Microscopía

Introducción
• El ojo humano puede distinguir a 25cm
dos objetos separados entre sí 0.2mm

• Este es el poder separador o poder de

resolución del ojo. Las células de
mamífero suelen tener 0.01mm de
tamaño, por tanto, son invisibles al ojo
humano.

• Para estudiar la morfología y estructuras

celulares, así como diagnosticar posibles
patologías, es imprescindible el empleo
de la microscopía.
 Conceptos básicos de óptica
 Muchas técnicas del laboratorio que tienen su base en la
óptica permitiendo distinguir elementos microscópicos

 La óptica es la rama de la ciencia que estudia la luz, sus

características y manifestaciones.

 Comprende el estudio del comportamiento de la luz, la

interacción de la luz con la materia y la formación de las
imágenes.
 Conceptos básicos de óptica
La luz:
 La luz es una oscilación electromagnética que se propaga en
el vacío o en un medio transparente y que puede ser
percibida por nuestro sentido de la vista. La luz, constituye
una pequeña parte del espectro electromagnético.

 El espectro electromagnético es el rango de todas las

radiaciones electromagnéticas posibles.
 Conceptos básicos de óptica
La luz:
 Las ondas se caracterizan por:
 La amplitud de onda (a): es la desviación de la onda con relación a
su valor medio.
 La longitud de onda (λ): es la distancia que separa dos crestas
sucesivas.
 La frecuencia de onda (f): es el número de oscilaciones por
segundo y está relacionada con la energía que transporta la onda,
a más energía, más frecuencia. Se expresa en hercios (Hz) y es
inversamente proporcional a la longitud de onda
 Conceptos básicos de óptica
La luz:
 Las ondas
 Las ondas de más frecuencia y más energía son radiaciones
ionizantes
 El ojo humano se caracteriza por ver en el espectro visible 380-800
nm
 La luz contiene todos los colores, lo que percibimos como el color
es las distintas longitudes de onda que se reflejan en el objeto
 Conceptos básicos de óptica
La luz:
 Conceptos básicos de óptica
La luz:
 En función de cómo se relaciona la luz con los objetos se
pueden distinguir tres tipos de materiales:
 Materiales opacos
 Materiales traslúcidos
 Materiales transparentes
 Conceptos básicos de óptica
La luz:
 Materiales opacos
 No permiten el paso de la luz a través de ellos y el color que
percibimos depende de la longitud de onda que reflejen
 Si absorben todas las longitudes de onda se perciben como negros

 Si reflejan todas las longitudes de onda se perciben como blancos

 Si absorben todas las longitudes de onda salvo una, los veremos del
color de la longitud de onda que reflejan
 Conceptos básicos de óptica
La luz:
 Materiales transparentes
 Dejan pasar la luz
 Toda la luz que atraviesa el material toma la misma dirección
 Esto hace que se puedan distinguir los contornos y formas
 Materiales traslúcidos
 Dejan pasar la luz
 La luz que atraviesa el material toma distintas direcciones
 Esto hace que a través de ellos todo se vea borroso
 Conceptos básicos de óptica
La visión:
 Los ojos detectan la energía lumínica a través de la retina.
Esta luz previamente pasa por la pupila y el cristalino que
enfoca los rayos y forma una imagen invertida

 Las células de la retina detectan las señales y se las envían al

cerebro que las interpreta
Conceptos básicos de óptica
La visión:
 Dentro de la retina existen dos tipos de fotorreceptores:

 Los bastones: Detectan la intensidad lumínica. Permiten ver en

condiciones de poca luz. No distinguen colores
 Conos: Detectan el color. En los humanos se presentan tres tipos
de conos: rojo, verde y azul
Las lentes
 Las lentes permiten enfocar un objeto y permiten obtener
imágenes para su estudio
 La luz se transmite en partículas llamadas fotones
(desplazándose de forma rectilínea) y se comporta como
una onda
 Además, puede tener distintos comportamientos:
Reflexión
Refracción
Las lentes
Reflexión
 Es un fenómeno por el cual la luz no penetra en el objeto,
sino que rebota y se dispersa en otra dirección.
 En función de la superficie la dispersión será más o menos
difusa:
 Las superficies pulidas toda la luz va en una dirección (dispersión
especular)
 Las superficies irregulares la luz sale en todas las direcciones
(dispersión difusa)
 Si es una superficie intermedia, dispersión predominará en una
dirección
Las lentes
Refracción
 Es el fenómeno por el cual la luz cambia de dirección al
pasar oblicuamente de un medio a otro de distinta
densidad
 Esta capacidad es propia tanto de los sólidos como de los
fluidos y gases
 A mayor refracción más lenta irá la luz con respecto a su
velocidad en el vacío
 Cada sustancia tiene un índice propio de refracción que se
calcula con la siguiente fórmula:
Las lentes
Refracción:
 Este fenómeno es el que usan las lentes. Una lente es
definida como todo objeto capaz de desviar la luz.
 Lentes convergentes o convexas: Funcionan como lentes de
aumento, los rayos coinciden en un punto y forman una imagen
ampliada del mismo
 Lentes divergentes o cóncavas: Funcionan como lentes de
reducción, dispersa los rayos formando una visión más reducida
del objeto
Microscopía
 La visualización de estructuras tales como las células y los tejidos, es
básica para poder detectar e identificar situaciones patológicas.

 Pero son más pequeñas que el poder de resolución del ojo humano y
encima son transparentes e incoloras.

 A lo largo de la historia se desarrollaron distintas técnicas de tinción

que aumentan el contraste y permiten diferenciar estructuras dentro
de la célula.

 Además, se desarrolló el microscopio electrónico que permitía ver

las estructuras detalladamente.
Microscopía
Microscopía
Componentes básicos de un microscopio:
 Un sistema de iluminación que puede emitir luz, radiaciones
electromagnéticas, electrones, conformando un rayo
incidente.
 Un sistema óptico que con un conjunto de lentes consiga el
aumento adecuado.
 Un sistema mecánico que es el conjunto de piezas que sirven
de soporte a las lentes y demás elementos (pie o base,
columna, mecanismo de enfoque, platina, revolver, tubo).
Propiedades ópticas del microscopio

 Aumento
 Poder de resolución
 Profundidad de foco
 Amplitud del campo
Propiedades ópticas del microscopio
Aumento
 Es el número de veces que se aumenta el tamaño real de un
objeto.
 Capacidad del microscopio de agrandar la imagen para ser
vista por el ojo humano.
 El poder de aumento de una lente está determinado por el
grado de curvatura de su superficie; en las lentes convexas,
cuanto mayor sea la curvatura, mayor será el aumento.
Propiedades ópticas del microscopio
Poder de resolución
 Depende de:
 Las lentes
 La longitud de onda de la radiación de luz
 Del índice de refracción del material que atraviesa la luz
 Del tamaño del objetivo; cuanto mayor sea, mayor haz de luz
podrá captar.
 El poder de resolución está determinado por su límite de
resolución que es la distancia mínima entre dos puntos
necesaria para distinguirlos
Propiedades ópticas del microscopio
La profundidad de foco:
 Es la posibilidad de enfocar correctamente un objeto de
cierto grosor.

La amplitud del campo:

 Es la parte de la preparación que se ve aumentada.
 A menor aumento, mayor campo.
 Técnicas de microscopía
Microscopio óptico:
 Es el más común en el
laboratorio, usa lentes ópticas
que refractan la luz
 Usa la luz visible y se basa en
un sistema de lentes entre la
muestra y el ojo humano
 Técnicas de microscopía

Microscopio óptico:
 Sistema óptico:
 Oculares:
- Todos los microscopios actuales poseen dos oculares son
binoculares. Los primeros microscopios eran monoculares.
- Los microscopios más avanzados, tanto el objetivo como el
ocular suelen estar compuestos por varias lentes
 Técnicas de microscopía
Microscopio óptico:
 Sistema óptico:
 Objetivos:
- Los objetivos colectan la luz proveniente del espécimen y
proyectan una imagen nítida real, invertida y aumentada
hacia el cuerpo del microscopio
- Hoy en día los microscopios ópticos poseen un revólver
donde se encuentran varios objetivos. Cada objetivo lleva
impreso los aumentos que proporciona.
- Los aumentos más usados del objetivo suelen ser 10x, 20x,
40x y 100x. Rotando el revólver se puede seleccionar el
objetivo y por tanto el aumento al que queremos observar la
preparación.
 Técnicas de microscopía
Microscopio óptico:
 Sistema óptico
 Objetivos
− En el objetivo de 100x es necesario utilizar aceite de
inmersión entre el objetivo y la muestra
− Esto es debido a que la refracción de la luz es alta en el aire y
provoca alteraciones en la imagen que se ponen de
manifiesto con objetivos con esta capacidad de aumento
− El aceite de inmersión reduce enormemente esta refracción
permitiendo imágenes mucho más nítidas
Principio de la microscopía de inmersión. Recorrido de los rayos con medio de
inmersión (fondo amarillo, mitad izquierda) y sin él (mitad derecha). Los rayos (en
negro) procedentes del objeto observado (punto rojo) en un cierto ángulo pasan por
el cubremuestras (color naranja, arriba y abajo) inciden en el objetivo (azul oscuro)
sólo si se utiliza la inmersión. En caso contrario, la refracción entre el cubremuestras
y el aire provoca que los rayos queden fuera del objetivo, perdiéndose la imagen.
 Técnicas de microscopía
Microscopio óptico:
 Sistema óptico
 Objetivos
Los objetivos suelen tener un código de colores:
 Anillo blanco y anillo negro: 100x Objetivo de inmersión

 Anillo azul: 40x

 Anillo verde 20x

 Anillo amarillo: 10x

 Anillo rojo 4x
 Técnicas de microscopía
Microscopio óptico:
 Sistema mecánico
Se le llama montura y su forma es muy variable. Contiene:
 Soporte: mantiene la parte óptica. Tiene un peso considerable
para garantizar la estabilidad del instrumento. Tiene dos
partes, el pie o base y el brazo.
 Cabezal: contiene los sistemas de lentes oculares, puede ser
monocular o binocular.
 Tornillos de enfoque (macrométrico y micrométrico): Enfocan
variando la distancia, la distancia de enfoque depende del
objetivo
 Técnicas de microscopía
Microscopio óptico:
 Sistema mecánico
Contiene:
 Platina

− Es la plataforma horizontal donde se coloca la preparación

− Generalmente es de forma cuadrada y posee un sistema de

fijación para inmovilizar el portaobjetos
− En el centro tiene un orificio circular, por donde pasa el
rayo de luz producido por la fuente luminosa y proveniente
del condensador
 Técnicas de microscopía
Microscopio óptico:
 Sistema mecánico
Contiene:
• Revolver

− Está constituido por una semiesfera situada en la parte

inferior del tubo
− Posee una serie de anillos en los cuales van atornillados
diferentes objetivos
− La semiesfera gira alrededor de un eje lo cual permite el
intercambio rápido de objetivos mediante un movimiento
de rotación
 Técnicas de microscopía
Microscopio óptico:
 Sistema de iluminación
 Fuente de luz
Actualmente se usa una lámpara cuyo haz de luz atraviesa el
diafragma, el condensador, la muestra y, tras ello, penetra por el
objetivo y atraviesa los oculares hasta nuestros ojos
 Técnicas de microscopía
Microscopio óptico:
 Sistema de iluminación
 Fuente de luz
Tipos de luz:
Bombillas de tungsteno y halógenas: la mayoría de los
microscopios las usan. Emiten luz continua en un espectro
comprendido entre 300 y 1200nm. Esta luz puede ser
demasiado brillante para la observación por lo que se aplican
filtros de densidad neutra que disminuyen la intensidad de
luz sin afectar a los colores.
 Técnicas de microscopía
Microscopio óptico:
 Sistema de iluminación:
 Fuente de luz
Tipos de luz:
Lámparas de arco electrónico
proporcionan luz monocromática y se suelen usar con filtros. Su
luz es ideal para la microfotografía. También se utilizan en los
microscopios de fluorescencia.

Láser:
algunos microscopios disponen de un dispositivo que ilumina
mediante láser. Se emplea sobretodo en microscopía confocal
 Técnicas de microscopía
Microscopio óptico:
 Sistema de iluminación
 Diafragma
− Es un dispositivo que está colocado inmediatamente por
debajo de la platina
− Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. La
apertura del diafragma se regula en relación al tipo de
objetivo que se esté utilizando
 Técnicas de microscopía
Microscopio óptico:
 Sistema de iluminación
 Condensador
Es un dispositivo que contiene una lente que concentra y
focaliza la luz proveniente de la fuente sobre la sección de
tejido. Debajo de la platina.
 Técnicas de microscopía
Microscopio óptico:
 Accesorios:
− Existen accesorios que facilitan el trabajo haciéndolo más
rápido y efectivo o ampliando las capacidades del
instrumento
− Existen distintos tipos de accesorios en base a su función
 Técnicas de microscopía
Microscopio óptico:
 Accesorios:
 Accesorios para capturar y procesar imagen:
− Son equipos especiales asociados al microscopio para
fotografiar o filmar lo observado. Para fotografiar se emplean
desde cámaras fotográficas clásicas hasta cámaras digitales
especializadas que están acopladas al microscopio.
− Para filmar se pueden acoplar cámaras de vídeo al
microscopio
Componentes básicos del microscopio óptico:
Técnicas de microscopía
Reglas generales para el uso del microscopio óptico

 Colocarnos en una postura adecuada. Sentarse con la espalda

recta y ajustar la distancia interpupilar.

 Colocar el objetivo de menor aumento y bajar la platina

completamente.
• Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas
metálicas.

• Conectar el sistema de iluminación.

• Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en

posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es
de bacterias.
 Técnicas de microscopía
Reglas generales para el uso del microscopio óptico:

Para realizar el enfoque:

 Usar primero el macrométrico. Esto debe hacerse mirando
directamente y no a través del ocular

 Mirando, a través de los oculares, ir separando lentamente el

objetivo de la preparación con el macrométrico y cuando se
observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta
obtener un enfoque fino.
 Técnicas de microscopía
Reglas generales para el uso del microscopio óptico:

 Pasar al siguiente objetivo (girando el revolver). La imagen

debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover
un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino.

 Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen es

preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la
operación
 Técnicas de microscopía
Reglas generales para el uso del microscopio óptico:

 El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la

preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de
percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan
las precauciones anteriores, y mancharlo con aceite de
inmersión si se observa una preparación que ya se
enfocó con el objetivo de inmersión.
 Técnicas de microscopía

Reglas generales para el uso del microscopio óptico:

 Una vez finalizada la observación, y con más razón si hemos

utilizado el aceite de inmersión, debemos limpiar estos
objetivos con un paño impregnado en una solución de origen
orgánico (alcohol-cetona o alcohol- éter).
 Técnicas de microscopía
Microscopio óptico:
 Para poder ver una muestra al microscopio, ésta tiene
que ser previamente preparada. Normalmente se
tiende a generar una capa muy fina de la muestra y se
tiñe para aumentar el contraste y diferenciar
estructuras
 Técnicas de microscopía
Microscopía fotónica especial:

 Dentro de la microscopia óptica, los microscopios de

campo claro (los más comunes) tienen un bajo
contraste y no permiten ver estructuras
 Para esto, se crearon distintos accesorios que generan
toda una variabilidad dentro de la microscopia óptica
que es la microscopia fotónica especial
 Técnicas de microscopía
Microscopia fotónica especial:
Microscopía de campo oscuro:

PRINCIPIO

Permite la desviación de los rayos de luz. Sólo aquellos rayos que han sido
desviados por la muestra observada serán captados por el objetivo

INSTRUMENTACION

Condensador especial
 Se plantea el condensador de forma que genere unos haces de luz cuya
dirección no coincide con el objetivo.

 Mientras estos haces no se desvíen la luz no entra en el objetivo y se

verá negro
 Sin embargo, si algo desvía la luz como una estructura cristalinas,
membranas o sustancias que modifiquen el índice de refracción, dicha
luz entrará en el objetivo y se verán estructuras brillantes dentro de un
fondo oscuro
Técnicas de microscopía
Microscopia fotónica especial:

Microscopio de campo oscuro

 Técnicas de microscopía
Microscopia fotónica especial:
Microscopio de campo oscuro

− El objeto iluminado dispersa la luz y se hace así visible contra el fondo oscuro que
tiene detrás.

− Como las partículas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una
habitación cerrada.

VENTAJA

Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes

y sin pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra, es decir, sin
matarla.
INCOVENIENTE

Imágenes con poca resolución

Al formarse imágenes microscópicas que solamente están constituidas de rayos difractados, hacen
evidente la falta de los rayos directos para presentar completa la información estructural de la
muestra, si la comparamos con el microscopio de campo claro.
Técnicas de microscopía
Microscopia fotónica especial

Microscopia de campo oscuro:

APLICACIONES

 Observar especímenes de tamaño pequeño no coloreados

 Observar células móviles difíciles de observar con microscopía
ordinaria
 Estudio de procesos biológicos como la mitosis o la migración
celular.
Técnicas de microscopía
Microscopia fotónica especial:
Microscopia de campo oscuro:
 Técnicas de microscopía
Microscopia fotónica especial:
Microscopia contraste de fases:

PRINCIPIO
• Utiliza el mismo principio que la microscopía de campo oscuro:

• Aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción

en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una
muestra de tejido

• En este caso la luz sin desviar sí entra en el objetivo, pero con

una intensidad diferente a la intensidad que se obtiene cuando
la luz es desviada en una u otra dirección.

VENTAJAS

• Aumenta muchísimo el contraste

• Útil para células vivas. Permite observar células sin colorear.
• La mayoría de los organismos vivos no pueden ser teñidos
debido a que los colorantes utilizados pueden dañar su
estructura celular hasta el punto de su muerte

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 Técnicas de microscopía
Microscopia fotónica especial:
Microscopio de contraste de fases

• Condensador especifico
• Moduladores:
diafragma anular
anillo de fase
Técnicas de microscopía
Microscopia fotónica especial:
Microscopia contraste de fases:
Técnicas de microscopía
Microscopia fotónica especial:
Microscopia contraste de fases:
 Técnicas de microscopía
Microscopía fotónica especial:

Microscopía de interferencia o de Novarski:

• Es una variación de la microscopía de contraste de fases

• En este caso se utiliza luz polarizada, cuando la muestra desvía la luz

cambia el tono del fondo generando un arco de oscuros y claros en
función de cómo se desvíe la luz polarizada

• Esto genera una sensación de tridimensionalidad

APLICACIONES

 Células vivas no coloreadas

 Muestras que no permitan el contraste de fases
 Técnicas de fertilización in vitro
Técnicas de microscopía
Microscopía fotónica especial:
Microscopio de interferencia
 Microscopia fotónica especial:
Microscopia de interferencia:

INSTRUMENTACION

• Filtro polarizador y prisma

• NO modulador de diafragma, ni anillo de fase

VENTAJAS

Elimina el halo que aparece en la microscopía de fases

 Técnicas de microscopía
Microscopia fotónica especial:
Microscopia de interferencia:
 Técnicas de microscopía
Microscopia fotónica especial:

Microscopio invertido
Objetivos en posición invertida

APLICACIONES

Observar cultivos bacterianos

INCOVENIENTE

Necesario teñir muestra

 Técnicas de microscopía
Microscopía fotónica especial:

Microscopía de fluorescencia:

 La fluorescencia es un fenómeno muy rápido que consiste en

que los objetos que absorben luz a una determinada onda (UV)
se excitan y liberan energía emitiendo luz de una longitud de
onda mayor

 Esta longitud de onda que emiten está dentro del espectro

visible y suele ser de color rojo, verde, amarillo y azul

 Para esta técnica se utilizan fluorocromos

 Técnicas de microscopía
Microscopía fotónica especial:

Microscopía de fluorescencia:

 Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente usado para

crear contraste en distintas zonas de los especímenes
 Fluoróforo: Parte de la molécula que le da la propiedad de
producir la fluorescencia
 Cada fluorocromo tiene su propio espectro de absorción y de
emisión entre los que se encuentra el naranja de acridina, la
rodamina y fluoresceína.
 Técnicas de microscopia
Microscopía fotónica especial:
Microscopía de fluorescencia:
La fluorescencia permite el marcaje selectivo de moléculas y
compuestos celulares pequeños lo que aumenta el contraste y
la resolución. La técnica más utilizada de fluorescencia es la
inmunofluorescencia
Técnicas de microscopia
Microscopía de fluorescencia:
 Técnicas de microscopia
Microscopía fotónica especial:
Microscopía de fluorescencia:
 Requisitos:
▪ Luz intensa de onda corta: Se emplean lámparas de mercurio
que generan luz UV, también pueden emplearse lasers. La luz
incide de manera oblicua sobre la muestra (epi-iluminación)
▪ Filtros: Permiten el paso de la luz a una determinada longitud
de onda (la del fluorocromo) y bloquean las no deseadas
dando un fondo oscuro a la observación.
▪ Un cuarto oscuro o cuarto de fluorescencia: La fluorescencia
pierde contraste y resolución si hay luz externa se necesita un
cuarto con oscuridad casi completa
Técnicas de microscopía
Microscopía fotónica especial:
Microscopía de fluorescencia:

APLICACIONES

 Marcaje de moléculas en células y tejidos para su

caracterización e identificación
 Estudios de células normales y patológicas.
 Estudios inmunológicos
Microscopía fotónica especial:

Microscopio de fluorescencia
 Técnicas de microscopía
Microscopía fotónica especial:
Microscopía de luz ultravioleta:
 La luz ultravioleta aumenta mucho el
poder de resolución
 Al ser una luz invisible al ojo humano
y muy nociva no puede observarse
directamente por lo que se suele
utilizar fluorescencia, fotografía o
sensores digitales
 Todos los elementos que intervienen
en el microscopio están hechos de
cuarzo o fluorita, nunca podrán ser
de vidrio porque este no transmite la
UV
 Técnicas de microscopía
Microscopía fotónica especial:

Microscopía de luz ultravioleta:

 La estructura del microscopio es igual al
microscopio de fluorescencia tan solo cambia la
fuente de luz que suele ser lámparas de arco de
mercurio o xenón
 Las imágenes obtenidas son similares a la
fluorescencia
 Se emplea en ciencia forense para el análisis de
drogas, ADN y estudios bioquímicos
Técnicas de microscopía
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
 Este tipo de microscopía permite ver estructuras casi a nivel
molecular
 La λ que utiliza es mucho más corta que la microscopía
óptica por lo que permite ver estructuras mucho más
pequeña sin perder resolución
 El poder de resolución del microscopio electrónico es
40000 veces más que el microscopio óptico y distingue
puntos a una distancia mínima de 0,2 nm
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:

 En lugar de un haz de fotones, esta microscopía utiliza un

haz de electrones de diversas longitudes de onda

INCOVENIENTE

 El inconveniente de esta técnica es el procesado de la

muestra, que entre otras cosas debe de tener muy poco
espesor
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Componentes básicos:
 Fuente de electrones: emite los electrones que van a chocar
con la muestra.
 Lentes magnéticas: dirigen y enfocan el haz de electrones.
 Sistema de vacío: evita que los electrones sean desviados
por las moléculas de aire.
 Placa fotográfica o pantalla fluorescente: se coloca detrás
del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada.
 Sistema de registro: muestra la imagen que producen los
electrones, suele ser un ordenador.
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Hay dos tipos de microscopios electrónicos:
De barrido
De transmisión
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Tipos:
Microscopía de transmisión (MET):
 Se corta al espécimen en láminas ultrafinas (nm) y se coloca en
una lámina de cobre
 La lámina es bombardeada con un haz enfocado de electrones

 Se proyecta la silueta en una placa fluorescente o fotográfica

 La resolución máxima es de 0,2 nm

 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Tipos:
Microscopía de barrido (MEB):
 Permite observar la superficie de un elemento mediante epi-
iluminación
 La resolución máxima es de 10nm y tiene un aumento de 20.000x

 Genera imágenes con aspecto 3D gracias a que los electrones que

chocan en la superficie (electrones primarios) rebotan y son
desviados (electrones secundarios) los cuales son recogidos por
un detector que genera una señal que permite ver una imagen a
través de una pantalla
 En este proceso, los átomos del espécimen producen rayos X que
también puede ser detectados
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Microscopía de transmisión:
 Requiere cortes muy finos para que lo puedan atravesar los
electrones
 Para ello el MET dirige el haz hasta la zona que se quiere
aumentar. Una parte de los electrones rebotan y/o son
absorbidos mientras que otra parte atravesará generando así una
imagen
 Esto requiere una placa fotográfica o fluorescente. El aumento
puede ser de hasta 106x
Microscopía electrónica
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Microscopía de transmisión:
Los pasos para hacer la preparación son:
− Fijación

− Contraste

− Deshidratación

− Inclusión

− Corte

− Observación y toma de micrografías

 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Microscopía de transmisión:
Los pasos para hacer la preparación son:
- Fijación
 El tejido se fija y endurece para luego preservarlo en OsO4 y
glutaraldehido, todo ello con un pH muy regulado
 De esta manera se forma en las membranas y proteínas una
malla tridimensional que protege de la degradación oxidativa
tras la muerte del espécimen
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Microscopía de transmisión:
Los pasos para hacer la preparación son:
- Contraste:
 Las estructuras que se quieren observar deben presentar
resistencia a ser atravesadas por un haz de electrones
(electrodensidad)
 La electrodensidad depende del tamaño del átomo (cuanto
más pesado más contraste) por lo que se utiliza OsO4 o acetato
de uranilo o citrato de plomo
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Microscopía de transmisión:
Los pasos para hacer la preparación son:
- Deshidratación:
 Al tener que introducir el espécimen en el vacío no puede
contener nada de agua ya que esta se evaporaría al instante y
dispersaría los electrones
 Para ello el agua se elimina mediante alcoholes que van
aumentado en concentración de forma gradual
 Técnicas de microscopia
Microscopía electrónica:
Microscopía de transmisión:
Los pasos para hacer la preparación son:
- Inclusión:
El espécimen deshidratado se coloca en óxido de propileno y
resinas epóxicas que se endurecen y forman un bloque sólido
muy duro de plástico
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Microscopía de transmisión:
Los pasos para hacer la preparación son:
- Corte:
 Se emplea un ultramicrotomo que utiliza una cuchilla de
diamante para realizar cortes de 100 nm
 Esto es importante debido a que los electrones tienen un
bajo poder de penetración

- Observación y tomas de micrografías

Técnicas de microscopía

Microscopía de transmisión
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Microscopía de transmisión:

APLICACIONES

 Estudio de ultraestructuras celulares y cristalinas

 Reconocimiento de virus
 Citoquímica
 Biología molecular
 Técnicas de microscopia
 Microscopía electrónica:
 Microscopía de transmisión:
 Los pasos para hacer la preparación son:
 Observación y tomas de micrografías
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Microscopía de barrido:
 Crea una imagen 3D del objeto por lo que no hace falta
cortarlo en capas
 En esta ocasión en haz de electrones recorre la muestra
haciendo un barrido haciendo que estos electrones en
contacto con la muestra se disperse o formen electrones
secundarios
 Tanto los dispersados como los secundarios son recogidos
por detectores situados a los lados
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Microscopía de barrido:
 Cada punto de la muestra es un pixel en la pantalla, en
función del número de electrones recogidos en ese punto,
ese pixel tendrá mas o menos brillo
 El aumento llega hasta 200.000x y la MEB es utilizada para
obtener una información realista de la superficie de los
objetos
 Cuanto más intenso sea el haz de electrones mejor se verá
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Microscopía de barrido:
Pasos para realizar la preparación:
- Fijación:
Se realiza una fijación estándar usando calor o alcoholes
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Microscopía de barrido:
Pasos para realizar la preparación:
- Deshidratación:
 El más utilizado es el de por punto crítico de CO2 donde se
evapora todo el agua líquida sin que esta llegue a
ebullición
 No se puede deshidratar utilizando alcohol porque
produce muchos artefactos
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Microscopía de barrido:
Pasos para realizar la preparación:
- Corte:
No es necesario, se observa la superficie
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Microscopía de barrido:
Pasos para realizar la preparación:
- Contraste:
Una vez deshidratado, la muestra se cubre con una capa de
grafito, oro o plata
 Técnicas de microscopía
Microscopía electrónica:
Microscopía de barrido:
Pasos para realizar la preparación:
- Observación de la muestra:
El MEB se utiliza sobre todo para ver estructuras
superficiales de cristales y morfología de células y tejidos
Técnicas de microscopía

Microscopía de barrido
Técnicas de microscopía