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Facultad de Ingeniería Versión: 01
Ambiental
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Biología
PRÁCTICA SEMANA 9
OBSERVACIÓN DE BACTERIAS, FORMAS Y CLASIFICACIÓN
I. INTRODUCCIÓN
Una de las características más importante de las bacterias es su morfología, definida
por el tamaño, la forma, el arreglo y la estructura. Existen bacterias en forma
redondeada denominadas cocos, en forma cilíndrica, denominadas bacilos y una
tercera morfología como son las que tienen forma de espirales, denominadas espirilos.
A su vez cada categoría puede subclasificarse con base a diferentes arreglos. Estas
características pueden determinarse examinando muestras al microscopio. Las células
no teñidas son prácticamente transparentes, pero pueden observarse al microscopio de
luz haciendo preparaciones entre lámina y laminilla o con microscopios especiales como
por ejemplo: de contraste de fases o de campo oscuro. Cuando se dispone de un
microscopio de luz, se pueden teñir las bacterias para facilitar su visualización. Si se
tiñe una muestra del cultivo extendida y fijada en una lámina portaobjeto con un
colorante dado, las células adquirirán el color del colorante añadido y podrá observarse
la forma, tamaño y el arreglo de las mismas. Este tipo de coloración se conoce con el
nombre de coloración simple.
Para obtener mayor información sobre la morfología y composición química de las
bacterias, debe recurrirse a tinciones diferenciales que involucran el uso de varios
reactivos y éstas pueden diferenciarse con base al color que retienen. Ej. Tinción de
Gram y Tinción de Ziehl Neelsen.
PREPARACIÓN ENTRE LÁMINA Y LAMINILLA
Este tipo de preparación permite observar vivos a los microorganismos y resulta muy útil
cuando se quiere determinar su motilidad. Estas preparaciones son muy fáciles de
realizar, pues sólo se coloca sobre la lámina portaobjeto la suspensión de
microorganismos a observar y luego ésta se cubre con una laminilla. Entre los
principales inconvenientes que tiene esta preparación, es que al no estar los
microorganismos teñidos, se dificulta su observación al microscopio y se puede
confundir el movimiento microbiano con las corrientes internas que se producen a causa
de la evaporación del medio a través del borde de la laminilla.
COLORACION SIMPLE
Las tinciones se basan en la utilización de colorantes que pueden clasificarse como
naturales o sintéticos. Los naturales se utilizan principalmente con fines histológicos. La
mayor parte de los colorantes que se utilizan para teñir bacterias son sintéticos, muchos
de ellos son las anilinas y los derivados del benceno. Se habla de coloración simple
cuando una muestra extendida se tiñe con un solo colorante. Si la preparación se tiñe
con safranina, las bacterias adquirirían un color rojo, si se utiliza azul de metileno, se
teñirán de azul, si por el contrario se tiñen con cristal violeta, las bacterias aparecerán
teñidas de color violeta, es decir adquirirán el color del único colorante que se utilizó.
Este procedimiento permite distinguir la morfología y estructuras internas de la célula
bacteriana, como por ejemplo, la presencia de endospora bacteriana. Existen
coloraciones especiales que permiten poner de manifiesto estructuras bacterianas como
por ejemplo: flagelo, cápsula, endosporas, etc.
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TINCION DE GRAM
En 1884, un bacteriólogo danés, Christian Gram, desarrolló una técnica de tinción que
permite separar a las bacterias en dos grandes grupos: gram positivas y gram
negativas, basados en si retienen o no, el colorante primario (cristal violeta) luego del
proceso de decoloración. Los organismos que retienen el cristal violeta luego de la
adición del agente decolorante, el alcohol, aparecen como azul oscuro o violeta, y se
designan como gram positivos; aquellos que pierden el cristal violeta y se tiñen con el
colorante secundario, la safranina, aparecen como rojos y se designan como gram
negativos. Un examen minucioso de un extendido bacteriano teñido diferencialmente,
provee una información muy importante sobre la caracterización morfológica e
identificación de la muestra. Por ejemplo, una reacción positiva o negativa a la Tinción
de Gram es sumamente importante como medio primario de clasificación.
El procedimiento puede resumirse de la siguiente manera: una vez que la preparación
ha sido fijada a la lámina portaobjeto, se añade el colorante cristal violeta, el cual se
deja en contacto por 1 minuto y las células se tiñen de color violeta, posteriormente se
lava el exceso de colorante con agua destilada, luego se añade la solución de lugol, que
actúa como mordiente, y se deja en contacto por un 1 minuto. El yodo se combina con
el cristal violeta y forma un compuesto que precipita en el interior de la célula; este
complejo puede extraerse fácilmente con alcohol etílico de las gram negativas, pero no
se remueve fácilmente de las gram positivas. Una vez realizada la decoloración se
añade el colorante de contraste, la safranina, la cual se deja en contacto por 30
segundos; el exceso de colorante se elimina con agua destilada. Las láminas así
preparadas se secan a temperatura ambiente o con la ayuda de toallas absorbentes.
Este procedimiento se esquematiza en la siguiente figura:
El por qué las bacterias gram positivas retienen el complejo cristal violeta-yodo y las
gram negativas no, ha sido un tema muy controversial. Una de las explicaciones que se
dan, está relacionada con la naturaleza química de la pared celular de las bacterias
gram positivas que previenen la remoción del complejo con el alcohol. Otra teoría
mantiene que la gruesa envoltura celular de las gram positivas, específicamente la capa
gruesa de peptidoglucano, se deshidrata y al encogerse por el efecto del alcohol,
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ocasiona el cierre de los poros lo cual impide la salida del complejo cristal violeta-lugol.
En definitiva, la pared celular es la barrera para la decoloración. Si se altera la pared
celular de las bacterias gram positivas se transforman en gram negativas.
II. OBJETIVOS
Identificar distintas formas y agrupaciones bacterianas.
Emplear técnicas de tinción para la detección de microorganismos
III. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
Violeta de genciana
Sol. de Lugol
Agente decolorante:
Alcohol 95°
Colorante de contraste Safranina
IV. DESARROLLO EXPERIMENTAL
PREPARACIÓN DE LAS LÁMINAS
Para realizar una coloración, ya sea simple o diferencial, es necesario como primer paso,
preparar el extendido de la muestra sobre la lámina portaobjeto y fijarlo, para
posteriormente añadir el o los colorantes y observar la muestra teñida bajo el microscopio
de luz.
PREPARACIÓN DEL EXTENDIDO
1. Colocar en cada una de las láminas limpias, secas y desgrasadas, una gota de
solución salina utilizando el asa de platino previamente esterilizada.
2. Tomar asépticamente con el filamento una pequeña muestra del cultivo sólido
suministrado por el profesor y mezclar con la gota de solución salina para obtener una
suspensión. También puede utilizarse un cultivo líquido, en dicho caso, la muestra se
toma con el asa de platino y no es necesario colocar la gota de solución salina.
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3. Extender la suspensión con el asa de platino previamente esterilizada y enfriada.
4. Dejar secar la lámina a temperatura ambiente.
5. Fijar la muestra extendida a la lámina utilizando calor.
6. Esto se logra pasando la lámina varias veces por la llama del mechero (máximo 3
veces). La lámina no debe calentarse mucho y ello se verifica tocando suavemente
el dorso de la mano con lámina. El operador debe soportar el calor, sin quemarse.
TINCIÓN DE GRAM
1. Colocar las láminas extendidas y fijadas en una bandeja adecuada y cubrir su superficie
con violeta de genciana por un minuto. Lavar con agua destilada y escurrir.
2. Cubrir la superficie de la lámina con la solución de lugol por un minuto. Lavar con agua
destilada y escurrir.
3. Colocar cada una de las láminas en posición inclinada y decolorarlas con alcohol a 95°
hasta que el color libre deje de salir (aproximadamente 10-20 segundos). Lavar con agua
destilada y escurrir.
Este es el paso más importante de la coloración ya que una excesiva adición del alcohol
permite la salida del colorante primario de las células gram positivas.
4. Cubrir las láminas con safranina por 30 segundos. Lavar con agua destilada y escurrir.
5. Secar las láminas utilizando papel absorbente.
OBSERVACIÓN BAJO EL MICROSCOPIO DE LUZ
1. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre las láminas teñidas y secas y
examinarlas bajo un microscopio de luz, utilizando el objetivo de inmersión. (90X-100X).
2. Observar varios campos hasta encontrar aquél, donde las células están adecuadamente
separadas para permitir la visualización de la morfología, arreglo de las células, presencia
de endosporas y su reacción al Gram.
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V. RESULTADOS
Una vez realizada la observación al microscopio, complete el siguiente cuadro y reporte los
resultados al profesor.
1. Dibujo de las células bacterianas en el campo observado
Streptococcus pneumoniae Pasteurella multocida
Las bacterias mostradas presentan forma Las bacterias mostradas presentan forma
esférica, con un tamaño de 1,2-1,8 µm. esférica y ovalada, con un tamaño de 0,3 -
Descripción de Tiene aspecto de cocos y su tinción es 1µm. Tiene aspecto de coco – bacilo y su
lo observado Gram. tinción es Gram.
Color de la
bacteria teñida Se puede observar a la muestra de un Se puede observar a la muestra de un color
color violeta. rosado.
Reacción al
Gram Gram Positivo Gram Negativo
VI. CUESTIONARIO
a. Investigar otros tipos de tinción bacteriana.
Tipos de tinción Bacteriana:
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1.Tinción Ziehl-Neelsen:
Esta técnica de tinción bacteriana tiene como función reconocer los bacilos ácido-alcohol
Resistentes (BAAR). Entre los BAAR, se encuentran las micobacterias, que son agentes
etiológicos de enfermedades como TBC y lepra. El nombre de esta tinción es debido a
Franz Ziehl (Bacteriólogo) y Friedrich Neelsen (Patólogo), que trabajaron y desarrollaron
la tinción el año 1883.
Las micobacterias Ácido-Alcohol Resistentes (AAR) son coloreadas de rojo y retienen
su color por más que el alcohol y el ácido hagan efecto en ellas.
Los colorantes empleados en esta tinción son la Fucsina fenicada, la cual da un color
rojizo a las bacterias AAR y el Azul de metileno, dando un color azulado al resto de las
bacterias no AAR.
2.Tinción Schaeffer-Fulton:
Esta técnica de tinción tiene como función dar color a las endosporas bacterianas para
poder observar el interior de estas, ya que las esporas poseen una pared gruesa y la
coloración no llega al interior de ella. Algunos ejemplos son las endosporas que forman
Bacillus anthracis y Clostridium perfringens. El nombre de la tinción se debe a los
Microbiólogos Alicia Schaeffer y MacDonald Fulton, quienes trabajaron en la tinción el año
1930. Los colorantes empleados en esta tinción son el Verde malaquita, que tiñe las
endosporas y la Safranina, colorea de color naranja o rojo lo restante de la espora.
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3.Tinción de Leifson:
Esta técnica de tinción tiene como función dar color a bacterias para poder observar
sus flagelos, ya que sin la tinción son difíciles de ver usando el microscopio. El nombre
de la tinción se debe a Leifson, quien publicó este método en 1930.
El colorante empleado en esta tinción es la Fucsina, que da un tono rosado a los
flagelos de la bacteria.
4.Tinción de Giemsa:
Esta técnica de tinción tiene como función detectar bacterias en posibles células infectadas,
algunas de las bacterias son Chlamydia y Rickettsia. También es usada en citología, para
diferenciar orgánulos de una célula. El nombre de la tinción se debe a Gustav Giemsa,
quien fue un químico y microbiólogo alemán. La coloración que se emplea es el colorante
de Giemsa, compuesto de eosina y azul de metileno (azur).
5. Tinción Negativa:
Esta técnica de tinción bacteriana tiene como función detectar las cápsulas en las cuales
están envueltas las bacterias mediante el contraste con la coloración negra de fondo. La
coloración que se emplea en esta tinción es la Tinta china y la Nigrosina, se puede usar
tanto en el microscopio electrónico como en el microscopio óptico. Su procedimiento es
bastante corto en comparación con las tinciones anteriores.
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VII. BIBLIOGRAFÍA
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