1.

INTRODUCCIÓN

La hibridación consiste en la unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos, por

complementariedad de su secuencia de bases nitrogenadas, originando una molécula híbrida bicatenaria.

La técnica de hibridación, por tanto, es la unión de forma complementaria de una sonda de ácidos nucleicos
con la cadena de ADN de la muestra, para conocer si tenemos una determinada secuencia de ADN o ARN en una
muestra.
Tanto la muestra como la sonda pueden ser ADN o ARN, ya que los híbridos se forman entre cadenas sencillas
ADN-ADN, ARN-ARN o ADN-ARN.
En el caso de que la muestra o la sonda sean ADN de doble cadena, es preciso primero desnaturalizarlo.
Por tanto, las técnicas de hibridación, en biología molecular, se usan para detectar secuencias concretas de
ácidos nucleicos mediante fragmentos complementarios.
Los conceptos que se manejan en las técnicas de hibridación son:

● Secuencia diana: secuencia concreta de bases nitrogenadas que se pretende detectar en la muestra problema.

● Sonda: cadena de nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es complementaria a la secuencia diana.
Se encuentran marcadas con alguna molécula.
La molécula bicatenaria que se forma se denomina híbrido se podrá detectar gracias al marcaje que se habrá
incorporado a la sonda.
El híbrido sonda/secuencia diana tiene las mismas propiedades que una molécula bicatenaria de ADN en
cuanto a desnaturalización/renaturalización.

2. Tipos de sondas

Una sonda es un ácido nucleico en el cual una porción de sus nucleótidos ha sido modificada para que puedan
ser detectados.
Las sondas pueden ser tanto de ADN como de ARN, y estarán marcadas mediante distintas técnicas para
reconocer si hay unión de la sonda con una parte determinada del ADN que buscamos.
Se pueden clasificar en función del tipo de modificación que introducen.
Pueden ser bicatenarias o monocatenarias y estar formadas por pequeños oligonucleótidos o miles de
nucleótidos.
Podemos clasificarlas de la siguiente manera:
● Sondas convencionales:
❖ Sondas ADN (recombinante, por PCR).
❖ Sondas de ARN.

● Sondas de síntesis químicas:

❖ Sondas PNA o de ácidos nucleicos peptídicos.
❖ Sondas LNA o de ácidos nucleicos bloqueados.

La elección del tipo de sonda depende de:

● Especificidad: capacidad para discriminar( encontrar sin fallos,reconocer), la secuencia diana.

Tamaño mínimo 16 bases.

● Sensibilidad: probabilidad de detectar cantidades mínimas del híbrido sonda-diana, relacionado con el
número de moléculas de marcadores que admite la sonda.

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2.1. Sondas de ADN (convencionales y de síntesis química).

Son las más usadas al ser fáciles de obtener en grandes cantidades y presentar gran versatilidad en tamaño y
método de marcaje. Pueden ser:

● De síntesis química: se obtienen por condensación química secuencial de los desoxirribonucleótidos

necesarios para obtener una secuencia determinada. Actualmente este proceso está automatizado.

● De ADN recombinante: se obtienen por un proceso de clonación y amplificación por cultivo celular.
El segmento de ADN se inserta en un vector (un plásmido bacteriano), que se introduce en una bacteria y se
cultiva, posteriormente se extrae el plásmido amplificado y se emplea como sonda o se separa el fragmento de
interés con enzimas de restricción.

● PCR: consiste en amplificar el fragmento mediante reacción en cadena de la polimerasa.

De síntesis química

Son sondas monocatenarias, de tamaño reducido (<200 nt) habitualmente entre 40-50 nt.

Destaca, entre sus ventajas, que no requieren desnaturalización y su tamaño permite mejor penetración en el
tejido. Pero, como inconvenientes, su baja sensibilidad y gran facilidad para hibridar inespecíficamente con
secuencias parecidas a la secuencia diana.

De ADN recombinante:

Son sondas bicatenarias, de gran tamaño (cientos-miles pb).

Tienen la ventaja de tener una alta sensibilidad y mayor especificidad.

De PCR: Son sondas bicatenarias, de tamaño intermedio (cientos pb: 100-200 pb).
El inconveniente es que se requiere conocer las secuencias que flanquean la secuencia sonda (cebadores).

2.2. Sondas de ARN o ribosondas (convencionales y de síntesis química).

Son menos utilizadas que las de ADN.

Son siempre monocatenarias por lo que no requieren desnaturalización.
Destaca entre sus ventajas que los híbridos ADN/ARN son ligeramente más estables que los de ADN/ADN.
Pero son altamente sensibles a cualquier contaminación debido a las ARNasas que lo degradan. Pueden ser:

● De síntesis química: se obtienen por condensación química secuencial de los ribonucleótidos concretos para
obtener la secuencia determinada y presentan las mismas ventajas e inconvenientes a las sondas químicas de
ADN.
● De transcripción: consiste en transcribir un vector que contiene el fragmento de interés o un ADNc mediante
una ARN polimerasa.
Estas sondas suelen ser de tamaño intermedio.

2.3. Sondas de síntesis química.

Son sondas con modificaciones químicas sintéticas de los ácidos nucleicos que se comercializan.
Pueden ser:

● De ácidos nucleicos peptídicos: oligómeros sintéticos en los que el esqueleto típico de azúcar-fosfato del ADN
y ARN es sustituido por unidades de aminoetil-glicina unidas entre sí por enlaces amidas.

A cada residuo se le acopla una base nitrogenada acetilada uniéndose a través del grupo carbonilo.
Hibridan con moléculas de ADN y ARN de secuencia complementaria mediante puentes de hidrógeno.

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● De ácidos nucleicos bloqueados: oligómeros sintéticos de ribonucleótidos en los que se modifican
químicamente algunas ribosas del esqueleto azúcar-fosfato.
Sondas PNA o de ácidos nucleicos peptídicos.

Presentan las características de no tener carga eléctrica, debido a que carecen del grupo fosfato.
Además, no son degradadas por nucleasas ni proteasas, lo que les da más estabilidad.

Entre sus ventajas destacan que hibridan más rápidamente, los híbridos que producen son más estables y con
Tm más altas y, dado que no tienen carga eléctrica, les influye poco la carga iónica del medio. Son sondas muy
específicas.

Sin embargo, tienen menor solubilidad, que disminuye con la longitud, por lo que deben tener <30 b.

Sondas LNA o de ácidos nucleicos bloqueados.

Destacan por tener mayor sensibilidad y especificidad que sondas de ARN sin modificar, pero son de tamaño
pequeño, por lo que no permiten detectar secuencias largas.

3. Tipos de marcaje
El marcaje es el procedimiento utilizado para poder visualizar los resultados de la hibridación y dependiendo
del tipo de marcador que se utilice, se puede distinguir:

● Marcaje directo: son sondas marcadas con isótopos radiactivos; con moléculas fluorescentes (fluorocromos);
o con enzimas.
● Marcaje indirecto: son sondas marcadas con haptenos (digoxigenina y biotina).

3.1. Marcaje directo.

Sondas marcadas con isótopos radioactivos.

Los isótopos radioactivos son elementos químicos con capacidad de emitir radiaciones.
Los más usados son: 32P; 3H.

La sonda se marca introduciendo nucleótidos radiactivos marcados con los isótopos.

El método de detección es con autorradiografía con película de rayos X (placa radiográfica).

Su ventaja es que son de gran sensibilidad, pero se necesitan instalaciones e infraestructuras para material
radiactivo y personal entrenado. La tendencia actual es usar sondas con marcajes no radiactivos.

Se usan en técnicas de hibridación en soportes sólidos: Southern blot; Northern blot; dot blot.

Sondas marcadas con moléculas fluorescentes.

Los fluorocromos son compuestos químicos que emiten luz al ser excitados por luz ultravioleta.
Se incorporan moléculas como la fluoresceína o la rodamina en la base nitrogenada, siempre en una posición
que no intervenga con la formación de puentes de hidrógeno, por lo que, normalmente, la molécula se sitúa en
el exterior.

Se necesita para detectarla un microscopio de fluorescencia.

Como ventaja, permite detectar simultáneamente varias secuencias diana, por lo que se usa mucho en
citogenética molecular, pero se requiere m.o. de fluorescencia

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Sondas marcadas con enzimas

Se incorporan a los nucleótidos enzimas que catalizan una reacción que permite la detección. Las más usadas
son la fosfatasa alcalina y la peroxidasa.
Al ser catalizados por la enzima, precipitan sobre el tejido o cromosoma unos sustratos coloreados o que
producen luz (luminiscentes).

3.2. Marcaje indirecto.

Los haptenos son moléculas de pequeño tamaño que se pueden acoplar a los nucleótidos y no alteran la
especificidad de la sonda. Se incorpora una molécula que tiene una interacción específica con otra molécula
que es la que va marcada. Las más usadas son la biotina, que interacciona con estreptavidina; y la digoxina, que
interacciona con un anticuerpo antidigoxenina

La detección de las sondas con este marcaje es, por afinidad química de moléculas o métodos inmunológicos.

Presentan la ventaja que la misma sonda puede ser revelada por distintos métodos: fluorescencia o enzimático.
Sin embargo, tienen menor sensibilidad que las sondas radioactivas.

Se pueden usar en todas las técnicas de hibridación.

4. Métodos de marcaje

Existen diferentes métodos para el marcaje de las sondas, que pueden realizarse durante la síntesis de la sonda
(marcaje por PCR) o posterior a la síntesis de la sonda (marcaje por replicación, por desplazamiento de mella o
nick translation; marcaje por transcripción; random priming o cebadores aleatorios); o con transferasa terminal.

Una vez realizado el marcaje de la sonda, ésta se debe purificar.

4.1. Marcaje por PCR.

Consiste en un método de marcaje durante la síntesis de la sonda, realizando una PCR con ADN molde que
contenga la secuencia de la sonda. En la mezcla de reacción, se incluyen algunos nucleótidos marcados como
hemos visto anteriormente.
El tipo de marcaje puede ser: isótopos radioactivos o fluorocromos; o haptenos.
El resultado del amplicón es la sonda marcada.

4.2. Marcaje por replicación.

Partiendo de un vector que contiene secuencias de la sonda se realiza la replicación in vitro mediante la
polimerasa ADN, usando los orígenes de replicación del vector o por desplazamiento de mella.

4.3. Desplazamiento de mella o Nick translation.

Consiste en un método de marcaje global de la sonda que se utiliza para marcar sondas de ADN bicatenario de
gran tamaño obtenidas por tecnología de ADN recombinante o genomas enteros.

Se realiza incubando a baja temperatura (alrededor de 15ºC) la sonda (1μg) con una mezcla de reacción que
contiene:
- ADNasa I; ADN polimerasa I bacteriana con función exonucleasa 5´-3´ y polimerasa 5´-3;
- DNTP con uno marcado con isótopo radioactivos o con marcaje indirecto.

*La ADNasa I, a bajas temperaturas y en presencia de cationes magnesio rompe, al azar, enlaces fosfodiéster
entre dos nucleótidos consecutivos creando la mella (Nick). Seguidamente, la ADN polimerasa I elimina
nucleótidos desde la mella y con su actividad polimerasa une aquellos nucleótidos marcados.

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4.4. Marcaje por transcripción.

Se utiliza para sintetizar sondas de ARN, a partir de un plásmido con secuencia de interés, que se transcribe.
Se incorporan DNTP marcados.
El vector contiene sitios de origen de transcripción generalmente víricos que es por donde se empieza.

4.5. Random priming o cebadores aleatorios al azar

Consiste en un método de marcaje global de la sonda, a partir de un fragmento de ADN clonado. Se

desnaturaliza y se incuba con hexámeros con secuencias al azar, que al hibridar servirán de cebadores;
fragmento Klenow (ADN polimerasa I E.coli), que es capaz de unir nucleótidos en el sentido 5’-3’ (actividad
polimerasa) y corrige errores, quitando nucleótidos en el sentido 3’-5’ (actividad exonucleasa). No tiene
actividad exonucleasa 5´-3´ y DNTP, marcados.

Se obtienen fragmentos de 200-300 nucleótidos, que presentan mejor penetración en los tejidos para
hibridación in situ.

El procedimiento consiste en desnaturalizar la sonda para que se produzca la unión de los hexámeros a la
cadena, al azar en múltiples zonas.
Estos actúan como cebadores para que el fragmento de Klenow sinteticen la cadena complementaria al molde,
incorporando los nucleótidos marcados.

4.6. Marcaje con transferasa terminal

Consiste en un método de marcaje de los extremos de la sonda.

● Se utiliza para marcar sondas de ADN bicatenario o monocatenario de pequeño y mediano tamaño.
● Se añade a un extremo una cola de nucleótidos marcados mediante la enzima transferasa terminal
(TdT).
● A diferencia de los otros, aquí el marcaje no está en la secuencia a hibridar, sino que se queda colgando
después (cola poli-A).

4.7. Purificación de la sonda marcada.

Consiste en eliminar los nucleótidos libres marcados, para evitar “ruido de fondo” o interferencias en los
resultados.
Se puede realizar mediante:

● Cromatografía de exclusión por tamaño: se suelen utilizar geles (como poliacrilamida) empaquetados en
microcolumnas que se acoplan a tubos colectores tipo eppendorf. La mezcla de reacción se carga en la columna
y se centrífuga de modo que los nucleótidos libres quedan retenidos en el gel.

● Cromatografía de adsorción: utiliza matrices de lana de vidrio o sílice empaquetadas en microcolumnas que
se acoplan a tubos colectores tipo eppendorf.

4.8. Sondas para hibridación in situ fluorescente en cromosomas (FISH).

El nombre de FISH viene del inglés Fluorescent In Situ Hybrididation.

La particularidad de estas sondas, en comparación con otras técnicas, es que suelen ser más grandes, ya que
tienen que detectar grandes porciones de los cromosomas.

Para ello, se pueden utilizar vectores de clonación capaces de aceptar fragmentos cromosómicos de varias
kilobases hasta una megabase, tales como los BAC (Bacterial Artificial Chromosome, plásmido F de la E. coli) o
YAC (Yeast Artificial Chromosome o Cromosoma artificial de la levadura).

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Alternativamente, se pueden utilizar mezclas complejas de sondas (toda la sonda entera no es complementaria a
la diana) más pequeñas, las cuales conjuntamente marcarán una porción considerable del cariotipo: regiones
cromosómicas, cromosomas enteros, etc.

Las sondas FISH permiten la visualización, la distinción y el estudio de los cromosomas y sus anomalías. Se
diferencian:

➢ Sondas centroméricas o ADN satélite (CEP).

➢ Sondas para cromosomas completos o de pintado cromosómico (WCP).
➢ Sondas subteloméricas (TEL).
➢ Sondas de secuencia única o de gen o locus específico (LSI).
➢ Sondas centroméricas o ADN satélite (CEP)

Hibridan con secuencias repetidas que se encuentran en los centrómeros de los cromosomas, de modo
que marcan únicamente zonas centroméricas, aunque presentan algunas excepciones, pues no se
diferencian los centrómeros de los cromosomas 13-21 y de 14-22.

Se utilizan para marcar cromosomas concretos, lo que permite detectar aneuploidías en metafase o
interfase (alteraciones de tipo numérico): especialmente monosomías, trisomías y otras aneuploidías.
Son muy apropiadas para detectar mosaicos.

Sondas para cromosomas completos o de pintado cromosómico (WCP).

Contienen un conjunto de secuencias que abarcan todo un cromosoma concreto, por lo que consigue el
“pintado” completo del cromosoma. Así, permiten visualizar cada cromosoma de un color específico.
Las sondas usadas son complementarias a cada cromosoma.

Se usa para realizar el cariotipo de un individuo y para detectar aberraciones cromosómicas (numéricas y
estructurales inter cromosómicas).

Permite detectar translocaciones complejas o identificar el origen de material adicional en un cromosoma.

También consiguen detectar de inversiones paracéntricas pero, debido a su baja resolución, no permite
detectar pequeñas deleciones, duplicaciones o traslocaciones.

Sondas subteloméricas (TEL).

Identifican regiones cercanas a los telómeros (fase que se aleja del centro).
Son sondas de ADN, que contienen secuencias únicas específicas de cada cromosoma.
Poseen una alta resolución.

Son útiles para detectar anomalías cromosómicas en las regiones teloméricas, donde hay gran cantidad de
genes.

Sondas de secuencia única o de gen o locus específico (LSI).

Hibridan con una secuencia (región concreta) única de ADN, pertenecientes a una banda o un gen.
Se puede usar en metafase e interfase.
Se usan para detectar alteraciones específicas de esa región y permiten detectar deleciones (un cromosoma
está más corto que otro, le faltaría un trozo) y duplicaciones cromosómicas de hasta 1 mb y translocaciones.

Se distinguen dos tipos:

● Sondas de fusión: se obtiene un patrón que corresponde a las dos sondas fusionadas. Se usan para detectar
traslocaciones. Tras la translocación suelen dar señal amarilla.
● Sondas break apart: dos fusiones que, al reordenarse, una de ellas se rompe. Patrón normal. Se utilizan en
hematología.

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5. Procedimiento de hibridación.

La hibridación de los ácidos nucleicos consiste en la formación de moléculas bicatenarias (denominadas

híbridos o dúplex) con hebras de ácidos nucleicos de distinto origen, mediante la unión de una secuencia diana
con la sonda marcada.
Para lograrlo, las dos hebras deben ser total o parcialmente complementarias.
A mayor proporción de bases complementarias y mayor longitud de las secuencias más estable será el híbrido.
Existen diferentes técnicas que se diferencian por:

- Tipo de ácido nucleico que se pretende detectar - Tipo de marcaje de la sonda

- Tipo de sonda que se va a utilizar - Medio o soporte en el que se realiza

En función del tipo de muestra hay distintos procesos de hibridación.

● Hibridación en solución: es la más sencilla, se realiza en medio líquido. Sirve fundamentalmente para
cuantificar el contenido de los ácidos nucleicos, sobre todo en la técnica de PCR cuantitativa.

● Hibridación en soporte sólido: se hace extracción de los ácidos nucleicos y estos se fijan a un soporte sólido:
membranas de nitrocelulosa o nylon, o chips.

● Hibridación in situ: en este caso no se extraen los ácidos nucleicos, sino que se desnaturalizan e hibridan en la
misma muestra, bien preparaciones histológicas, bien extensiones de cromosomas.

5.1. Principales etapas del proceso de hibridación.

1º) Preparación o extracción de la muestra.

En el caso de que queramos detectar ADN este se debe desnaturalizar para separar las hebras.

2º) Se añade la sonda marcada.

3º) Se produce la hibridación para la unión de la sonda con las secuencias complementarias.

4º) Lavado de la sonda no unida: es una fase crítica del proceso.

Se realiza con un tampón en el que se fijan las condiciones de rigurosidad (temperatura de lavado, fuerza iónica
y concentración de formamida).

5º) Detección de la sonda para comprobar si ha habido unión (se realiza gracias al marcaje de la sonda).
Preparación de los ácidos nucleicos y desnaturalización Añadir sonda marcada Hibridación Lavado post
hibridación Detección de la sonda

5.2. Condiciones de la hibridación

Todas las técnicas de hibridación se basan en los fenómenos de desnaturalización / renaturalización de los
ácidos nucleicos. Por ello, son importantes las condiciones en las que se realizan las técnicas.

Si las condiciones son restrictivas, sólo se unirán aquellas secuencias completamente homólogas. Pero, si las
condiciones son permisivas, se podrá dar la unión con otras secuencias parecidas, pero no totalmente idénticas.

Jugando con estas condiciones, podemos lograr una hibridación, por ejemplo, que sea específica de una especie
de microorganismo (Mycobacterium tuberculosis) o de varias (Mycobacterium ssp.), o que sea específica de un
gen o de una familia génica.
Este conjunto de condiciones se denominan condiciones de exigencia de identidad.

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Los factores que influyen en la exigencia de identidad son:

● Temperatura: alrededor de los 65ºC. Las temperaturas altas solo permiten la unión de secuencias muy
parecidas.

● Fuerza iónica: influye en la especificidad de formación de híbridos; a mayor fuerza iónica, menor
especificidad.

● Características de la sonda: cuanto mayor es su tamaño, mejor hibridación. También influye la proporción de
guanina y citosina, cuanto mayor proporción de G-C, mejor hibridación.

El porcentaje de homología con el molde influye también, cuanto más parecida sea la secuencia a la del molde,
más exigente es la reacción.

Por último, a mayor concentración de la sonda, más hibridación inespecífica.

Los factores que influyen en la hibridación son:

● Fuerza iónica de la solución: los híbridos de ácidos nucleicos tienen una carga eléctrica neta negativa por los
fosfatos dispuestos en la periferia de la doble hélice.

Los cationes de la solución se disponen rodeando los híbridos y neutralizando su carga negativa, lo que
estabiliza la doble hélice.

Por tanto, cuantos más cationes tiene la solución más calor se requiere para desnaturalizar.

● Presencia de agentes desnaturalizantes: algunos agentes y solventes orgánicos (DMSO, formamida, etc.)
desestabilizan los puentes de hidrógeno.

Por ello, al añadirlos se requiere menos energía para desnaturalizar (es más fácil la desnaturalización).

● Porcentaje de bases no complementarias o mismatch: la sonda puede unirse a secuencias parecidas a la

secuencia diana (menos del 100% de porcentaje de homología con el molde).
Cuantas más uniones hay a bases no complementarias menos energía se necesita (menos puentes de
hidrógeno).

Además, en la solución de hibridación se puede añadir otros tipos de compuestos:

● Formamida: permite bajar la temperatura a 20-30ºC sin alterar la especificidad.

● Heparina o dextrán sulfato para la hibridación in situ: forman partículas porosas que absorben el tampón y
excluyen a la sonda incrementando su concentración efectiva.