volumen, n.5 están en 0,1 mm 3 (recordar que la profundidad era de
0,1mm). Hay que referirlo a 1 mm3 y luego a 1 cm3. Por lo tanto se multiplica por 10
para llevarlo a mm3 y por 1000 para llevarlo a cm3
n.5 ----------- 0,1mm3 ----------- 0,1.10 –3 cm3
x ------------------------------------------ 1 cm3

x = n . 5 . 104. fv = 104
fdil: factor de dilución; si se parte de una muestra diluída se multiplica por el factor de
dilución para referir los microorganismos a la muestra original. Por ejemplo si la dilución
es 10 – 1 el fdil = 10

Nº  org /ml = n . 5 . 104 . fdil.

A.1.2) Método de Breed: consiste en distribuir uniformemente un volumen conocido de

la muestra (0,01 ml) sobre un área determinada del portaobjeto (1 cm2). Se colorea el
extendido y se cuentan las células que están en los distintos campos con objetivo de
inmersión. Deben contarse aproximadamente 80-100 campos. En algunas
oportunidades, cuando la concentración de bacterias es muy elevada, el número de
campos a contar puede ser menor. Como el número de microorganismos por ml se
determina teniendo en cuenta el diámetro del campo examinado se necesita entonces
que el microscopio esté calibrado, para lo cual debe utilizarse una platina micrométrica
que permite determinar el diámetro del campo microscópico cuando se observa con
objetivo de 100x (inmersión). Dado que el campo es circular, el área se obtiene por
aplicación de la fórmula:

A= . r2 =  . d2/4

El valor anterior será utilizado para calcular el Nº de campos que hay en un cm2. Una
vez calculado el promedio de células por campo y teniendo en cuenta el vol. de la
muestra en 1 cm2 = 0,01 ml y el factor de dilución si se partiera de una muestra diluída,
el cálculo de la concentración se efectúa:

Nº mo/ml = promedio de m.o. por campo x Nº de campos en 1 cm2 x 100 x fdil.

donde 100 es el factor necesario para referir la muestra a 1ml y fdil. el factor de dilución
de la muestra.

Además de su rapidez y bajo costo, el RMD exhibe otras ventajas como:

a) manipulaciones sencillas;
b) facilidad del ensayo;
c) el instrumental utilizado es mínimo;
d) las coloraciones pueden conservarse (Recuento de Breed) para ser consultadas;
e) se tiene idea de los microorganismos presentes (cocos, bacilos);
f) se requiere una mínima cantidad de muestra;
g) no se necesita de material estéril;
h) se puede añadir conservantes a la muestra antes de su análisis para preservarla y
facilitar así su envío a otro laboratorio, sin que los microorganismos proliferen.
Sin embargo y, dado que tanto las células vivas como muertas intervienen en el
recuento (no se pueden diferenciar), la validez del método puede originar ciertas dudas
respecto a la carga microbiológica de la muestra. Así, en un alimento sometido a
pasterización, un número elevado de células (vivas y muertas) denota una mala calidad
antes del procesamiento, supervivencia o proliferación durante el mismo (mal diseño
del proceso) o recontaminación posterior a dicho tratamiento (malas condiciones de
almacenamiento y/o transporte). Por otro lado, si se cuenta con una muestra clínica,
por ejemplo una orina, lo importante es conocer solamente los microorganismos
viables.
Otro aspecto a considerar es la limitación del recuento microscópico directo
(RMD) a muestras con un Nº reducido de microorganismos, ya que se comete mayor
error.
Finalmente para el Recuento en CÁMARA deben tenerse en cuenta los errores
que puedan cometerse al manejar inadecuadamente la cámara (cubreobjeto mal
adherido, cámara mal cargada, tiempo de reposo para que sedimenten las células no
respetado, etc.).

El grupo B (Cuadro 1) incluye los “métodos microbiológicos”. Estos métodos

determinan únicamente células viables.
B.1) MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
B.2) MÉTODOS BASADOS EN EL METABOLISMO

B.1) Métodos microbiológicos

B.1.1) Recuento en placa por vertido y en superficie (o siembra por extensión)

Por vertido: es un procedimiento relativamente sencillo. Previamente se realiza

la dilución de la muestra para lo cual se emplea una serie de tubos conteniendo 9,0 ml
de un diluyente apropiado como es el agua de peptona al 0,1%. Con una pipeta estéril
se toma 1,0 ml de la muestra homogenizada y se lo vierte en el primer tubo de la serie.
Luego se agita el tubo a fin de homogenizar la dilución realizada (1/10), se toma 1,0 ml
y se lo transfiere al segundo tubo de la serie (1/100). Se lo agita y se procede en igual
forma para los tubos restantes hasta llegar al último de la serie. Posteriormente se
transfiere 1,0 ml de cada una de las diluciones preparadas a placas de Petri 4 estériles a
la que se añade luego el medio de cultivo agarizado, estéril y fundido. La temperatura
del mismo debe ser entre 45-50ºC aproximadamente. Luego se homogenizan
realizando movimientos rotatorios suaves con el objeto de distribuir las células
uniformemente (Fig.7). Una vez solidificada la preparación, las placas se incuban
invertidas5 en las condiciones que correspondan al tipo de microorganismos que se
esté investigando (psicrófilos, termófilos, anaerobios, etc.). Durante la incubación el
crecimiento y proliferación prosigue hasta que se forma una colonia visible.
Posteriormente se contarán las placas que contengan entre 30 y 300 colonias 4,6. Este

4
En todos los recuentos microbiológicos cada dilución se siembra en placas de Petri por duplicado.
5
El objeto de la inversión de las placas durante la incubación es evitar la condensación del agua sobre la
superficie del agar, impidiendo la coalescencia de las colonias.
6
AOAC (Assotiation of Oficial Agricultural Chemist) 1975; FDA (Food and Drugs Administration) 1976
 número se multiplica luego por el factor de dilución (fd) de la muestra y se expresa
como UFC (unidades formadoras de colonias) por ml o gr de la muestra (Fig. 8):

UFC/ml =Nº colonias contadas x fd

Dada su sencillez y la posibilidad de poder abarcar una gran variedad de

concentraciones es, probablemente, el método más preciso para la determinación de
las bacterias que crecen en medio agarizado. Además permite recuperar los
microorganismos para estudios ulteriores.
Algunas desventajas son: el período de incubación que puede variar de dos a diez
días, el elevado costo por la cantidad de material que se emplea en comparación con
otros métodos y la necesidad de un técnico especializado (lo que está en relación
directa con la precisión del método).

En superficie: la diferencia con el anterior estriba en preparar previamente las

placas de Petri estériles con el medio agarizado dejando solidificar. Luego de secar la
superficie se esparce uniformemente con ayuda de una varilla de vidrio estéril (doblada
en forma de palo de jockey: espátula de Digralsky) 0,1 ml de la dilución de la muestra.
Se incuban las placas invertidas siguiendo las mismas indicaciones para las
condiciones de incubación, conteo y expresión del resultado que con el método por
vertido pero agregando el factor 10 para referir a 1 ml de la muestra:

UFC/ml =Nº colonias contadas x fd x 10

Las ventajas en relación al método anterior son:

a) Desaparece el inconveniente de los microorganismos termosensibles afectados por
el agar caliente (42-45ºC).
b) Los microorganismos exclusivamente aeróbicos crecen más rápido en la superficie
que en la masa, se detectan pronto y sus colonias son más grandes y fáciles de
contar.

Figura 7: Esquema que representa el método de Recuento en placa. a) Siembra

por extensión o en superficie. b) Siembra por vertido. (Extraído de Brock, 1999).
Figura 8: Esquema que representa las diluciones y el cálculo final para el
método de recuento en placa. (Extraído de Brock, 1999).

B.1.2) Filtros de membrana: se basa en el empleo de membranas que tienen un

tamaño de poro que permite retener bacterias (generalmente 0,20 m). Una vez que la
muestra ha sido filtrada y las bacterias retenidas mediante la membrana (estéril), ésta
se coloca sobre una placa con medio agarizado. Luego de la incubación las colonias se
enumeran obteniéndose el resultado de igual forma que para recuento en placa.
También puede hacerse un recuento microscópico directo realizando previamente una
tinción apropiada, lavado y tratamiento de la membrana para tornarla transparente. La
eficiencia del procedimiento anterior radica en la introducción de tinciones
fluorescentes. Es aplicado fundamentalmente para muestras de agua o muestras con
baja carga microbiana.

B.1.3) Petrifilm (Dry film): esta técnica ha sido desarrollada para efectuar recuentos
de diferentes tipos y grupos de microorganismos: coliformes totales, Escherichia coli,
hongos y levaduras, etc. Consiste de dos láminas de polipropileno, permeables al
oxígeno e impermeables al dióxido de carbono, que se encuentran pegadas sobre un
lado y cubiertas con medio de cultivo y un gel soluble en agua fría. Sobre la lámina
superior, un papel con una cuadrícula impresa favorece el recuento (Fig. 9) de las
microcolonias luego de la incubación. Los medios de cultivo contienen diferentes
sustratos según el tipo de microorganismo que se esté investigando. Así por ejemplo,
las microcolonias de E. coli, presentarán a su alrededor un halo azul que las distinguirá
de otros microorganismos coliformes presentes. Esto se debe a que con el medio de
cultivo empleado se pone de manifiesto la enzima -glucuronidasa, la cual es
específica para esta especie.
Este método está aprobado por la AOAC. Ha sido y es aplicado en numerosas
clases de alimentos: todo tipo de productos lácteos, frutas y vegetales, productos
cárnicos, etc. Otras aplicaciones son realizadas en el monitoreo del medio ambiente
donde se procesan alimentos o de superficies que están en contacto con los mismos, a
fin de evaluar su calidad higiénico-sanitaria. En cuanto a su sensibilidad se puede decir
que se han detectado hasta menos de 10 coliformes/gr de alimento.
Las ventajas que ofrece frente al método de recuento en placa son:
a) menor tiempo en la preparación de material;
b) menores costos;
c) facilidad en el manejo;
d) presencia de indicadores químicos que facilitan la lectura de las microcolonias;
e) menor tiempo de incubación;
f) resultados confiables en tiempos más cortos.

Figura 9: Esquema del diseño de un Petrifilm. En él se observa la lámina de

papel superior con la cuadrícula impresa que favorece el recuento.

B.1.4) Dilución en tubo: consiste en inocular asépticamente la muestra en una serie

de tubos con caldo estéril obteniendo diluciones sucesivas de la misma. Luego de la
incubación, se examina el caldo: la turbidez indica crecimiento de microorganismos. Si
no existe turbidez se supone que no había microorganismos o éstos no pudieron
multiplicarse. Si se preparan varias diluciones puede que, después de inocular, algunas
presenten crecimiento y otras no. Así por ejemplo, si el tubo que contiene la dilución
1/100 presenta crecimiento y el que contiene la 1/1000 no, la interpretación es que la
muestra contiene entre 100 y 1000 microorganismos.
Este método se aplica cuando se trata de tener una aproximación del nivel de
microorganismos presentes en una muestra. De esta forma se puede generalizar que el
Nº de microorganismos presentes en un ml de la muestra estará comprendido entre
dicha dilución (1/1000) y la dilución inmediata inferior (1/100). (fig. 10)

Figura 10: Esquema de la muestra y las sucesivas diluciones que se obtienen en

un caldo estéril. (extraído de Ingraham, 1997)

B.1.5) Número más probable (NMP)7: es un método de recuento por dilución en tubo.
Así, al usar varios tubos para cada dilución y tomando como positivos los que muestran
crecimiento (turbios) y/u otras características, la apreciación de microorganismos
presentes es más precisa que con el método anterior. Para utilizar el método del NMP
se necesitan al menos tres diluciones pero cuantos más tubos se inoculen por cada
dilución, más exacto será el resultado. Por razones de economía y comodidad suelen
usarse series de tres o cinco tubos por dilución (Fig. 11). Obtenido el resultado se
ingresa a Tablas de NMP buscando el valor que satisfaga el número de tubos positivos.
La expresión del resultado será NMP/g o ml de muestra. El método del NMP permite
contar microorganismos en niveles comprendidos entre 0 y 103 NMP/ml o g.

Figura 11: Esquema metodológico para la técnica del Número Más Probable

7
NMP: Número más probable, es un método que al igual que el de recuento en placa proporciona el
recuento de los microorganismos totales viables. Se basa en el principio de que una única célula viva
puede desarrollarse y producir un cultivo turbio.
Este método en muchos aspectos es más fácil y simple de realizar que el método de
recuento en placas aunque menos preciso. Permite detectar concentraciones muy
bajas de microorganismos y emplear medios selectivos-diferenciales según los tipos de
microorganismos a investigar. Su aplicación más frecuente consiste en la
determinación de la calidad bacteriológica del agua de consumo.

B.2) Métodos basados en el metabolismo:

El metabolismo de los microorganismos puede ser utilizado como estimación de
las poblaciones bacterianas. Algunos de los métodos que aprovechan esta propiedad
son:

B.2.1) Reducción de colorantes: implica una reacción de óxido-reducción donde el

sustrato o fuente de energía se oxida mientras otro compuesto se reduce, es decir, el
primero cede electrones y el último los acepta. La reacción de óxido-reducción puede
evidenciarse utilizando agentes colorantes o indicadores de pH, los que tienen la
particularidad de cambiar de color cuando se oxidan o reducen. De esta forma, cuando
se los adiciona a un sustrato que contiene bacterias metabolizadoras (por ejemplo una
muestra de alimento), los electrones originados por acción bacteriana sobre un sustrato
determinado son transferidos al indicador, cambiando éste de color. Este cambio de
color depende de la capacidad metabólica del cultivo microbiano, de manera que a
mayor número de células más rápido se produce el cambio de color. De ahí que el
tiempo de reducción será inversamente proporcional al número de células
presentes. Los compuestos más utilizados son el azul de metileno (colorante) y la
resazurina (indicador). La muestra preparada convenientemente es adicionada de una
solución diluída estándar del colorante o indicador para su reducción. Cuando se
observe el cambio de color, se registra el tiempo transcurrido para dicho cambio como
tiempo de reducción. Para el azul de metileno el cambio será de azul a incoloro (Fig.
12) mientras que la reducción de la resazurina involucra dos cambios: azul a rosa en
primer término, y luego a incoloro en segundo término.

Figura 12: Reducción del colorante Azul de metileno: viraje de la solución del azul al
incoloro
Si bien esta técnica es de gran aplicación en el campo de los alimentos, uno de
sus principales inconvenientes radica en la existencia de sustancias reductoras
inherentes a algunos de ellos. Por ejemplo en carnes crudas la presencia de tales
sustancias invalida el empleo de la resazurina, lo que no sucede en carnes cocidas
pues el proceso térmico las elimina. Existen también ciertos alimentos que contienen
enzimas reductoras presentes en forma natural que pueden producir cambios de
coloración por sí mismas, lo cual indicaría una contaminación superior a la presente.
Cabe destacar que el azul de metileno es un agente inhibidor del crecimiento para
determinados microorganismos, con lo que su uso se ve limitado. Otra desventaja
consiste en que no todos los microorganismos causan un descenso del potencial redox
en la misma proporción. Además sus resultados no son siempre comparables con el
método de recuento en placa.
Sus ventajas radican en:
a) bajo costo;
b) rapidez con que se obtienen los resultados, en algunos casos menos de 2 horas.

B.2.2) Determinación de trifosfato de adenosina (ATP) (test de bioluminiscencia):

el ATP, adenosin trifosfato, es el nucleótido trifosforado más importante existente en los
organismos vivos. Es el principal transportador de energía la cual está contenida entre
el segundo y el tercer enlace fosfato. Cuando el ATP se hidroliza libera dicha energía
convirtiéndose en adenosina difosfato (ADP).
Durante el metabolismo todas las células sintetizan ATP, disminuyendo los
niveles de éste cuando mueren. Por lo tanto la cuantificación de esta molécula resulta
ser un buen indicador del número de microorganismos presentes en una muestra. El
método se basa en una reacción bioluminiscente (luz fría):

Mg+2
LH2 + E + ATP E-LH2-AMP + PP

Luciferina Luciferasa adenosín Complejo de Pirofosfato

trifosfato adenilato luciferil

E-LH2-AMP + O2 E + LO + CO2 + AMP + luz

.. oxiluciferina adenosin
monofosfato

De esta forma, cuando un extracto purificado de luciérnaga que contiene

luciferina y luciferasa, reacciona con ATP en presencia de iones magnesio (Mg +2), se
produce una emisión de luz. Un instrumento como el fotómetro permite medir la luz
emitida en la reacción.
Es importante tener en cuenta la eliminación del ATP no bacteriano presente,
antes de realizar la determinación, a fin de evitar interferencias y/u obtener resultados
erróneos. Para ello, generalmente se trata la muestra con agentes que lisan las células
no bacterianas (por ej. tritón X-100) adicionando luego una enzima que hidrolice el ATP
no bacteriano liberado. Luego se procede a la desnaturalización del enzima por
calentamiento. Finalmente el ATP bacteriano se libera por rotura de las células ya sea
por métodos físicos o químicos, reaccionando posteriormente con el sistema luciferina-
luciferasa. La utilización de curvas estándares que correlacionen los niveles de ATP
con los recuentos de células viables por métodos convencionales (como recuento en
placa) permite calcular el número de microorganismos presentes.
Entre sus ventajas podemos mencionar:
a) su rapidez y sencillez;
b) la posibilidad de ser automatizado lo convierte en un método excelente para la
estimación rápida del número de microorganismos en alimentos;
c) es ampliamente utilizado como método rápido en el monitoreo de superficies en
contacto con alimentos, por hisopado de áreas designadas (ver más adelante). La
 luminosidad producida se lee como unidades de luz relativa (ULR) utilizando un
instrumento llamado luminómetro.

Como se mencionó anteriormente la principal desventaja radica en la remoción del

ATP no microbiano. Si bien algunos investigadores establecen que los niveles de éste
son insignificantes comparados con los de ATP microbiano y que disminuye con el
tiempo de almacenamiento del producto, en el caso de su utilización como lo indica el
inciso d), debe tenerse en cuenta que el ATP no microbiano contribuye a la lectura de
ULR.
Este método se emplea con frecuencia para determinar el número de
microorganismos totales en alimentos de origen marino y para recuento de levaduras
en jugos.

CANTIDADES DE MICROORGANISMOS PRESENTES EN LOS

ALIMENTOS

Introducción:
Si bien el método de recuento en placa se sigue utilizando para estimar las
poblaciones microbianas en diferentes alimentos, actualmente las empresas
alimentarias requieren, por la velocidad a la que procesan, distribuyen y venden sus
productos, métodos rápidos de detección que permitan evaluar la calidad
microbiológica tomando acciones correctivas a tiempo. Así, cuando se habla de rapidez
se incluye velocidad de reacción (segundos/minutos/horas vs. horas/días/semanas) y el
número de muestras procesadas (10/50/200 vs. una al mismo tiempo). Estos métodos
rápidos se clasifican en dos categorías: las que requieren entre 2-24 hs. de
realización (dilución en tubo, Petrifilm, etc.) y las que necesitan menos de 1 hora
(Recuento microscópico directo, test de bioluminiscencia, etc.). La diferencia en tiempo
se debe a que los primeros necesitan del desarrollo de los microorganismos, mientras
que los segundos detectan directamente al microorganismo o sus metabolitos. No
obstante, los métodos rápidos involucran ciertas desventajas como la necesidad de
confirmar los resultados a través de los métodos convencionales (recuento en placa,
NMP, dilución en tubo, etc.), el costo de la técnica por el instrumental empleado, etc.
Cuando se determinan los microorganismos aerobios presentes en estas
muestras mediante recuento en placa (Recuento aeróbico total en placa) debe
tenerse en cuenta que su número variará en función de la contaminación original, del
aumento o disminución de la carga microbiana durante el tratamiento al que ha sido
sometido, y del crecimiento o muerte durante su manipulación, almacenamiento,
transporte y venta. Por ejemplo en la carne fresca refrigerada el número de
microorganismos aumenta durante el almacenamiento en cámara (sobre todo
microorganismos psicrótrofos) pero en carnes sometidas a un tratamiento de secado o
congelación tiende a disminuir. La carne picada se contamina más fácilmente que los
cortes enteros debido a la manipulación de la operación en sí y a la expulsión de jugos
cárnicos que favorecen el crecimiento microbiológico, por lo que el recuento microbiano
será mayor. Por otra parte, todo alimento sometido a tratamientos térmicos como
cocción o pasterización, tendrán recuentos microbianos inferiores a los alimentos no
tratados.
Cuando el recuento aeróbico en placa asciende a valores cercanos o superiores
a 10 7- 10 8/gr. o ml en una muestra de alimento, la alteración del mismo se torna
rápida e inevitable. Por lo tanto esta determinación puede utilizarse para establecer la
vida útil del producto y su calidad higiénico-sanitaria. En general cuanto más elevado
es el número de microorganismos, peor es la calidad del alimento, quedando excluídos
de esta generalización los alimentos “fermentados” en cuya producción intervienen
microorganismos.
Para lograr alimentos seguros con una óptima calidad microbiológica, es decir
que arrojen recuentos que cumplan las normas establecidas para dicho producto, debe
procederse no sólo al análisis del producto terminado, sino también de muestras de los
ingredientes, de los equipos utilizados durante el tratamiento, del embalaje y del medio
ambiente donde son procesados. Esto contribuye a evaluar todas las condiciones
sanitarias para identificar las posibles causas de contaminación y evitar riesgos para la
salud de los consumidores.

Toma de muestra:
Las muestras de alimentos necesarias para análisis microbiológico pueden
provenir de la línea de producción, del lugar de almacenamiento, del transporte, de los
estantes de las bocas de expendio, etc. Los productos, sometidos a distintos
tratamientos de elaboración o preelaboración, pueden presentarse en estado líquido,
sólido, mezcla sólido-líquido, semisólido, y en multitud de formas y tamaños. De
acuerdo al número de variables presentes a la hora de realizar el muestreo, puede
hacerse necesario establecer varios planes de muestreo, que dependerán del objetivo
que persiga el análisis, del potencial de contaminación y del peligro potencial del
alimento sobre la salud del consumidor. Además, si los resultados debieran cumplir con
determinadas normas microbiológicas deberá seguirse el plan de muestreo indicado en
las mismas. Si en cambio, están destinados al propio industrial, puede seguirse un plan
menos exigente.
Es de suma importancia que la muestra sea: representativa del material
sometido a análisis, recolectada asépticamente y protegida de cualquier contaminación
hasta el momento del análisis. De esto depende que la muestra sea significativa y que
los resultados obtenidos de su análisis sean útiles.
Por lo general los microorganismos no están distribuidos uniformemente y, por
tanto, la mezcla de la muestra antes de proceder al muestreo es de vital importancia.
Cabe destacar también que el muestreo de objetos en movimiento, como sucede en
plena línea de producción, tiende a minimizar las variables que intervienen en el
muestreo. Así, dicha muestra resulta más representativa que la que se obtiene de
material inmóvil (estanterías en comercio, estibas, etc.). Los métodos y los
instrumentos estériles utilizados en la recolección de la muestra están determinados
por el tipo de sustancia a estudiar: líquidos y partículas pequeñas; materiales
voluminosos, superficies, aire, etc.
Los mejores resultados se obtienen al analizar la muestra en forma inmediata una vez
recibidas en el laboratorio. De no ser posible conviene refrigerarla para impedir el
desarrollo de microorganismos (involucra las etapas de conservación y transporte de
la muestra).

Preparación de la muestra:
El primer paso es lograr una suspensión homogénea de microorganismos de
modo que pueda ser pipeteada. Este procedimiento se facilita con muestras líquidas y
se complica para muestras sólido-líquidas y sólidas. Para una muestra líquida de
alimento (leche, jugo, etc.) se toma una alícuota de la misma multiplicando el volumen
tomado por 9 a fin de saber la cantidad de diluyente a agregar para obtener una
dilución 1/10. Una vez homogenizada, dicha dilución será la empleada en el análisis
microbiológico. Por el contrario, para alimentos sólidos, pueden seguirse un método no
destructivo o uno destructivo. El primero se refiere al hisopado que se realiza sobre
superficies o determinados alimentos donde su alteración depende de la carga
microbiana superficial como, por ejemplo, en las medias reses o en pollos. Se utiliza
para ello una plantilla de 100 cm2 la cual se apoya por lo menos en 10 partes diferentes
de la superficie total hisopando cada vez la zona interna que delimita dicha placa. El
hisopo con la carga microbiana se sumerge posteriormente en un diluyente apropiado
obteniendo una dilución 1/10. El método destructivo es más representativo de la carga
microbiana del producto y se realiza colocando una cantidad de muestra determinada
en licuadora o STOMACHER8 previamente esterilizados. Éste último tiene la ventaja de
ser más rápido y práctico pues la muestra se coloca en bolsas plásticas descartables,
no existe calentamiento de la muestra ni formación de aerosoles, evitando posibles
riesgos al operador. La cantidad de muestra tomada se multiplica por 9 para saber la
cantidad de diluyente a agregar obteniendo de nuevo una dilución 1/10 de la muestra.
Los diluyentes utilizados con más frecuencia, como el agua de peptona al
0,1%, conservan bien los microorganismos en la dilución y son fáciles de preparar. No
obstante presentan el inconveniente de no poder dejarse demasiado tiempo a
temperatura ambiente ya que los microorganismos se multiplican (en un intervalo de 20
minutos entre la preparación de la dilución y el plaqueo hay un aumento del 10%). En
todos los casos se debe tener en cuenta: la composición, la temperatura y el pH del
diluyente. Finalmente la cantidad de diluciones necesarias para calcular el número de
microorganismos presentes se determinará en función de los antecedentes de la
muestra, o por las normas, instrucciones y especificaciones del caso.

8
Hace más de 20 años que el investigador Tony Sharpe ideó el Stomacher. Recientemente ha ideado un nuevo
instrumento denominado “Pulsifier” que separa las bacterias de los alimentos mediante vibración en una bolsa,
obteniéndose los mismos recuentos que con el Stomacher.
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