Biología Molecular

TCP 2 Solemne III

23.10.2020

Genética molecular ii

PCR

Esta técnica fue descrita por Kary Mullis, quien también participó en la técnica de mutagénesis de sitio
dirigida, obteniendo por sus aportes a la ciencia el Premio Nobel de Química en 1993.

El PCR consiste en una reacción en cadena de la polimerasa que se basa

en el proceso de replicación. Es una reacción enzimática
termorregulada mediante la cual se amplifica de manera exponencial
una región determinada del genoma.

Antes de que existiera el PCR si se necesitaba tener un gen en múltiples

copias la única posibilidad que existía era en una clonación a través de
cortar, transformar a vector y dirigir la muestra a un sistema bacteriano
o de levaduras y de esa manera, dentro del microorganismo se copiaba
muchas veces el clon. Además de poder transformar la bacteria o
levadura, hacer la copia, purificarlo, extraerlo y al final clonar solo el
pedacito de interés.

En la actualidad, gracias a la existencia del PCR y con el diseño de

partidores o primers que dirigen la reacción de amplificación a la
secuencia específica, ya no es necesario aislar el gen que necesito, solo
se aisla el ADN fuente del gen (ADN total de X célula).

Explicación dibujo

A partir de células hepáticas se extrae ADN y se somete a amplificación obteniéndose por resultado el gen
requerido.

El requisito que tiene esta técnica es que se debe conocer parte de la estructura de la región del ADN que
se quiere amplificar, es decir, se debe tener una secuencia para poder diseñar los partidores específicos
para poder amplificar solamente la parte del ADN que se requiere.

Una vez que se tiene el diseño de partidores a través de ciclos termorregulados, se parte con la
polimerización del segmento del ADN.

Requisitos para que la reacción de la ADN polimerasa funcione

• ADN molde a amplificar à a partir del cual se dirige la amplificación.

• Diseño de partidores específicosà para amplificar la secuencia de interés.

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 • ADN polimerasaà enzima responsable de la amplificación a través de la replicación es una DNA
polimerasa, que tiene la capacidad de ser resistente a los diferentes cambios de temperatura a los
que se llevara esta reacción en cada una de sus diferentes etapas.
o Esta ADN polimerasa taq es resistente a altas Antes de que existiera la taq polimerasa
temperaturas, que se pueden aislar por había que hacer cada una de las etapas del
ejemplo de volcanes o la thermophilus PCR y volver a poner enzimas, porque la
aquaticus que es aislada de geisers. enzima en la etapa inicial, que es la de mayor
o Si la bacteria tiene la capacidad de sobrevivir a temperatura 90-95°C, la enzima se moría.
esas temperaturas es porque su maquinaria Entonces cada vez que se pasaba por la
celular completa está adaptada a trabajar a etapa 1 se debía agregar nuevamente DNA
esos valores. polimerasa y terminaba siendo una técnica
o Replica el ADN molde de las regiones donde muy cara y difícil de aplicar.
están los primers

• Desoxinucleotidos trifosfato (dNTP) à sustratos.

• Buffer (Mg++) à entrega el ambiente químico adecuado.
• Ciclos de temperatura à reacción termorregulada, ocurre en distintos ciclos y cada uno tiene 3
etapas.

Etapas del PCR

Ø Primera etapa
o Es la de alta temperatura, 95°C generalmente, en la cual se produce la separación de la
hebra molde.

o Esto lo haría la enzima helicasa en el caso que no se pueda llevar la reacción a esas
temperaturas. Lo que hace la temperatura es reemplazar la acción de la helicasa de la
replicación (romper los puentes de hidrogeno para obtener la hebra sencilla y así tener los
moldes).

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 Ø Segunda etapa
o Consiste en la de la hibridación de los primers.
o Los primers se encuentran presentes en el tubo, al disminuir a la temperatura óptima de
hibridación, que depende de cada uno, normalmente se encuentra entre los 55-65°C, estos
son capaces de reconocer la hebra complementaria y ubicarse en la zona correcta.

En la segunda etapa se tiene todo para que la ADN polimerasa al tener un molde pueda leer en un primer que le
entrega el 3’ OH libre para poder replicar, además contiene los sustratos necesarios que son los desoxinucleótidos
trifosfato (cada uno de adenina, citosina, guanina y timina) y el ambiente con Magnesio para poder partir
replicando.

Ø Tercera etapa
o Etapa de síntesis/replicación que posee una temperatura que es óptima para que la ADN
polimerasa trabaje.
o La ADN polimerasa realiza el proceso de alargar los primers para iniciar el proceso de
amplificación a una temperatura cercana a 72 °C, sin embargo, puede variar dependiendo
del tipo de ADN polimerasa que actúe

Recapitulación

- Etapa 1, de denaturación → 95 °C
- Etapa 2, de hibridación → Temperatura dependiente de la secuencia presente en el primer, puede
cuantificarse, suele ser cercana a 55-65 °C
- Etapa 3, de síntesis → 72 °C, varía según el tipo de polimerasa.

Proceso de amplificación
Existe una región de ADN cromosomal
de doble hebra que requiere ser
amplificada.

1.- Primer ciclo, producir 2 moléculas de

ADN de doble hebra

2.- Segundo ciclo, producir 4 moléculas

de ADN de doble hebra

3.- Tercer ciclo, producir 8 moléculas de

ADN de doble hebra

Cada ciclo realiza los mismos 3 pasos

§ Cada hebra hermana de ADN es separada de su complementaria (Denaturación)

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 § Se ubica su primer correspondiente para la síntesis de una nueva hebra complementaria
(Hibridación)
§ Ocurre la replicación de cada hebra en base a su propio primer (Amplificación)
Como resultado final de estos 3 ciclos se obtienen 8 paquetes de 2 hebras de ADN complementarias
delimitadas en su extensión por la ubicación de su primer (Resaltados en amarillo).

- Dichos fragmentos aumentan exponencialmente en número hasta que se completan los 30-35
ciclos correspondientes a este proceso.
- En este momento este tipo de fragmentos de ADN representa más del 99% de la totalidad del
ADN.
- Los fragmentos de ADN complementarios que conservan su largo original y/o no fueron
delimitados en su extensión por uno o ambos primers se considera ADN residual, el cual es
prácticamente insignificante.
En n ciclos se obtienen 2n moléculas de ADN (Sin considerar ADN residual) resultante de la amplificación
de la molécula original.

El objetivo del alto grado de amplificación del ADN en PCR es permitir el análisis o detección de ADN o
ARN (Proceso de retrotranscripción previo) en mínimas cantidades, es decir, lograr utilizar el ADN
presente en una muestra a pesar de que este se encuentre en una concentración ínfima.
El alto grado de amplificación en PCR es extremadamente útil para los análisis de cadáveres por parte de
médicos forenses, debido a que a partir de un rasguño, pelo o marca en el cuerpo es posible analizar la
procedencia del ADN involucrado en el cuerpo del fallecido

Características del PCR

§ En un tubo se agregan enzimas con sus sustratos

correspondientes, además de la muestra de ADN molde.
§ Maquina llamada termociclador realiza de manera
automática al programarla cada etapa de cada ciclo
necesario para el proceso.
o Separación: 1 min a 95º
o Hibridación: 1 min a 65º
o Amplificación: 1 min a 72º
§ Se repite el proceso 30 veces. (App 1 hora y media).
§ Queda programado, se tapa el termociclador y los tubitos quedan dentro.
§ El termociclador permite cambiar la temperatura del ambiente rapidamente.

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 § Etapa de visualización del amplificado.
o A través de electroforesis
§ A un lado polo positivo y al otro lado polo negativo.
§ Se siembran las muestras de ADN en el polo negativo.
§ ADN es polianión, por lo que migrará al polo positivo a través del gel.
§ Se tiñe con colorante específico para ADN.
§ Fragmentos de ADN de mayor tamaño migran
menos; fragmentos de menor tamaño migran
más, por lo que quedan separados según su
tamaño.
§ Los fragmentos separados pueden
compararse con un marcador de pesos
moleculares: mezcla de fragmentos de ADN
con peso molecular conocido.
§ Se identifican fragmentos amplificados de
acuerdo a su tamaño.

Valor diagnóstico de PCR

• Por ejemplo, se puede buscar la presencia de una bacteria determinada que provoque
enfermedad en una persona, a traves de la amplificación de ADN bacteriano con primers
dirigidos a un gen que este solamente presente en la bacteria. Aquello determinará si es positivo
o negativo (presente o no la bacteria).
• Para que PCR tenga un valor diagnóstico (en investigación también), se necesitan controles.

Controles

1. Control interno:
• Indica si la reacción ocurrió correctamente dentro del tubito.
• Se dirige una amplificacion poniendo otra pareja de primers dentro del mismo tubito para que
amplifiquen otra “cosa” que es seguro que ahí esta.
• Por ejemplo:
o Si se busca la presencia de ADN bacteriano, se puede tener un control interno que sea
amplificar el gen del ARN ribosomal. (Todas las bacterias tienen gen para el ARN ribosomal,
el cual es altamente conservado).
o ARNr conservado quiere decir que si se dirigen los primers a la región más conservada de
ese gen, esos primers amplificarán cualquier gen de ARNr de cualquier bacteria.
o Si no hay amplificación de la bacteria que se está buscando, pero si de el control interno,
quiere decir que la reacción de PCR dentro del tubito ocurrió correctamente y descarto la

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 posibilidad de por ejemplo, error de pipeteo (sólo se introduce uno de los dos primers o
no se puso el buffer de magnesio).
o Si no se puso el buffer de magnesio la ampliación va a dar negativa para la muestra, pero
tampoco va a estar la amplificación del control interno lo que indica que el negativo que
hay en la muestra puede ser un falso negativo ya que hay un error en la reacción porque
el control interno no se amplificó.
o El Control interno es muy importante al aplicar técnicas moleculares con un valor
diagnostico porque nos indica si la reacción ocurrió correctamente.

Controles + y - prueban que el diseño del protocolo es el correcto y que los partidores estén bien.

2. Control positivo (+):

• De haber amplificación: es específica.
• Es una muestra (en otro tubo) que imita. Se pone el DNA de la bacteria. Por ejemplo, si se esta
buscando Staphylococcus aureus en una muestra de un paciente que esta cursando una
infección que no ha podido ser controlada, se pone en el tubo de control positivo DNA extraido
de Staphylococcus aureus que se tiene en el laboratorio para controles positivos.
o Si el control positivo no tiene amplificación quiere decir que los primers no estan
funcionando correctamente y no estan reconociendo Staphylococcus aureus. Por lo tanto
si se tiene una muestra positiva del paciente se empieza a dudar que sea Staphylococcus
aureus porque el control positivo no dió.

o Si se tiene una muestra negativa se empieza a dudar que los partidores sean los correctos
porque el control positivo tampoco dio, por ende quizás no estan reconociendo.

3. Control negativo (-):

• De no haber amplificación: realmente no está presente lo que se buscaba.
• Se agrega en vez de ADN, agua por ende no se tiene el molde de ADN solo se tienen los reactivos.
Este control permite descartar que la amplificación de la muestra del paciente no sea una
amplificación al azar de cualquier cosa.
o Si en el control negativo hay algo que se amplifica quiere decir que los reactivos estan
contaminados y por lo tanto hay que cambiarlos todos. Se pierde el valor diagnostico de
ese PCR.

Estos tres controles (interno, positivo y negativo) lo que hacen es validar el PCR de la muestra, son el
fundamento o apoyo de lo que se esta detectando en la PCR es lo que se esta indicando.
Los controles son válidos para cualquier técnica, no solamente para PCR.

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Visualización del amplificado
Lo más sencillo es revisarlo en una electroforesis en donde al ver el tamaño del amplificado se puede
decir si está correcto.

• Ejemplo: Los primers están dirigidos a la amplificación de un gen de staphylococcus aureus, y están
dispuestos con 500 pares de base de diferencia, por lo tanto, este será el tamaño del amplificado.
• En la electroforesis esto se debería ver a la altura del marcador de peso molecular de 500 pares de
base.
• Cuando se está en las etapas de prueba y validación de esta técnica, para que esta tenga valor
diagnóstico, se debe asegurar que el amplificado que se está estudiando sea realmente
staphylococcus aureus y no otro, ya que puede ocurrir, por ejemplo, que al estar contaminada la
muestra, por coincidencia se tenga un amplificado del mismo tamaño, como sucede en el caso de la
escherichia coli.
• Para descartar que no ocurra esto, en las etapas previas del montaje de esta técnica, es necesario que
se realice una visualización más específica y con más información del amplificado, en donde se recurre
a otras técnicas de Biología Molecular que ya no solo reconocen por tamaño, sino que reconocen por
la secuencia de los amplificados. En ese caso se utiliza por ejemplo, la visualización a través de la
técnica de Southern Blot.

Hibridación: Técnica de Southern Blot

Esta técnica consiste en realizar una

transferencia de la separación de los
fragmentos ADN por electroforesis, a una
membrana o un papel de nitrocelulosa que
permita realizar una identificación de los
cambios de ADN que se separaron por dicha
electroforesis, a través de una reacción que
los reconozca de una manera más específica
como, por ejemplo, a través de una
hibridación.

Etapas:

• Lo primero, es separar los fragmentos de ADN por tamaño a través de una electroforesis.
• Luego, se tiene el gel (gris), al cual se le coloca encima la membrana de nitrocelulosa (verde) y se
presiona como un sándwich con una cámara especial para que lo que quedó de ADN en la
electroforesis se traspase en la misma posición que quedaron en el gel al papel.
• En este papel en donde quedaron los diferentes fragmentos de ADN separados, se realiza la reacción
de hibridación.

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• Para esto, se tiene una sonda específica que tiene la secuencia complementaria de la secuencia de
ADN que se quiere amplificar del gen del staphylococcus aureus.

En esta reacción de hibridación o reconocimiento, se coloca la sonda la cual “flota” dentro de todo el
papel. Esto es como una “bolsa ziploc”, en donde dentro de ella está el papel de nitrocelulosa, y se le
agrega la solución que tiene la sonda, dejando un momento que se relaje un poco la estructura del ADN
para que quede denaturado permitiendo que la sonda pueda hibridar donde encuentre la secuencia
complementaria del gen que se busca.

• Finalmente, se revelan las sondas mediante:

- Marca radioactiva àpueden observar mediante una
autoradiografía.
- Quimioluminiscencia à es una reacción química que implica la
luminiscencia de la sonda y se puede detectar su ubicación.
- Fluorescencia.

En la imagen se ve que la sonda hibridó en los sitios donde se ve una línea

gruesa.

Con la reacción de hibridación se esta haciendo una visualización mucha más específica del fragmento, ya
que no solo se obtiene el peso molecular que se esperaba (ej.: 500 pb), sino que también se conoce que
es complementario a la sonda específica para ese gen. Es decir, es una forma de corroborar lo que se
determina en la electroforesis.
Si se realiza este proceso múltiples veces y en todas se obtiene un resultado positivo (ej.: 500 pb son de
estafilococo maduro) se valida la técnica y, por lo tanto, se puede realizar solo hasta la electroforesis con
un valor diagnóstico.
El nivel máximo de identificación del fragmento:
- Tomar el fragmento de la electroforesis.
- Cortar el segmento donde está el ADN con un cartonero.
- Se coloca en un buffer de extracción
- Se saca el ADN.
- Secuenciación del ADN
o Identificación y validación completa de la técnica para que tenga valor diagnóstico.
o Se obtienen los pares de bases para determinar en definitiva si corresponde al sujeto en
estudio (ej.: se obtienen las 500 pb del estafilococo). Si no se obtiene la secuencia exacta se
debe afinar el diseño de los primers para que sea realmente específica la detección de la zona
en observación.

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 o Se puede utilizar en la caracterización de brotes epidémicos y así encontrar distintas cepas
con mutaciones o con diferencias en la secuencia para una proteína. Luego, se puede asociar
el brote, la población en la que ocurrió y la cepa correspondiente (puede ser una cepa menos
o más invasiva).
o Determinación de patrones genéticos que determinan la resistencia a terapias. Hay estudios
que relacionan patrones genéticos con la resistencia a diferentes terapias, como por ejemplo
el VIH, pues se conocen distintas cepas del virus y se sabe que cada persona responde
diferente a distintas terapias.
o El proceso de secuenciación sirve para tener información sobre qué cepa del virus se está
tratando.

Diseño de los partidores (primer) para la realización de un PCR

Determinación de la temperatura de alineamiento en la segunda etapa de cada ciclo.

- Es muy importante este proceso, ya que un PCR es bueno si el

diseño de los primer es óptimo. Si se falla en el diseño de los
partidores, de ahí en adelante, el proceso está completamente
erróneo.
- Se observa en la imagen un resultado de PCR en etapa de
determinación o detección para el Citomegalovirus.
- Se realizó la hibridación a 63, 65 y 68 grados. Estas temperaturas
se determinan a través de una fórmula de acuerdo a la
secuencia de los partidores, en donde la TM (Temperatura de
Melting) que normalmente es la cual en donde el 50% del ADN
está denaturado, sin embargo, desde el punto de vista de un
primer, la TM es la temperatura a la cual el 50% de los primer ya
se unió a su hebra complementaria (hebra sencilla uniéndose),
por lo tanto es una temperatura óptima para que los primer se
puedan unir para reconocer la secuencia que se diseñó
para que reconocieran.

La TM depende del contenido de pares CG y AT, y la cantidad

de puentes de hidrógeno que se forman entre ellas, por lo
tanto su fórmula es: TM = (𝑪 + 𝑮) × 𝟒 + (𝑨 + 𝑻) × 𝟐

En la formula para calcular la secuencia del partidor tenemos que:

Los partidores normalmente no tienen
- El contenido de C+G lo multiplico por 4 mas de 10-15 pares de bases
- El contenido de A+T lo multiplico por 2
- Me da la Tm óptima para ese partidor (son pequeños)

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Temperatura de Alineamiento:

63ºC

• El primer se une en muchas partes distintas, es una temperatura muy baja por lo que el primer se
une muy fácilmente a más del 50%, tan fácil es su unión que puede ser que se una a regiones
donde no tiene complementariedad entre sus bases y las bases del blanco, hibridación poco
especifica.
65ºC

• Es una temperatura un poco mas restrictiva en la unión, tiene un poco más de especificidad en la
hibridación.
68ºC

• Con el experimento se determino que es la temperatura

adecuada para la segunda etapa (hibridación) por que permite ver solo la banda que se busca,
muy restrictiva y especifica.

• A 70° - 72° es una temperatura muy alta, por lo que puede ocurrir que los primers no se una a nada y
no se realice ningún tipo de amplificación.
• Por esto es que la temperatura del alineamiento depende de la secuencia de ADN.
• Al estar en la etapa de investigación, se debe recortar rápidamente el trozo de gen, secuenciarlo y
observar que esta sea la secuencia que se busca.
• Se realiza una primera aproximación a través de la fórmula, y después se corrobora y se determina
finalmente experimentalmente.
Para saber que está pura la banda, se puede recortar y secuenciar el ADN, o también se puede realizar la técnica
de southern blot, en donde se puede hibridar con una sonda específica o con una sonda x la cual sirve para
muchos genes distintos, con la finalidad de buscar que no haya hibridación, y corroborando así, que esto es
específico.

[Todo esto mencionado anteriormente, se realiza antes de utilizar la técnica, ya que son pruebas que
permiten diagnosticar, por ejemplo, que lo que el paciente tiene es staphylococcus aureus]

Partidores degenerados:

Para poder determinar un gen, se debe tener la información de este y de su secuencia, pero en algunos
casos cuando no se tiene la secuencia del gen, pero se tiene, por ejemplo, la secuencia aminoacídica de
la proteína, se pueden utilizar los partidores degenerados, que se llaman así porque tienen relación con
el concepto de degenerado del código genético.

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• Lo que se realiza aquí es que en base a la secuencia aminoacídica por código genético codón-
aminoácido, se saca la secuencia nucleotídica, pero como existen algunos aminoácidos que ocupan
más de 1 codón, se realizan todas las posibilidades existentes:
o Se realiza un primer que tenga la secuencia GATTGT y otro primer que en vez de utilizar el
codón GAT utiliza el codón GAC.
o Se tiene una colección de primers, incluyendo el primer de un extremo llamado primer forward
que va de 5’ a 3’ y el primer reverse que está en el
otro extremo y va de 3’ a 5’.
o Se coloca una mezcla de estos primers, ya que no
se conoce qué codón está en el gen, y como se
tienen 3 posibilidades en total, se utilizan GAG, GCG
y GTG, que son los 3 codones que codifican, por
ejemplo, para un mismo aminoácido.

Nested PCR (anidado)

Es un PCR que se utiliza cuando en la muestra es tan pequeña la cantidad de ADN molde inicial, que se
necesita aumentar aún más la sensibilidad del PCR. Entonces se realiza el PCR anidado que, en otras
palabras, es el PCR de un PCR.

• Se realiza una etapa inicial en donde se toma un fragmento del ADN, con estos 2 partidores (IF, IR), y
se realiza una amplificación inicial de un fragmento grande.
• Se toma el tubo 1, se hace la reacción, se amplifica y después de este tubo del PCR 1 se saca la muestra
y se monta el tubo 2 realizándose un PCR de ese amplificado obtenido.
• En el PCR anidado lo que hay son 2 parejas de primer y la segunda pareja tiene que reconocer
secuencias internas en el fragmento amplificado en el PCR 1.

En la imagen se ve la amplificación del primer PCR (1) y después del Nested (3) que se amplificó una parte
más pequeña.

Ambos en este caso debieran hibridar con a misma sonda. Si se dirige la sonda a una región especifica
(entre rojo y verde) va a anidar con el amplificado rojo y el verde. Sin embargo, si se pone en el extremo
(cerca del negro) no va a hibridar. Ambos están dirigidos a la misma región, pero se aumenta la
sensibilidad. Se hace un PCR y luego un PCR del PCR. Entonces se amplifica 230 y para el 2 PCR tengo una
cantidad de ADN bastante grande para hacer otro PCR mejor.

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Esto se utiliza cuando se hace mil veces el PCR y no se logra porque hay una mala muestra y es tan poco
que no logro amplificar, entonces se utiliza para probar si resulta hacer PCR del PCR.

PCR MÚLTIPLE

• Principal problema (clínico): Un PCR múltiple se suele usar en la infección de bebes (recién nacidos)
en la UCI de neonatología que suelen cursar con septicemia.
• Segundo problema (técnico): para poder realizar las pruebas y poder hacer un tratamiento
adecuado con el antibiótico adecuado es necesario cultivar la bacteria, para detectar que bacteria es
y saber que antibiótico dirigir.
• Tercer problema: Cada vez que se hace un cultivo, se necesita un volumen importante de sangre de
este bebe prematuro, especialmente si se deben hacer todos los días varios exámenes diferentes.

• Normalmente un cultivo bacteriano demora mínimo 48 en tener un resultado positivo y hasta 72hrs.
si el cultivo es negativo. En una bebe recién nacida que no pesa mas de 2kg 48 h puede significar que
sobreviva o que no. Por lo que los tratamientos son con antibióticos de gran espectro sin tener idea.
Muchas veces la infección no es por bacteria, sino que son por virus, como el citomegalovirus.

Por mientras, al bebe en la UCI, que pesa menos de 1.5 kg, se le trata con antibióticos de gran espectro,
considerando que en el tiempo que se demora la prueba podría vivir o morir. Algunas veces, incluso podría
terminar siendo que la infección no era por una bacteria, sino que, por un virus, por lo que se debe
intentar llegar a un diagnóstico rápido, para disminuir las repercusiones de un diagnóstico equivocado.

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Lo que se busca es realizar una técnica más rápida y específica, que pueda comparar de inmediato, y
determinar si es virus o bacteria, aunque no logre determinar cual específicamente, idealmente con una
muestra de sangre mínima.

Extraer una gota de sangre à sacar el ADN à sacar ácidos nucleicos à reacción de PCR múltiple, ya que
permite que en una única reacción se pueda determinar: la presencia de la bacteria y/o del virus. Esto con
presencia de partidores que reconocen los genes tanto de la bacteria específica como del virus.

Partidores

• Debe existir un buen diseño

de estos, y ser altamente
específicos.
• Por ejemplo, en el ejemplo
de la imagen, existen dos
parejas partidores que
reconocen dos genes
distintos (dos partes
diferentes del ADN) del
virus, y dos parejas que
reconocen dos genes
distintos de la bacteria.
• Las secuencias de estos
partidores no deben
hibridar entre ellas. No deben existir secuencias complementarias entre ellas, ya que esto las anula.
Esto es bastante importante de controlar, especialmente cuando se tienen varios partidores distintos
(como en la imagen, que se tienen 8= 4 parejas).
• Todos estos partidores se encuentran en un mismo tubo, con un mismo protocolo de amplificación,
por lo que es importante que las Tm de todos estos sean lo más parecidas posibles.
• Se identifican los amplificados en una electroforesis y para saber realmente cual es de cual, el tamaño
del amplificado debe ser distinto.
o Es decir, en el ejemplo de la imagen uno debe saber que lo que se amplifica en citomegalovirus
es una región de 400 pares de base (bp) y una de 225, en cambio en el estreptococo agalactiae
se tiene una amplificación de 300 bp y una de 150. Si uno amplifica secuencias con tamaños
similares, corre el riesgo de confundirse y no saber qué se está viendo en la electroforesis. Por
lo tanto se requiere que el tamaño de los amplificados de un PCR múltiple sean lo
suficientemente distintos para poder diferenciarlos al separarlos por tamaño.

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En una única reacción, se obtiene de inmediato el diagnóstico de ¿Se pueden utilizar primers de colores
si la muestra presenta citomegalovirus, estreptococo agalactiae para diferenciarlos (a las secuencias)?
o ambos. Según la imagen, podemos decir que el diagnóstico por
Las secuencias de colores se utilizan en
paciente es:
técnicas de hibridación con sonda
- Paciente 1: vemos un amplificado de 300 bp y uno de 150, fluorescente específica, en donde no
por lo tanto hay presencia de estreptococo agalactiae en interesa el color sino la secuencia.
la muestra de esta guagüita. Debe ser tratada con
antibiótico.
- Paciente 2: Tiene una coinfección (ambas). Debe ser tratada con antibiótico y con antiviral.
- Paciente 3: Tiene lo mismo que la primera bendición.
- Paciente 4: Vemos un amplificado de 400 bp y uno de 225, por lo tanto tiene una infección viral
(citomegalovirus).

RT-PCR:
• Se trata del PCR en donde se puede amplificar RNA. Se utiliza cuando se
busca identificar un virus que tiene RNA como material genético, como
por ejemplo los enterovirus.

• En esta técnica se debe hacer una etapa previa a la amplificación, en

donde con una transcriptasa reversa termoestable (termoestable para
que se pueda poner en un solo tubito con la DNA polimerasa y no sufra
denaturación producto de la temperatura) que transforme el RNA en
cDNA (hebra de DNA complementaria) por transcripción reversa.
Luego, la DNA polimerasa utiliza como molde el cDNA para amplificarlo.

• Entonces, la diferencia con el PCR anterior es que esta técnica tiene una
etapa previa de transcripción reversa y que esta sirve para la detección
de algún agente que tenga como material genético ARN (retrovirus).

→ Electroforesis en gel de agarosa al 2,0% con

muestras de LCF de niños con meningitis para la detección de enterovirus.

Existen meningitis bacterianas y virales, ambos con tratamientos diferentes, donde

en este caso correspondía a una de tipo viral y en la imagen se observa la
amplificación de las bandas para el enterovirus.

Paciente 1: negativo.

Paciente 2, 3 y 4: positivos.

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Methylation-specific PCR (MSP)

• Corresponde a un tipo de PCR especifico utilizado para ver el grado de metilación del ADN.
• Se realiza un estudio de los promotores de un gen, se amplifican y se observa en que estados están metilados,
es decir, cuando y cuando no.

*Importante recordar que esto es importante ya que el grado de metilación de un promotor indica la expresión del
gen, de manera que si esta metilado, el gen esta silenciado.

Proceso

1) Se tiene una muestra de ADN sin saber el estado de metilación (las citosinas son los nucleótidos que se
metilan).
2) La muestra se trata con bisultifo, el cual desamina la citosina y la transforma en uracilo, de manera que si
se encontraba metilada, el bisulfito no puede hacer la desaminación y se queda tal cual.
3) Se tienen 2 partidores/primer: unos para detectar metilación y otros para detectar uracilo.

Para ADN metilado:

• Primer con adeninas: Estos se unen al uracilo, pero como el ADN esta metilado, el primer no
hibrida y por ende no hay amplificación.
• Primer con guaninas: Estos logran unirse a la citosina metilada, por lo tanto si hay amplificación.

Para ADN no metilado:

• Primer con guaninas: Estos se unen a citosina metilada, pero como el bisulfito transformo la
citosina en uracilo, no se puede unir y por ende no hay amplificación.
• Primer con adeninas: Estos se unen al uracilo, por lo tanto si hay amplificación.

Por lo tanto, cuando el partidor para metilación hibrida, se obtiene un amplificado, esto quiere decir que el ADN
estaba metilado. Pero si se colocan en esa posición partidores que hibridaban con uracilo, estos no se unirán y
por lo tanto no habrá amplificación.

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Caba mencionar que en un mismo segmento se utilizan ambos partidores para corroborar la información, por lo
tanto solo se obtendrá amplificación con uno de ellos.

Objetivos:

• Determinar el grado de metilación del ADN en una célula.

• Efectos de la regulación de un gen frente a un estímulo externo.
• Observar si en ciertos cáncer, el silenciamiento o activación de un gen se debe a una metilación o
desmetilación de ciertos promotores.

PCR REAL TIME

• Es la técnica que actualmente se esta utilizando para la determinación del COVID.

• La diferencia entre el PCR y el PCR real time, es que este último utiliza el método cuantitativo.
Indica la cantidad de ADN que se tiene en la muestra original (que fue el blanco para la
amplificación) .
• La detección y amplificación son simultaneas.
• Se detecta mediante la emisión de fluorescencia producida durante la amplificación. Es
directamente proporcional a la cantidad de ADN amplificado. Mayor fluorescencia, mayor ADN
amplificado y viceversa.
• No posee una etapa de visualización del amplificado, todo el proceso ocurre en el mismo
momento.
• El método de detección va a florecer dependiendo la cantidad de ADN.
Tipos de Detección

Agentes intercalantes

• SYBR Green: es una molécula de pequeño tamaño que florece de color

verde cuando se intercala la estructura de doble hebra del ADN.
• Mientras mayor cantidad de ADN haya en la muestra (aumentará la
cantidad ya que se esta amplificando) habrá una mayor cantidad de
fluorescencia emitida por SYBR Green.
• Si hay solamente ADN denaturado SYBR Green no florece.
• El problema es que SBR posee poca especificidad, se une únicamente
a ADN de doble hebra. No depende de una secuencia única, se une a
una secuencia, aunque no sea específica. No tiene relación con la
secuencia amplificada sino con la estructura de doble hebra.

16
Sondas de hidrolisis

• Se agregan a la muestra, la sonda se une en la región

que se quiere amplificar.
• Se observa el primer reverse (verde), el primer
forward (rojo) y la sonda que se va a utilizar para
detectar.
• La sonda esta dirigida a una secuencia interna
dentro del fragmento que se va a amplificar.
• Posee 2 moléculas: una que emite fluorescencia y la
otra es el que la absorbe.
• Cuando se encuentran una sonda al lado de la otra
(primera imagen), la sonda de la derecha absorbe la
fluorescencia, por lo que no se llega a observar.
• Al comenzar la polimerización, la ADN polimerasa
que va avanzando y replicando, desplaza la sonda y
la degrada a la vez, provocando que la sonda que emite fluorescencia se aleje de la que absorbe,
con lo que se logra observar la fluorescencia como tal.

Conclusión: la fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de amplificado, pero solamente

se expresará en casos de que sea la región de interés la que se amplifique. Si los primers se unen a otra
parte distinta, no se observará la amplificación.

Es por esto por lo que las sondas de hibridación son específicas y dirigidas a la región exacta en la que se
produce la amplificación. Comparadas con otras técnicas, son un método de comparación más costoso.

La Taq va digiriendo para poder amplificar y va separando a

quien emite la fluorescencia de quien la absorbe.

La sonda de hidrólisis es un oligonucléotido de 20 bases de

longitud que contiene colorante fluorescente en el extremo 5’
y un colorante inhibidor (quencher) en el 3’. La actividad
nucleasa de la enzima ADN polimerasa, cliva a la sonda de
hidrolisis durante la extensión del amplicón, lo que produce una
emisión de fluorescencia en cada ciclo de PCR. La emisión es
proporcional a la cantidad de producto formado.

17
Existen diversos tipos de
sondas dirigidas para
distintas especificaciones.

Cuantificación

• Mediante va avanzando la amplificación va

surgiendo la fluorescencia, que es medida por un
instrumento de trabajo específico (de alto costo)
que grafica su evolución según número de ciclos y
la fluorescencia detectada. Inicialmente se calibra
al equipo con una muestra de ADN con
concentraciones conocidas.
• Mientras mayor sea la concentración inicial de ADN en la muestra,
la detección de fluorescencia iniciará antes en el denominado
punto de corte/ciclo umbral/Cp (crossing point). A mayor ADN
originalmente en la muestra, más bajo es el Cp ya que se requieren
menos ciclos para llegar al umbral donde comienza la
fluorescencia.

Análisis de cinética de disociación

• Se puede someter el amplificado a una gradiente de temperatura, donde cada fragmento tendrá
una Tm específica de cada amplificado que será el 50% de la denaturación.

18
 • Si a partir un fragmento se logran observar 2 peak de denaturación de Tm, significa que tendrá 2
productos de PCR.

En este caso, habría que secuenciarlos para determinar si es:

- Una mutación puntual.

- Una amplificación de 2 productos completamente distintos (esto porque los partidores no
fueron lo suficientemente específicos).

Esto entonces, comprueba la especificidad de la amplificación, lo normal es que se tenga solo uno.
También puede servir para analizar mutantes puntuales, es decir, diferencias puntuales en el gen o alelo
por ejemplo, distinto a los alelos de un mismo gen.

RT-PCR

Se está usando para detectar: SARS-

CoV-2 (Covi-19).

RT (siglas en inglés)à puede

significar:

- Real Time
- Transcripción Reversa

En este caso, (Covid-19), es ambos,

ya que tiene una etapa de
transcripción reversa para transformar el ARN viral en una hebra de ADN que puede ser amplificada
para hacer el corte y determinar si el PCR es positivo o negativo, dependiendo de la cantidad de virus
que se tenga.

Se usa una sonda marcada con fluorescencia que hibrida en una región diana conservada de estos genes
virales, ORF1ab y N por ejemplo.

Esta tiene que ser lo más conservada posible porque idealmente tiene que detectarse en las distintas
cepas de COVID-19 que pudiesen aparecer.

19
Esta prueba de diagnóstico es
importante para la etapa
aguda de la enfermedad, que
es en la que hay infección
viral, o sea, hay riesgo de que
esto sea transmitido.

En esta fase, mientras mayor

sea la carga viral que se puede
observar (por esto es
importante que el PCR sea
cuantitativo), mayor será el
riesgo de transmisión.

Conforme esto evolucione (si lo hace bien), el antígeno o la carga viral bajará. Si el paciente se agrava
esta se mantendrá alta.

El PCR también identifica el agente, por lo tanto, lo hará mientras estemos desarrollando la enfermedad,
por eso que previo a, podemos tener PCRs negativos si es que:

- Aún no hay carga viral suficiente.

- No hay carga viral en lo absoluto.
- Tuvo la enfermedad, pero ya no.

Esta es la diferencia con el resto de PCR que se están utilizando, que son tests rápidos de detección
temprana de algunos anticuerpos (inmunoglobulina), que son los que aparecen posteriormente.

En esta aparecerán:

- Primero la Inmunoglobulina Mà si está es positiva, aún se está en fase contagiosa.

- Luego aparece la IGG à indica una fase más avanzada, el paciente generalmente ya está
recuperado y no hay riesgo de contagio.

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