ENUMERACION BACTERIANA: EL NUMERO MAS

PROBABLE

EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia efeciente de

estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación
cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa en la
determinación de presencia o ausencia (pos o neg) en réplicas de diluciones
consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras
de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este método es
la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la población(es) en el
medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene
del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla
probabililística.

Algunas de las ventajas del NMP son: (i) la capacidad de estimar tamaños
poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por
ejemplo se puede determinar la densidad poblacional de organismos que pueden
nodular leguminosas en una muestra de suelo usando el método de infección de
plantas, (ii) provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de
suelos diversificados, (iii) determina sólo organismos vivos y activos
metabólicamente, y (iv) suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos
tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros.

En este ejercicio, se utilizará una variante de esta metodología para estimar la

densidad total de bacterias presentes en una muestra. El atributo particular a
utilizarse será la capacidad de microorganismos a formar colonias en medios sólidos
de crecimiento.
226 MANUAL ECOLOGIA DE MICROORGANISMOS

Materiales & Equipos:

• Muestras ambientales (lodos activados, ríos, charcas, suelo, etc.)

• Placas Petri con medio de crecimiento (R2A, LB, TSA u otro)
• Tubos de dilución con 9 ml de 0.85% NaCl
• Micropipetas de 20 µl
• Puntas para micropipeta
• Incubadora a 25°C
• Vortex

Metodología

1. Muestras: Colecte asépticamente muestras frescas de suelo (10 g) de varios

lugares u obtenga muestras de agua (10 ml) de lagos, ríos o charcas.
2. Extracción de microorganismos viables: Para muestras de suelo, las células
podrán ser removidas y homgenizadas añadiendo 1 g de muestra a un tubo de
ensayo que contenga 9 ml de solución salina. Agite moderadamente por 5
minutos en un vortex.
3. Diluciones en serie: El extracto de suelo puede ser diluido seriadamente
transfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de 0.85% NaCl. Cada transferencia
corresponde a una dilución de 1 en 10. Repita en serie el procedimiento de
dilución hasta alcanzar la dilución 10-7. Para muestras líquidas, mezcle bien la
muestra y proceda a preparar las diluciones seriadas como fueron descritas
anteriormente.
4. Placas Petri: Utilizando un marcador, divida la placa petri en cinco zonas de
igual tamaño. Use una placa por cada muestra. Rotule cada zona con el factor
de dilución a ser inculado:

10-3

10-4

10-7

10-5
10-6
 EL NUMERO MAS PROBABLE 227

5. Inoculación: Transfiera 5 µl de la dilución apropiada al área correspondiente.

Repita esta operación cinco veces por cada dilución:

6. Permita que el inóculo seque sobre el medio de crecimiento. Selle la placa con
una tirilla de parafina. Invierta la placa e incube a 25°C por 7 días.
7. Evaluación de crecimiento: Para cada dilución en ascendencia evalúe el
crecimiento o no crecimiento sobre cada réplica inoculada. Reporte los
resultados como se indican en el ejemplo a continuación:

10-3

10-4

10-7

10-5
10-6

Diluciones 10-3 - 10-4 - 10-5 - 10-6 - 10-7 :: 5 - 5 - 3 - 2 - 0

Datos & Análisis:

Utilizando los valores ofrecidos en la tabla 1, determine la población estimada para

su muestra (ej., 5-5-3-2-0: 1,383). De su patrón de respuestas no estar en la tabla,
promedie el valor estimado del patrón superior e inferior presente en la tabla 1 (ej.,
5-4-1-1-0 no está en la tabla, entonces promedie 5-4-1-0-0 (169) y 5-4-2-0-0 (216)
como el resultado más apropiado: 5-4-1-1-0 = (169+216)/2 = 193). Este valor
obtenido es el NMP sin ajustar. Para calcular la densidad poblacional de la muestra,
entonces tendrá que multiplicar el NMP sin ajustar por el factor de corrección de
volumen (ver nota Tabla 1) por el recíproco del factor de dilución menor inoculado
en la placa (ej., 5-5-3-2-0: 1,383 X 200 X 1000 = 2.78 x 108 células/g de suelo). A
continuación un ejemplo
 228 MANUAL ECOLOGIA DE MICROORGANISMOS

COMO LEER LOS RESULTADOS DEL NMP

A. Organizar la data en forma de tabla donde cada columna representa una

dilución y cada fila representa una replica.

Negro = positivo, Blanco = negativo

B. Determinar el numero de tubos positivos por dilución

# de tubos positivos 5 5 5 5 5 5 2 1 0

C. Identificar la dilución mas alta con menos de 5 positivos pero que no sea 0.
D. A partir de la dilución que identificó en el paso anterior anote el número de
positivos de las diluciones a la izquierda dependiendo de la tabla de NMP
que este utilizando (en nuestro caso son 6 diluciones) Este número será el
que usted buscará en la tabla de NMP para obtener la densidad aproximada.

# de tubos positivos 5 5 5 5 5 5 2 1 0

E. Calcule la densidad del cultivo utilizando la siguiente ecuación:

#* 1 &** # volumen de la tabla &***

Densidad =# valor de la tabla " % ( "% (
$ Factor de dilución ' $ volumen de inóculo '
*Se obtendrá del código numérico derivado en el paso D
**Se obtendrá de la dilución mas concentrada en su código numérico
***Esto es un factor de corrección en el caso de que el volumen de inóculo sea
!
distinto al de la tabla.
 EL NUMERO MAS PROBABLE 229

En el caso del ejemplo anterior utilizamos 0.1 ml de inóculo y la tabla de NMP es de

1.0 ml. Entonces tendremos:
$ 1 ' $1.0 ml '
Densidad = 69,148 " & #3 ) " & )
% 10 ( % 0.1 ml (
Densidad= 6.9x108 células/ml

!
 230 MANUAL ECOLOGIA DE MICROORGANISMOS

Tabla 1. El número más probable para series de diluciones en réplicas de

cinco por nivel de dilución (Woomer, 1994)*.
Núm. Respuestas Núm. Respuestas
Pos. por Nivel de Población Pos. por Nivel de Población
Dilución estimada Dilución estimada
1-2-3-4-5-6 1-2-3-4-5-6
1-0-0-0-0-0 1.9 5-5-4-2-0-0 2159
1-1-0-0-0-0 4.0 5-5-4-3-0-0 2716
2-0-0-0-0-0 4.4 5-5-5-0-0-0 2305
2-1-0-0-0-0 6.8 5-5-5-0-1-0 3126
3-0-0-0-0-0 7.7 5-5-5-1-0-0 3282
3-1-0-0-0-0 10 5-5-5-1-1-0 4532
3-2-0-0-0-0 13 5-5-5-2-0-0 4922
4-0-0-0-0-0 12 5-5-5-2-1-0 6918
4-1-0-0-0-0 16 5-5-5-3-0-0 7797
4-2-0-0-0-0 21 5-5-5-3-1-0 10702
4-3-0-0-0-0 27 5-5-5-3-2-0 13826
5-0-0-0-0-0 23 5-5-5-4-0-0 12753
5-0-1-0-0-0 31 5-5-5-4-1-0 16902
5-1-0-0-0-0 33 5-5-5-4-2-0 21589
5-1-1-0-0-0 45 5-5-5-4-3-0 27150
5-2-0-0-0-0 49 5-5-5-5-0-0 23054
5-2-1-0-0-0 69 5-5-5-5-0-1 31225
5-3-0-0-0-0 78 5-5-5-5-1-0 32720
5-3-1-0-0-0 107 5-5-5-5-1-1 45261
5-3-2-0-0-0 138 5-5-5-5-2-0 49224
5-4-0-0-0-0 127 5-5-5-5-2-1 69148
5-4-1-0-0-0 169 5-5-5-5-3-0 78127
5-4-2-0-0-0 216 5-5-5-5-3-1 107022
5-4-3-0-0-0 270 5-5-5-5-3-2 138269
5-5-0-0-0-0 230 5-5-5-5-4-0 127528
5-5-0-1-0-0 312 5-5-5-5-4-1 169028
5-5-1-0-0-0 327 5-5-5-5-4-2 215899
5-5-1-1-0-0 453 5-5-5-5-4-3 271557
5-5-2-0-0-0 488 5-5-5-5-4-4 334051
5-5-2-1-0-0 692 5-5-5-5-5-0 230546
5-5-3-0-0-0 780 5-5-5-5-5-1 328192
5-5-3-1-0-0 1070 5-5-5-5-5-2 492238
5-5-3-2-0-0 1383 5-5-5-5-5-3 781272
5-5-4-0-0-0 1275 5-5-5-5-5-4 1312535
5-5-4-1-0-0 1690
*Esta es la densidad poblacional estimada asumiendo 1 ml de inóculo. Este valor debe ser ajustado por el factor de
dilución y el volumen de inóculo (por ejemplo, si usted inoculó en cada placa un volumen de 10 µl, entonces el valor
de la tabla debe ser corregido multiplicándolo por 100 [10 X 100 = 1,000 µl ó 1 ml]).
 EL NUMERO MAS PROBABLE 231

Observaciones:

1. ¿Qué tiempo de incubación de sería el más apropiado?

2. ¿Cuáles son algunas desventajas del método de NMP?

3. ¿Qué otras aplicaciones tiene este método?

4. Si luego de preparar diluciones en serie de 10-2 hasta 10-6 de una muestra de

una laguna usted obtuvo un patrón de respuestas positivas 5-5-4-3-1, ¿Cuál es
la densidad poblacional en la laguna?

5. ¿Qué tendría usted que hacer si luego de incubar los resultados son 5-5-5-5-5-
5?