Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco
Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud.
Cátedra: Química Biológica I
Año 2019
Trabajo Práctico: Ácidos nucleicos
Extracción, aislamiento y reconocimiento
OBJETIVO
-Extraer ácidos nucleicos de tejidos biológicos.
-Caracterizar químicamente los componentes estructurales del ADN .
FUNDAMENTO TEÓRICO
Los ácidos nucleicos son compuestos nitrogenados de elevado peso molecular que se pueden
encontrar en las células asociados a proteínas formando complejos llamados núcleo-proteínas.
Estas proteínas tienen carácter básico mientras que los ácidos nucleicos son ácidos. Se
conocen dos grupos de ácidos nucleicos: ARN (ácido ribonucleico) y el ADN (ácido
desoxirribonucleico). La hidrólisis controlada de ARN y ADN produce nucleótidos. Si la hidrólisis
continúa se producen nucleósidos y finalmente fosfatos, azúcares y bases púricas y
pirimidínicas.
La función biológica de los ácidos nucleicos es fundamental:
El ADN está asociado con el material genético de las células, pudiendo encontrarse
como una sola cadena en algunos microorganismos o formando parte de núcleo-
proteínas de los cromosomas en organismos superiores. Almacena información
genética y sirve de molde para la síntesis de proteínas. Se encuentra
mayoritariamente en el núcleo y en muy poca cantidad en mitocondria y cloroplastos.
Contiene dos purinas (adenina y guanina) y dos pirimidinas ( citosina y timina). El
azúcar presente en sus estructuras es una desoxirribosa
El ARN participa en la síntesis de proteínas y se distribuye en toda la célula,
mayormente en citoplasma en forma soluble o formando parte de los ribosomas.
Contiene dos purina (adenina y guanina) y dos pirimidinas (citosina y uracilo). El
azúcar presente en su estructura es una ribosa.
La polimerización de nucleótidos para formar ácidos nucleicos implica la formación de enlaces
fosfodiester entre el 5´fosfato de un nucleótido y el 3´hidroxio de otro. Los oligonucleótidos
son pequeños polímeros que contienen solo unos pocos nucleótidos; los poli nucleótidos
mayores que componen el ARN y ADN celular pueden contener miles o millones de
nucleótidos. Una cadena polinucleotidica tiene un sentido, con un extremo de la cadena
terminando en un grupo 5´fosfato y el otro en un grupo 3´OH. Los poli nucleótidos siempre se
sintetizan en la dirección 5´a 3´, añadiéndose un nucleótido libre al grupo de 3´OH de la
cadena en formación.
Los nucleótidos no solo son importantes como ladrillos de construcción de los ácidos
nucleicos; también desempeñan papeles vitales en otros procesos celulares por ejemplo: el
adenosin 5´trifosfato (ATP) que representa la principal forma de energía química dentro de la
célula.
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El protocolo básico de extracción de ADN consiste en el tratamiento del homogeneizado con
disolventes orgánicos (fenol, cloroformo o ambos)
Para evidenciar la presencia de ácidos nucleicos en extractos celulares vegetales se requiere
células en cantidad suficiente y en medio libre de interferencias que puedan causar lisis celular
o hidrólisis de los ácidos nucleicos por nucleasas. Una completa extracción de ácidos nucleicos
es fundamental para la determinación indirecta.
Una hidrólisis ácida remueve todas las bases púricas (hidrólisis de uniones N-glicosídicas entre
pentosa y las bases púricas) sin afectar las uniones fosfodiester del esqueleto nucleotídico, por
lo tanto obtenemos como producto ácidos nucleicos sin bases púricas.
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PARTE EXPERIMENTAL:
Extracción de ácido nucleico de material biológico
Solución de lisis: 0,1 % de SDS en 25 mM EDTA pH 8,0.
Solución de lisis alternativa: 120 ml H2O, 1,5 g NaCl, 5 g bicarbonato de sodio, 5 ml de
detergente.
Alcohol etílico 96% (agente precipitante).
Pelar y rallar una cebolla mediana con rallador o procesador hasta picarla finamente.
Pesar 10 g de cebolla rallada y adicionar 25 ml de solución de lisis y dejar 20 min. a t° amb.
Filtrar en gasa y recoger en probeta.
Centrifugar 10 minutos, recoger el sobrenadante.
Transferir 2 ml de sobrenadante a un tubo de ensayo.
Adicionar 2 volúmenes de etanol 96% frío, procurando no mezclar las dos soluciones. En la
interfase observar la formación de una fina hebra.
Aspirar la interfase con pipeta Pasteur y separarla en un tubo. Observar.
Homogeneizar en 2 ml de agua destilada para realizar reacciones.
Caracterización química de los componentes estructurales del ADN
Hidrólisis ácida de ADN: Colocar la solución de ADN obtenida en un erlenmeyer, agregarle 30
ml de H2SO4 al 10% y calentar a baño maría durante 30 min. En caso de excesiva evaporación
agregar agua destilada hasta alcanzar el volumen inicial.
Reconocimiento de azúcares, reacción de Molisch
Trasvasar 5 ml del hidrolizado a un tubo de ensayo, agregar 4 gotas de solución de α-naftol,
agitar y añadir por las paredes del tubo 3 ml de H2SO4 (c). Observar y anotar los resultados.
Caracterización de fosfatos
Colocar 3 ml del hidrolizado en un tubo de ensayo y alcalinizar con NH4OH. Posteriormente,
acidificar con HNO3 (c) y agregar 3 ml de molibdato de amonio al 30%. Calentar y observar los
resultados.
Caracterización de bases púricas
Colocar 3 ml del hidrolizado en un tubo de ensayo y agregarle NH4OH hasta reacción alcalina.
Luego agregar gota a gota solución de AgNO3 al 10 %. Observar y anotar los resultados.
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Cuestionario de entrega obligatoria (individual)
1. Dibujar un nucleótido e indicar cada uno de sus componentes estructurales, cómo los
tipos de enlaces presentes.
2. Mencionar las diferencias estructurales entre el ADN y ARN ¿Qué función tienen
dichas diferencias estructurales?
3. Mencionar y dibujar la estructura de los nucleótidos de importancia en el
metabolismo.
Bibliografía
Morrison, Boyd. Química Orgánica. Fondo Educativo Interamericano. S.A. México.
1996.
Cooper, G., La célula. Marban libros. España. 2007. Pág.: 48-49.
Rivera J. M., Pertierra A. Fundamentos de Bioquímica estructural.
