UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL
Practica de Laboratorio N° 2:
Asignatura: Ecotoxicología y análisis de riesgo
Docentes:
Dra. TRINIDAD BETTY PAREDES DE GOMEZ
Dra. MARIA OFELIA GUILLEN ZEVALLOS
Alumna:
Caballero Aquepucho Ghimena Ruby
Zegarra Lopez Diana Elizabeth
Kenio Villena Prieto
I. Información general
Las actividades antrópicas generan grandes cantidades de desechos
tóxicos los cuales son liberados en el medio ambiente, de está forma
dichos contaminantes ingresan a los ecosistemas (aire, agua, suelo o
biota). Para poder realizar una evaluación de los efectos potencialmente
perjudiciales de alguna sustancia química sobre la biota es necesario
establecer una relación cuantitativa reproducible sobre la exposición
química y un cierto grado de daño para el organismo o grupo de
organismos bajo estudio.
La preservación de la estructura y el funcionamiento de los ecosistemas,
así como la protección de la salud humana, se fundamenta en la
evaluación del peligro de los productos químicos artificiales, dicha
evaluación se basa principalmente en el uso de pruebas de ecotoxicidad.
El objetivo de estas pruebas es generar información cuantitativa o
cualitativa sobre los efectos no deseados de los xenobióticos para su
regulación, según lo solicitado por numerosas autoridades reguladoras de
todo el mundo, para estimar concentraciones aceptables de contaminantes
en el agua y los alimentos, para establecer límites de exposición
permisibles para los trabajadores, y para proteger la biota. (Peluso, n.d.)
Los bioensayos resultan ser técnicas de suma importancia en el estudio de
las interacciones entre organismos y sustancias cuya finalidad radica en la
identificación del gradiente de concentración necesario para observar
algún efecto entre ambos incluyendo la muerte del organismo empleado.
La mayoría de datos toxicológicos ambientales actuales provienen de
ensayos de laboratorio controlados y generalmente involucran productos
químicos individuales y poblaciones muy pequeñas de organismos de
prueba.
Objetivos del experimento
Objetivo General
Estudiar y determinar la concentración letal media de dos detergentes domésticos
por medio de bioensayos toxicológicos utilizando organismos del género Daphnia.
Objetivo específico
- Determinar el porcentaje de mortalidad de Daphnia Magna de acuerdo a la exposición
de cada detergente y a la dosificación
- Determinar la estimación de la dosificación media por el método Probit.
- Analizar los resultados del bioensayo, mediante un gráfico para seguir cambios a través del
tiempo.
II. MARCO TEÓRICO
3.1. Bioensayos
Se presentan 21 ensayos con organismos de agua dulce, agua marina y de suelo; así
como también se presentan ocho procedimientos que son complementarios gracias a
diversos métodos que tienen como finalidad el facilitar los ensayos.
Para la selección de las pruebas biológicas en laboratorio para una evaluación
ecotoxicológica se necesitan diversos criterios.
Tabla 1: Criterios para la selección de pruebas biológicas en laboratorio para la
evaluación toxicológica de sustancias químicas
Criterios
Factibilidad - Bajo costo.
- Materiales y reactivos disponibles en la localidad.
- Tiempo máximo de desarrollo, 5 días.
- Procedimiento de prueba simple.
- Facilidad en la evaluación de la respuesta a medir
De los - Fácil obtención (cepario).
organismos - Fácil mantenimiento.
- Representatividad ecológica:
De un grupo funcional (productores primarios,
herbívoros, carnívoros, descomponedores).
De un grupo taxonómico (bacterias, peces, insectos,
etc.)
De una ruta de exposición (dérmica, ingestión,
branquial, combinadas, etc.)
- Con información sobre su sensibilidad a compuestos
tóxicos (base de datos).
- Estadio más sensible.
- Respuesta relevante a los compuestos tóxicos.
- Sensibilidad a bajas concentraciones.
- Sensibilidad a una amplia variedad de compuestos
tóxicos.
- Sensibilidad no redundante con otras especies.
- Con información sobre su biología
De la prueba - Condiciones presentes en los ecosistemas mexicanos
(temperatura, salinidad, dureza, etc.)
- Concentraciones químicas reales (que se presenten en el
medio ambiente)
- Técnicamente seguros y no contaminantes Posibilidad de
ser estandarizada.
- Buena exactitud y precisión analíticas.
- Aplicación universal (usos, ventajas y limitaciones)
- Significado ecológico de los resultados.
- Buenas prácticas de laboratorio.
Validación de la salud de los organismos de prueba.
Requerimientos mínimos de sobrevivencia
/reproducción en pruebas y testigos.
Edades o etapas de vida requeridos al inicio de la
prueba.
Comprobación de concentraciones nominales.
Podemos clasificar a los bioensayos de acuerdo a su reproductibilidad:
1. Ensayos Intercalibrados (IC).
2. Ensayos de Amplia Experiencia (AE).
3. Ensayos con Experiencia (E).
Para cada uno de los ensayos presentados se requiere la descripción de los siguientes puntos:
- Principio de la prueba Material, reactivos y equipo necesarios.
- Características de los organismos de prueba, incluyendo su obtención, cultivo
y condiciones de mantenimiento.
- Procedimiento de la prueba, incluyendo la obtención y expresión de los
resultados.
- Cuadro resumen del procedimiento de prueba.
3.2. Toxicidad
Los detergentes están compuestos de benceno sulfonato de sodio, sulfonatos de alquilbencenos lineales
(LAS). Otros son compuestos de alquilbenceno sulfatos de cadena ramificada (ABS).
Los LAS son de uso común debido a su bajo costo y fácil biodegradable. Los datos de toxicidad de
LAS para organismos acuáticos oscilan entre 1 a 10 mg por litro.
La toxicidad de los detergentes del tipo LAS varía ampliamente en invertebrados -1 acuáticos
(1-100 mg·L ) (Faba & Crotti 1979, Sivak et al. 1982). Además, este xenobiótico en vertebrados,
como en algunos peces, provoca el aumento de la permeabilidad en las branquias modificando los
procesos respiratorios (Cabridenc 1979, Katz 1979, Mason 1981).
3.3. Daphnia
Las Daphnias son crustáceos planctónicos diminutos, con una longitud que oscila entre 5 a 6 mm
para las hembras y de 1 a 3 mm para los machos. Debido a su peculiar estilo de natación, que se
asemeja a pequeños saltos en el agua, se les conoce comúnmente como pulgas de agua. Tiene una
especie de caparazón quitinoso, del que emerge una cabeza de ojos compuestos, el macho no tiene
bolsa incubadora.
Figura 1. Daphnia sp.
3.4. Características de la Daphnia
3.4.1. Taxonomía
Tabla 2: Taxonomía de la Daphnia sp.
Nombre común Pulga de Agua
Reino Animalia
Phylum Arthropoda
Subphylum Crustacea
Clase Branchiopoda
Orden Cladocera
Familia Daphniidae
Nombre científico (género y Daphnia sp.
especie)
3.4.2. Morfología
Los Daphnia son microcrustáceos que pertenecen a su propio género. La
disponibilidad de alimento en su entorno tiene una relación directa con su
tamaño; en ambientes con escasez de nutrientes, las hembras suelen tener
descendientes de tamaño relativamente grande, pero en menor cantidad, a
diferencia de lo que ocurre en ambientes ricos en nutrientes.
Estos organismos tienen el cuerpo dividido en tres regiones: céfalon, péreion y
pleon, aunque esta segmentación no es muy evidente. El céfalon está
compuesto por seis metámeros que tienden a fusionarse para formar un
caparazón bivalvo lateralmente comprimido que cubre el resto del cuerpo y se
extiende hacia atrás en una espina caudal. El caparazón no cubre el céfalon,
que está protegido por un escudo cefálico.
Daphnia sp. posee un cuerpo lateralmente aplanado, con una segmentación
muy limitada, protegido por un caparazón bivalvo que no tiene una zona de
unión. Este caparazón cubre todo el cuerpo del organismo, excepto el céfalon.
El céfalon es muy prominente y en él se pueden distinguir un par de ojos
compuestos, una antena bifurcada de gran tamaño (que queda fuera del
caparazón), y una zona anterior conocida como rostro.
Por otro lado, el pereión y el pleon están fusionados y forman un tronco con
cuatro o seis pares de apéndices (pereiópodos) en la parte anterior. Este tronco
termina en un postabdomen doblado con ramas caudales en forma de gancho.
Los apéndices del tronco son generalmente filopodiales.
El caparazón actúa como cámara incubadora, por lo que es común encontrar
embriones en su interior.
Figura 2: Morfología de Daphnia sp.
3.4.3. Ciclo de vida
La vida útil de una Daphnia no supera los 120 días en condiciones óptimas de
temperatura. Por ejemplo, estos organismos pueden vivir hasta 108 días a una
temperatura de 30 °C, mientras que algunos sólo sobreviven 29 días a 28 °C.
Durante el verano, pueden vivir varias semanas, y en ausencia de
depredadores, su vida útil puede extenderse hasta cien días.
El ciclo de vida de una Daphnia se desarrolla completamente dentro de la
cámara de cría de la madre. La etapa juvenil consta de entre cuatro y cinco
estadios. La adolescencia es breve y varía entre uno o dos estadios; es en este
periodo donde se desarrolla la primera camada de huevos dentro del ovario. La
etapa adulta, en cambio, presenta un mayor número de estadios. El inicio de la
función reproductiva marca el comienzo de esta última etapa.
3.4.4. Parámetros ambientales
- Temperatura: 10 - 30 °C
- Nivel de nitrógeno hasta 20 mg/L.
- pH básico, lo ideal es de 8.4
- Calidad de luz: 800 luxes
- Fotoperiodo: 16 horas luz: 8 horas oscuridad
- Densidad poblacional: No mayor de 12 individuos/L.
3.5. Usos en investigación de la Daphnia
El género Daphnia es de las más usadas para realizar pruebas de toxicidad, debido a
factores como su amplia distribución geográfica y su papel clave en la comunidad
zooplanctónica, la facilidad con la que puede ser cultivada en laboratorio y su tipo de
reproducción que es partenogenética, lo que significa una uniformidad de respuesta, y
como último factor el corto ciclo de vida con la producción de un alto número de
crías, han hecho de este grupo un ideal para la evaluación de toxicidad, a nivel
universal. (Romero, 2008)
3.6. Método gráfico de probit
El método probit, es un método estadístico paramétrico conocido como el “probit
análisis”. Informa de las estimaciones de los valores efectivos para las diferentes tasas
de respuesta (incluyendo la dosis efectiva para la mediana),
En este tipo de análisis los datos de mortalidad son transformados a unidades probit
utilizando un análisis gráfico. En este método se asume una curva dosis respuesta
simétrica.
Al término de un ensayo de toxicidad aguda se obtienen distintos niveles de un efecto
tóxico determinando (mortalidad, inmovilidad, inhibición del crecimiento de
población, entre otros.) Expresados en función de las diferentes concentraciones de la
sustancia ensayada. Es necesario disponer de métodos estadísticos adecuados para
estimar un valor único, o un grupo limitado de ellos, que represente el conjunto de
datos obtenidos. En general, este valor es la CL50 o DL50.
III. MATERIALES
Materiales de laboratorio
● Vaso de precipitados
● Instrumento para la manipulación de la Daphnia
● Pipeta Gravimétrica
● Fiola
● Bagueta
Equipos
● Balanza analitica
Material biológico
● 2 porciones de Daphnia
Reactivos
● Tensoactivos ()
● 1 L de Agua destilada
● Agua de mar
IV. PROCEDIMIENTO
1. Adquisición de organismo adultos de Artemia Salina que son trasladados al
laboratorio en dos recipientes de vidrio con la finalidad de no saturar ni
estresar a los organismos.
2. Se hace la selección de los organismos con un tamaño aproximadamente de 15
a 20 mm que no estén dañados (fragmentados, con coloración y poco
movimiento)
3. Para la preparación de los bioensayos se utilizan 1 testigo y 5 concentraciones
nominales.
4. Para ambos detergentes (PATITO Y ARIEL) se prepara una solución madre al
0.3% (3g) del producto en 1L de agua destilada.
5. Se añade agua de mar a cada vaso precipitado hasta un volumen de 200 ml.
6. Seguidamente, se procede a colorar 15 organismos de Artemia Salina en cada
vaso de precipitado (0.5 L de capacidad de agua), tomados al azar, empleando
un total de 180 organismos.
7. Se observa los microorganismo por un periodo de 24 horas, en cada cámara de
bioensayo
8. Se realizan las lecturas de mortalidad cada 30 minutos de la exposición
9. Al término del periodo de observación se cuentan los organismos de Artemia
Salina L. que sobreviven de la siguiente manera:
- Los organismos que presentan movimiento, aunque este sea mínimo,
se consideran vivos.
- Los organismos que presenten una coloración pálida, hinchados y que
yacen inmóviles en la superficie se consideran muertos.
10. Tan pronto se detectan los organismo muertos, estos tienen que ser retirados.
V. RESULTADOS
7.1 Determinación del DL50 - Detergente (PATITO)
- Siendo n el número de daphnias utilizadas en cada repetición
- Mientras que m es el número de daphnias muertas en cada repetición.
A. Cálculo del DL50
Tabla 1. Resultados experimentales de la prueba de toxicidad
Repeticiones del experimento Total de Total de Porcentaje de
Daphnias Daphnias mortalidad (%)
muertas
1 2 3 4 5
Concentra
ción de 𝑛1 𝑚1 𝑛2 𝑚2 𝑛3 𝑚3 𝑛4 𝑚4 𝑛5 𝑚5 ∑𝑚 𝑖
∑ 𝑛𝑖 ∑ 𝑚𝑖 𝑝1 =
detergente ∑𝑛 𝑖
(PATITO)
15 0 15 0 15 2 13 3 10 3 68 8 12
B. Método del Gráfico - Pendiente : Cálculo DL50
Gráfica 1. Tiempo por mortalidad en el ace Patito
Interpretación: En la gráfica 1 se evidencia que el detergente deja como saldo Daphnias muertas, tras
seguir prolongando el tiempo de exposición. En la repetición 1 en un inicio había 15 vivas y 0 muertas,
luego en la repetición 5 había 10 vivas y 3 muertas.
7.2. Determinación del DL50 - Detergente (ARIEL)
A. Cálculo del DL50
Tabla 1. Resultados experimentales de la prueba de toxicidad
Repeticiones del experimento Total de Total de Porcentaje de
Daphnias Daphnias mortalidad
muertas
1 2 3 4 5
Concentra 𝑛1 𝑚1 𝑛2 𝑚2 𝑛3 𝑚3 𝑛4 𝑚4 𝑛5 𝑚5 ∑𝑚 𝑖
ción de ∑ 𝑛𝑖 ∑ 𝑚𝑖 𝑝1 =
detergente ∑𝑛 𝑖
(ARIEL)
0-60 MIN 15 0 15 0 13 2 12 3 11 4 100 50
60-135MI 9 6 7 8 7 8 6 9 5 10
N
B. Método del Gráfico - Pendiente : Cálculo DL50
Gráfica 2. Tiempo por Mortalidad (Detergente - ARIEL)
INTERPRETACIÓN: Segun el coeficiente de correlacion,concentacion de Ariel, pH,
tienen mucha relacion con el porcentaje de mortandad, denotando tambien que la
dafnia tiene poc resistencia a ls detergentes, siendo que parte de la poblacion total
sobrevivió a dicho ´´ambiente´´ , es decir pudieron adaptarse.
VI CUESTIONARIO
7.1 Describa el comportamiento de la daphnia en función del tiempo de exposición hacia el
contaminante
El detergente Patito tras las repeticiones que se fueron dando en determinados horarios, se
concluyó que el porcentaje de mortalidad es de 12% en una concentración de 3 gramos en un litro
de agua destilada, por lo que se comprueba que este detergente si afecta a la especie. Al igual que
este, Ariel ha dejado a Dahnias inmóviles y/o muertas, ambos detergentes tienen LAS pero debe
haber algo más en su fórmula que causó una variación de Daphnias muertas diferente.
7.2 Indique los campos de aplicación de las pruebas de toxicidad
Las pruebas de toxicidad se utilizan en diversos campos para evaluar los efectos nocivos de sustancias
químicas o productos en organismos vivos. Algunos de los campos de aplicación de las pruebas de
toxicidad son:
● Farmacología y medicina: Las pruebas de toxicidad se realizan en medicamentos y productos
farmacéuticos para evaluar su seguridad y determinar posibles efectos adversos en humanos y
animales.
● Cosméticos y productos de cuidado personal: Se llevan a cabo pruebas de toxicidad en productos
como cremas, champús, maquillaje, entre otros, para garantizar que no causen daño a la piel, ojos
u otros órganos.
● Alimentos y aditivos alimentarios: Las pruebas de toxicidad se realizan en alimentos y aditivos
para evaluar su seguridad y determinar posibles efectos adversos en la salud humana.
● Medio ambiente: Se utilizan pruebas de toxicidad para evaluar el impacto de sustancias químicas
en el medio ambiente, como en el agua, suelo y aire, y determinar su toxicidad para los
organismos acuáticos, plantas y animales.
● Industria química: Las pruebas de toxicidad se llevan a cabo en productos químicos industriales
para evaluar su seguridad y determinar posibles efectos adversos en los trabajadores y el medio
ambiente.
● Investigación científica: Las pruebas de toxicidad se utilizan en la investigación científica para
estudiar los efectos de sustancias químicas en diferentes sistemas biológicos y comprender mejor
los mecanismos de toxicidad.
7.3 Describe otro método para determinar el DL50
El DL50 (dosis letal 50) es una medida utilizada para determinar la dosis de una sustancia que causa la
muerte en el 50% de los organismos expuestos. Aunque tradicionalmente se han utilizado pruebas en
animales para determinar el DL50, en los últimos años se han desarrollado métodos alternativos que
buscan reducir o eliminar el uso de animales en estas pruebas.
Uno de los métodos alternativos para determinar el DL50 es el uso de modelos in silico o modelos
computacionales. Estos modelos se basan en algoritmos y datos recopilados de estudios previos para
predecir la toxicidad de una sustancia en función de su estructura química y otras propiedades. Estos
modelos pueden ser utilizados para estimar la DL50 de una sustancia sin la necesidad de realizar pruebas
en animales.
Otro método alternativo es el uso de cultivos celulares y tejidos en lugar de animales vivos. Los cultivos
celulares son células aisladas que se cultivan en el laboratorio y se exponen a diferentes concentraciones
de una sustancia para determinar su toxicidad. Los tejidos también pueden ser utilizados para evaluar la
toxicidad de una sustancia, ya sea mediante el uso de tejidos humanos o tejidos de animales sacrificados.
Además, se están desarrollando técnicas de biología molecular y genómica que permiten evaluar los
efectos de una sustancia a nivel molecular y genético. Estas técnicas pueden proporcionar información
sobre los mecanismos de toxicidad de una sustancia y ayudar a predecir su DL50.
7.4 Cuales son los efectos de los detergentes en la salud al ser humano y al medio ambiente
Los detergentes son productos químicos utilizados comúnmente en la limpieza y lavado de ropa,
utensilios y superficies. Si bien son eficaces para eliminar la suciedad, es importante tener en cuenta que
pueden tener efectos tanto en la salud humana como en el medio ambiente. A continuación, se describen
algunos de estos efectos:
Efectos en la salud humana:
1. Irritación de la piel y los ojos: Algunos detergentes pueden causar irritación en la piel y los ojos,
especialmente en personas con piel sensible o condiciones preexistentes.
2. Problemas respiratorios: Algunos detergentes contienen compuestos volátiles que pueden
liberarse al aire y causar irritación respiratoria, especialmente en personas con asma u otras
afecciones respiratorias.
3. Reacciones alérgicas: Algunas personas pueden desarrollar alergias a ciertos ingredientes
presentes en los detergentes, como fragancias o conservantes, lo que puede provocar erupciones
cutáneas, picazón o dificultad para respirar.
4. Contaminación química: Si los detergentes no se eliminan adecuadamente, pueden contaminar el
agua potable y los cuerpos de agua, lo que puede tener efectos negativos en la salud humana si se
ingieren o se utilizan para el riego de cultivos.
Efectos en el medio ambiente:
1. Contaminación del agua: Los detergentes pueden contener fosfatos y surfactantes que, cuando se
liberan en el agua, pueden causar eutrofización, un proceso en el que se produce un crecimiento
excesivo de algas y plantas acuáticas, agotando el oxígeno y afectando la vida acuática.
2. Toxicidad para la vida acuática: Algunos ingredientes presentes en los detergentes, como los
surfactantes, pueden ser tóxicos para los organismos acuáticos, afectando su reproducción,
desarrollo y supervivencia.
3. Bioacumulación: Algunos componentes de los detergentes pueden acumularse en los tejidos de
los organismos acuáticos a lo largo del tiempo, lo que puede tener efectos negativos en la cadena
alimentaria y en los organismos que se alimentan de ellos, incluyendo a los seres humanos.
V CONCLUSIONES
● En el caso del detergente Ariel, hubo una tasa de mortandad del 83% queriendo decir que
hubieron dafnias que se adaptaron al medio y condiciones de pH del detergente.
● El presente experimento nos demostró que las pruebas de toxicidad son importantes para la
evaluación de riesgos generados por diversas sustancias químicas.
VI BIBLIOGRAFÍA
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