Electroforesis
Nos permite separar componentes de
masas y establecer un valor relativo de
peso molecular. A nivel de proteínas
podemos separar aminoácidos según
su carga, logrando obtener el ph
isoeléctrico o punto isoeléctrico. La
utilidad de esto identificar la identidad
cercana del compuesto que estamos
analizando. La electroforesis puede ser
el primer paso a otras técnicas.
“Para estar seguro de la proteína
debemos conocer su secuencia
aminoacídica mediante la
secuenciación”.
El western blot también es una manera
de identificar proteínas, pero no es
100% fiable, ya que puede haber interacción cruzada del anticuerpo con otro componente.
La palabra electroforesis viene del griego “llevado por corriente”. Inicialmente se uso para
explicar la conducta de partículas coloidales cargadas eléctricamente en un campo eléctrico.
“Un coloide (moléculas no difusibles entre 2 compartimientos) es una molécula o especie
química que se considera que esta en una fase dentro de otra, como las proteínas por su alto
peso molecular y porque tienen propiedades de agregamiento pese a estar solubles”.
Es importante que este es un proceso de difusión y debe tener un potencial eléctrico. La
electroforesis se puede también hacer en solución acuosa y en ese caso se le denomina
electroforesis libre o acuosa y permite generar distintas velocidades de movimiento de
partículas, el problema es la visualización (es difícil).
Cuando se realiza la electroforesis en gel o medio de soporte se le denomina electroforesis
en gel. Este soporte se le considera inactiva cuando solo aporta a la estabilidad (no interactúa,
ejemplo agarosa o poliacrilamida) y activo cuando tiene propiedades que interaccionan con
las partículas (ejemplo gel en gradiente).
Existen geles macroporoso que tienen agarosa al 1-2% y son prácticamente electroforesis en
agua y en el caso de los geles de poliacrilamida este tendrá determinada función.
Nomenclaturas no sistemáticas:
- Prefijo indica el gel, el tipo de muestra o las características del campo eléctrico.
Ejemplo: Agarosa, SDS-PAGE (muestra desnaturalizada) y campo pulsado.
“La electroforesis en campo pulsado es útil para separar ac nucleicos grandes como purificar
cromosomas en campos de agarosa, su funcionamiento esta en invertir la polaridad del campo
eléctrico y esto provoca que la gran molécula de material genético adopte formas que
permitan transitar en este medio separador”.
Fines preparativos, semi preparativos, analíticos:
- Ventajas y desventajas.
“Los fines preparativos se asocian a la producción masiva de una sustancia y por eso que la
electroforesis no es muy buena para esto, ya que cuando aplicamos diferencias de potencial
induciendo un campo eléctrico se genera una corriente eléctrica se genera calor y por lo tanto
diseñar un sistema macro generara mucho calor y encarece los costos para refrigerar, sin
contar que también el calor afecta la cinética molecular”.
“Semi-preparativo, ya que se ocupa como pasos previos a una técnica, pero sin usarse grandes
cantidades de sustancia”. “La principal función es analítica”.
La utilidad central que aporta es:
- Separación de proteínas.
- El peso molecular relativo de proteínas (M).
- El punto isoeléctrico de proteínas (pl).
Ventajas prácticas de la electroforesis:
- Equipos simples y no costosos.
- Resultados con alta resolución (electroforesis bidimensional).
- Fácil análisis de múltiples muestras.
- Alta sensibilidad (ug – ng).
- Detección específica (acoplada con fluorescencia que permita ver picogramos).
- Patrón de bandas “estético”.
Equipos comerciales:
- Velocidad.
- Conveniencia.
- Reproductibilidad.
- Exactitud.
“Antiguamente los geles se hacían con clips,
vaselina, silicona y otros. Es decir, que eran
componentes bastante rudimentarios”.
En esta imagen vemos los componentes actuales.
Esta imagen muestra cómo se
comporta la proteína según pH y
cargan.
La carga neta cambia con el pH,
debido a la ionización de los
grupos con propiedad ácido-
base al estar protonados o
desprotonados.
La proteína:
- A tiene un pl mucho más
ácido y se les conoce
como proteínas ácidas.
Migración electroforética
Existe un movimiento inducido por un campo eléctrico (E volts/cm, V/cm) que cuando se le
aplica a una partícula se le va a otorgar una determinada fuerza (F) que actúa sobre sus
moléculas.
- F = Ex z, magnitud de E y la carga neta de la partícula z (afectado por detergentes,
pH y fuerzas iónicas).
Inmediatamente que se genera esta F, se va a generar una F’ de fricción del medio que se
opone y es directamente proporcional a la velocidad de migración de la partícula.
Esta F’ depende de:
- Tamaño de la molécula.
- Temperatura.
- Viscosidad del medio.
- Propiedades del gel (tamaño del poro).
F’ = v x f.
“Existen parámetros generales o del medio y otros que son propios de las partículas que
vamos a analizar”.
En la electroforesis ocurre que ambas F se igualan y cuando esto ocurre hay movimiento,
pero no hay aceleración, es decir, la velocidad se hace constante.
Movilidad electroforética
Es la velocidad de migración de una proteína en un campo eléctrico unitario (E= 1 V/cm) en
condiciones definidas (temperatura, buffer, pH, fuerza iónica, tipo de gel, etc).
v (cm/h) = E (V/cm) x m (cm2/Vh)
m: movilidad electroforética; E: campo eléctrico; v: velocidad de la proteína.
Sin embargo, dado que todos los
parámetros son constantes,
excepto las propiedades de cada
proteína (y por tanto v), se puede
calcular la movilidad relativa para
cada proteína (mf).
“Esto explica porque aparecen bandeos correspondientes”.
“En una banda podemos tener más de 1 proteína, pero que comparten componentes o cargas”.
“Cuando vemos bandas gruesas, puede ser por la cantidad de proteína evaluada o por las
glicosilaciones variables”.
“Haciendo una electroforesis bidimensional podemos separar las proteínas de una banda
gruesa”.
Existen distintos grados de poro que
deben atravesar las proteínas.
Dependiendo la relación entre la
acrilamida y el agente entrecruzador
“bisacrilamida”, vamos a tener de
manera reproducible determinados
tamaños de poro y nos permite
separar un amplio rango de tamaños
de proteínas.
La acrilamida se transforma en
bisacrilamida (polímero) usando un
reactivo (persulfato de amonio y
TEMED) que genera radicales
libres.
En la electroforesis vertical los geles van en tubos y se usa
en la técnica de iso electro enfoque que es separar por
punto iso eléctrico.
“La agarosa sirve para separar nucleótidos de alto peso
molecular, ya que tiene poros más grandes y por eso no se
ocupa para proteínas”.
Tinción con azul de coomassie que tiene
una sensibilidad muy alta.
Marcador de peso se usa para estimar una
masa relativa.
Primera parte gel concentrador (bajo
porcentaje de poliacrilamida y solo
cumple concentrar las proteínas para que
entren juntas a la siguiente fase) y luego
gel separador.
El frente de avance nos permite calcular (Rf) entre la banda de interés y la distancia hasta el
frente.
Determinación de
la masa relativa
Esta técnica nos
permite graficar el
Rf en comparación
al logaritmo del
peso molecular del
patrón conocido.
