UNIVERCIDAD VIZCAYA DE LAS AMERICAS
CAMPUS DELICIAS CHIHUAHUA.
HEMATOLOGÍA.
MATERIA: PRINCIPIOS BASICOS DE QUIMICA.
PROFE: QUIMICO. LUIS SOLTERO TERÁN.
ALUMNA: JESSICA ALEJANDRA SAUCEDO ONTIVEROS. CRIMINOLOLOGIA 2”A”
TECNICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SANGRE.
TECNICA DE LA BENCIDINA O DE ADLER.
FUNDAMENTO QUIMICO: Las peroxidasas sanguíneas son catalasas que como su nombre lo indica, poseen
catalica (enzimática) en las reacciones de oxidación, ya que tienen la propiedad de descomponer el peróxido
de hidrogeno u otros peróxidos orgánicos, produciendo liberación de radicales oxhidrilos. La oxidación de la
bencidina es utilizada como prueba presuntiva para la identificación de sangre. La técnica tiene una
sensibilidad de 1,300,000 a 500,000.
Un resultado negativo excluye la presencia de sangre; si la reacción es positiva requiere como toda técnica de
orientación, del empleo de reacciones de confirmación ya que se puede obtener falsas reacciones positivas
como otras sustancias que tengan actividad semejante a la de las peroxidasas o bien otros materiales
oxidantes.
PREPARACION DEL REACTIVO:
a) Solución de bencidina: 0.25 g. de bencidina se disuelven en 175ml. De etanol y se añaden 5 a 10 gotas
de ácido acético glacial. Se guarda en un frasco gotero ámbar en refrigeración en tanto no se usa.
b) H202 al 3%, también en frasco gotero de ámbar.
PRODECIMIENTO:
Humedecer un hisopo con H2O destilada y frotarlo sobre la mancha problema. Añadir al hisopo 1 o 2 gotas de
solución de bencidina, después de unos momentos de observar que no de coloración con esta, poner la misma
cantidad de H2O2 sobre el hisopo. En caso de positivo aparecerá rápidamente una coloración azul.
TECNICA DE LA FENOLFTALEINA O DE KASTLE-MAYER.
FUNDAMENTO QUIMICO: Esencialmente la rige del mismo principio que se señaló para la reacción de Adler:
La diferencia en que:
a) La fenolftaleína debe ser reducida previamente a fenolftaleína inclorada y este reactivo por su
labilidad debe ser guardado en refrigeración en frascos de ámbar.
b) Se trata en medio alcalino en vez de en medio acido.
c) Se efectuará un calentamiento previo a 100°c durante un minuto.
Esta técnica de la fenolftaleína reducida en más sensible que la de la bencidina, siendo esta de sensibilidad de
1: 1,000,000 a 10, 000,000.
PREPARACION DEL REACTIVO:
a) Solución de fenolftaleína: fenolftaleína 2g. Hidróxido de potasio 20g. Agua destilada 100ml. Polvo
de zinc 20g.
Disolver estas sustancias y colocarlas a reflujo con el polvo de zinc hasta completar descoloración.
Esta solución madre deberá guardarse en un frasco ámbar en refrigeración y deberá añadírsele polvo de zinc.
b) Solución de trabajo: Diluir la solución madre en etanol en la proporción de 1:5; la que también
deberá refrigerarse en tanto no se use.
c) Solución de agua oxigenada al 3%.
PROCEDIMIENTO:
Humedecer un hisopo con solución salina, frotar la muestra problema y pasarlo a un tubo de ensayo con 2ml.
De la misma solución, calentar un minuto a 100°c, añadir unas gotas de reactivo, esperar unos segundos y
agregar agua oxigenada. En caso positivo se obtendrá una coloración rosa brillante.
TECNICA DE LA LEUGO MALAQUITA VERDE.
FUNDAMENTO QUIMICO: Se basa al igual que las anteriores, en una reacción de oxidación y reducción.
La estructura química de esta sustancia recuerda a la de la fenolftaleína. El prefijo “leuco” se refiere a la forma
reducida inclora; la forma leuco puede ser preparada por reducción de la maquita verde.
PREPARACION DEL REACTIVO:
a) Se prepara una mezcla solida que contenga: 0.32g. de perborato de sodio y 0.10g. de malaquita verde;
se mezclan perfectamente y se guardan en frasco ámbar. Esta mezcla dura un año sin perder su
estabilidad.
b) El solvente se prepara diluyendo 6.6 ml, de ácido acético glacial en 3.3 ml. De agua destilada.
c) Preparar el reactivo de trabajo inmediatamente antes de usarlo, disolviendo la mezcla solida a) en la
solución b). Si en el reactivo recién preparado llegara a observarse la más leve coloración verde, no
debe ser usado.
PROCEDIMIENTO:
La mancha sospechosa se levanta con un hisopo humedecido en agua destilada y se le agregan unas gotas del
reactivo recientemente preparado. En caso positivo se observará una coloración verde.
TECNICA DEL LUMINOL.
El luminol es el 3 amino-ftalhidracina y el reactivo se prepara de la siguiente manera, en el momento de
utilizarse:
Solución A. Luminol 0.1 gr.
Carbonato de sodio 1 gr.
Agua destilada c.b.p 100 ml.
Solución B. Hidracina hidratada al 95% 0.1 gr.
Agua destilada 100 partes.
Al ml de la solución A, se añade una gota de agua oxigenada e inmediatamente después, 2 gotas de la solución
B; se espera un minuto y la mezcla se asperje sobre la zona sospechosa. En caso positivo las manchas de
sangre producen luminiscencia.
Como reactivo no alteran la mancha, se puede continuar con la metodología normal.
TECNICA PARA IDENTIFICAR SANGRE HUMANA.
FUNDAMENTO: Esta técnica inmunoquímica se basa en las reacciones que se efectúan entre un antígeno que
emigran anódicamente y un anticuerpo que emigra hacia el catalogo durante una electroforesis. Sobre una
placa de agarosa, se hacen horadaciones en pares; el antígeno (seroalbúminas y alfa y beta globulinas) en la
otra; una vez terminada la electroforesis aparecen bandas visibles de precipitación entre las perforaciones
pares de los materiales proteínicos específicos.
MATERIAL Y EQUIPO:
1. Cámara de electroforesis.
2. Fuente de poder con control de voltaje hasta 500v., 20ma. Y control de tiempo.
3. Puentes de papel filtro u otro material absorbente.
4. Perforador y extractor de gel aproximadamente 2mm. De diámetro.
5. Micropipetas graduadas.
6. Portaobjetos desgrasados y pulidos.
REACTIVOS:
1. Suero de antihumano completo.
2. Agar.
3. Ácido dietilbarbitúrico.
4. Barbital sódico.
5. Lactato de calcio.
PREPARACION DE REACTIVOS:
1. Buffer para la cámara de electroforesis ( pH 8.6).
Ácido dietilbarbitúrico 1.38 gr.
Barbital sódico 8.76 gr.
Lactato de calcio 0.384 gr.
Agua deionizada c.b.p 1000 ml.
2. Buffer para el gel (pH 8.6).
Ácido dietilbarbitúrico 1.1 gr.
Barbital sódico 7.0 gr.
Lactato de calcio 1.0 gr.
Agua deionizada c.b.p. 1000 ml.
3. Gel.
Pesar 2 gr. De gel / difco agar especial) y añadir 100 ml. De agua destilada, mezclar y agregar 100 ml. De
buffer 2.
PREPARACION DE LAS PLACAS:
Sobre una superficie uniforme y perfectamente nivelada, colocar los portaobjetos y con la solución de gel lo
suficientemente caliente para facilitar su aplicación, dejar caer con una pipeta y partiendo del centro de la
placa 2.5 ml. De gel, teniendo cuidado de que su distribución en la placa sea uniforme. Una vez solidificado el
gel, acomodar las placas en una caja de plástico en cuya base se ha colocado una grasa húmeda para evitar la
desecación del gel; conservarlas en refrigerador un mínimo de una hora hasta el momento de su uso, las
placas puede almacenarse en en estas condiciones aproximadamente durante un mes.
Tambien se pueden almacenar en el refrigerador tubos de ensayo conteniendo 7 ml. De gel (3), para ser
utilizados en el momento en que se requieran, licuándolos por calentamiento y aplicando el gel sobre las
laminillas portaobjetos como se indica al principio de este apartado.
PROCEDIMIENTO:
1. Colocar en uno de los comportamientos laterales de la cámara de electroforesis 100 ml. De Buffer No
1.
2. Colocar los puentes de papel filtro u otro material absorbente adecuando en los comportamientos
laterales.
3. Preparar el estracto de muestra o muestra problema, suspendiéndoles un minuto de 5 minutos en el
Buffer No. 2.
4. Colocar muestra problema, antisuero y testigos, colocando en cada horadación de 8 a 10 lambdas.
5. Una vez aplicadas las muestras contra su antisuero especifico, se coloca la placa en la cámara de
electroforesis, poniendo especial atención en que la polaridad sea la correcta.
6. Trabajar a 150 v. durante 45 minutos.
INTERPRETACIÓN:
Una vez terminando el periodo de corrimiento programado, observar y en caso positivo las bandas de
precipitación se harán visibles en la zona comprendida entre el antígeno y el anticuerpo.
DETERMINACION DE GRUPO SANGUÍNEO.
DETERMINACION DE GRUPO SANGUÍNEO EN SANGRE FRESCA Y EN MANCHAS DE SANGRE:
La determinación del grupo sanguíneo en la practica forense aporta a los tribunales en sus pocas ocasiones
elementos de prueba muy importantes tanto para señalar si una mancha de sangre recogida del lugar de los
hechos puede prevenir de la victima o bien del victimario, o con mayor certeza indicar que no puede haber
analogía entre la sangre encontrada y la de la víctima o la de presunto agresor.
DETERMINACION DEL GRUPO SANGUÍNEO EN SANGRE FRESCA CON FINES FORENSES:
Recolección y preparación de las muestras sujetas a estudio:
En personas vivas:
a) Tomar 5 ml. De sangre venenosa con una jeringa estéril y seca.
b) Separar el suero por centrifugación.
c) Hacer una suspensión del paquete globular al 2% en el propio suero de la muestra tomada, para
efectuar determinaciones en tubo de ensayo y al 5% para determinaciones placa.
En cadáveres:
a) Tomar 5 ml. De sangre de una arteria o vaso grueso o bien de la cavidad cardiaca teniendo cuidado de
que no se contamine con tejido adiposo del propio cadáver.
b) Separar el paquete globular por centrifugación.
c) Lavar el paquete globular tres veces con solución salina fría, fresca y estéril (por lavar glóbulos rojos se
entiende: depositar una pequeña cantidad de glóbulos rojos en el fondo del tubo; llenarlo con solución
salina; mezclar invirtiendo el tubo suavemente varias veces, centrifugar y desechar el sobrenadante).
En coágulos:
a) Exprimir cuidadosamente el coágulo contra las paredes de un tubo de ensayo de 12 por 100, con el
auxilio de un aplicador de madera.
b) Lavar lo extraído durante tres ocasiones con solución salina.
c) Con los glóbulos lavados, hacer suspensiones al 2% y al 5% igual que en los casos precedentes.
DETERMINACION DEL GRUPO SANGUÍNEO:
Material empleado:
1. Centrifuga calibrada a 3,400 R.P.M.
2. Tubos de ensayo de 12 por 75 mm.
3. Laminillas portaobjetos o placas hemoclasificadoras.
4. Pipetas pasteur (con punta uniforme).
5. Bulbos de goma.
6. Aplicadores de madera.
7. Solución salina fresca y estéril (8.5 gr. De cloruro de sodio disueltos en 1, 000 ml. De agua destilada).
8. Suero humano hemoclasificadoras:
Anti-A
Anti-B
Lectina Anti-H
Anti-A1
Anti-Rh°D
Anti-M
Anti-N
DETERMINACION DEL GRUPO EN TUBO:
1. Preparar suspensiones de glóbulos rojos al 2% en solución salina.
2. Colocar una gota de suero Anti-A en un tubo de ensayo marcado como A.
Una gota de suero Anti-B en un segundo tubo signado como B.
Una gota de Leuctina Anti-H un tercer tubo marcado como O.
Una gota de Anti-A1 en el tubo 4 que se marcara como A1.
Una gota de suero Anti-Rh°D en un tubo al que se anotara Rh.
3. Añadir a cada tubo una gota de la suspensión de eritrocitos preparada en “1”.
4. Mezclar y centrifugar 15 segundos a 3,400 R.P.M. para loa primeros cuatro tubos y 90 segundos para el
correspondiente al Rh.
5. Agitar suavemente para desprender el botón globular y observar microscópicamente la presencia o
ausencia de aglutinación.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS:
Si se observa aglutinación en el tubo A; la sangre corresponderá al grupo A.
Si se observa en el tubo B, la sangre será grupo B.
Si se observa aglutinación en los tubos A y B el grupo será AB.
Si no se observa aglutinación ni en A ni en B; el grupo será O y se observará además que aglutina el tubo
marcado como O.
Si aglutina el tubo A y el A1; el grupo será A1.
Si aglutina el tubo A y el O, el grupo será A.
Si se observa aglutinación en el tubo 5, la sangre será Rh positiva: si no la hay, la muestra será Rh negativa.
IDENTIFICACION DEL ADN.
El material genético este contenido en los 46 cromosomas del núcleo celular y en el ADN mitocondrial. Este
solo es heredado al hijo por su madre, ya que, durante la fecundación, no pasa al ovulo, en virtud de que a el
solo entra la cabeza del espermatozoide y el ADN mitocondrial se encuentra en el cuello de la célula
espermática.
Todas las células que forman un ser humano, proceden de una sola célula, el cigoto. La cual se origina en la
fertilización al unirse las células sexuales.
PASOS A SEGUIR METODOLOGICAMENTE:
1. Extraer el material genético de las muestras problema (sangre, semen, saliva, tejido blando, tejido
óseo, manchas o de células epiteliales) impregnadas en algún soporte. En virtud de que el ADN no se
encuentra totalmente solo en el núcleo de las células, se aplica una lisis diferencial de tipo iónico, al
adicionarle un detergente, con la finalidad de ir lisando pared celular y diferencial de centrifugación;
esta operación llamada “lavado” se va repartiendo para seguir degradando de manera diferencial
iónica y centrifugación, hasta llegar al núcleo y después ir desgradando a las proteínas provenientes del
núcleo, hasta obtener el ADN de alto peso molecular y pureza, para no afectar el proceso de la PCG
(reacción en cadena de la polimerasa). Para asegurarse de la pureza del ADN se efectuará un lavado
con una solución de cloroformo impregnado con fenol, para eliminar algún resto de proteínas, se
mezcla perfectamente en un mezclador tipo vortex y se separa la fase acuosa. Se adiciona un volumen
igual al de la fase acuosa (que es la útil pues es donde va disuelto el ADN) de etanol absoluto frio el
cual precipita al ADN. El estanol lo desplaza, ya que este es mas soluble en agua que el ADN.
2. Una vez extraído el material genético, se cualifica y cuantifica a través de electroforesis horizontal, que
consiste en preparar una gelatina de un grosor de 0.6 cm y con una superficie de 14 cm de largo por 11
cm de ancho. Otra forma de cuantificar el ADN se efectúa por espectroscopia de luz ultravioleta, para
determinar la pureza y la concentración del material genético.
3. Después de cuantificar, se toman en promedio de 2 a8 nanogramos de ADN para llevar a cabo la
reacción en cadena de la polimerasa. La primera temperatura utilizada es de 90°C, donde la doble
hélice de ADN se separa en dos hebras de ADN; rompiéndose los enlaces de hidrogeno generando dos
cadenas de ADN. Después se somete a una temperatura de 60°C, momento en que los “primers”, cada
base púrica y piridimica, generando a partir de una doble hélice, 2 hélices de ADN; de dos se obtienen
4 y así sucesivamente hasta completar en promedio 30 ciclos, los que generan millones de secuencias
en cuestión.
4. Al final de los ciclos programados, el producto amplificado es sometido a una temperatura final de
72°C, por un periodo de tiempo de 7 minutos con la finalidad de asegurar la unión de las cadenas de
ADN formadas. Los factores que pueden afectar la amplificación son: la pureza del ADN, la
concentración del mismo y la temperatura de amplificación.
5. Al final de la reacción en cadena de la polimerasa, se elabora un gel de agarosa grado PCR al 4%
dependiendo de la muestra y para verificar la presencia de la misma, deberá aplicarse al gel, la llamada
“escalera de peso molecular” para determinar con precisión los productos de PCR. Una vez hecho lo
anterior se determinara el genotipo de cada muestra, lo que puede lograrse utilizando cualesquiera
procedimientos: uno de ellos es por medio de tiras Dot-Blot, que utilizan unas tiras de nylon en donde
se encuentran fijadas covalentemente los oligonucleótidos específicos, en forma de cadena simple
polimórfica posteriormente se les adiciona el complemento, mismo que se distinguirá en color, cuando
se unan, formándose así la doble hélice, que se identificara en forma de un color, generando un punto,
que representa un alelo, 2 alelos forman un genotipo.
