Microscopía
Ing. PhD. Lina Patricia Vega Garzón
Temas
● Microscopia óptica
● Microscopia de campo oscuro
● Microscopia de contraste de fases
● Microscopia de fluorescencia
● Microscopia electrónica
01
Observando los
microorganismos
en el microscopio
Magnificación en los microscopios
Magnificación en los microscopios
La magnificación total de un espécimen se halla multiplicando la
magnificación de los lentes objetivo (potencia) por la magnificación
del lente ocular
● Lentes objetivo: 10x (baja potencia), 40x (alta) y 100x
(inmersión en aceite)
● Lentes oculares: generalmente 10x
Multiplicando la magnificación del lente objetivo por la del ocular la
magnificación sería:
● 100 x (baja potencia)
● 400x (alta potencia)
● 1000 x (Inmersión en aceite)
[Link]
BfsFyWWMGYCZdbEfp2_w0RSCj0gV7X&index=30
Resolución en los microscopios
La resolución es la habilidad de los microscopios de
distinguir pequeños detalles y estructuras. En
especial se refiere a la habilidad de los lentes de
distinguir dos puntos que están cierta distancia
aparte
Por ejemplo, si un microscopio tiene una resolución
de 0,4 nm, puede distinguir dos puntos que están al
menos 0,4 nm aparte
A menos longitud de onda de la luz utilizada, mayor
resolución
En los microscopios ópticos se usa luz blanca, con
una longitud de onda alta, y la resolución no es La resolución del microscopio de
mayor a los 0,2 µm Van Leeuwenhoek era de 1 µm
Resolución en los microscopios
Para obtener imágenes detalladas bajo un microscopio óptico compuesto,
los especímenes deben tener contraste con el medio. Se debe cambiar el
índice de refracción del espécimen, respecto del medio
Se cambia el índice refractivo de los especímenes coloreándolos
Una vez hecha la tinción, el espécimen y su medio, tienen índices refractivos
distintos
Al pasar la luz a través de los dos materiales, los rayos cambian de dirección,
lo que aumenta el contraste
Para que haya alta magnificación con buena resolución, los lentes deben ser
pequeños. Y para conservar los rayos de luz en la dirección correcta , se usa
aceite de inmersión entre la placa de vidrio y el lente objetivo de aceite de
inmersión. Su efecto es como si se incrementara el diámetro del lente
objetivo
02
El microscopio
óptico
El microscopio óptico
El microscopio óptico
● El microscopio óptico compuesto, tiene varios lentes y utiliza la luz como
fuente de iluminación
● La luz proveniente del iluminador, pasa a través de un condensador, que
tiene lentes que direccionan los rayos de luz a través del espécimen
● De aquí, los rayos pasan a los lentes objetivo, que son los que están mas
cercanos al espécimen
● Esta imagen a su vez es magnificada nuevamente por los lentes oculares
[Link]
Uo2fHZaZCU
El microscopio óptico con lentes de inmersión
Se usa para
magnificaciones mayores a
900x
[Link]
PWAMXK92Jo
03
Otros
microscopios
Microscopía de
contraste de fases
Permite ver mejor microorganismos vivos
Se definen más las estructuras internas
No se necesita fijar los microorganismos o
colorearlos
Una serie de rayos vienen de la fuente, y otra de
la luz refractada o difractada de una estructura
del espécimen
iliate (Oxytricha saprobia?) in brightfield (left) and
with phase contrast illumination (right)
[Link] Gregor T. Overney, California, USA
tJd0
Microscopía de campo oscuro
Sirve para ver microorganismos vivos
Para aquellos que no pueden verse con el microscopio
normal, no se pueden teñir o no es bueno teñirlos
Usa un condensador de campo oscuro que tiene un
disco opaco. Este disco bloquea la luz, y solo la luz que
viene directamente del espécimen es transimitida.
Asi el espécimen aparece con luz contra un fondo
oscuro.
[Link]
ch?v=R99T08FjTkc
Comparación de microscopios
Microscopia de fluorescencia
Sustancias que absorben longitudes de
onda cortas (UV) y laS reflejan a una
longitud de onda mas alta (fluorescencia)
Algunos microrganismos fluorescen normalmente bajo
la luz UV. Otros deben ser teñidos con floro cromos
Su uso principal es la
Fuente de luz UV técnica de anticuerpo
Los objetos parecen como brillantes contra un fondo fluorescente o
oscuro inmunofluroescencia
Por ejemplo el Mycbecterium tuberculosis con el
fluorocromo auramina O, que brilla amarillo cuando se (anticuerpos combinados
expone a la luz UV: organismos amarillos contra un con flurocromo)
fondo oscuro
Inmunofluroescencia
Microscopia electrónica
Microorganismos menores a 0,2 µm como
los virus, o las estructuras internas de
las células, se deben observar con un
microscopio electrónico ● Un rayo de electrones se usa en vez de
luz, La resolución es mucho mayor que
los ópticos
● Debido a que los electrones tienen
una longitud de onda mucho menor
(100,000 veces menor)
● Imágenes en blanco y negro
● Usa lentes electromagnéticos para
focalizar los electrones
[Link]
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE
TRANSMISION
Un rayo bien focalizado de
electrones pasa por una sección
ultradelgada del espécimen. El rayo
se focaliza sobre un área especifica
mediante un condensador
electromagnético
El rayo pasa por el espécimen, y
después por un lente objetivo
electromagnético que magnifica la
imagen. Luego los electrones se
proyectan a un lente proyector
electromagnético y de ahí a una
pantalla
MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN
Microscopía electrónica de barrido
● No necesita seccionar los especímenes como en
el microscopio de transmisión
● Genera imágenes en 3D de los especímenes
● Una pistola de electrones produce un rayo de e-
que es el rayo primario.
● Estos electrones pasan a través de los lentes
electromagnéticos se dirigen a la superficie del
espécimen
● Al golpear la superficie del espécimen, se
producen electrones secundarios que van a un
colector de electrones, se amplifican y generan
una imagen en una pantalla o una placa
fotográfica
[Link]
04
Preparación de
muestras
Preparación de muestras para microscopia óptica
● Se tiñen los especímenes para que sean visibles
● Primero deben fijarse en la placa
● Se esparce una pequeña capa del material que
contiene los microrganismos (Frotis)
● Se deja secar al aire
● Se pasa la placa por el mechero de Bunsen o se
cubre con metanol por un minuto
● Se aplica el colorante, se lava con agua y se seca
● Los colorantes son sales que tienen un ión Básicos: Se atraen
positivo y uno negativo, uno de los cuales
coloreado y se llama el cromóforo con la carga negativa
● Colorantes básicos: en el catión de las bacterias –
● Colorantes ácidos: en el anión
● Bacterias están cargadas negativamente
ligeramente a pH 7
Tinción negativa
● Colorantes ácidos
● No atraen las bacterias que están
cargadas negativamente
● Colorean el fondo
● Sirven para ver formas, tamaños, etc.
TINCION SIMPLE
Permite ver la forma general y
estructuras internas
Se usa un colorante en solución
alcohólica
Se tiñe un frotis y luego se lava
A veces se usa otro químico para
aumentar el color, que se llama un
mordiente
Algunos colorantes simples son el
azul de metileno, carbolfucsina,
safranina y cristal violeta
[Link]
TINCION DIFERENCIADA
Colorea de forma diferente
diferentes tipos de bacterias,
entonces sirve para clasificarlas
Comunes: Tinción Gram y Tinción
acida rápida
Por qué se colorean diferente las
bacterias gram postivas de las
gram negativas?
Lee la siguiente
diapositiva y
concluye
Por que se colorean diferente las bacterias gram postivas de las gram
negativas?
[Link]
Tinción rápida ácida
El colorante se fija fuertemente a bacterias que tienen una material
ceroso en sus paredes celulares
Sirve para distinguir las bacterias del genero Mycobacterium,
incluida la Mycobacterium tuberculosis y la Mycobacterium leprae, así
como las del genero Nocardia
● El colorante carbolfucsina se aplica a un frotis seco, se calienta
por varios minutos, luego se lava con agua. Se trata con un
alcohol-acido o decolorante, que remueve el colorante de las
que no son rápidas acidas. Luego se utiliza azul de metileno
● Las bacterias acido-rápido aparecen azules
[Link]
Lee y concluye cual es el
principio de la tinción
ácido rapida o de Ziehl-
Neelsen
[Link]
Actividad 1
Club de revista
Lee el capítulo 2
del libro: How did Preguntas
we find out about 1. En que consistieron los experimentos de Redi, y para
germs? De Isaac que sirvieron?
Asimov 2. El experimento de Needham estuvo bien realizado? Por
qué?
3. Por qué las personas no creyeron en la teoría
propuesta por Spallanzani?
4. Como mostró Pasteur que los microorganismos no
venían de algún químico en el aire?
5. Podrías crear un dispositivo para evitar por ejemplo,
que el COVID entrara a un sitio, con base en los
experimentos de Pasteur?
Actividad 2.
Práctica de
laboratorio 2.
Microscopia
Gracias!
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