UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO
FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
DOCENTE:
Edgar Huberto Marin Sanchez
INTEGRANTES:
- Angulo Vargas Hugo Enrique
- Aranda Reyes Stefany Yamile
- Barreno Arizola Mayté Alejandra
- Campos Rojas, Nadia Rosely
- Castillo Rojas, Sofía Michell
- Cedrón Madalengoitia, Diana Sofía.
- Cebrian Zarate Jorge Luis
ASIGNATURA:
Genética y embriología
NRC:
8262
TURNO:
Miércoles 8:50 am - 10:40 am
Trujillo, 2024
SEMANA 10
PRUEBA MOLECULAR DE APOYO AL DIAGNÓSTICO:
Reacción en cadena de la Polimerasa: PCR punto final.
Competencias:
❖ Reconoce las implicancias de la técnica de PCR punto final y sus aplicaciones.
❖ Emplea los conocimientos de la técnica del PCR punto final en el diagnóstico
propuesto: Síndrome de Marfan.
Introducción:
Tamay, Ibarra y Velasquillo, 2013 nos comentan:
“La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica
millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los
que la secuencia blanca es copiada fielmente” (p.70)
Los elementos importantes en la reacción son el templado o molde (ADN o ADNc), la
enzima, los oligonucleótidos o primers, los desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs:
adenina, timina, citosina y guanina), el ión magnesio (Mg +), una solución amortiguadora o
buffer y H2O (Tamay, Ibarra y Velasquillo, 2013, p. 71)
Cruz, Larios y Caldera, 2016 en su investigación no dice:
“La PCR punto final se lleva a cabo en tres fases: desnaturalización, hibridación y
elongación”. P. 15
Si, el protocolo aplicado para la PCR punto final, ha sido el correcto; podemos verificarlo
mediante las visualizaciones de amplicones aplicando la técnica de electroforesis, que
mediante la separación de moléculas gracias al campo eléctrico aplicado se visualiza tras
aplicar un colorante fluorescente para su posterior análisis (Tamay, Ibarra y Velasquillo,
2013, p. 73).
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una técnica fundamental para la mayor
parte de las aplicaciones de la biología molecular. Se ha presentado la base teórica y
práctica de la PCR. Existen muchas variantes de la PCR convencional, como son la PCR
en tiempo real o PCR cuantitativa (que permite cuantificar la cantidad de producto
amplificado) o la PCR por transcripción inversa (mediante la cual se obtiene una copia de
DNA complementario, DNAc, utilizando como molde ácido ribonucleico, RNA). Existe gran
cantidad de información referida tanto a la PCR convencional como a sus variantes (Pérez,
A. 2011, p.10)
Desarrollo del caso
(Hipotético).
Se presenta 2 niños de 10 (paciente N°1) y 8 (paciente N°2) años respectivamente, con
clínica típica de Síndrome de Marfan, el médico entre otros estudios de laboratorio pide un
estudio diferencial de PCR punto final para el gen de la fibrilina 1 (FBN1), implicado en
este síndrome; obteniéndose los siguientes resultados:
LEYENDA:
PM: Leader / peso molecular
C (+): control positivo
C (-): control negativo
Ig: inmunoglobulina
P-1: paciente 1
P-2: paciente 2
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es el papel del gen FBN1 en el S. de Marfan y cómo es su expresión
normal?
El gen FBN1 codifica la fibrilina 1, una glicoproteína crucial para la matriz extracelular y
esencial en la formación y función de los tejidos conectivos elásticos y no elásticos.
Ubicado en el cromosoma 15q21.1, FBN1 tiene 65 exones y su expresión normal resulta
en la producción adecuada de fibrilina 1, lo que garantiza la resistencia y elasticidad de los
tejidos conectivos. (1)
En el síndrome de Marfan, las mutaciones en FBN1 alteran la fibrilina 1, comprometiendo
la integridad de los tejidos conectivos y provocando síntomas como la dilatación y ruptura
de la aorta, así como problemas cardiovasculares, esqueléticos y oculares. Estas
mutaciones pueden ser heredadas o surgir de novo.(1)
2. ¿Qué es PCR punto final o convencional?
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction) amplifica
una secuencia de DNA mediante ciclos repetidos de separación de cadenas y replicación
del DNA. Con la PCR cada DNA recién sintetizado se convierte en una molécula molde
para generar más, creando así una reacción en cadena que genera copias de DNA de
manera exponencial.
3. ¿Qué pasos se siguen para hacer un PCR punto final?
1) Desnaturalización: Implica el calentamiento y consecuente separación de las
cadenas de ADN a una temperatura de alrededor de 95 °C durante un período de 20-30
segundos. La duración de esta etapa puede variar según la secuencia del ADN, ya que las
uniones entre las bases G-C, que tienen tres enlaces de hidrógeno, pueden requerir más
tiempo para romperse en comparación con las bases A-T. Además, la velocidad a la que
se aumenta la temperatura depende del modelo del termociclador utilizado. Al final de esta
etapa, las cadenas de ADN estarán completamente separadas y servirán como plantilla
para el siguiente paso.
2) Hibridación: Durante esta etapa, los primers diseñados específicamente se
alinean al extremo 3' del ADN previamente desnaturalizado, emparejándose con su
secuencia complementaria. Para que se forme el complejo templado-primers, es
importante que la temperatura de hibridación o temperatura melting (Tm) sea la óptima;
ésta generalmente oscila entre 50-60 °C. Si el diseño de los primers es el correcto y la
temperatura es la adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo será eficiente.
3) Elongación: En la etapa de extensión, la enzima Taq polimerasa entra en acción
sobre el complejo templado-primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy
rápida; agrega dNTP’s complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La
extensión se produce en la dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5' a 3'. La
temperatura ideal para que la enzima funcione eficazmente es de alrededor de 72 °C. Al
final de este ciclo, se habrán producido los amplicones*, cuyo tamaño dependerá del
número total de pares de bases y que debe ser conocido previamente por el investigador.
Este ciclo se repite de 25 a 35 veces en una reacción de PCR típica, que generalmente
tarda de 2 a 4 horas, según la longitud de la región de ADN que se copia. Si la reacción es
eficiente (funciona bien), puede producir miles de millones de copias a partir de una o unas
cuantas copias de la región blanco.
Al final de la PCR, para saber si la reacción transcurrió eficientemente, los amplicones* son
visualizados a través de una electroforesis en gel, tema de la siguiente pregunta.
*Amplicón – Amplicon: Fragmento de ADN amplificado por la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) o cualquier otro proceso que dé lugar a la producción de diferentes
copias de ese fragmento.
4. ¿Qué es la electroforesis en gel?
La electroforesis en gel es una técnica de laboratorio utilizada para separar y analizar
macromoléculas como ADN, ARN y proteínas en función de su tamaño y carga. En esta
técnica, las moléculas migran en un campo eléctrico, con las cargas negativas (como los
ácidos nucleicos) moviéndose hacia el ánodo (polo positivo) y las cargas positivas hacia el
cátodo (polo negativo). La separación ocurre en una matriz de gel que actúa como filtro
molecular, siendo los geles más comúnmente usados el de agarosa para ácidos nucleicos
y el de poliacrilamida para proteínas y, a veces, para ácidos nucleicos de menor tamaño.
5. ¿Cómo es el proceso de migración del ADN a través del gel?
La electroforesis en gel es una técnica empleada para separar fragmentos de ADN según
su tamaño y carga. Este método implica la aplicación de una corriente eléctrica a través de
un gel que contiene las moléculas de ADN. Dependiendo de su tamaño y carga, las
moléculas se desplazan por el gel en diferentes direcciones y a distintas velocidades, con
lo que se separan unas de otras. Todas las moléculas de ADN tienen la misma cantidad de
carga por masa. Debido a esto, la electroforesis en gel separa los fragmentos de ADN
únicamente por su tamaño. La electroforesis nos permite ver cuántos fragmentos
diferentes de ADN están presentes en una muestra y cuán grandes son unos con respecto
a otros. También podemos determinar el tamaño absoluto de un fragmento de ADN
examinándose junto a una "escala" estándar de fragmentos de tamaño conocido.
6. Según los resultados del PCR punto final ¿Cuál es su interpretación?
Los resultados de la PCR de punto final se obtienen al concluir el ciclo, momento en el
cual se forman las amplificaciones. Estas se visualizan como bandas (mostradas en las
dos últimas columnas para el primer y segundo niño, respectivamente) de un tamaño
específico. Dichas bandas se comparan con un marcador de peso molecular conocido
(visible en la primera columna) para determinar la especificidad de la reacción. En el
primer niño, se obtuvo una banda de 80 x 10³ pares de bases (pb). En el segundo niño, la
banda tenía un tamaño de 230 x 10³ pares de bases (pb). Ambas bandas no se observan
brillantes, lo que sugiere la presencia de una mutación en ambos casos.
7. Explique genéticamente la razón por la cual el niño N° 1 (P-1) obtiene 80 x 103
pb y el niño N° 2 (P-2) obtiene 200 x 103 pb; en el corrido electroforético del PCR
punto final para el gen FBN1.
En el caso del niño N° 1, se observa una amplificación menor debido a que se analizan los
exones de la región codificante del gen FBN1 en busca de mutaciones mediante
secuenciación bidireccional con métodos automatizados que utilizan dideoxinucleótidos
fluorescentes. Además, se detectó un cambio heterocigoto en el nucleótido 6684T>A del
gen FBN1. Este cambio provoca la sustitución de una tirosina por un codón de parada
prematura en la posición 2228 (Y2228X), lo que se clasifica como una mutación sin
sentido.
En el caso del niño N° 2, se amplificaron los exones y partes de los intrones adyacentes
del gen mediante PCR a partir del ADN de pacientes e individuos sanos. Para obtener
buenos resultados, los fragmentos amplificados deben tener aproximadamente 200 pares
de bases. Después de la amplificación, los fragmentos se desnaturalizan, se enfrían y se
someten a electroforesis. Cada molécula de ADN de cadena sencilla adopta una
conformación tridimensional dependiente de su secuencia de nucleótidos. Estas
conformaciones migran a diferentes velocidades durante la electroforesis en gel, por lo que
cada fragmento amplificado mostrará dos bandas después de teñir el gel. Un cambio de un
solo nucleótido causará que los fragmentos adopten una conformación diferente y, por lo
tanto, una movilidad distinta en el gel.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
1. Muñoz J, Saldarriaga-Gil W. Síndrome de Marfan, mutaciones nuevas y
modificadoras del gen FBN1. Scielo scientific. 2014;27. Disponible en:
http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S0121-07932014000200008&script=sci_arttext
2. Cruz, S., Larios, A. y Caldera, U. (2016). Estandarización de la PCR punto final,
para la detección de la mutación JAK2 V617F en pacientes con diagnóstico clínico de
Síndromes Mieloproliferativos Crónicos, atendidos en los servicios de hematología de los
hospitales de referencia nacional en el periodo febrero-octubre 2015(Monografía de
pregrado). Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua. Managua Pérez, A. (2011).
Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR).
3. Tamay , L., Ibarra, C., y Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigación en discapacidad,
2(2), 70-78.
4. Mas E. Poza J. Ciriza J. Zaragoza P. Osta R. Rodellar. C. (2001). Fundamento de la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Universidad de Zaragoza. España.
5. Agarose gel electrophoresis. (s/f). Molecularcloning.com, de
http://www.molecularcloning.com/index.php?prt=20
