UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA DE LABORATORIO CLÍNICO E
HISTOPATOLÓGICO
GUÍA DE PRÁCTICA DE LABORATORIO
PERÍODO ACADÉMICO 2024-1S
ASIGNATURA Prácticas Hospitalarias SEMESTRE: 7 PARALELO:
A
NOMBRE DEL ANA CAROLINA GONZÁLEZ R
DOCENTE
FECHA 06/05/2024
NÚMERO DE 3 HORA: 16:00-20:00H DURACIÓN: 4H
PRÁCTICA
GRUPO 1
Espinoza Espinoza Tanya Aracelly
NOMBRE DE LOS
Hernandez Grijalva Jessica Ana
ESTUDIANTES.
Rodriguez Calderon Alex Danilo
Velez Arevalo Talitacum Yolanda
LUGAR DE LA Laboratorio E302
PRÁCTICA
TÍTULO DE LA UNIDAD Protocolos de identificación de bacterias Gram positivas a través de
algoritmos
TEMA DE LA Pruebas de identificación de especies de importancia clínica del género
PRÁCTICA Staphylococcus I Parte
RESULTADO DE APRENDIZAJE.
Analiza las principales pruebas microbiológicas, para la identificación de bacterias Gram positivas de
importancia clínica
OBJETIVO GENERAL Identificar a Staphylococcus aureus y Stapphylococcus epidermidis
implicados en procesos infecciosos.
Detectar la presencia de Staphylococcus aureus y
Stapphylococcus epidermidis en muestras de infecciones de
piel y tejidos blandos a través de esquemas de identificación
bacteriana a través de algoritmos.
Familiarización con la morfología y las características de
crecimiento de Staphylococcus, mediante la observación de
las colonias en medios de cultivo selectivos y diferenciales
para identificar características como la forma, el tamaño, el
color y la hemólisis.
Realización de pruebas bioquímicas para distinguir entre
Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis,
Objetivos específicos
principalmente utilizando pruebas como la prueba de
coagulasa para diferenciar entre especies de Staphylococcus,
ya que S. aureus es coagulasa positiva mientras que S.
epidermidis es coagulasa negativa.
Analizar mediante una discusión sobre la relevancia clínica,
explorando así la importancia clínica de la identificación
precisa de Staphylococcus aureus y Staphylococcus
epidermidis en procesos infecciosos, incluyendo la selección
de tratamientos adecuados y la prevención de complicaciones
asociadas.
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FUNDAMENTO TEÓRICO:
Staphylococcus es un género de bacterias gram-positivas, esféricas y en forma de coco que es
ampliamente distribuido en el medio ambiente y se encuentra comúnmente en la piel y las
membranas mucosas de los seres humanos y otros animales. Algunas especies de Staphylococcus
pueden causar enfermedades en humanos, mientras que otras son parte de la microbiota normal
del cuerpo sin causar problemas.
Algunas de las especies de Staphylococcus más notables incluyen:
Staphylococcus aureus: Esta especie es una de las más patogénicas y puede causar una
amplia variedad de infecciones en humanos, que van desde infecciones cutáneas leves
hasta infecciones graves como neumonía, osteomielitis y sepsis. Es conocida por su
capacidad para desarrollar resistencia a múltiples antibióticos.
Staphylococcus epidermidis: Esta especie es una parte normal de la microbiota de la piel y
mucosas humanas. Aunque generalmente no es patógena, puede causar infecciones en
personas con sistemas inmunológicos comprometidos o cuando se introduce en el torrente
sanguíneo, como en infecciones relacionadas con dispositivos médicos.
Staphylococcus saprophyticus: Esta especie a veces causa infecciones del tracto urinario
en mujeres jóvenes y sexualmente activas.
Staphylococcus haemolyticus: Es una especie que a menudo se encuentra en entornos
hospitalarios y puede estar asociada con infecciones nosocomiales.
La identificación y caracterización precisa de las especies de Staphylococcus son importantes en
el ámbito clínico y de laboratorio para determinar el tratamiento adecuado de las infecciones. La
resistencia a los antibióticos, especialmente en Staphylococcus aureus, ha sido un desafío
importante en la atención médica y requiere un enfoque cuidadoso en el uso de antibióticos y
estrategias de control de infecciones.
La identificación de especies de Staphylococcus, un género de bacterias gram-positivas, se puede
llevar a cabo utilizando diversas técnicas microbiológicas y moleculares. Aquí hay algunas de las
técnicas comunes de identificación bacteriana para Staphylococcus:
Coloración de Gram: La coloración de Gram es una técnica inicial que puede ayudar a
diferenciar Staphylococcus de otras bacterias gram-positivas. Staphylococcus
generalmente aparece como cocos gram-positivos que se tiñen de violeta en una
coloración de Gram.
Cultivo en medios selectivos: Staphylococcus puede crecer en medios selectivos
diseñados para promover su crecimiento y suprimir el crecimiento de otras bacterias. Un
ejemplo común es el agar mannitol salino, que permite la identificación de
Staphylococcus aureus en función de su capacidad para fermentar el mannitol y cambiar
el color del medio.
Pruebas bioquímicas: Estas pruebas implican la evaluación de las características bioquímicas de
las bacterias, como la prueba de la coagulasa y la prueba de la catalasa. La prueba de la coagulasa
ayuda a distinguir entre S. aureus (positiva) y otras especies de Staphylococcus (negativa). La
prueba de la catalasa se utiliza para confirmar la presencia de bacterias gram-positivas, ya que
estas producen burbujas de oxígeno cuando se expone peróxido de hidrógeno.
Técnicas de PCR: Las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permiten la
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amplificación de secuencias de ADN específicas de Staphylococcus. La secuenciación del gen
16S rRNA es un enfoque común para identificar bacterias a nivel de especie.
MALDI-TOF MS: La espectrometría de masas por tiempo de vuelo asistida por láser y matriz
(MALDI-TOF MS) es una técnica moderna de identificación rápida y precisa. Se basa en perfiles
de proteínas y permite la identificación de Staphylococcus a nivel de especie.
La elección de la técnica dependerá de los recursos disponibles, la necesidad de identificar a nivel
de especie y la precisión requerida. La combinación de varias técnicas puede ser la estrategia más
efectiva para una identificación precisa de Staphylococcus en aplicaciones clínicas y de
laboratorio.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
Equipos Reactivos
Estufa, mecheros Cajas de Petri, gradilla, asas. Medios de cultivo:
agar sangre, agar
manitol salado,
catalasa, plasma
citratado, coloración
de Gram, peróxido de
hidrógeno.
PROCEDIMIENTO / TÉCNICA:
Procedimiento:
Preparación del cultivo: Asegúrate de tener una muestra pura de la bacteria, preferiblemente
crecida en un medio de cultivo adecuado.
Prueba de la catalasa:
1. Coloca una pequeña cantidad de colonias de la bacteria en un portaobjetos limpio.
2. Agrega una gota de peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) sobre las colonias.
3. Observa si se produce efervescencia (burbujas). La presencia de efervescencia es un
resultado positivo para la catalasa y es característica de S. aureus.
Prueba de la coagulasa:
1. Puedes realizar la prueba de la coagulasa en tubos de ensayo.
2. Inocula una pequeña cantidad de la bacteria en un tubo que contiene plasma de conejo o
plasma humano citratado.
3. Incuba a 37 °C durante 4 horas.
4. Observa si se forma un coágulo en el tubo. La formación de un coágulo es un resultado
positivo para la coagulasa y es característica de S. aureus.
5. Pruebas adicionales: Puedes realizar pruebas adicionales, como la prueba de fermentación
de carbohidratos (por ejemplo, la prueba de fermentación de manitol), aunque estas
pruebas pueden variar según el laboratorio y el protocolo utilizado.
Es importante recordar que aunque estas pruebas bioquímicas son útiles para identificar S.
aureus, en el laboratorio clínico actual, se utilizan cada vez más técnicas de biología molecular,
como la PCR, que ofrecen resultados más precisos y rápidos en la identificación de bacterias. Por
lo tanto, además de las pruebas bioquímicas, se pueden utilizar métodos moleculares para
confirmar la identificación de S. aureus.
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RESULTADO (Gráficos, cálculos, etc.)
PROCEDIMIENTO
1. Solicitar a la encargada de laboratorio los materiales necesarios para la práctica.
Figura 1. Materiales.
2. Solicitar a la encargada de laboratorio los materiales necesarios para la práctica.
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Figura 2. Utilizar adecuadamente el equipo de protección personal.
3. Tomar la placa de agar manitol salado que contiene la cepa de Staphylococcus, encender
el mechero para que todo se encuentre en un ambiente estéril y preparar todos los
materiales a utilizar durante el desarrollo de la práctica.
Figura 3. Alistar el medio de Staphylococcus del cual se realizarán las pruebas de identificación
Figura 3. Preparar los materiales para el desarrollo de la práctica.
4. Previamente rotular los tubos con la identificación del paciente en los que se realizarán la
prueba de la coagulasa y las placas portaobjetos para las pruebas de la catalasa.
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Figura 4. Rotular los tubos con el medio de cultivo y la bacteria que se va a inocular según corresponda.
PRUEBA DE LA CATALASA
1. Rotular un portaobjetos con el código correspondiente al paciente.
Figura 5. Rotular una laminilla portaobjetos para la prueba de la catalasa.
2. Colocar una gota de agua oxigenada (peróxido de hidrógeno) sobre el portaobjetos con
ayuda de una pipeta Pasteur.
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Figura 1. Tomar una alícuota de peróxido de hidrogeno con una pipeta y colocar sobre el portaobjetos.
3. Suspender una colonia de la bacteria otorgada por la docente con la ayuda de un palillo de
madera, y colocarla sobre la gota de peróxido de hidrógeno.
Figura 2. Tomar una colonia de la bacteria con un palillo y colocar sobre la gota de peróxido.
4. Mezclar muy bien la colonia con el peróxido de hidrógeno, y detectar la formación de
burbujas.
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Figura 3. Revolver con el palillo y esperar la reacción.
5. Si la colonia pertenece al género Staphylococcus se observará la formación de burbujas,
por tanto, la prueba será positiva.
Figura 9. Reacción oxidasa positiva para el género Staphylococcus.
PRUEBA DE LA COAGULASA
1. Obtener una muestra de sangre en un tubo con anticoagulante de citrato de sodio, para
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posteriormente obtener el plasma.
Figura 10. Tomar una muestra de sangre en tubo con citrato.
2. Homogeneizar el tubo con la muestra de 6 a 8 movimientos para que el anticoagulante se
mezcle con la sangre.
Figura 11. Homogenizar la muestra para que se integre con el anticoagulante.
3. Llevar a la centrífuga por 10 min a 4000 rpm, para obtener el plasma que se utilizará para
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la realización de la prueba.
Figura 12. Llevar a la centrifuga por 10 minutos 4.000 r.p.m.
Figura 13. Transcurrido el tiempo obtendremos la muestra citratada para la prueba de la coagulasa.
4. Con la ayuda de una jeringa o una pipeta calibrada tomar 500ul o 0,05mL de solución
salina estéril.
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Figura 14. Desinfectar una jeringa o inyección para tomar la solución y medirla en CC.
5. Depositar el contenido de solución salina estéril en el tubo correspondiente para la
realización de la prueba.
Figura 15. Con una inyección (jeringa)tomar 0.05 cc de solución salina al 0.9%.
6. Tomar la colonia de Staphylococcus y colocar en el tubo, disolviendo la cepa con la
solución salina.
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Figura 16. Esterilizar el asa y tomar con la misma una colonia de la bacteria.
Figura 17. Sumergir el asa en el tubo con solución salina hasta que se observe una turbidez.
7. Agregar 500 ul de plasma citratado previamente obtenido por centrifugación, mezclar y
llevar a incubar a 37°C durante 4 a 6 horas.
Figura 18. Llevar a la incubadora por 4 a 6 horas a 37°C.
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COLORACIÓN GRAM
1. Preparar los colorantes para la tinción.
Figura 19. Tinción Gram.
2. Una vez fijada la lámina se coloca sobre el puente de tinción.
Figura 20. Puente de tinción.
3. Primero colocar sobre la muestra cristal violeta durante un minuto, después de transcurrir
el tiempo establecido se procede a lavar con mucho cuidado el portaobjetos.
Figura 21. Colocar cristal violeta.
4. Después colocar sobre la muestra lugol durante un minuto, después de transcurrir el
tiempo establecido se procede a lavar con mucho cuidado el portaobjetos.
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Figura 22. Colocar Lugol.
5. Posteriormente colocar alcohol acetona durante 10 segundos, después de transcurrir el
tiempo establecido se procede a lavar con mucho cuidado el portaobjetos.
Figura 23. Colocar el alcohol acetona.
6. Y por último colocar safranina durante 30 segundos, después de transcurrir el tiempo
establecido se procede a lavar con mucho cuidado el portaobjetos.
Figura 24. Lavar el portaobjetos.
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7. Agregar aceite de inmersión y observar en el microscopio con objetivo de 100x.
Figura 25. Observar en el microscopio.
8. En el gram se observan cocos gram positivos dispuestos en racimos color morado,
morfológicamente similar a Staphylococcus.
Figura 26. Se puede observar cocos grampositivos como racimos.
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SEGUNDA PARTE
1. Una vez transcurrido el tiempo, se verifica en el tubo la formación de un coágulo si sale
positivo, pues el plasma coagulará, a veces el coágulo esta tan desarrollado que el líquido
se solidifica completamente. Si sale negativo, el plasma permanece líquido.
Figura 28. Pasado las 6 horas se observa los tubos para determinar si es coagulasa positiva o negativa. En nuestro caso fue
positiva.
REPORTE DE RESULTADOS
BIOT
Dirección: Av. 29 de Mayo e Ibarra
Teléfono: 02-3740913
DATOS DEL PACIENTE
Nombre: Talitacum Yolanda Velez Arevalo Fecha de toma de Muestra: 27/04/2024
Edad: 21 años Fecha de Emisión: 03/05/2024
C.I. 180195467-0 Sexo: Femenino Código: 0386 Teléfono: 099562289
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Dirección: Av. Antonio José de Sucre y Juan Montalvo
Tipo de Muestra: Exudado Faringeo
Examen Solicitado: Cultivo y Antibiograma
RESULTADOS
GRAM: Cocos Grampositivos dispuestos en cadena.
Cultivo: Desarrollo bacteriano del género Staphylococus.
Prueba de la Catalasa: Positiva
Prueba de la Coagulasa: Positiva
NOTA: Se subestima crecimiento bacteriano de Staphylococus aureus.
Lic. Jessica Ana Hernández Grijalva
C.I. 180469026-9.
OBSERVACIONES
Observación de las colonias en medios de cultivo selectivos y diferenciales. Por ejemplo,
las colonias de Staphylococcus aureus pueden ser doradas y con una apariencia más
pigmentada, mientras que las de Staphylococcus epidermidis tienden a ser blancas o
cremosas
En cuanto a las pruebas de coagulada se pudo analizar la formación de coágulos en el
tubo de plasma después de la incubación, indicando la positividad para la coagulasa en
Staphylococcus aureus y la negatividad en Staphylococcus epidermidis.
Con relación a las diferentes características de la tincion Gram, se pudo observar la
morfología celular de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis bajo el
microscopio después de la tinción de Gram, donde ambas especies aparecen como cocos
grampositivos, pero se distinguen por otras características morfológicas.
El análisis de la importancia clínica de identificar correctamente Staphylococcus aureus
y Staphylococcus epidermidis en procesos infecciosos, incluyendo la selección de
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tratamientos adecuados y la prevención de complicaciones asociadas.
CONCLUSIONES
En relación con la diferenciación precisa entre especies, se logró identificar correctamente
Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis utilizando pruebas bioquímicas y
fenotípicas específicas, como la prueba de coagulasa, que mostró la formación de
coágulos en S. aureus y la ausencia de coagulasa en S. epidermidis.
La relevancia clínica en cuanto a la identificación precisa de Staphylococcus aureus y
Staphylococcus epidermidis es crucial en el contexto clínico, ya que estas especies están
implicadas en diferentes tipos de infecciones, con S. aureus siendo una causa común de
infecciones de la piel y tejidos blandos, así como infecciones sistémicas, mientras que S.
epidermidis se asocia más comúnmente con infecciones relacionadas con dispositivos
médicos.
La necesidad de técnicas complementarias resulta tener un gran valor de importancia ya
que como la como la tinción de Gram y la observación morfológica de colonias, junto con
pruebas bioquímicas específicas, determinan de manera especifica la identificación
precisa de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis y de esta manera tener
indicativos opetunos para los tratamientos que se requiera y ser de gran ayuda diagnostica.
RECOMENDACIONES
Aplicar todas las medidas de bioseguridad en el laboratorio uso de guates, mascarilla,
mandil, pelo recogido para evitar contaminación en muestras y contaminar a las personas
de nuestro alrededor y contaminarnos de patógenos que puede ser causantes de producir
un cuadro clínico.
Utilizar controles de calidad adecuados, ya que es esencial incluir controles positivos y
negativos de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis en cada corrida de
pruebas para validar los resultados obtenidos y garantizar la precisión de la identificación
bacteriana.
Utilizar de manera consciente los materiales del laboratorio, observando y asegurándose
que sean estériles para evitar contaminaciones en los estudios microbiológicos de manera
más importante cuando estos son cultivos bacterianos.
Realizar la correcta estriación del medio de cultivo además de realizar las lecturas de los
resultados en los tiempos adecuados para evitar falsos resultados.
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Utilizar el mechero en todo caso que necesite esterilidad para evitar que este se contamine
y produzca una interpretación inadecuada en los resultados interpretados.
Verificar los resultados con técnicas complementarias, se recomienda verificar los
resultados de las pruebas bioquímicas, como la prueba de coagulasa, con técnicas
adicionales como la tinción de Gram y la observación morfológica de colonias,
especialmente en casos donde los resultados puedan ser ambiguos.
Actualizar los protocolos de identificación, manteniendo los protocolos de identificación
actualizados con los últimos avances en técnicas microbiológicas y criterios de
interpretación, para asegurar la aplicación de métodos más sensibles y específicos.
Implementar medidas de bioseguridad, asegurando de seguir estrictamente las medidas
durante todas las etapas de la práctica de laboratorio, incluyendo el manejo adecuado de
muestras y cultivos bacterianos, para prevenir la contaminación cruzada y proteger la
salud del personal y del medio ambiente.
BIBLIOGRAFÍA
Microbiologia en Práctica de Jawets, Melnick y Adelberg E. Alche Editorial Atlante s.r.l
Microbiologia Fuerst Nueva Editorial Interamericana
Cotaquispe R, Sarmiento R, Lovón S, Rodriguez J. Caracterización fenotípica y genotípica de
Staphylococcus spp con resistencia a meticilina. Rev Investig Vet Peru [Internet]. 2021 [citado el 4 de
mayo de 2024];32(3):e20395. Disponible en: http://www.scielo.org.pe/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S1609-91172021000300028
Betancourt HO; Cuesta UY; Méndez DD; Galdós CA. Staphylococcus aureus y su identificación en
los laboratorios microbiológicos. Revisión bibliográfica Rev SciELO [Internet]. 2021 [citado el 4 de
mayo de 2024]; Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1025-
02552005000100016
Ximena Robalino Ana Carolina González Eliana de la Torre
Director/a de carrera Docente Responsable del laboratorio
