Cibertorio 2019 Análisis forense PCR p.

Análisis forense: identificación genética de individuos mediante

ensayo de PCR múltiplex sobre marcadores polimórficos STR
(Práctica en laboratorio virtual Cibertorio)

Fundamento:
Las pruebas de identidad genética, a menudo llamadas huella dactilar genética o identificación mediante
pruebas de ADN (DNA) se basan en la diversidad genética de los individuos, es decir, que unas personas nos
diferenciamos de otras en la secuencia de nucleótidos presente en diversas regiones del genoma, lo que se
denomina polimorfismo genético.
Lo más frecuente es el empleo de regiones polimórficas del genoma que no codifican ningún producto
(proteína o RNA) y, por ello, no representan ninguna ventaja ni desventaja funcionales y sus variantes (alelos)
se distribuyen en la población con una gran diversidad.
En concreto, este ensayo se centra en varias regiones polimórficas conocidas como STR (short tandem
repeats, repeticiones cortas en tándem) que forman parte de uno de los grupos de marcadores de referencia
internacional, los marcadores del CoDIS conocidos por ser los utilizados por el FBI. La diferencia entre los
alelos presentes en distintos individuos está en el número de unidades repetidas y, en consecuencia, en la
longitud de los fragmentos de DNA que se amplificarán mediante PCR y se analizarán mediante electroforesis.
Como material de partida disponemos de muestras de DNA (virtuales) correspondientes a la prueba del
delito (por tanto, DNA del delincuente desconocido) y a varios sospechosos.

Bibliografía:
• A. Herráez (2012) Texto Ilustrado e Interactivo de Biología Molecular e Ingeniería Genética, 2ª ed,,
p. 423. Elsevier España, Madrid.
• R.B. Hallick, C. Ryan, A. Herráez (2000) Actividad nº 2 con el ADN de la familia Blackett [en línea].
En El Proyecto Biológico, Biología Humana, ADN en Medicina Legal [fecha de consulta: 15 de enero
de 2017]. Disponible en http://biomodel.uah.es/epb/human_bio/activities/blackett2/overview.html
• Colaboradores de Wikipedia (2016) CoDIS [en línea]. Wikipedia, la enciclopedia libre [fecha de
consulta: 15 de enero de 2017]. Disponible en https://es.wikipedia.org/wiki/CoDIS

Cómo comenzar:
El laboratorio virtual funciona dentro de una página web, por lo que debes comenzar abriendo el navegador
de internet en tu ordenador o tableta. Cualquier navegador moderno debería funcionar, siempre que tenga
activado JavaScript (se recomienda Firefox o Chrome).
Visita la página de Cibertorio en http://biomodel.uah.es/lab/cibertorio/

Ensayo:
identificación genética de individuos mediante PCR múltiplex
Objetivo:
Analizar los marcadores polimórficos para realizar la identificación del delincuente, es decir, la comparación
de los sospechosos con la prueba del delito. El ensayo consiste en, partiendo de las muestras de DNA de cada
uno de los sospechosos y de la muestra obtenida en la escena del delito, realizar una amplificación por PCR de
varios marcadores STR y separar los fragmentos amplificados mediante electroforesis. Por comparación de los
patrones de bandas, se deducirá cuál de los sospechosos puede ser el autor del delito (o bien se descartarán
los cinco sospechosos).

Materiales virtuales:
Software:
• Laboratorio virtual de biología molecular “Cibertorio”, biomodel.uah.es/lab/cibertorio/
Reactivos virtuales:
TM
• Muestras para análisis forense (compradas en CygnusLab ), que contiene DNA genómico nuclear procedente de:
• DNA extraído de la prueba de un delito
• DNA de cinco personas sospechosas de la comisión del delito (designadas S1 a S5)

Angel Herráez doi:10.5281/zenodo.2529359

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TM
• Mezcla maestra para PCR 10x (CygnusLab PCR master mix ), que contiene
• DNA polimerasa Taq, 250 U/mL
• nucleótidos dATP, dGTP, dTTP, cCTP, 2 mM de cada uno
• MgCl2 15 mM
• tampón TAPS 125 mM de pH=8.5
• Parejas de cebadores o iniciadores de PCR, específicas para los marcadores STR del CoDIS denominados
CSF1PO, D3S1358, D8S1179, D18S51, D21S11, FGA, TPOX y VWA, así como para el marcador determinante
del sexo AMEL (gen de amelogenina).
TM
• Marcador de masa molecular de DNA Ladder2™ (de CygnusLab )
• Agua libre de nucleasas
• Puntas de pipeta amarillas, capacidad de 1 a 100 µL
• Agarosa
• Acrilamida, bisacrilamida, TEMED, persulfato amónico, urea (para preparar el gel de poliacrilamida)
• Tampón de electroforesis TBE 0.5x (Tris-Borato-EDTA)
• Bromuro de etidio
• Colorante de carga de muestras en el gel (contiene azul de bromofenol, xileno-cianol y glicerol)
Instrumentación virtual:
• Micropipeta variable hasta 100 µL
• Termociclador CygnusLab PCtRonic™
TM
• Cubeta de electroforesis CygnusLab GelMatic Plus
TM
• Fuente de corriente continua CygnusLab 1000ZX (de 10 a 1000 V)
• Transiluminador ultravioleta (acoplado a la cubeta)
• Pantalla y gafas de seguridad protectoras contra UV

Procedimiento:
Comienza pulsando en el botón “Iniciar Cibertorio”. Tras unos segundos, aparecerá un aviso requiriendo que se
haga un pedido de muestras y cebadores; acéptalo.
1) Investiga la página del Catálogo en línea.
2) Pulsa el botón “Realizar un pedido”.
3) Selecciona las “Muestras para análisis forense” y todas las parejas de cebadores que desees
ensayar.
4) Al pie de página necesitarás proporcionar unos datos. (Esto es una simulación de una situación real, no es
importante lo que escribas en nombre y apellido pero sí es importante que la contraseña corresponda al centro).
5) Pulsa el botón “Enviar el pedido” y luego “Confirmar el pedido”. Espera a que se actualice
la pantalla y aparezca el laboratorio simulado (tubos, pipeta, etc.).
Uso de la micropipeta virtual
Para seleccionar el tubo sobre el que quieres actuar
debes pulsar sobre él con el ratón (no sobre la tapa ni
la etiqueta); se abrirá su tapa y la pipeta se desplazará
a él. Haciendo clic en el pulsador superior del émbolo
consigues que se desplace, expulsando o aspirando
alternativamente el contenido de la punta. El volumen
que se quiere pipetear se establece pulsando con el
ratón sobre la rueda de ajuste (mitad izquierda
disminuye, mitad derecha aumenta) o escribiendo en la
casilla del indicador de volumen (no pulses la tecla
Enter).
El intervalo de trabajo de la micropipeta es de 1 a
100 μL, en pasos de 1 μL.
Para evitar contaminación, se deben cambiar las
puntas cada vez que se cambia de muestra. La punta
se expulsa haciendo clic con el ratón sobre la palanca
expulsora de puntas o sobre el cubo de basura.
Se consigue una punta nueva haciendo clic sobre la
caja de puntas.

Posibles problemas:
Si, por algún error, necesitas empezar de nuevo con tubos limpios, pulsa sobre la imagen del recipiente a la
izquierda de la caja de puntas.
Tras pulsar con el puntero sobre un tubo, pipeta, etc., deja tiempo para que ocurra lo que sea. No seas
impaciente.
Al pulsar el émbolo de la pipeta, el cursor-mano no desaparece: mueve el puntero del ratón fuera de la pipeta.
Si quieres ver mejor el líquido que hay dentro de un tubo, puedes hacer que la pipeta salga del tubo pulsando
de nuevo en el mismo tubo.

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6) Prepara mezclas de reacción en los tubos 1 a 6 para el ensayo de PCR. Para ello, debes poner:
• en cada tubo, 20 µL de una de las 6 muestras de DNA (D, S1, S2, S3, S4, S5);
• en todos los tubos, 5 µL de la mezcla de reactivos para PCR (“PCR Mix”);
• en todos los tubos, 1 µL de cada uno de los cebadores para todos los marcadores que quieras
ensayar; (se pueden combinar hasta ocho, pero ten en cuenta que eso complicará el resultado y
quizá sea difícil de interpretar; una posibilidad es mezclar los cuatro marcadores "D" por un lado y el
resto por otro, en otro grupo de tubos)
• completa con agua el volumen en cada tubo hasta un total de 50 µL.
Conviene que hagas previamente una tabla en la que indiques los reactivos y los volúmenes que debes
pipetear en cada tubo.
7) Pon en marcha la reacción de PCR pulsando en el botón “incubar” (está en la parte central inferior, bajo
el cronómetro). Transcurrido el tiempo virtual requerido, se habrán completado las reacciones.
Dependiendo de la configuración del laboratorio, puede que aparezca un mensaje que te informa de lo que se ha
añadido en cada tubo; verifica que coincide con lo que pretendías.
8) En el menú principal de Cibertorio, selecciona el módulo “Laboratorio de
electroforesis”. Selecciona en la cubeta el gel de poliacrilamida
5%. Pulsa el botón “autocarga”, que hará que las 12 muestras preparadas
en la reacción de PCR anterior se transfieran a los 12 primeros pocillos del
gel virtual; en el pocillo nº 13 se carga automáticamente una mezcla de
patrones de tamaño (“escalera de DNA” Ladder2™).
Los pocillos tras la carga se ven azules debido a los colorantes añadidos rutinariamente a las
muestras (azul de bromofenol y xileno-cianol), para facilitar que se vean primero éstas y luego
el frente de avance. También se ha añadido un agente denso (p.ej. glicerol, sacarosa o ficoll)
que hace que la muestra se deposite al fondo del pocillo.
TM
La “autocarga” es una característica única de los geles CygnusLab ; en la vida real las
muestras se deben transferir laboriosamente a mano desde los tubos a los pocillos con una
micropipeta.

9) Ajusta en la fuente el voltaje a 250 voltios y el tiempo a 1 hora y 15 min virtuales. Conecta la corriente
para comenzar la electroforesis. Mientras progresa, puedes encender la luz UV (asegúrate de tener
puestas tus gafas o careta virtuales de protección) y apagar las luces de la habitación virtual para ver cómo
va avanzando el DNA y separándose las bandas.
En cualquier electroforesis, si la fuente de corriente de la que dispones no indica la intensidad
(miliamperios), es importante que te asegures de que está circulando la corriente. Observa cómo de ambos
electrodos se desprenden burbujas, efecto de la electrólisis del tampón. También verás que las bandas
azules de ambos colorantes avanzan por el gel (al igual que lo hacen las del DNA, si enciendes la luz UV).
Si se usan voltajes superiores, las muestras avanzarán más rápido por el gel, pero los voltajes elevados
producen corriente de alta intensidad y un calentamiento excesivo del gel que, aparte de afectar a la
muestra (por ej., desnaturalizando el DNA), puede llegar a fundir la agarosa o alterar la estructura de la
TM
poliacrilamida. A diferencia de los geles reales, los geles CygnusLab nunca se funden, por lo que el
único inconveniente de usar un voltaje muy alto puede ser que las muestras se pierdan por la parte inferior
del gel antes de que puedas reaccionar.

10) Una vez completada la electroforesis, dibuja un esquema de la posición de las bandas (puedes capturar
una imagen usando la cámara digital incluida en la cubeta) e interpreta los resultados obtenidos:
 ¿Cuál de los sospechosos es, con cierta probabilidad, el delincuente?

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