“VPH y CÁNCER DE CÉRVIX

EN ASTURIAS”

Dra. Cristina Pérez Menéndez

Avilés, Octubre 2011

 Introducción

Cáncer de cuello uterino - Epidemiología

2º cáncer + común en mujer a nivel mundial.

Causa principal de muerte a mediana edad en

la mayoría de los países en desarrollo.

Incidencia global:
- 11,3/100.000 en países más desarrollados.
- 18,7/100.000 en países en desarrollo.
- 44,3/100.000 en África.
 493.243 casos por año

 En Europa es el 7º cáncer más común entre las mujeres y el 3º entre aquellas con una
edad comprendida entre los 15 y 44 años.
 Introducción

Cáncer de cuello uterino- Epidemiología

Incidencia en España: Mortalidad en España:

11º cáncer más común entre las mujeres.  15º cáncer por mortalidad.

 2.103 casos por año

 739 fallecen

WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer (HPV Information Centre). Human Papillomavirus and Related Cancers in Spain. Summary
Report 2010. Date accesed October 2011. Available at [Link]/hpvcentre.
 Introducción

Cáncer de cérvix en España

Asturias
Navarra
Girona Incidencia Asturias
Zaragoza año 2000:
Tarragona
11,6/100.000
Mallorca
Cuenca
Albacete
Periodo 1993-1997:
Murcia Mallorca 12.05
Granada Tarragona 9.03
Asturias 8.11
Islas Canarias 7.94
Murcia 7.39
Girona 7.38
Granada 6.13
Zaragoza 5.58
Albacete 5.36
Islas Canarias
Navarra 3.74
Cuenca 3.36
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
 Introducción

VPH y Cáncer cervical

Estudios de epidemiología apoyados por técnicas moleculares, identificaron la infección

por ciertos tipos de virus del papiloma humano (VPH) como “causa necesaria" para el
desarrollo de cáncer cervical.

Infección más frecuente de todas las enfermedades de transmisión sexual.

Virus del papiloma humano inductor de la carcinogénesis.

El cáncer cervical sólo se desarrollará si existe una presencia persistente del ADN de
VPH.
 Introducción

Virus del papiloma humano (VPH)

Más 200 tipos ≠ 118 aislados y caracterizados.

40 tipos de VPH afectan al tracto genital.

Clasificación Epidemiológica de los VPH ANOGENITALES:

VPH AR 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 Cáncer cervical
VPH BR 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 y CP6108 VPH AR 95% casos
VPH probable AR 26, 53, 66, 68, 73, 82 16 50%-60%
AR: Alto Riesgo; BR: Bajo Riesgo. 18 10-12%
. Datos de Muñoz N y cols. HPV in the etiology of human cancer. Vaccine 2006;24:1-10
45 5%
31 4%
 Introducción

VPH: Estructura

Familia Papillomaviridae
Partículas víricas proteínicas sin envoltura
Ø de 55-60nm
Cápside viral de 72 capsómeros ordenados en icosaedro
 Introducción

VPH: Estructura
ADN de doble cadena circular de 7900 pb

E1, E2, E4 y E5: Reproducción virus y contagiosidad.

E6 y E7: Proceso de oncogénesis (“transformación”). Diferentes según los diferentes tipos virales.

L1-L2: Proteínas mayor y menor de la cápside. Región de mayor conservación génica. Inmunogénicos. Vacunas profilácticas.

LCR (Región no codificante): Elementos reguladores.

 Introducción

Diagnóstico molecular del VPH

¿Por qué un diagnóstico molecular?
Los modelos de cultivo in vitro son poco adecuados y costosos y los anticuerpos
carecen de valor diagnóstico.
Significado del genotipo en el pronóstico de la infección:
Está demostrado que existen genotipos con una mayor capacidad de establecer
lesiones crónicas y cáncer.

ADN-VPH EN
CÁNCER 30%-60% 75% 95% 99%
CERVICAL
- SENSIBILIDAD +
SOUTHERN
TESTS PARA FISH
LA DETECCIÓN [Link]; [Link] [Link]
DE ADN-VPH
HC I HC II HC III

realtime-PCR

1980 1990 2000

Bosch et al. J Clin Pathol 2002; 55: 244-65.
 Introducción

Técnicas de detección de ADN de VPH

Técnicas de Biología Molecular para la detección de ADN de VPH en muestras FFPE:
-Hybridación in situ
-PCR es la técnica molecular más sensible

E6 E2 E5 L1
E7 E1 L2
E4
1 2 3 4 5 6 7 7,9 kb

primers “degenerados”
CGTCCMARRGGAWACTGATC 450 bp
MY09/11 PGMY
GCMCAGGGWCATAAYAATGG GP5+/6+ 150 bp
AMPLICOR® ROCHE 170 bp
SPF10 65 bp
 Introducción

Técnicas de detección de ADN de VPH

PCR
Primers
de consenso
GP5+/6+
PGMY
SPF10
MY09/11
primers
específicos

Hibridación reversa
RFLP Array Secuenciación

PCR en tiempo real

 Objetivo

Objetivo

Objetivo principal:

o Comparar los resultados de dos sistemas de genotipado del ADN de VPH basados en
PCR, para poder determinar cual presenta mayor sensibilidad y especificidad en el
análisis de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE).
 Material y Métodos

Metodología

Diseño de la muestra:

-Estudio retrospectivo de casos consecutivos de CCI, diagnosticados mediante biopsia

desde Enero de 1998 hasta Diciembre del 2007.

-Servicios de Anatomía Patológica de todas las Áreas Sanitarias de Asturias (8 Áreas):

San Agustín de Avilés, HUCA, Jove, Cabueñes, Mieres, Riaño, Jarrio, Cangas de Narcea y
Arriondas.

-235 biopsias con diagnóstico histopatológico de CCI, fijadas en formol e incluidas en

parafina.

-Las Hematoxilinas fueron re-evaluadas.

-Estudio aprobado por el Comité Ético del HUCA.

 Resultados y Discusión

1er Estudio de estas características en casos de CCI en Asturias:

Nº Importante de muestras: 235 casos de CCI

Técnicas de detección viral altamente sensible

Marco Internacional de investigación: Retrospective International Survey of Human

Papillomavirus Types in Cervical Cancer (RIS HPVTT).
 Material y Métodos

Metodología
SPF10-LiPA 25 PCR SYSTEM ( Versión 1; labo Biomedical Products, Rijswijk, The Netherlands).

Técnica
Sandwich
 Material y Métodos

Metodología
SPF10-LiPA 25 PCR SYSTEM ( Versión 1; labo Biomedical Products, Rijswijk, The Netherlands).

Técnica Sandwich
 Material y Métodos

Metodología
SPF10-LiPA 25 PCR SYSTEM ( Versión 1; labo Biomedical Products, Rijswijk, The Netherlands).

SPF10 PCR
Técnica
Sandwich
 Material y Métodos

Metodología
SPF10 PCR

SPF10

Molijn A y cols. J Clin Virol 2005;32:43-51.

 Control positivo:  Controles negativos:

HeLA Parafina blanco
Mix PCR sin muestra
 Lesión no dependiente de VPH
 Material y Métodos

Metodología

SPF10-LiPA 25 PCR SYSTEM ( Versión 1; labo Biomedical Products, Rijswijk, The Netherlands).

Técnica
Sandwich

DNADNA Enzyme Inmuno Assay

Enzyme Inmuno Assay -54 Genotipos VPH:
AR, PAR,BR.
-25 Genotipos VPH: - DO 450
AR, PAR, BR.
-No diferencia
VPH 68/73 LiPA25
LiPA 25
 Material y Métodos

Metodología

SPF10-LiPA 25 PCR SYSTEM ( Versión 1; labo Biomedical Products, Rijswijk, The Netherlands).

Técnica
Sandwich

-globina (-) y VPH(-)

Muestras descartadas
del estudio
 Material y Metodos

Metodología
PCR más hibridación en microarray

- 35 genotipos de VPH : AR, PAR, BR.

Biopsia Extracción de ADN AmplificaciónADN

Amplificación ADN HibridaciónEspecífica
Hibridación Específica Interpretación
Interpretación

MY09/11

Molijn A y cols. J Clin Virol 2005;32:43-51.

 Controles de calidad internos:

Control de ADN de la muestra: gen humano CFTR de 892 pb
Control de la reacción de la amplificación: Plásmido de 1200pb
 Resultados y Discusión

Concordancia de la positividad a ADN de VPH

LiPA Nº Total de
Microarray Positivas Negativas muestras Concordancia de detección del VPH del 77,8%.
Positivas 160* 6 166 Índice de Kappa: 0, 24
Negativas 43 12 55 Concordancia baja
Nº Total de Diferencias estadísticamente significativas
muestras 203 18 221
p <0,05
*3 casos MicroArray y LiPA positivos son : VPH 61 por Microarray.

De las 221 muestras que conforman el estudio 160 resultaron positivas con ambas técnicas.

Prevalencia del VPH para LiPA: Prevalencia del VPH para Microarray:
(166/221) 91,9 % (203/221) 75,1 %
 Resultados y Discusión

Concordancia de la positividad a ADN de VPH

Las muestras fijadas en formol e incluidas en parafina pueden tener el ADN dañado1,2,3.

Frecuencias de casos positivos de VPH relativamente bajos en estos tejidos al utilizar los
cebadores consenso MY09/112,4

Amplifican segmentos relativamente largos en muestras con el ADN dañado.

La eficacia de la PCR decrece con el incremento del tamaño del fragmento a amplificar, ya que la
fijación en parafina dificulta una amplificación de secuencias mayores de 200pb 2,5

Las técnicas que amplifican pequeños fragmentos de ADN de VPH mayor sensibilidad
con especímenes degradados menos resultados falsos negativos6.

1- Kleter B y [Link] J Pathol 1998; 153:1731-9;2-Biedermann K y cols.J Clin Mirobiol 2004;42:3758-65;3-Greer C y [Link] Pathol 1991;95:117-24;
4-Baay MFD y cols.J Clin Microbiol 1996;34:745-47;5- Karlsen F y [Link] Invest 1994:71-604-11.6- IARC Handbooks on cancer prevention,IARC Press;
2005.
 Resultados y Discusión

Concordancia tipo específica

Concordancia tipo específica en los casos positivos para al menos una técnica:

N %
Concordancia total 88 42,1

Concordancia parcial 59 28,2

Discordante 62 29,7

Total 209 100,0

-”Concordancia total”: Ambas técnicas detectan el mismo/mismos tipos virales en una muestra determinada.

-”Concordancia parcial”: La concordancia no es total, pero ambas técnicas detectan al menos un mismo tipo
de virus

-”Discordante”: Cuando los tipos detectados con cada técnica no coinciden.

 Resultados y Discusión

Concordancia tipo específica

DISCORDANTES CONCORDANTES
(N=62) N MICROARRAY LiPA PARCIAL (N=59) N MICROARRAY LiPA
16 negativo 16 10 16y61 16
5 negativo 45 5 16y18 16
4 negativo 18 5 16y58 16
4 negativo 33 4 16y84 16
3 negativo 31 3 16y53 16
2 negativo 39 2 11y16 16
43 1
1
negativo
negativo
52
51
2
1
16y33
16
33
16y51
1 negativo 35 1 16 16y45
1 negativo x 1 16 16y52
1 negativo 16y18 1 16 16y53
1 negativo 68o73 1 16 16y56
1 negativo 16y52 1 16 16y33
1 negativo 11y39 1 18 18y52
1 negativo 35,68o73 1 45 35y45
2 16 negativo 1 11,16 11,16 y35
1 18 negativo 1 16y33 16
6 1 52 negativo 1 16y35 16
1 16 y 83 negativo 1 16y35 35
1 18y61 negativo 1 16y39 39
1 16 52 1 16y45 16
1 16 33 1 16y45 45
1 16 x 1 16y51 16
1 16 68o73 1 16y59 59
1 16 45 1 16y66 16
1 61 16 1 18y58 18
1 58 56 1 33y58 33
1 61 31 1 35y58 35
1 61 18,52y68o73 1 33y58 58
1 16 y 58 45 1 45y61 16y45
1 16y61 18 1 58y66 16y58
1 6y31 16 1 11,16,81 16
1 33y59 35 1 16,58 y 61 16
1 11,18,58y61 18
1 18,33 y 61 16y33
 Resultados y Discusión

Concordancia tipo específica

Se observan diferencias en los genotipos de VPH:

- Diseño de los cebadores MY09/11 consenso degenerados amplifica amplio espectro

de genotipos de VPH pero con varios niveles de sensibilidad entre ellos1, podría dar falsos
negativos para ciertos tipos virales por su menor sensibilidad2.

- Diseño de los cebadores SPF consenso no degenerados más sensible en la detección

de determinados VPH3.
Detectan fragmentos más pequeños de la región L1 viral,
detección ultrasensible de un ancho espectro de genotipos VPH aunque tengan baja carga
viral3,4.

1- Gravitt PE. y cols. J Clin Microbiol 2000;38:357-61; 2- Depuydt CE y cols. J Cell Mol Med 2007;11:881-91; 3- Kleter B y cols. Am J Pathol 1998;
153:1731-9; 4- Kleter B y cols. J Clin Mirobiol 1999; 37:2508-17;
 Resultados y Discusión

Concordancia de detección de infecciones múltiples

Microarray detecta un 35% de infecciones múltiples (58/166 muestras positivas por Microarray)
LiPA detecta un 8,9% de infecciones múltiples (18/203 muestras positivas por LiPA)

Índice de concordancia para la detección de infecciones simples o múltiples: se consideran

sólo las muestras positivas para ambas técnicas (N=160).

LiPA
Infección Nº Total de
MICROARRAY Simple Infección Múltiple muestras Concordancia 62,5%
Infección Simple 95 9 104 Índice de Kappa: 0,003
Concordancia insignificante
Infección Múltiple 51* 5 56
Diferencia No significativa p › 0,05
Nº Total de
muestras 146 14 160
*10 casos Microarray VPH 16 y 61- LiPA VPH 16
4 casos Microarray VPH 16 y 84- LiPA VPH 16
 Resultados y Discusión

Concordancia de detección de infecciones múltiples

22 % de los muestras tanto precancerosas como frescas no parafinadas con Microarray1.

4.4% en parafinadas con SPF10 PCR-LiPA252

- Diseño de los cebadores MY09/11 consenso degenerados detecta amplio espectro

de genotipos de VPH pero cadecen de alta especificidad en la detección de los mismos.
Reacción cruzada de los cebadores3.

Tras consultar la bibliografía se podría decir, que este es el primer gran estudio
comparativo entre ambas técnicas para muestras parafinadas.

-La dificultad de la realización de la técnica es similar para ambos métodos, siendo la

interpretación de los resultados más sencilla con el Microarray.

-El riesgo de contaminación es alto para ambas técnicas al estar basadas en PCR.

1- Gomez-Roman JJ y cols. APMIS 2009;117:22-7. 2- Kleter B y cols. J Clin Microbiol 1999;37:2508-17. 3- Gravitt PE. y cols. J Clin Microbiol
2000;38:357-61.
 Conclusiones

Conclusiones

En nuestras muestras de archivo, fijadas en formol e incluidas en parafina, se ha

demostrado que la técnica LiPA tiene un 20% más de sensibilidad para la detección
del ADN de VPH que la técnica basada en Microarays.

El uso de la técnica basada en microarrays, con material parafinado, no aporta un grado

de sensibilidad suficiente para considerarlo una técnica útil cuando se utiliza este
tipo de material. Es posible que su menor sensibilidad sea debida a que los
cebadores utilizados amplifiquen una región genómica demasiado larga al tratarse
de muestras con el ADN probablemente dañado.

La técnica basada en microarrays detecta un mayor porcentaje de infecciones múltiples

que LiPA, posiblemente debido al diseño de sus cebadores degenerados, lo que
permite detectar un amplio espectro de genotipos de VPH, sin embargo carecen de
una alta especificidad en la detección de los mismos.
“Muchas gracias por su atención”