UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA Y TECNOLÓGICA DE COLOMBIA
BIOQUÍMICA
2023
JUAN ESTEBAN CADENA
SANDRA KATHERIN RUBIANO
MARILUZ MUÑOZ
CONSULTA PARA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PREGUNTAS:
1. CONSULTE LAS SIGUIENTES TECNICAS DE SEPARACION DE AMINOACIDOS Y
PEPTIDOS
● Cromatografía, HPLC, Dicroismo circular, Dispersión óptica rotatoria y Electroforesis
SOLUCIÓN:
CROMATOGRAFIA:
Cromatografía en capa fina:
En esta técnica, la muestra para análisis se aplica por medio de un tubo capilar en la
superficie de una capa fina adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es
adsorbida en la superficie por la acción de fuerzas electrostáticas (fuerzas de Van der
Waals, puentes de hidrógeno, efectos inductivos, etc.). Los adsorbentes más utilizados son
gel de sílica, alúmina, tierra silícea, celulosa y poliamidas, mientras que los soportes más
comunes son láminas o placas de vidrio, plásticas o metálicas (Hammond, 1998).
El disolvente utilizado para la separación se mueve junto con el compuesto a
separar sobre esta capa fina y la separación de las sustancias se basa principalmente en
sus características de polaridad. La placa seca se coloca en el tanque cromatográfico o
cámara, en el cual debe encontrarse saturado el eluyente (fase móvil líquida). El eluyente
ascenderá o desplazará por capilaridad en la placa y arrastrará los componentes a lo largo
de ésta produciendo «manchas» que representan a los componentes. Posteriormente se
evapora el eluyente y la placa se analiza por medio de métodos químicos; por inmersión o
rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes (adición de ninhidrina a
aminas, ácido sulfúrico para carbonizar compuestos orgánicos, etc), o por medio de
métodos físicos ópticos utilizando radiación UV o luz visible (Clement, 2002). En el anexo
1 se presentan los aspectos básicos de la interpretación de una cromatografía en
capa fina
Cromatografía de intercambio iónico:
Las proteínas, al igual que otras biomoléculas, exponen cargas eléctricas en su
superficie, las cuales pueden interactuar con matrices de intercambio iónico para lograr su
separación en una mezcla (Jungbauer & Hahn, 2009). Para lograr la separación de una
mezcla de proteínas, la cromatografía de intercambio iónico se basa en las diferentes
cargas eléctricas y la magnitud de estas que asume cada proteína a un pH determinado
(Nelson & Cox, 2017).
La separación se basa en la atracción de moléculas con carga opuesta. Las proteínas
presentan una carga neta definida, la cual depende del pH de la solución en la cual se
encuentran disueltas; por otra parte, la fase estacionaria del sistema cromatográfico está
compuesta por un gel que corresponde a una matriz formada por un sistema poroso que
provee suficiente área de adsorción, en la matriz se encuentra presente un ligando con una
carga eléctrica definida (positiva o negativa), el cual está inmovilizado. La separación se
realiza en base a la carga de las proteínas de la mezcla y a la capacidad, o no, de
interactuar, por atracción electrostática, con la matriz (Jungbauer & Hahn, 2009).
Los intercambiadores iónicos se clasifican en dos grupos (Jungbauer & Hahn, 2009):
1. Intercambiadores catiónicos cargados negativamente, interactúan con cationes.
2. Intercambiadores aniónicos cargados positivamente, interactúan con aniones.
Los intercambiadores de iones se comportan como ácidos o bases y la magnitud de la
carga que presenten depende del pH del sistema. Existen intercambiadores catiónicos y
aniónicos fuertes, que mantienen su carga a un amplio rango de pH, también existen
intercambiadores débiles que mantienen la carga en un ámbito de pH más reducido. Estas
características pueden ser empleadas para aumentar la selectividad del proceso de
separación, empleando gradientes de pH para la elución de las proteínas unidas a
la matriz (Jungbauer & Hahn, 2009).
La afinidad de una proteína por la columna depende del pH del sistema y de la forma en
que compite con iones de las sales disueltas en la solución. La elusión de las proteínas que
interactúan con la matriz cargada se logra al emplear, como fase móvil, una solución con un
gradiente salino creciente, el cual logra disociar a las proteínas de la matriz por
competencia. También se puede emplear soluciones con gradiente de pH para lograr la
elución de las proteínas que interactúan con la matriz ((jungbauer & Hahn, 2009; Nelson &
Cox, 2017).
Cromatografía de exclusión molecular:
La cromatografía de filtración en gel se realiza con el uso de un gel conformado por perlas
porosas como fase estacionaria, permitiendo la separación de moléculas (proteínas)
por su tamaño. La columna construida con esta fase estacionaria posee dos volúmenes de
líquido (buffer de elución, fase móvil), que pueden medirse: el volumen externo, que
corresponde al volumen presente entre las perlas y el volumen interno, que corresponde al
volumen de líquido presente en los poros internos de las perlas. Al colocar una mezcla de
proteína en la parte superior de la columna, las proteínas de mayor tamaño son excluidas
del volumen interno, presentando un recorrido más rápido y abandonando primero la
columna; por el contrario, las proteínas de menor tamaño que tienen acceso al volumen
interno presentan un recorrido más largo y tardan más en abandonar la columna
(Jungbauer & Hahn, 2009).
HPLC:
La cromatografía líquida de alta eficacia o high performance liquid chromatography (HPLC)
es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química
analítica. También es denominada cromatografía líquida de alta presión o cromatografía
líquida de alta resolución (high pressure liquid chromatography) (HPLC), aunque esta
terminología se considera antigua y está en desuso. La HPLC es una técnica utilizada para
separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones
químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica. Se puede emplear
para separar refinar sustancias químicas, o, lo que es más frecuente, para análisis químico.
DICROISMO CIRCULAR:
En general, este fenómeno se presenta en las bandas de absorción de cualquier molécula
ópticamente activa. En consecuencia, las moléculas biológicas presentan dicroísmo circular,
debido a sus componentes dextrógiros y levógiros. Aún más importante es que una
estructura secundaria también impartirá un DC distinto a sus respectivas moléculas. Así, la
hélice alfa de las proteínas y la doble hélice de los ácidos nucleicos tienen firmas
espectrales de DC representativas de sus estructuras. La capacidad del DC para dar una
firma estructural representativa la convierte en una poderosa herramienta de la bioquímica
moderna con aplicaciones que pueden encontrarse en prácticamente todos los campos de
estudio.
El DC está estrechamente relacionada con la técnica de dispersión óptica rotatoria (ORD), y
generalmente se considera más avanzada. El DC se mide en o cerca de las bandas de
absorción de la molécula de interés, mientras que la ORD puede medirse lejos de estas
bandas. La ventaja del DC es evidente en el análisis de los datos. Los elementos
estructurales se distinguen más claramente, ya que sus bandas registradas no se solapan
ampliamente en determinadas longitudes de onda, como ocurre en la ORD. En principio,
estas dos mediciones espectrales pueden interconvertirse mediante una transformada
integral (relaciones de Kramers-Kronig), si se incluyen todas las absorciones en las
mediciones.
DISPERSIÓN ÓPTICA ROTATORIA:
La dispersión rotatoria óptica es la variación en la rotación óptica de una sustancia con un
cambio en la longitud de onda de la luz. La dispersión rotatoria óptica se puede utilizar para
encontrar la configuración absoluta de los complejos metálicos. Por ejemplo, cuando la luz
blanca con polarización plana de un retroproyector pasa a través de un cilindro de solución
de sacarosa, se observa un arco iris en espiral perpendicular al cilindro.
ELECTROFORESIS:
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de
estas en un campo eléctrico.[1]La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada
de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), a través de
una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre).
Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga
eléctrica de las moléculas y a su masa.
La electroforesis se usa en una gran mayoría en la materia del ADN recombinante ya que
nos permite saber la carga que poseen los polipéptidos, y separar los diferentes
polipéptidos resultantes de las variaciones del experimento del ADN recombinante. La
variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos
utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos
nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo,
mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente)
que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la
proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, estas se moverán y
deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo
que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán
más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.
