Universidad Nacional Agraria La Molina

INFORME N.°3

TINCIÓN DIFERENCIAL ÁCIDO-RESISTENTE

ASIGNATURA: Microbiología General

DOCENTE: Roberto Ramos Chaupin

ESTUDIANTES:

● 20180095- Arteaga Chacón Linda Rosemery

● 20181200 - Jacinto Chavez Anais Briggit
● 20221274- Salazar Allccaco, Sofía Patricia
● 20200149 - Salvatierra Montes Andrea Soar

MESA N.°: 2

LIMA-PERÚ
2024

I. INTRODUCCIÓN
 La tinción diferencial ácido-resistente es un método fundamental en microbiología,
que se emplea especialmente para la identificación de bacterias resistentes a
ácidos. Esta técnica posee una alta efectividad en la detección de microorganismos
como la Mycobacterium tuberculosis y la Mycobacterium leprae, causante de la
tuberculosis y lepra, respectivamente (Vázquez, 2011). Haciéndose presente desde
el diagnóstico de enfermedades hasta investigaciones epidemiológicas más
profundas, su aplicación brinda información importante sobre estas estructuras
bacterianas.

Este proceso consiste en la capacidad de ciertos microorganismos de retener el

color del colorante inicial (carbolfucsina), incluso posterior a su decoloración con
alcohol-ácido. Esta propiedad de ciertas micobacterias, está estrechamente
relacionada con la estructura de las paredes celulares de las micobacterias que
contienen lípidos y otros ácidos grasos (ácidos micólicos) de elevado peso molecular
(Graterol, 2016).

En este informe, exploraremos dos técnicas de tinción diferencial y su aplicación en

la microbiología. Así mismo, la visualización de las esporas según la técnica
empleada que puede ser la técnica de Dorner y la de Schaeffer & Fulton.

II. MARCO TEÓRICO

1. Esporas
Las esporas son estructuras indispensables para la supervivencia y
dispersión de un gran número de especies bacterianas.
Las esporas bacterianas son más resistentes que las células vegetativas de
las bacterias. Tienen una pared gruesa que las protege de la desecación, la
radiación y los productos químicos. También son resistentes a las altas
temperaturas y a la falta de nutrientes (MedlinePlus, 2023).

Las endosporas bacterianas pueden distinguirse en las preparaciones

microscópicas sin previa coloración debido a la gran refringencia de su
protoplasma, que las diferencia de las células vegetativas. En las
preparaciones teñidas por métodos comunes, las endosporas no se colorean
debido a la resistencia que ofrece su gruesa cubierta a la impregnación por
los colorantes habituales utilizados en la coloración de Gram y azul de
metileno, permaneciendo incolora rodeada por la parte coloreada (vegetativa)
de la bacteria. No obstante, es posible lograr la tinción de las endosporas por
medio de métodos especiales en los que se emplea el calor como mordiente
(María, 2022).
 Fig. 1. Estructura de una endospora

2. Técnica de Dorner
Se hace uso de la carbonilfucsina para la tinción de la espora y de nigrosina
como agente decolorante y de tinción negativa. Las esporas se verán de
color rojo, el resto de la bacteria incolora, sobre un fondo negro.
- Nigrosina: Es una mezcla de tintes negros sintéticos producidos por
calentamiento de una mezcla de nitrobenceno anilina e clorhidrato de
anilina. Se utiliza industrialmente como colorante de lacas y barnices.
Su sulfonación produce un tinte soluble aniónico, nigrosina WS.
(Willey, 2017).
3. Técnica de Schaeffer y Fulton
La tinción de esporas bacterianas, también llamada tinción Schaeffer-Fulton,
es utilizada ampliamente para la identificación de bacterias esporuladas,
generalmente pertenecientes a los géneros Bacillus y Clostridium, algunas de
las cuales son patógenas por naturaleza (Domínguez, 2013).
Esta técnica emplea carbolfucsina para teñir la espora, alcohol ácido como
decolorante y verde malaquita como colorante de contraste. Dará como
resultado la tinción de la espora de color rojo y la parte vegetativa de color
verde.

Fig. 2. Tinción de Schaeffer & Fulton

- Colorante primario: Carbolfucsina, es una tinción bacteriológica
especial utilizada para identificar organismos acidorresistentes que
resisten a la tinción por métodos ordinarios. Las micobacterias se
tiñen de color rojo magenta (ChemLab).
- Decolorante: Alcohol-ácido, Una vez aplicado el agente decolorante,
las células ácido-alcohol resistentes resisten la decoloración, debido a
que el colorante primario es más soluble en la cera de la pared que
en el agente decolorante. Por lo tanto, el colorante primario será
retenido y las micobacterias permanecerán rojas.
- Contracolorante: Verde Malaquita, Este colorante es utilizado como el
reactivo final que colorea a las células incoloras. Las células ácido-
alcohol resistentes, debido a la composición de su pared, no serán
teñidas por este colorante, estas se verán color fucsia, ya que
previamente fueron teñidas con el colorante primario. Es por esto que
la espora se tiñe de rojo y la parte vegetativa de verde.
III. DISCUSIÓN
Las técnicas de Dorner y la técnica de Schaeffer-Fulton son métodos comúnmente
utilizados en microbiología para la identificación de endosporas en bacterias. Las
endosporas son estructuras de resistencia formadas por ciertas bacterias en
respuesta a condiciones ambientales desfavorables. Estas técnicas son cruciales
para identificar la presencia de endosporas en muestras bacterianas, lo que puede
ser importante tanto para el diagnóstico clínico como para la investigación
microbiológica.(Dominguez, 2012)
Aquí la estructura protagónica es la endospora, la cual se forma cuando hay una
carencia nutricional dentro de la célula bacteriana, a su vez es muy resistente a
efectos dañinos como el calor, la desecación, la precesión, etc. Esta gran resistencia
se debe a su capa exterior que contiene queratina, además por su estado
deshidratado. Su formación en la célula vegetativa es llamada esporulación, tarda
algunas horas. Su ubicación puede variar, a veces puede estar en el centro de la
célula vegetativa o en alguno de los extremos y su diámetro puede ser menor o
mayor que el aquella.(González, 2020).
En cuanto a su afinidad con los colorantes en una tinción para su identificación, las
endosporas presentan una característica distintiva en su estructura que les permite
resistir la tinción con colorantes convencionales utilizados en las técnicas de tinción
bacteriana, como la tinción de Gram. Esto se debe a que la capa externa de la
endospora, llamada esporangio, es muy impermeable a los colorantes.
Por lo tanto, para poder visualizar las endosporas en una muestra bacteriana, se
utiliza una técnica de tinción específica llamada tinción ácido-resistente. En esta
técnica, se utilizan colorantes especiales, como el verde malaquita o la safranina, y
se aplica calor para facilitar la penetración de los colorantes en la estructura de la
endospora. De esta manera, las endosporas pueden ser teñidas y visualizadas bajo
el microscopio óptico. (Madigan, 2019)
Tras aplicar la técnica de Schaeffer-Fulton al cultivo de Bacillus sp., observamos una
coloración característica en las células bacterianas. Las células vegetativas
adquirieron un tono verde, mientras que las endosporas retuvieron un color rojo o
rosado brillante. Esta distinción nos permitió identificar claramente la presencia de
endosporas en el cultivo de Bacillus sp. Sin embargo, observamos cierta variabilidad
en la intensidad de la coloración entre las muestras, lo que podría deberse a
diferencias en la preparación de la muestra o en la edad del cultivo. A pesar de estas
variaciones, la técnica de Schaeffer-Fulton demostró ser efectiva para la
visualización de las endosporas en el cultivo de Bacillus sp., lo que respalda su
utilidad como herramienta de diagnóstico en microbiología.(Prats, 2023)
Al aplicar la técnica de Dorner al cultivo de Bacillus sp., observamos una mejora
notable en la visualización de las endosporas en comparación con la técnica de
Schaeffer-Fulton. Las endosporas adquirieron un tono rojo o rosado distintivo,
mientras que las células vegetativas permanecieron incoloras. Esta nitidez en la
distinción entre las células vegetativas y las endosporas facilitó la identificación de
estas últimas en el cultivo de Bacillus sp. Aunque la técnica de Dorner requiere
equipo adicional y un procedimiento ligeramente más complicado, los resultados
obtenidos respaldan su eficacia como una herramienta mejorada para la
visualización de endosporas en microbiología.(Prats, 2023)

IV. CONCLUSIONES
 ● Se logró distinguir a través de las técnicas de tinción DONER Y
SCHAEFFER y FULTON ,la presencia de endosporas bacterianas y
diferenciarlas de sus estructuras vegetativas.
● En la práctica se comprobó, la compleja y resistente estructura de las
endosporas hace que no sea fácil su tinción ni su decoloración.
● Se empleó la carbolfucsina en ambas tinciones como colorante primario ya
que es altamente reactivo y además el fenol contenido en su interior actuó
como mordiente.
● En algunos casos, se excedió el suministro de calor en la técnica de
Schaeffer y Fulton por lo que las partes vegetativas de algunas células
reventaron quedando solo sus respectivas endosporas.

V. CUESTIONARIO
1.¿Cuál de los métodos utilizados le permitió observar mejor las endosporas
bacterianas? A qué atribuye la diferencia
En la segunda técnica se utiliza la técnica de Scheffer y Fulton que se diferencia del
método Dörner en la tinción de la parte vegetativa. La parte vegetativa en éste
método resulta teñida, la endospora es teñida por la carbolfucsina de color rojo,
mientras la zona vegetativa se tiñe gracias a la verde malaquita quien brinda una
coloración de azul-verdoso. Toda la célula se diferencia tanto de su vegetativa y
endospora, cada una con diferente coloración. Por lo tanto al grupo de trabajo le
pareció más efectiva la segunda técnica (Scheffer y Fulton) ya que permite observar
mejor el tamaño de las bacterias, su forma y poder diferenciarlas con colorantes
distintos (carbolfucsina y verde malaquita), además de ser la técnica que mayor
cantidad de grupos de trabajos pudo efectuar satisfactoriamente.

2.¿Qué efecto produciría el reemplazar el alcohol ácido por otro colorante como el
alcohol acetona ?
En el el método de SCHAEFFER y FULTON , se utilizó el alcohol ácido como
decolorante de carbolfucsina en la muestra de Bacillus sp, la cual se resistió a la
decoloración debido a la alta concentración de ácido micolitico en la pared
celular.En bacterias que no son acidorresistentes ,la carbolfucsina se elimina con
facilidaddurante la decoloracion.Si se hubiese usado la mezcla de alcohol/ cetona ,el
cual es un solvente lipídico ocasiona que la membrana de la pared se disuelva y no
habría el mismo efecto,ya que este debe utilizarse con colorantes básicos y la
carbolfucsina es ácido.

3.¿Qué otros géneros de bacterias pueden formar endosporas?

Ciertos géneros de bacterias Gram-positivas, tales como Bacillus,

Clostridium, Sporohalobacter, Anaerobacter y Heliobacterium, pueden formar
endosporas. En casi todos los casos, las endosporas no forman parte de un
proceso reproductivo, aunque Anaerobacter puede formar hasta siete
endosporas a partir de una célula. Las endosporas tienen una base central de
citoplasma que contiene DNA y ribosomas, rodeada por una corteza y
protegida por una cubierta impermeable y rígida. Las endosporas no
presentan un metabolismo detectable y pueden sobrevivir a condiciones
 físicas y químicas extremas, tales como altos niveles de luz ultravioleta, rayos
gamma, detergentes, desinfectantes, calor, presión y desecación. En este
estado durmiente, las bacterias pueden seguir viviendo durante millones de
años, e incluso pueden sobrevivir en la radiación y vacío del espacio exterior.
Las endosporas pueden también causar enfermedades. Por ejemplo, puede
contraerse carbunco por la inhalación de endosporas de Bacillus anthracis y
tétanos por la contaminación de las heridas con endosporas de Clostridium
tetani.

4.Revise otras técnicas de tinción de endosporas y comparelas con las usadas en

este ejercicio.Destaquen ventajas y desventajas

Técnicas de Tinte para agente Resultados

tinción de teñir decolorante
endosporas endospora

DORNER carbolfucsina nigrosina - tinción negativa

- la espora se tiñe de rojo
- parte vegetativa
incolora
- estructura aparece
sobre un fondo oscuro
- emplean fenol y alta
temperatura como
agentes coadyuvantes

SCHAEFFER & carbolfucsina alcohol ácido y - La endospora se tiñe de

FULTON verde malaquita rojo
como colorante - parte vegetativa verde
de contraste - emplean fenol y alta
temperatura como
agentes coadyuvantes

WIRTZ-CONKLIN) verde safranina - La endospora se tiñe de

malaquita verde
- parte vegetativa de rojo

Existen otros métodos , como por ejemplo si utilizamos un cultivo viejo y la tinción de Gram,
Rodamina-Auramina, Naranja de Acridina, Ziehl-Neelsen, etcétera. Se observará un espacio
sin colorear que sería la endospora y la bacteria coloreada

VI. BIBLIOGRAFÍA
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