Amplificación de los ácidos nucleicos y sus
variants. Caso práctico – PCR convencional
Claudia Patricia Jaimes Bernal
Universidad de Boyacá
2022
KARY B. MULLIS
•Nació en diciembre 28, 1944 en Lenoir,
North Carolina, United States
•Campos de trabajo: Biología molecular
•Conocido por: Reacción en cadena de la
polimerasa
•Ganó el premio nobel en Química (1993) http://www.karymullis.com/
DEFINICION
Método IN VITRO
para la síntesis
enzimática de
secuencias
específicas de ADN
de cualquier
origen y se basa
en la amplificación
exponencial de
una secuencia de
ADN conocida.
BASES TEORICAS
El fragmento de ADN a
amplificar está delimitado
pro dos fragmentos cortos
de ADN o cebadores.
Cebadores
complementarios
En cada ciclo se duplica el
número de copias de la
secuencia deseada,
respecto al ciclo anterior.
APLICACIONES DE LA PCR
Diagnóstico y seguimiento de
enfermedades genéticas y cáncer
Detección rápida de bajas cantidades de
microorganismos y virus
Tipificación de HLA en trasplantes
Análisis de ADN en laboratorios forenses
por huellas genómicas
Análisis de material genético antiguo o
archivado
Generación de sondas de ácidos
nucleicos
Clonación de genes
Mapeo de genes
Secuenciación
Etapas
Extracción y purificación de los
ácidos nucleicos
Amplificación de un segmento
seleccionado del genoma mediante
PCR
Detección de los fragmentos
amplificados en la PCR (amplicones)
PCR: PROCESO
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PASOS EN LA PCR
Prieto Solla, L. Estudio de polirmorfismos de ADN en restos humanos antiguos y muestras forenses criticas.
PASOS EN LA PCR
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DENATURACION
90ºC a 95ºC >GC > Temperatura 30 – 60seg
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ALINEAMIENTO
40ºC a 60ºC Temperatura melting 30 – 60 seg
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Cálculo de la Tº de alineamiento
2 (A+T) + 4(C+G) = Tm
Se realiza el cálculo para ambos
primers
Promedio de las Tº
Restar al promedio 5ºC = T de
alineamiento
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EXTENSION
70ºC a 75ºC 5’ 3’ Tiempo depende tamaño
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CICLOS
Prieto Solla, L. Estudio de polirmorfismos de ADN en restos humanos antiguos y muestras forenses criticas.
CICLOS
20 a 35 ciclos
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CICLOS
PROGRAMACION de una PCR
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g
SEPARACION FISICA DE LAS AREAS DE TRABAJO
EN EL LABORATORIO
Prevención de la
contaminación de la PCR
GABINETE para PCR
EQUIPOS para PCR
Early model of a Polymerase
Chain Reaction machin
("Gene Machine"), featuring
three constant temperature
baths and a robotic action
that moves samples
between the baths.
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TERMOCICLADOR
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TERMOCICLADOR
INGREDIENTES
PARA LA PCR
ADN MOLDE (TEMPLATE)
PRIMERS (cebadores)
20 a 30 nucleótidos
[ ] 0.1 y 0.5 µM
Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
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Preparación del Primer
Concentración final deseada
No de nmoles depende de cada primer
Para realizar la PCR, es necesario utilizar ambos primers a una
concentración de 10uM
C1 * V1 = C2 * V2
Dilución final del primer
dNTPs
[ ] 200 µM concentración
final de cada dNTP en la
reacción – Vol Rx: 25 µl
TAQ DNA POLYMERASE
1 a 2 Unidades Vf: 25µl
A thermostable (75-800C)
DNA polymerase from hot
springs and hydrothermal
vents bacteria Thermus
aquaticus.
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ADN POLIMERASAS TERMOESTABLES
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Magnesio
Cofactor de la enzima Taq
Polimerasa
[ ] 0.5mM hasta 5mM
BUFFER
Buffer para PCR puede contener:
10 mM Tris, pH 8.3
50 mM KCl
1.5 mM MgCl2
0.01% gelatin
TUBOS PARA PCR
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Master Mix (Mmix)
Concentraciones
Componentes 1 Reacción ( ) final
Master Mix 1X
Primer forward
Primer reverse
H2O
ADN
Total
VARIANTES DE LA PCR
Variantes de la PCR
PCR con transcriptasa reversa
PCR multiple
PCR anidada
PCR en tiempo real
RT-PCR
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PCR anidada
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PCR – TIEMPO REAL
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DETECCION DE
PRODUCTOS PCR
ELECTROFORESIS
Ethidium bromide
ASPECTOS RELEVANTES DE LA PCR
Fidelidad: capacidad de la enzima para insertar nucleótido apropiado,
según la secuencia del ADN molde
Especificidad: que el producto amplificado por PCR corresponda
específicamente a la secuencia blanco que se pretende analizar
Sensibilidad y Eficiencia: posibilidad de obtener un mejor producto de
amplificación, aunque el número de moléculas de ADN molde sea muy
bajo y se encuentre mezclado con otros materiales genéticos de diferentes
orígenes.
CONTROL DE CALIDAD DE LA PCR
Minimizar las fuentes de
contaminación cruzada y
definir estrategias que
ayuden a identificarlas
Control positivo
Control negativo
PCR products of HCV RNA runned on 2% agarose gel. From
Control interno right to left we have negative control, 4 positive patients'
samples and two negative patients' samples as well as positive
control and DNA ladder 100bp.
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